Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiomics analyse af TMEM200A som en pan-cancer biomarkør

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

Her præsenteres en protokol, hvor flere bioinformatiske værktøjer kombineres for at studere de biologiske funktioner af TMEM200A i kræft. Derudover validerer vi også eksperimentelt bioinformatikforudsigelserne.

Abstract

Transmembranproteinet, TMEM200A, er kendt for at være forbundet med humane kræftformer og immuninfiltration. Her vurderede vi funktionen af TMEM200A i almindelige kræftformer ved multiomics-analyse og brugte in vitro-cellekulturer af maveceller til at verificere resultaterne. Ekspressionen af TMEM200A i flere humane kræfttyper blev vurderet ved hjælp af RNA-seq-data fra UCSC Xena-databasen. Bioinformatisk analyse afslørede en potentiel rolle TMEM200A som en diagnostisk og prognostisk biomarkør.

Kulturer af normale mave- og kræftcellelinjer blev dyrket, og TMEM200A blev slået ned. Ekspressionsniveauerne for TMEM200A blev målt ved anvendelse af kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion og western blotting. In vitro tab-af-funktion undersøgelser blev derefter anvendt til at bestemme rollerne af TMEM200A i den ondartede adfærd og tumordannelse af gastrisk cancer (GC) celler. Western blots blev brugt til at vurdere effekten af knockdown på epitel-mesenkymal overgang (EMT) og PI3K / AKT signalvej i GC. Bioinformatisk analyse viste, at TMEM200A blev udtrykt på høje niveauer i GC.

Spredningen af GC-celler blev hæmmet af TMEM200A knockdown, som også reducerede vimentin-, N-cadherin- og Snai-proteiner og hæmmede AKT-phosphorylering. PI3K/AKT signalvejen syntes også at være involveret i TMEM200A-medieret regulering af GC-udvikling. Resultaterne præsenteret her tyder på, at TMEM200A regulerer tumormikromiljøet ved at påvirke EMT. TMEM200A kan også påvirke EMT gennem PI3K / AKT signalering, hvilket påvirker tumormikromiljøet. Derfor kan TMEM200A i pan-cancers, især GC, være en potentiel biomarkør og onkogen.

Introduction

Kræft har vist sig at være et vedvarende folkesundhedsproblem, der bringer menneskers sundhed i fare globalt1på grund af dets høje sygelighed og dødelighed på verdensplan, hvilket udgør en tung økonomisk og medicinsk byrde for samfundet2. Betydelige fremskridt inden for kræftbehandling er opnået i de senere år takket være opdagelsen af kræftmarkører3, og forskere har udviklet nye diagnostiske metoder og nye lægemidler til behandling af kræft. Nogle patienter med kræft har dog stadig dårlige prognoser på grund af faktorer som medicinresistens, bivirkninger af lægemidler og kemisk følsomhed4. Der er derfor et presserende behov for at identificere nye biomarkører til screening og behandling af kræft i tidlige stadier5.

Membranproteiner er proteiner, der kan binde og integrere i celler og organelmembraner6. Disse kan grupperes i tre kategorier afhængigt af styrken af binding til membranen og deres placering: lipidforankrede proteiner, integrerede proteiner og perifere membranproteiner 7,8. Et transmembranprotein (TMEM) er et integreret membranprotein, der består af mindst et transmembransegment9, som passerer enten helt eller delvist gennem den biologiske membran.

Selvom virkningsmekanismerne for proteiner, der tilhører TMEM-familien, ikke forstås godt, er disse proteiner kendt for at være involveret i flere typer kræftformer10. Flere TMEM-proteiner er forbundet med migrerende, proliferative og invasive fænotyper, og deres udtryk er ofte forbundet med en patients prognose11. Derfor er TMEM-familiemedlemmer blevet målet for forskning. En omfattende gennemgang af eksisterende rapporter om TMEM afslørede, at de for det meste er forbundet med inter- og intracellulær signalering12, immunrelaterede sygdomme og tumorigenese10. Mange TMEM'er har også vigtige fysiologiske funktioner, for eksempel ionkanaler i plasmamembranen, aktivering af signaltransduktionsveje samt formidling af cellekemotaxis, vedhæftning, apoptose og autofagi10. Derfor antog vi, at TMEM-proteiner kan være vigtige prognostiske markører i påvisning og behandling af tumorer.

