Summary
במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, התרבית והאינדוקציה האידיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם בשברי כלי דם סטרומה מרקמת השומן הפריאו-אורטית של עכבר, מה שמאפשר לחקור את תפקוד רקמת השומן הפריווסקולרית ואת הקשר שלה עם תאי כלי הדם.
Abstract
רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT) היא מחסן רקמת שומן המקיף כלי דם ומציג את הפנוטיפים של אדיפוציטים לבנים, בז' וחומים. תגליות אחרונות שפכו אור על התפקיד המרכזי של PVAT בוויסות הומאוסטזיס כלי הדם והשתתפות בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם. הבנה מקיפה של תכונות PVAT ורגולציה היא בעלת חשיבות רבה לפיתוח טיפולים עתידיים. תרביות ראשוניות של אדיפוציטים פריאורטיים הן בעלות ערך לחקר תפקוד PVAT וההצלבה בין אדיפוציטים פריאורטיים ותאי כלי דם. מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני וישים לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם במקטע כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר, אשר יכול להיות שימושי למידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה במבחנה. הפרוטוקול מתאר עיבוד רקמות והתמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים מעכברים צעירים. פרוטוקול זה יספק את אבן הפינה הטכנולוגית בצד הספסל לחקירת תפקוד PVAT.
Introduction
רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT), מבנה פריווסקולרי המורכב מתערובת של אדיפוציטים בוגרים ומקטע כלי דם סטרומה (SVF), הוא האמין אינטראקציה עם דופן כלי הדם הסמוך באמצעות ההפרשה שלהparacrineally 1. כמווסת קריטי של הומאוסטזיס כלי דם, תפקוד לקוי של PVAT מעורב בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם 2,3,4. SVF של רקמת השומן מורכב ממספר אוכלוסיות תאים צפויות, כולל תאי אנדותל, תאי חיסון, תאי מזותליום, תאים עצביים ותאי גזע ותאי אב שומניים (ASPCs)5,6. ידוע היטב כי ASPCs השוכנים ב- SVF של רקמת השומן יכולים להצמיח אדיפוציטים בוגרים5. SVF מוסק להיות מקור קריטי של אדיפוציטים בוגרים PVAT. מספר מחקרים הראו כי PVAT-SVF יכול להתמיין לאדיפוציטים בוגרים בתנאי אינדוקציה ספציפיים 6,7,8.
כיום קיימות שתי מערכות בידוד לבידוד SVF מרקמת השומן, האחת היא עיכול אנזימטי והשנייה אינה אנזימטית9. שיטות אנזימטיות בדרך כלל מביאות לתשואה גבוהה יותר של תאי אב בעלי גרעין10. עד כה, היתרונות של SVF בקידום התחדשות כלי הדם וניאו-וסקולריזציה בריפוי פצעים, מחלות אורוגניטליות ומחלות לב וכלי דם הוכחו באופן נרחב11, במיוחד בדרמטולוגיה ובכירורגיה פלסטית12,13. עם זאת, סיכויי היישום הקליני של SVF הנגזר מ- PVAT לא נחקרו היטב, וניתן לייחס זאת להיעדר שיטה סטנדרטית לבידוד SVF מ- PVAT. מטרת פרוטוקול זה היא לבסס גישה סטנדרטית לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מ-PVAT עכברי סביב אבי העורקים החזי, מה שיאפשר חקירה נוספת של תפקוד PVAT. פרוטוקול זה מייעל את עיבוד רקמות וטכניקות התמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים המתקבלים מעכברים צעירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים החזה בשנחאי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (מספר אישור: KS23010) ועמדו בתקנות האתיות הרלוונטיות. יש להעדיף עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בגילאי 4-8 שבועות לניסוי זה.
1. הכנת כלים כירורגיים, חוצצים ומדיה תרבותית
- כלים כירורגיים אוטוקלאביים (למשל, מספריים כירורגיים ומלקחיים סטנדרטיים) בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות. חיטוי מכשירים מיקרוכירורגיים עם 75% אלכוהול.
