Summary
在这里，我们描述了从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养和诱导基质血管部分来源的前脂肪细胞，从而可以研究血管周围脂肪组织功能及其与血管细胞的关系。
Abstract
血管周围脂肪组织 （PVAT） 是一种围绕血管的脂肪组织库，表现出白色、米色和棕色脂肪细胞的表型。最近的发现揭示了PVAT在调节血管稳态和参与心血管疾病发病机制中的核心作用。全面了解PVAT特性和调控对于未来疗法的开发非常重要。主动脉周围脂肪细胞的原代培养对于研究PVAT功能以及主动脉周围脂肪细胞与血管细胞之间的串扰很有价值。本文提出了一种经济可行的方案，用于从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养和诱导基质血管部分来源的前脂肪细胞，可用于 体外模拟脂肪生成或脂肪生成。该方案概述了用于培养年轻小鼠主动脉周围脂肪细胞的组织处理和细胞分化。该协议将为研究PVAT功能提供工作台侧的技术基石。
Introduction
血管周围脂肪组织 （PVAT） 是一种由成熟脂肪细胞和基质血管部分 （SVF） 混合物组成的血管周围结构，被认为通过其分泌组旁分泌与相邻血管壁相互作用1。作为血管稳态的关键调节因子，PVAT 功能障碍与心血管疾病的发病机制有关 2,3,4。脂肪细胞组织的 SVF 由几个预期的细胞群组成，包括内皮细胞、免疫细胞、间皮细胞、神经元细胞以及脂肪干细胞和祖细胞 （ASPC）5,6。众所周知，存在于脂肪组织SVF中的ASPC可以产生成熟的脂肪细胞5。SVF 被推断为 PVAT 中成熟脂肪细胞的关键来源。多项研究表明，PVAT-SVF 可以在特定的诱导条件下分化为成熟的脂肪细胞 6,7,8。
目前，从脂肪组织中分离SVF有两种分离系统，一种是酶消化，另一种是非酶9。酶法通常可提高有核祖细胞的产量10。迄今为止，SVF 在促进伤口愈合、泌尿生殖系统和心血管疾病中的血管再生和新生血管形成方面的益处已得到广泛证明11，尤其是在皮肤病学和整形外科领域12,13。然而，PVAT衍生SVF的临床应用前景尚未得到很好的探索，这可能是由于缺乏标准化的SVF与PVAT分离方法。该协议的目的是建立一种标准化方法，用于从胸主动脉周围的小鼠PVAT中分离，培养和脂肪生成诱导SVF衍生的前脂肪细胞，从而能够进一步研究PVAT功能。该方案优化了组织加工和细胞分化技术，用于培养从年轻小鼠获得的主动脉周围脂肪细胞。
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Protocol
动物用药方案经上海交通大学医学院附属上海胸科医院机构动物护理与使用委员会批准（批准文号：KS23010），符合相关伦理规范。4-8周龄的雄性和雌性C57BL / 6小鼠是该实验的首选。
1. 手术工具、缓冲液和培养基的制备
- 将手术工具（例如手术剪刀和标准镊子）在121°C高压灭菌30分钟。用75%酒精对显微外科器械进行消毒。
- 制备补充有 1% v/v 青霉素 - 链霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和另外 10 mL 补充有 10% v/v 青霉素 - 链霉素的 PBS。
注意：在以下各节中，如果没有特别提及，PBS 是指常规无菌 PBS。 - 制备克雷布斯林格HEPES BSA缓冲液：1%牛血清白蛋白（BSA），20mM HEPES溶解在克雷布斯林格溶液中。
- 制备新鲜消化溶液：1型胶原酶（1mg / mL）和分散酶II（4mg / mL）溶解在Krebs Ringer HEPES BSA缓冲液中。使用0.2μm过滤器对溶液进行灭菌。
- 准备胶原蛋白包被的 12 孔板。