TMEM200A ekspression er signifikant forhøjet i gastrisk cancer (GC). Højere ekspression af TMEM200A13, som har otte exoner og en fuld længde på 77.536 kb på kromosom 6q23.1, har været forbundet med en dårlig prognose for samlet overlevelse (OS) i tilfælde af GC. Alligevel er ændringerne i dets udtryk sjældent blevet rapporteret i onkologiske undersøgelser. Denne artikel sammenligner og analyserer nytten af TMEM200A som terapeutisk mål og tumordiagnostisk markør i forskellige kræftundersøgelser ved hjælp af forskellige offentligt tilgængelige datasæt. Vi vurderede effektiviteten af TMEM200A som en pan-cancer diagnostisk og prognostisk biomarkør samt dens ekspressionsniveauer i forskellige humane kræfttyper ved hjælp af RNA-seq-data fra UCSC Xena- og TCGA-databaserne samt ved kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qRT-PCR) og western blotting.

Effekten af TMEM200A ekspressionsniveauer på mutationshastigheder, regulatoriske processer, tumordiagnose og prognose, immuninfiltration og immunterapi blev yderligere undersøgt ved hjælp af en blanding af beregningsværktøjer og datasætwebsteder. CBioPortal og Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) databaser blev brugt til at undersøge mutationer i TMEM200A. Sangerbox- og TISIDB-websteder blev brugt til at forstå, hvordan TMEM200A påvirker immuninfiltration. Onlineværktøjet Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) og CancerSEA-databasen blev brugt til at undersøge funktionen af TMEM200A. Endelig, for at vurdere virkningen af TMEM200A på GC-cellernes ondartede adfærd og tumorudviklingsfunktion, blev der udført et funktionstabseksperiment i et in vitro-assay . Derudover blev western blotting udført for at vurdere, hvordan knockdown TMEM200A påvirket PI3K / AKT signalvejen og epitel-mesenkymal overgang (EMT) i GC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cancer Genome Atlas (TCGA) database

BEMÆRK: TCGA-databasen (Cancer Genome Atlas) indeholder sekventeringsdata for gener i forskellige tumorvæv14. RNA-seq-data i TCGA til undersøgelse af TMEM200A transkripter pr. del pr. million (TPM) formater blev ekstraheret fra UCSC Xena-webstedet 15 (https://xenabrowser. net / datasider /) og log2 transformeret til sammenligning af udtrykkene mellem prøver.

  1. Gå til UCSC Xena-webstedets grænseflade.
  2. Klik på fanen Start Xena .
  3. Klik på fanen DATASÆT øverst på skærmen.
  4. Fra de 129 kohorter og 1,571 datasæt på denne side skal du klikke på fanen for i alt 33 kræftformer såsom GDC TCGA akut myeloid leukæmi (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) og mere.
  5. Fra genekspression RNAseq menuen, vælg og klik på fanen HTSeq - FPKM GDC Hub .
    BEMÆRK: HTSeq - FPKM GDC Hub repræsenterer data, der er blevet rettet ved samtykke.
  6. Fra downloadmenuen skal du klikke på det tilsvarende link.
    BEMÆRK: Ved ovenstående metode blev RNA-Seq-data downloadet for 33 forskellige kræfttyper.
  7. Udpak zip-arkivet med RNA-seq-data for 33 forskellige kræfttyper i en enkelt fil i computerens skrivebordsmappe.
  8. Foren de udpakkede txt-filer i den samme mappe, og placer Perl-scripts i denne mappe.
  9. Åbn Perl-softwaren, kopier og indsæt stien til mappen i Perl-softwaren, hvor musemarkøren er placeret, tryk på Enter-tasten, indtast navnet på Perl-koden og navnet på genet (TMEM200A), og tryk derefter på Enter-tasten for at få en ny txt-fil (singleGeneExp.txt).
    BEMÆRK: Denne nye txt-fil (singleGeneExp.txt) indeholder genekspression af TMEM200A i 33 kræftformer hos forskellige patienter.
  10. Åbn R-koden (diffR), og kopier og indsæt stien, hvor den singleGeneExp.txt fil er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  11. Åbn R-softwaren, kør den ændrede R-kode (diffR), og tegn billedet gennem pakken "ggpubr".

2. TIMER2.0-databasen

  1. Gå til TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) database 16-webstedets grænseflade.
  2. Klik på fanen Udforskning af kræft.
  3. Indtast gen-id'et (TMEM200A) i søgefeltet, og klik på fanen Send for at få differentielle ekspressionsbilleder af TMEM200A i forskellige typer tumorer.