- הכינו מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) בתוספת 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ועוד 10 מ"ל של PBS בתוספת 10% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
הערה: בסעיפים הבאים, אם לא הוזכר במפורש, PBS מתייחס PBS סטרילי רגיל. - הכינו את מאגר קרבס רינגר HEPES BSA: אלבומין 1% בסרום בקר (BSA), 20 mM HEPES מומס בתמיסת קרבס רינגר.
- הכינו תמיסת עיכול טרייה: collagenase מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ו-dispase II (4 מ"ג/מ"ל) מומסים במאגר Krebs Ringer HEPES BSA. יש לעקר את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
- הכינו צלחת מצופה קולגן עם 12 בארות.
- יש לדלל את תמיסת הקולגן (1 מ"ג/מ"ל) במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה עד לריכוז של 40 מק"ג/מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת הקולגן המדולל על פני כל באר כדי להשיג ריכוז של 6-10 מיקרוגרם / ס"מ2. דוגרים על הציפוי במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- הסר את התמיסה הנותרת ושטוף כל באר 2x עם 1 מ"ל של PBS. השתמש בצלחת מיד, או יבש את הצלחת באוויר במכסה מנוע זרימה למינרית Class II ואחסן את הצלחת המצופה ב 2-8 ° C. בעת אחסון, לאטום את לוחות מצופים עם parafilm.
- הכינו מדיום תרבית: גלוקוז גבוה Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM), 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- הכן אמצעי השראה ליפוגני: DMEM גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין, 1 ננומטר triiodothyronine, 1 μM rosiglitazone, 1 μM אינסולין, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), ו 1 μM dexamethasone. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- הכן אמצעי תחזוקה: DMEM גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין, 1 ננומטר triiodothyronine, 1 μM rosiglitazone, ו 1 מיקרומטר אינסולין. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
2. דיסקציה ובידוד של רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT)
- הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם תחת הרדמה איזופלורנית 2% או עם מנת יתר של פחמן דו חמצני. יש לרסס עם 75% אלכוהול לחיטוי העור.
- הנח את העכבר במצב שכיבה (פונה כלפי מעלה).
- הרימו את העור, בצעו חתך קטן והפרידו בבוטות בין העור לשרירי הבטן בעזרת מספריים כירורגיים לאורך קו האמצע הגחוני מהאגן ועד הצוואר. חשוף את הלב והריאות על ידי חיתוך הסרעפת והצלעות לאורך שני צידי קו האמצע.
- הסר בזהירות את הכבד, הטחול, המעיים והכליות. הימנע חיתוך דופן המעי.
- הסר את הריאות ואת הוושט.
- הרימו בעדינות את הלב עם מלקחיים ביד אחת והפרידו את אבי העורקים מעמוד השדרה בעזרת מספריים כירורגיים ביד השנייה. לאחר מכן, הניחו את הלב ואבי העורקים בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ עם PBS המכילה 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
- הסר מלקחיים מיקרוכירורגיים ומספריים מיקרוכירורגיים מאלכוהול ושטוף ב -25 מ"ל של PBS כדי להסיר את עודף האלכוהול. תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר את בלוטת התימוס ורקמות אחרות מהלב ומאבי העורקים, ולאחר מכן הסר את הלב, והשאיר את אבי העורקים עם PVATs.
- מעבירים את אבי העורקים עם PVAT לצלחת פטרי נקייה בקוטר 60 מ"מ עם PBS המכילה 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
- השתמש במלקחיים מיקרוכירורגיים כדי להפשיט PVATs, כאשר זוג אחד של מלקחיים מתקן את אבי העורקים והשני מושך את רקמת השומן. הסר את רקמת כלי הדם ככל האפשר תוך מזעור הנזק לרקמת השומן ההיקפית.
- אספו את ה-PVAT המקיף את אבי העורקים החזי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין המונח על קרח.