- 用无菌去离子水稀释胶原蛋白溶液（1mg / mL）至40μg/ mL的浓度。在每个孔的表面加入 1 mL 稀释的胶原蛋白溶液，以达到 6-10 μg/cm 2 的浓度。将涂层在室温下孵育1小时。
- 取出剩余的溶液，用 1 mL PBS 冲洗每个孔 2 次。立即使用板，或在II级层流罩中风干板，并将涂层板储存在2-8°C。 储存时，用封口膜密封涂层板。
- 制备培养基：高葡萄糖 Dulbecco 改良的 Eagles 培养基 （DMEM）、10% 胎牛血清 （FBS）、1% v/v 青霉素 - 链霉素。在4°C下保持长达2周。
- 制备脂肪生成诱导培养基：高葡萄糖DMEM，10%FBS，1%v / v青霉素 - 链霉素，1nM三碘甲状腺原氨酸，1μM罗格列酮，1μM胰岛素，0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和1μM地塞米松。在4°C下保持长达2周。
- 准备维持培养基：高葡萄糖DMEM，10%FBS，1%v / v青霉素 - 链霉素，1nM三碘甲状腺原氨酸，1μM罗格列酮和1μM胰岛素。在4°C下保持长达2周。
2. 血管周围脂肪组织（PVAT）的解剖和分离
- 通过在2%异氟烷麻醉下或二氧化碳过量的颈椎脱位对小鼠实施安乐死。喷洒75%酒精进行皮肤消毒。
- 将鼠标置于仰卧位（面朝上）。
- 提起皮肤，做一个小切口，用手术剪刀沿腹侧中线从骨盆到颈部钝性地分离皮肤和腹部肌肉。通过沿中线两侧切割横膈膜和肋骨来暴露心脏和肺部。
- 小心切除肝脏、脾脏、肠道和肾脏。避免切割肠壁。
- 切除肺和食道。
- 一只手用镊子轻轻提起心脏，另一只手用手术剪刀将主动脉与脊柱分开。然后，将心脏和主动脉置于含有1%v / v青霉素 - 链霉素的PBS的60mm培养皿中。
- 从酒精中取出显微外科镊子和显微外科剪刀，然后用 25 mL PBS 冲洗以除去多余的酒精。在立体显微镜下，从心脏和主动脉中取出胸腺和其他组织，然后取出心脏，将主动脉与PVAT一起留下。
- 将带有PVAT的主动脉转移到含有1%v / v青霉素 - 链霉素的PBS的干净60mm培养皿中。
- 使用显微手术镊子剥离PVAT，一对镊子固定主动脉，另一对拉出脂肪组织。尽可能切除脉管组织，同时尽量减少对血管周围脂肪组织的损伤。
- 将胸主动脉周围的 PVAT 收集到含有补充有 1% v/v 青霉素 - 链霉素的高葡萄糖 DMEM 的 2 mL 微量离心管中，置于冰上。
3. 基质血管分数（SVF）的分离
- 用含有10%v / v青霉素 - 链霉素的PBS和含有1%v / v青霉素 - 链霉素的PBS依次冲洗收集的组织。
注意：从此步骤开始，所有实验都必须在无菌条件下在II级层流罩中进行。 - 将组织转移到无菌的 60 mm 培养皿中，加入 200 μL 消化溶液，并使用无菌剪刀将它们切成 1 mm3 块。
- 使用塑料移液器吸头将混合物转移到 15 mL 离心管中，末端通过无菌剪刀切开，并加入 6 mL 消化溶液以开始消化反应。
注：一个消化反应（3mL消化溶液）足以用于来自六只小鼠的PVAT仓库。 - 将组织在37°C下在带有轨道振荡器（150rpm频率用于有效混合）的培养箱中孵育30-45分钟。将试管平放在架子上，使试管水平摇晃。每 5-10 分钟用手剧烈上下摇晃 10 秒。
注意：当看到均匀的淡黄色消化液而没有组织碎片时，可以停止消化。 - 通过 70 μm 细胞过滤器将消化的组织过滤到 50 mL 离心管中。用等体积的培养基冲洗细胞过滤器，以最大限度地提高细胞产量并停止消化。
- 将滤液转移到新的 15 mL 离心管中，并以 1,800 × g 离心 10 分钟。倒置试管以弃去上清液，并将沉淀重悬于 5 mL PBS 中。以1,800× g 离心5分钟。