3. Humant proteinatlas (HPA)

  1. Gå til webgrænsefladen Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org ) 17.
  2. Skriv ID (TMEM200A) i søgefeltet , og klik på knappen Søg . Vælg TISSUE sub-atlas.
  3. Hold markøren over siden, og rul ned for at finde fanen Oversigt over proteinudtryk .
    BEMÆRK: Afsnittet Oversigt over proteinekspression viser proteinekspressionsniveauerne for TMEM200A i 45 organer i menneskekroppen.

4. HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-methyleringsplatform array

BEMÆRK: HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA methyleringsplatform array blev brugt til at indsamle data om methylering. Vi kunne vurdere de TMEM200A DNA-methyleringsniveauer ved hjælp af SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) databasen18.

  1. Gå til SMART-webstedets grænseflade.
  2. Indtast gen-ID'et (TMEM200A) i søgefeltet for at opnå fordelingen af TMEM200A i kromosomer og methyleringsniveauet for TMEM200A i forskellige typer maligniteter.
  3. Rul ned på siden til menuen Klik for at kontrollere CpG-aggregeret methylering , og klik på knappen Afbildning . Nederst på siden skal du finde og klikke på knappen Download figur . Download figuren.

5. UALCAN-databasen

  1. Gå til UALCAN-webstedets grænseflade.
    BEMÆRK: Boksplottninger af TMEM200A promotormethyleringsniveauer i forskellige maligniteter blev genereret via UALCAN-databasen (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. Klik på TCGA-knappen øverst på siden.
  3. Indtast TMEM200A i indtastningsfeltet Gen-ID på skærmen. I menuen TCGA-datasæt skal du rulle ned og vælge den type kræft, der skal forespørges om.
  4. Når du har klikket på knappen Udforsk , skal du klikke på dens undergruppeanalyse Methylering i menuen Links til analyse for at få methyleringsresultaterne af denne tumor.
    BEMÆRK: Ved denne metode opnåede vi methyleringsresultater for 22 tumorer i UALCAN-databasen .

6. Kataloget over somatiske mutationer i kræftceller (COSMIC) database

  1. Gå til kataloget over somatiske mutationer i kræftceller (COSMIC) hjemmeside interface.
    BEMÆRK: Data om kodende mutationer, ikke-kodende mutante genomiske omlejringer og fusionsgener i det menneskelige genom er tilgængelige fra Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) database20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), som også bruges til at bestemme hyppigheden af forskellige TMEM200A mutationer i forskellige kræftformer.
  2. Indtast gen-id'et (TMEM200A) i søgefeltet, og klik på knappen SØG for at gå til et nyt skærmbillede.
  3. I menuen Gener skal du finde og klikke på linket, hvor gen-ID-navnet på TMEM200A vises.
  4. Find kolonnen Mutation distribut grouping på den nye side for at få mutationsstatus for TMEM200A i tumoren.

7. CBioPortal

  1. Gå til CBioPortal-webstedets grænseflade.
    BEMÆRK: Kræftgenomiske data kan findes, downloades, analyseres og visualiseres ved hjælp af cBioPortal (www.cioportal.org) databasen. Somatiske mutationer, DNA-kopinummerændringer (CNA'er), mRNA- og microRNA-ekspression (miRNA), DNA-methylering, proteinoverflod og phosphoproteinoverflod er kun nogle få af de genomiske datatyper, der er integreret af cBioPortal21. Med cBioPortal kan der gennemføres en bred vifte af undersøgelser; Hovedvægten ligger dog på forskellige analyser vedrørende mutationer og deres visualisering.
  2. Vælg datasættet Pan-cancer-analyse af hele genomer fra underafsnittet PanCancer-undersøgelser i afsnittet Vælg undersøgelser til visualisering og analyse . Klik derefter på knappen Forespørg efter gen .
  3. Indtast målgen-id'et (TMEM200A) i forespørgselsfeltet for Indtast gener. Klik på knappen Send forespørgsel .
  4. Klik på knappen Kræfttype detaljeret øverst på siden for at få mutationerne af TMEM200A i forskellige typer kræftformer.

8. Sangerbox 3.0 værktøj

  1. Gå til Sangerbox 3.0-værktøjsgrænsefladen .
    BEMÆRK: Korrelationen mellem TMEM200A ekspression og immuninfiltrerende celler, immunsuppressive midler, immunstimulerende faktorer og MHC-molekyler (større histokompatibilitetskompleks) i alle kræftformer blev analyseret af CIBERSORT immuninfiltration ved hjælp af pan-cancer immuninfiltrationsdata i Sangerbox 3.0 værktøj22 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. Fra værktøjslinjen til venstre på siden skal du vælge og klikke på fanen Immunocellulær analyse (CIBERSORT) i menuen Pan-Cancer Analysis .
  3. Indtast målgen-id'et (TMEM200A) i forespørgselsfeltet for Indtast gener. Klik på knappen Send .