3. בידוד של מקטע כלי דם סטרומה (SVF)
- יש לשטוף את הרקמות שנאספו ברצף עם PBS המכיל 10% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ו-PBS המכיל 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
הערה: משלב זה ואילך, כל הניסויים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית סוג II. - מעבירים את הרקמות לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 60 מ"מ, מוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת עיכול וטוחנים אותן ל-1 מ"מ3 חתיכות באמצעות מספריים סטריליים.
- מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק, שקצהו מורחב על ידי חיתוך מספריים סטרילי, ומוסיפים 6 מ"ל של תמיסת עיכול כדי להתחיל את תגובת העיכול.
הערה: תגובת עיכול אחת (3 מ"ל של תמיסת עיכול) מספיקה למחסני PVAT משישה עכברים. - לדגור את הרקמות ב 37 ° C באינקובטור עם שייקר מסלולית (תדר 150 סל"ד לערבוב יעיל) במשך 30-45 דקות. קשרו את הצינורות בצורה שטוחה על מתלה כדי לגרום לצינורות לרעוד אופקית. נערו מעלה ומטה במרץ ביד במשך 10 שניות כל 5-10 דקות.
הערה: ניתן להפסיק את העיכול כאשר נוזל עיכול הומוגני וצהבהב נראה ללא שברי רקמות. - מסננים את הרקמות המעוכלות דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. שטפו את מסננת התאים בנפח שווה של מדיום תרבית כדי למקסם את תפוקת התאים ולעצור את העיכול.
- מעבירים את התסנין לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגה בעוצמה של 1,800 × גרם למשך 10 דקות. הפוך את הצינור כדי להשליך את supernatant ו resuspend את הכדורים ב 5 מ"ל של PBS. צנטריפוגה בעוצמה של 1,800 × גרם למשך 5 דקות.
- השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצינור והשעו מחדש את הכדוריות בנפח מתאים של מדיום תרבית.
הערה: כדורי התא שנאספו מכל שישה עכברים מושעים מחדש ב-1 מ"ל של מדיום תרבית ונזרעים לבאר אחת של צלחת בת 12 בארות. - זרעו את התאים לתוך צלחת מצופה קולגן של 12 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה עם 5%CO2 למשך הלילה.
- למחרת, שאפו את מדיום התרבית, שטפו את התאים עם PBS שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) המכיל 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין כדי להסיר פסולת תאים ותאי דם אדומים, והוסיפו בחזרה 1 מ"ל של מדיום תרבית טרי כל באר.
4. אינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית
- שנה את מדיום התרבית כל יומיים עד שהתאים מגיעים ~ 60-70% מפגש.
הערה: בדרך כלל לוקח 3-4 ימים לתאים להגיע למפגש של 60-70%. - כאשר התאים מגיעים למפגש של 60-70%, שואפים את מדיום התרבית ומחליפים אותו בתווך אינדוקציה אדיפוגני חום. שקול את יום האינדוקציה של התמיינות אדיפוגנית כיום 0 של התמיינות.
- לאחר 72 שעות (יום 3 של בידול), רענן את המדיום עם אמצעי תחזוקה. שנה את אמצעי התחזוקה כל יומיים עד שהתאים ישמשו לניסויים.
- לנתח את התאים האדיפוגניים בצורה מתאימה, כגון שמן אדום O צביעה14 ו blotting המערבי15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה שתואר לעיל, בודדנו בקפידה PVAT סביב אבי העורקים החזי של עכבר (איור 1A-D). לאחר שטיפה וטחינה של PVAT לחתיכות קטנות באמצעות מספריים סטריליים (איור 1E,F), שברי רקמות עוכלו בתמיסת עיכול שהכילה collagenase מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ו-dispase II (4 מ"ג/מ"ל) והודגרו ב-37°C על שייקר במשך 30-45 דקות (איור 1G). הרקמות המעוכלות נמתחו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל (איור 1H). כדורי תאים נאספו לאחר צנטריפוגה (איור 1I).