- 通过倒置管弃去上清液，并将沉淀重悬于适当体积的培养基中。
注：从每六只小鼠收集的细胞沉淀重悬于1mL培养基中，并接种到12孔板的一个孔中。 - 将细胞接种到胶原包被的12孔板中，并在37°C下在含有5%CO2 的潮湿气氛中孵育过夜。
- 第二天，吸出培养基，用含有1%v / v青霉素 - 链霉素的预热（37°C）PBS洗涤细胞以除去细胞碎片和红细胞，并加入1mL新鲜培养基。
4. 主动脉周围脂肪组织中SVF衍生的前脂肪细胞的成脂诱导
- 每隔一天更换一次培养基，直到细胞达到~60-70%汇合。
注意：细胞通常需要 3-4 天才能达到 60-70% 的汇合度。 - 当细胞达到60-70%汇合时，吸出培养基并用棕色脂肪诱导培养基代替。将诱导脂肪分化的日期视为分化的第 0 天。
- 72小时后（分化的第3天），用维持培养基刷新培养基。每2天更换一次维持培养基，直到细胞用于实验。
- 以适当的方式分析脂肪生成细胞，例如油红O染色14 和蛋白质印迹15。
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Representative Results
使用上述方案，我们仔细分离小鼠胸主动脉周围的PVAT（图1A-D）。使用无菌剪刀将PVAT洗涤并切碎成小块（图1E，F）后，将组织碎片在含有1型胶原酶（1mg / mL）和分散酶II（4mg / mL）的消化溶液中消化，并在37°C下在振荡器上孵育30-45分钟（图1G）。将消化的组织通过70μm细胞过滤器过滤到50mL离心管中（图1H）。离心后收集细胞沉淀（图1I）。
为了确认 SVF 衍生的前脂肪细胞的成脂潜力，我们用含有 1 nM 三碘甲状腺原氨酸、1 μM 罗格列酮、1 μM 胰岛素、0.5 mM IBMX 和 1 μM 地塞米松的棕色脂肪诱导培养基诱导细胞。在棕色脂肪生成诱导7-10天后观察到成熟的脂肪细胞，其特征在于形成油红O染色的富含脂质的液泡（图2A）。蛋白质印迹分析进一步显示脂肪细胞特异性蛋白的表达水平增加，包括脂联素、Fabp4、Pgc1α、Pparγ、Ucp1 和线粒体蛋白 Cox IV（图 2B、C）。这些数据表明，来自小鼠主动脉周围脂肪组织的SVF衍生的前脂肪细胞表现出很强的成脂潜力。
图 1：从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离基质血管部分 。 （A） 使用手术钳和剪刀仔细解剖心脏和主动脉。白色和黄色箭头分别表示心脏和主动脉。（B） 用镊子小心地剥离胸主动脉周围的 PVAT。（C） 切除胸主动脉周围的 PVAT 后离开的主动脉。（D） 将 PVAT 收集在含有含有 1% v/v 青霉素 - 链霉素的高葡萄糖 DMEM 的 2 mL 微量离心管中。（E）用含有10%v / v青霉素 - 链霉素的PBS和含有1%v / v青霉素 - 链霉素的PBS依次冲洗PVAT。（F） 用无菌剪刀将 PVAT 切成 1 mm3 块。（G）将切碎的PVAT转移到含有6mL消化溶液的15mL离心管中，并在37°C下孵育组织30-45分钟，以150rpm振荡。（H） 停止消化并通过 70 μm 细胞过滤器过滤悬浮液至 50 mL 离心管。（I） 将滤液以 1,800 × g 离心 10 分钟;SVF 已被隔离。缩写：PVAT=血管周围脂肪组织;SVF = 基质血管分数。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：小鼠主动脉周围脂肪组织中基质血管部分的成脂分化 。 （A） 第 8 天与主动脉周围前脂肪细胞分化的原代脂肪细胞的光学显微镜和油红 O 染色的代表性图像。比例尺 = 200 μm。 （B，C） 第 8 天从主动脉周围前脂肪细胞分化的原代脂肪细胞的脂联素、Fabp4、Pgc1α、Pparγ、Cox IV 和 Ucp1 蛋白水平的蛋白质印迹分析。采用非配对双尾学生 t检验计算两组间差异有统计学意义。数值为SEM±平均值。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