9. TISIDB-databasen

  1. Gå til TISIDB-webstedets grænseflade.
    BEMÆRK: TISIDB-databasen23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) blev anvendt til at undersøge korrelationen mellem TMEM200A ekspression og immuninfiltrerende celler, immunsuppressive midler, immunstimulerende faktorer og MHC-molekyler i forskellige kræftformer.
  2. Indtast målgensymbolet (TMEM200A) i forespørgselsfeltet for Indtast gener. Klik på knappen Send .
  3. Klik på afsnittene Lymfocytter, Immunmodulatorer, Kemokiner og Undertype øverst på siden. Download de relevante billeder nederst på siden.

10. TIDE-databasen

  1. Gå til TIDE-webstedets grænseflade.
    BEMÆRK: TIDE-databasen (http://tide.dfci.harvard.edu/) blev brugt til at evaluere potentialet for TMEM200A som en biomarkør til forudsigelse af respons på tumorimmun checkpoint-blokadebehandling.
  2. Indtast e-mail-adressen på startskærmen for at registrere kontoen og logge ind.
  3. Find underafsnittet Biomarkørevaluering øverst på siden, og klik på det.
  4. Indtast målgen-id'et (TMEM200A) i forespørgselsfeltet for Indtast gener nederst på siden. Klik derefter på knappen Send .
  5. Træk musen på siden for at skubbe siden ned for at finde resultaterne af analysen.

11. CancerSEA databasen

  1. Gå til CancerSEA hjemmeside interface.
    BEMÆRK: Ved hjælp af enkeltcellesekventeringsdata blev forholdet mellem TMEM200A ekspression og den funktionelle tilstand af forskellige tumorceller undersøgt. Dette blev gjort ved hjælp af CancerSEA database24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. Find og klik på fanen Søg øverst på siden.
  3. Indtast målgen-id'et (TMEM200A) i forespørgselsfeltet for Indtast gener. Klik på knappen Send .

12. Tumorimmun enkeltcellecenter (TISCH) netværksværktøj

  1. Gå til tumorimmun enkeltcellecenter (TISCH) netværksværktøjets webstedsgrænseflade.
    BEMÆRK: Sammenhængen mellem ekspressionsniveauerne for TMEM200A og kræftceller blev også vist ved hjælp af tumorimmun enkeltcellecenter (TISCH) netværksværktøj25.
  2. Indtast målgen-id'et (TMEM200A) i forespørgselsfeltet for Indtast gener. Klik på knappen Udforsk .
  3. I menuen Kræfttype på denne side skal du vælge og klikke på datasættet Alle kræftformer . Rul derefter ned på siden, og klik på knappen Søg .

13. GeneMANIA

  1. Gå til GeneMANIAs hjemmesidegrænseflade.
    BEMÆRK: Korrelationen mellem TMEM200A og dets funktionelt relevante gener blev forudsagt ved hjælp af integrationsstrategien for gen-multi-association netværket Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 til konstruktion af gen-gen-interaktion (GGI) netværk.
  2. Indtast gen-id'et (TMEM200A) i søgefeltet øverst til venstre på siden, og klik på Søgeværktøjer.
    BEMÆRK: Webværktøjet GeneMANIA blev brugt til at finde 20 gener, der er forbundet med TMEM200A.

14. Analyse af funktionel berigelse

  1. Gem symbol-id'erne for de gener, der skal analyseres for berigelse i txt-filformat.
  2. Åbn R-koden (symbolidR), og kopier og indsæt stien, hvor ovenstående txt-fil er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  3. Åbn R-softwaren, og kør den ændrede R-kode (symbolidR). Konverter symbol-id'erne for disse gener til entrezID'er via "org. Hs.eg.db" pakke. Hent id.txt filen.
  4. Åbn R-koden (GOR og KEGGR), og kopier og indsæt stien, hvor den id.txt fil er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  5. Åbn R-softwaren, og kør den ændrede R-kode (GOR og KEGGR). For at følge denne protokol skal du analysere disse gener for GO- og KEGG-berigelse med pakkerne "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" og "enrichplot" og plot berigelsesresultaterne ved hjælp af pakken "gglot2".

15. Analyse af forskellene i genaktivitet

BEMÆRK: TMEM200A scoring i hver kræftprøve blev beregnet ved hjælp af ssGSEA (single-sample gene set enrichment analysis)27, og differentialanalysen af TMEM200A genaktivitet i kræft og sundt væv blev udført for forskellige kræftformer.