כדי לאשר את הפוטנציאל האידיפוגני של הקדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF, גרמנו לתאים להשתמש בתווך אינדוקציה אדיפוגני חום המכיל 1 ננומטר טריודותירונין, 1 מיקרומטר רוזיגליטזון, 1 מיקרומטר אינסולין, 0.5 מילימטר IBMX ו-1 מיקרומטר דקסמתזון. אדיפוציטים בוגרים נצפו לאחר 7-10 ימים של אינדוקציה אדיפוגנית חומה, המאופיינת על-ידי היווצרות של ואקולים עשירים בשומנים מוכתמים בשמן O (איור 2A). ניתוח הכתמים המערבי הראה גם את רמות הביטוי המוגברות של חלבונים ספציפיים לאדיפוציט, כולל אדיפונקטין, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 וחלבון מיטוכונדריאלי Cox IV (איור 2B,C). נתונים אלה מצביעים על כך שהקדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת השומן הפריאורטית של העכבר מפגינים פוטנציאל אדיפוגני חזק.
איור 1: בידוד של מקטע כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר . (A) הלב ואבי העורקים מנותחים בזהירות באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים. ראשי חץ לבנים וצהובים מציינים את הלב ואת אבי העורקים, בהתאמה. (B) PVAT המקיפים את אבי העורקים החזי מופשטים בזהירות באמצעות מלקחיים. (C) אבי העורקים שנותר לאחר הסרת PVAT סביב אבי העורקים החזי. (D) PVAT נאספים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל DMEM עתיר גלוקוז עם 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין. (E) PVAT נשטפים ברצף עם PBS המכיל 10% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ו-PBS המכיל 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין. (F) טחינת ה-PVAT ל-1 מ"מ3 חתיכות באמצעות מספריים סטריליים. (G) העברת PVAT טחון לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל המכיל 6 מ"ל תמיסת עיכול, ודגירת רקמות בטמפרטורה של 37°C למשך 30-45 דקות עם טלטול ב-150 סל"ד. (H) עצור את העיכול וסנן את המתלה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. (I) צנטריפוגה את התסנין ב-1,800 × גרם למשך 10 דקות; ה-SVF בודד. קיצורים: PVAT = רקמת שומן פריווסקולרית; SVF = מקטע כלי דם סטרומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התמיינות אדיפוגנית של מקטע כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר . (A) תמונות מייצגות של מיקרוסקופ אור וצביעת שמן אדום O של אדיפוציטים ראשוניים המובחנים מפראדיפוציטים פריאורטיים ביום 8. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B,C) ניתוח קלאץ' מערבי של רמות חלבון אדיפונקטין, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV ו- Ucp1 עבור אדיפוציטים ראשוניים המובחנים מפראדיפוציטים פריאורטיים ביום 8. מבחני t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג שימשו לחישוב הבדלים משמעותיים בין שתי הקבוצות. הערכים הם ממוצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציעים גישה מעשית וישימה לבידוד ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית של עכבר. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא פשוט וחסכוני. מספר מספיק של עכברים הוא קריטי לבידוד מוצלח, שכן רקמה לא מספקת עלולה לגרום לצפיפות SVF נמוכה ולמצב גדילה ירוד, מה שבסופו של דבר משפיע על יעילות הליפוגנית. בנוסף, גיל העכבר הוא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון, שכן הפוטנציאל האידיפוגני של SVF פוחת עם הגיל. הפרדה מהירה וזהירה של PVAT תוך מזעור זיהום כלי הדם היא חיונית. תמיסת העיכול היא גם מרכיב מרכזי, שכן תוספת של dispase II לקולגנאז מסוג 1 יכולה לשפר את קצב העיכול ואת התפוקה של תאים. חשוב להקדיש תשומת לב רבה לתהליך העיכול כדי למנוע עיכול יתר, שכן הוא עלול להשפיע על יכולת הקיום של התא. הקפדה על טכניקות סטריליות ושמירה על תנאי תרבות מתאימים לאורך כל הפרוטוקול היא חיונית.