我们提出了一种实用可行的方法，用于从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离和诱导SVF来源的前脂肪细胞。该协议的优点是简单且经济。足够数量的小鼠对于成功分离至关重要，因为组织不足会导致 SVF 密度低和生长状态不佳，最终影响脂肪生成效率。此外，小鼠年龄是一个需要考虑的重要因素，因为SVF的成脂潜力随着年龄的增长而降低。快速、仔细地分离PVAT，同时最大限度地减少脉管系统的污染至关重要。消化液也是一个关键组分，因为在 1 型胶原酶中添加分散酶 II 可以提高细胞的消化率和产量。重要的是要密切关注消化过程以避免过度消化，因为它可能会影响细胞活力。在整个方案中遵循无菌技术并保持适当的培养条件至关重要。
主动脉周围脂肪细胞的原代培养对于研究PVAT的特性和功能很有价值。从转基因小鼠主动脉周围脂肪组织中分离和诱导SVF来源的前脂肪细胞为探索体外PVAT分化和脂肪生成的重要调控因子提供了平台。PVAT 是一种由外向内调节血管收缩和血管重塑的调节剂，通过产生血管活性分子，如过氧化氢、脂联素、血管紧张素 1-7、棕榈酸甲酯、硫化氢、一氧化氮和瘦素3。该方法允许进一步研究主动脉周围脂肪细胞与内皮细胞 16、血管平滑肌细胞 （VSMC）17、外膜成纤维细胞18 或巨噬细胞 19 之间的串扰，从而深入了解 PVAT 在高血压、动脉粥样硬化、狭窄和动脉瘤等心血管疾病发病机制中的核心作用20,21,22。
此外，前脂肪细胞的分离和成脂诱导是研究PVAT谱系和PVAT异质性的基础。PVAT 是异质性血管间和血管内床，表现为不同的转录谱，这可能有助于不同的生理和病理功能特征20,23。Chang等人报道，具有VSMC特异性PPARγ缺失的小鼠在主动脉和肠系膜区域缺乏PVAT，表明PVAT可能与局部血管壁具有相同的胚胎起源24。有证据表明，来自不同胚胎来源的 PVAT 可能具有不同的表型25,26。升主动脉和主动脉弓周围的 PVAT （AA-PVAT） 来源于外胚层来源的神经嵴细胞，在形态和转录学上更类似于棕色脂肪组织 （BAT）27。相应地，来源于神经嵴细胞的PVAT的SVF在体外往往比白色脂肪细胞更容易分化为棕色脂肪细胞28。然而，腹主动脉 PVAT 主要表现为白色脂肪组织样表型29。PVAT 的 BAT 样表型或 PVAT 的 beiging 与抗炎和抗病理重塑作用相关，通过 PVAT 表型调节阐明了心血管疾病的治疗19,30。该协议将为工作台提供技术基石。
然而，该协议存在一些局限性。由于 PVAT 的可用性有限，提取 PVAT-SVF 需要大量的小鼠。在对 SVF 需求量很大的情况下，可能需要聘请多个人来加快实验进度。与永生化前脂肪细胞相比，SVF衍生的前脂肪细胞需要更多的人力和物力资源。
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Disclosures
作者没有财务或其他利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（82130012和81830010）和上海市胸科医院基础研究培育项目（批准号：2022YNJCQ03）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
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