  1. Baseret på RNA-seq-data fra 33 tumortyper, der blev downloadet i trin 1.7, skal du pakke alle downloadede filer ud og placere dem i en samlet mappe.
  2. Placer merge.txt filen i ovenstående mappe.
    BEMÆRK: Dataene i merge.txt fil fra BioWolf (www.biowolf.cn) indeholder genekspression for alle patienter i alle tumorer i The Cancer Genome Atlas (TCGA) database.
  3. Åbn R-koden (ssGSEAR), og kopier og indsæt stien, hvor ovenstående mappe er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  4. Tag linjen, hvor geneName er i R-koden (ssGSEAR), og indtast gen-ID'et (TMEM200A).
  5. Åbn R-softwaren, og kør den ændrede R-kode (ssGSEAR). Hent scoringsfilen for genaktivitet: scores.txt.
    BEMÆRK: Med ssGSEA-algoritmen konstruerer vi først en gensætfil baseret på korrelationskoefficienterne mellem gener i henhold til dataene i merge.txt filen og identificerer generne med en højere korrelation med målgenet (TMEM200A) fra filen. Derefter forenes generne med højere korrelation som de aktive gener i TMEM200A, og til sidst får vi scoring af aktive gener i hver prøve.
  6. Åbn R-koden (scoreDiffR), og kopier og indsæt stien, hvor den scores.txt fil er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  7. Åbn R-softwaren, kør den ændrede R-kode (scoreDiffR), og tegn billedet gennem pakkerne "plyr", "reshape2" og "ggpubr".

16. Klinisk patologisk korrelation og overlevelsesprognoseanalyse

  1. Gå til UCSC Xena-webstedets grænseflade.
  2. Klik på fanen Start Xena .
  3. Klik på fanen DATASÆT øverst på skærmen.
  4. Hold markøren over siden, og rul ned for at finde fanen TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. Fra de 129 kohorter og 1.571 datasæt på denne side skal du klikke på fanen TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. Fra fænotypemenuen skal du vælge og klikke på fanen Kuraterede kliniske data.
  7. Fra downloadmenuen skal du klikke på det tilsvarende link.
    BEMÆRK: Download kliniske data for 33 kræftformer fra TCGA-databasen på ovenstående link.
  8. Udpak den downloadede kliniske datafil, og åbn den udpakkede fil i xls-filformat.
  9. Organiser og bevar de nødvendige kliniske data (stadie, alder, patologisk stadium og patientstatus) i filen, slet de resterende unødvendige kliniske data, og gem hele filen som en fil i txt-format, når du har omdøbt den klinisk.
  10. Baseret på de singleGeneExp.txt , der blev opnået i trin 1.9, skal du placere denne fil i samme mappe som den organiserede clinical.txt fil.
  11. Udpak de downloadede kliniske data, og placer filerne singleGeneExp.txt og clinical.txt i samme mappe som de udpakkede kliniske filer.
  12. Åbn R-koden (clinicalDiffR), og kopier og indsæt stien, hvor ovenstående mappe er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  13. Åbn R-softwaren, kør den ændrede R-kode (clinicalDiffR), og tegn billedet ved hjælp af pakken "ggpubr".
  14. Gå til UCSC Xena-webstedets grænseflade.
  15. Klik på fanen Start Xena .
  16. Klik på fanen DATASÆT øverst på skærmen.
  17. Fra de 129 kohorter og 1,571 datasæt på denne side skal du klikke på fanen for i alt 33 kræftformer såsom GDC TCGA akut myeloid leukæmi (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) og mere.
  18. Fra fænotypemenuen skal du vælge og klikke på fanen overlevelsesdata.
  19. Fra downloadmenuen skal du klikke på det tilsvarende link.
  20. Udpak zip-arkivet med overlevelsesdata for 33 forskellige kræfttyper i en enkelt fil i computerens skrivebordsmappe.
  21. Placer de udpakkede overlevelsesdata i samme mappe som den singleGeneExp.txt fil, der blev opnået i trin 1.9.
  22. Åbn R-koden (preOSR) og kopier og indsæt stien, hvor ovenstående mappe er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  23. Åbn R-softwaren og kør den ændrede R-kode (preOSR). Beregn gennem "limma" -pakken for at få en datafil om overlevelsen af TMEM200A i pan-cancer: expTime.txt.
  24. Åbn R-koden (OSR), og kopier og indsæt stien, hvor den expTime.txt fil er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  25. Åbn R-softwaren, og kør den ændrede R-kode (OSR). Udfør en KM-analyse ved hjælp af pakkerne "survival" og "survminer" baseret på dataene i expTime.txt filen og plot overlevelseskurverne for TMEM200A i pan-cancer.