תרביות ראשוניות של אדיפוציטים פריאורטיים הן בעלות ערך לחקר תכונות ופונקציות PVAT. בידוד ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית של עכברים מהונדסים גנטית מספקים פלטפורמה לחקר הרגולטור החשוב של התמיינות PVAT ואדיפוגנזה במבחנה. PVAT הוא אפנן של היצרות כלי דם ועיצוב מחדש של כלי הדם באופן חיצוני כלפי פנים, באמצעות יצירת מולקולות vasoactive כגון מי חמצן, adiponectin, אנגיוטנסין 1-7, מתיל palmitate, מימן גופרתי, תחמוצת החנקן, ולפטין3. שיטה מוצגת זו מאפשרת מחקר נוסף של ההצלבה בין אדיפוציטים פריאורטיים ותאי אנדותל16, תאי שריר חלק וסקולרי (VSMCs)17, פיברובלסטים אדוונטיטיאליים 18, או מקרופאגים 19, ומספקת תובנות לגבי התפקידים המרכזיים של PVAT בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם כגון יתר לחץ דם, טרשת עורקים, היצרות ומפרצת20,21,22.
בנוסף, בידוד ואינדוקציה אדיפוגנית של preadipocytes הם הבסיסים לחקר שושלות PVAT והטרוגניות PVAT. PVAT הן מיטות הטרוגניות בין ותוך וסקולריות, המתבטאות בפרופילי שעתוק נפרדים, אשר עשויים לתרום לתכונות תפקודיות פיזיולוגיות ופתולוגיות מובהקות20,23. צ'אנג ועמיתיו דיווחו כי עכברים עם מחיקת PPARγ ספציפית ל-VSMC חסרו PVAT באזור אבי העורקים והמזנטרי, מה שמצביע על כך ש-PVAT עשוי לחלוק את אותם מקורות עובריים עם דופן כלי הדם המקומית24. ישנן ראיות לכך של-PVAT ממקורות עובריים שונים עשויים להיות פנוטיפים שונים25,26. ה-PVAT המקיף את אבי העורקים העולה ואת קשת אבי העורקים (AA-PVAT), המופק מתאי פסגה עצבית ממקור אקטודרמלי, דומה יותר מבחינה מורפולוגית ושעתוק לרקמת שומן חומה (BAT)27. בהתאמה, SVF של PVAT שמקורו בתאי פסגה עצבית נוטה להתמיין לאדיפוציטים חומים בקלות רבה יותר מאשר אדיפוציטים לבנים במבחנה28. אבי העורקים הבטני PVAT, לעומת זאת, מציג בעיקר פנוטיפ דמוי רקמת שומן לבנה29. פנוטיפ דמוי BAT של PVAT או בז של PVAT קשור להשפעות עיצוב מחדש אנטי דלקתיות ואנטיפתולוגיות, ושופך אור על הטיפול במחלות לב וכלי דם באמצעות אפנון פנוטיפ PVAT19,30. פרוטוקול זה יספק את אבן הפינה הטכנולוגית בצד הספסל.
עם זאת, יש כמה מגבלות לפרוטוקול זה. בשל הזמינות המוגבלת של PVAT, חילוץ PVAT-SVF מחייב מספר גדול יותר של עכברים. במצבים בהם יש ביקוש גבוה ל- SVF, ייתכן שיהיה צורך להעסיק יותר מאדם אחד כדי להאיץ את התקדמות הניסוי. בהשוואה לפראדיפוציטים אלמותיים, קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF דורשים משאבים אנושיים וחומריים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים, כספיים או אחרים, להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82130012 ו -81830010) ופרויקטי טיפוח למחקר בסיסי של בית החולים לחזה בשנחאי (מספר מענק: 2022YNJCQ03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
References
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
- Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
- Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
- Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
- Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
- Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
- Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
- Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
- Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
- Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
- Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
- Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
- Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
- Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
- Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
- Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
- Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
- Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).