17. Univariate og multivariate Cox-regressionsanalyser med skovplotkonstruktion

  1. Åbn R-koden (COXR), og kopier og indsæt stien, hvor vi fik den expTime.txt fil fra 16.23 er placeret til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  2. Åbn R-softwaren, og kør den ændrede R-kode (COXR). Baseret på dataene i expTime.txt-filen udføres univariate COX-regressionsanalyser ved hjælp af pakkerne "overlevelse", "survminer" og "forestplot" for at plotte et univariat skovplot af TMEM200A i forskellige kræftformer.
  3. Placer expTime.txt filen fra trin 16.23 og clinical.txt fra trin 16.10 i samme mappe.
  4. Åbn R-koden (multicoxR), og kopier og indsæt stien, hvor mappen, der indeholder expTime.txt filen fra trin 16.23 og clinical.txt fil fra trin 16.10, er placeret på den linje, hvor setwd er placeret i R-koden.
  5. Åbn R-softwaren, og kør den ændrede R-kode (multicoxR). Udfør en multivariat COX-regressionsanalyse ved hjælp af pakkerne "survival" og "survminer" for at plotte et multivariat-skovplot af TMEM200A i forskellige kræftformer baseret på dataene i expTime.txt - og clinical.txt-filerne .

18. Prognostisk model af gastrisk kræft baseret på TMEM200A ekspression og kliniske træk

  1. Placer clinical.txt filen fra trin 16.10 og den expTime.txt fil fra trin 16.23 i samme mappe.
  2. Åbn R-koden (NomoR), og kopier og indsæt stien, hvor ovenstående txt-fil er placeret, til linjen, hvor setwd er placeret i R-koden.
  3. Åbn R-softwaren, og kør den ændrede R-kode (NomoR). Brug softwarepakkerne "overlevelse", "regplot" og "rms" til TMEM200A ekspressionsdata i GC og kliniske data til at konstruere en prognostisk model til at forudsige patientens overlevelse.

19. Cellekultur og siRNA-transfektion af TMEM200A

BEMÆRK: Human STAD HGC-27-celler, SGC-7901-celler og humane gastrisk slimhindepitelial GES-1-celler blev opnået kommercielt (se materialetabellen), genoplivet, podet i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 komplet medium (indeholdende 10% neonatal føtalt bovint serum og 1% penicillinblanding) og dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2 cellekultur inkubator. Kulturmediet blev ændret hver 2-3 dage. Cellerne i god væksttilstand blev podet i seksbrøndsplader i henhold til (2-3) × 105 celler pr. Brønd.

  1. Først tages tre mikrocentrifugerør og tilsættes 8 μL transfektionsreagens (seMaterialernes T) og 200 μL basalmedium til hvert rør. Derefter tilsættes 4 μg SiRNA1, SiRNA2 og SiRNA3 til hvert rør.
    BEMÆRK: Til TMEM200A knockdown blev siRNA designet og købt (se materialetabellen).
  2. Bland blandingen grundigt i de tre mikrocentrifugeglas og tilsæt til hvert af de tre huller i 6-brøndpladen. Ryst forsigtigt pladen med 6 brønde for at fordele blandingen jævnt. Mærk de tre huller, hvor blandingen blev tilsat som SiRNA-1, SiRNA-2 og SiRNA-3.
  3. Når cellerne er blevet inkuberet i 4-6 timer, udskiftes halvdelen af substratet i de tre underbrønde i 6-brøndspladen.
    BEMÆRK: Når du udskifter halvdelen af det komplette medium, aspireres halvdelen af det originale komplette substrat og genopfyldes med halvdelen af det friske komplette medium.
  4. Fireogtyve til 48 timer senere skal du bruge TMEM200A siRNA-transfekterede celler som den eksperimentelle gruppe og utransfekterede celler som den negative kontrolgruppe. Udfør kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qRT-PCR, se afsnit 20) for at vurdere transfektionens virkning på cellerne.

20. Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid

  1. Kassér cellekulturmediet i hver undergruppe og vask forsigtigt cellerne to gange med 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
  2. Isoler total RNA ved hjælp af et RNA-isolationssæt (se materialetabellen).
  3. Anslå RNA-koncentrationen og syntetiser cDNA med 1 μg RNA ved hjælp af et cDNA-syntesesæt efter producentens anvisninger.
  4. Udfør kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) på 10 gange fortyndinger af cDNA i 10 μL reaktionsblanding, herunder menneskespecifikke fremadgående og omvendte primere til GAPDH (til standardisering), TMEM200A (se materialetabellen) og qPCR Master Mix ved hjælp af PCR-analysesystemet i realtid.
    BEMÆRK: Udfør hvert eksperiment i tre eksemplarer.
  5. Brug følgende qPCR-reaktionsbetingelser: initialisering, 95 °C i 3 minutter; denaturering, 95 °C i 10 s; udglødning, 60 °C i 30 s; og forlængelse, 80 °C i 10 s; Gentag denaturering, glødning og forlængelse 40x. Bestem den relative ekspression af hvert gen ved hjælp af 2-ΔΔCt-teknikken 28.
  6. Forsøgene gentages mindst tre gange for at opnå biologiske triplicater.

21. Western blot-påvisning af relevant proteinekspression

  1. Kassér cellekulturmediet i hver undergruppe og vask forsigtigt cellerne med 2 x 1 ml PBS.
  2. Afkøl de 6-brøndede plader, der indeholder cellerne på is, og tilsæt 150 μL forkølet radioimmunudfældningsanalyse (RIPA) lysisbuffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 og frisk tilsat proteasehæmmercocktail). Lad lysen fortsætte på is i 10 minutter.
  3. Brug en plastcelleskraber til at fjerne klæbende celler fra skålen og overfør forsigtigt celleopløsningen til et mikrocentrifugerør, der er forkølet.
  4. Cellelysatet centrifugeres i 10 minutter ved 1,5 × 104 g ved 4 °C. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
  5. Brug et BCA-proteinanalysesæt til at bestemme proteinindholdet i henhold til producentens anvisninger.
  6. Fyld 30 g protein fra hver prøve på en 10% natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og kør ved 80 V i 0,5 timer efterfulgt af 1,5 timer ved 120 V.
  7. Overfør proteinerne fra gelen til en 45 μm polyvinylidendifluorid (PVDF) membran ved en spænding på 300 mA i 1-1,5 timer.
  8. Efter at have anbragt PVDF-membranen på en ryster og rystet den i 3 x 5 minutter, tilsættes Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20) til den passende beholder med proteinsiden (gelsiden) opad.
  9. Anbring membranen i blokeringsbufferen (se materialetabellen) og inkuber den i 0,5 timer ved stuetemperatur.
  10. Vask membranen med TBST i 3 x 10 min.
  11. Membranen inkuberes med primære antistoffer mod phospho-AKT (p-AKT; 1:1.000), total AKT 1:1.000, E-cadherin (E-ca; 1:1.000), N-cadherin (N-ca; 1:1.000), Vimentin 1:1.000, snegl 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH; 1:1.000), natten over ved 4 °C.
  12. Vask membranen i 3 x 10 min og inkuber membranen med et sekundært antistof fra kanin eller mus (1:5.000) i 1 time ved stuetemperatur.
  13. PVDF-membranen inkuberes med ECL-substrat i 30 s, og signalet detekteres ved hjælp af et billeddannelsessystem.

22. CCK-8-analyse

  1. Frø menneskelige STAD HGC-27 celler i god væksttilstand i 96-brøndplader.
  2. Når celletætheden når 60-70%, transfekteres cellerne med TMEM200A siRNA (som i trin 19.3).
  3. De transfekterede celler hældes i plader med 96 brønde ved en celletæthed på 5 × 10 3/brønd (tæl levedygtige celler ved hjælp af en celletæller), opdelt i NC - og TMEM200A siRNA-grupper (med tre replikate brønde i hver gruppe) og inkuberes ved 37 °C.
  4. Der tilsættes CCK-8-reagens efter 0, 24, 48, 72 og 96 timer, og der inkuberes ved 37 °C i 2 timer. Absorbansen (450 nm) måles ved hjælp af en multifunktionel enzymmærkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ekspression af TMEM200A i forskellige kræftformer
Som illustreret i figur 1 analyserede vi først de forskellige ekspressionsniveauer for TMEM200A i forskellige kræftformer gennem forskellige databaser. TMEM200A ekspression var forhøjet i cholangiocarcinom (CHOL), pladecellekarcinom i hoved og hals (HNSC), renalt klart cellekarcinom (KIRC), renal papillærcellekarcinom (KIRP), hepatocellulært karcinom (LIHC), STAD og skjoldbruskkirtelkarcinom (THCA) sammenlignet med tilstødende normalt væv udelukkende baseret på TCGA-data. Imidlertid faldt TMEM200A ekspression i blære uroepitelcarcinom (BLCA), cervikal pladecellekarcinom og cervikal adenokarcinom (CESC), glioblastoma multiforme (GBM), nyrekromofori (KICH), lungepladekarcinom (LUSC), fæokromocytom og paragangliom (PCPG), rektal adenokarcinom (READ) og livmoderkorpus endometriecarcinom (UCEC) (figur 2A). I TIMER2.0-databasen steg TMEM200A ekspression i CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC og STAD. Desuden steg TMEM200A ekspression i BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, hudkutant melanom (SKCM) og UCEC (figur 2B).

Ved at sammenligne resultaterne af de to databaser fandt vi, at pan-cancer-ekspressionen af TMEM200A var den samme i hver database. Vi indhentede de kliniske opfølgningsdata og RNA-sekventeringsdata fra 33 patienter med kræft fra TCGA-databasen, beregnet TMEM200A scoring i hver kræftprøve ved hjælp af ssGSEA-analyse og beregnede derefter TMEM200A genaktivitet i tumor og normalt væv i mange tumorer. Vi opdagede, at TMEM200A var stærkt udtrykt i GBM, HNSC, nyre KIRC og THCA (figur 2C); Derfor blev genaktiviteten af TMEM200A rangeret i hvert tumorvæv. Det blev konstateret, at genaktiviteten af TMEM200A var den højeste i KIRC og den laveste i uveal melanom (UVM) (figur 2D). Efterfølgende HPA-databasevurdering af TMEM200A ekspressionsniveauer i humant væv viste, at TMEM200A ekspressionsniveauer var lave i de fleste normale væv, men høje i binyrebarken, endetarmen, endometrium og glat muskulatur (figur 2E).

I normale vævscellelinjer viste nogle få cellelinjer såsom granulosaceller, bipolære celler, skeletmuskelceller, endometriestromale celler og T-celler høj ekspression af TMEM200A, mens TMEM200A ekspression var lav i de fleste andre cellelinjer (figur 2F). Vi undersøgte også immunohistokemiske (IHC) data i HPA-databasen for at se på ekspressionen af TMEM200A på proteinniveauet. Dataene vedrørende farvning og intensitet afslørede meget større og mere udtalte ekspressionsniveauer af TMEM200A i kolorektal cancer (CRC), lungekræft (LUAD), leverkræft (LIHC), brystkræft (BRCA) og prostatacancer (PRAD) væv sammenlignet med normalt væv (figur 2G). Disse resultater antydede, at TMEM200A blev udtrykt bredt i forskellige kræftformer og påvirket kræftudvikling via forskellige mekanismer i forskellige tumorer.

Klinisk patologisk forhold og overlevelsesprognose
For 33 humane maligniteter indsamlede vi information og kliniske data i TCGA pan-cancer (PanCan) kohorten fra UCSC Xena-databasens websted og undersøgte sammenhængen mellem TMEM200A ekspression i PanCan og alder, patologisk grad, klinisk patologisk stadium og patientens overlevelsesstatus. Denne undersøgelse afslørede, at ekspressionen af TMEM200A i seks kræftformer var forbundet med det kliniskpatologiske stadium, herunder BLCA, invasivt brystkarcinom (BRCA), spiserørskarcinom (ESCA), KIRP, SKCM og testikelkarcinom (TGCT) (figur 3A). Alder var korreleret med seks tumorer, herunder invasiv BRCA, GBM, akut myeloid leukæmi (LAML), SKCM, thymisk carcinom (THYM) og endometriecancer (UCEC) (figur 3B). Den patologiske grad var forbundet med seks tumorer, herunder esophageal carcinom (ESCA), HNSC, KIRC, lavgradig gliom i hjernen (LGG), pancreas adenocarcinom (PAAD) og endometriecarcinom (UCEC) (figur 3C). Overlevelsesstatus var forbundet med fem tumorer, herunder adrenokortikalt karcinom (ACC), BLCA, KIRC, PCPG og uvealt melanom (UVM) (figur 3D).

Vi gennemførte undersøgelser for forskellige kræftformer på OS, DSS, PFI og DFI ved hjælp af envejs Cox-regressionsanalyse med en mediangruppetærskel for at lære mere om sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og prognose. Resultaterne af OS-analysen afslørede, at blandt de fire tumorer havde højere TMEM200A ekspression større indflydelse på OS-prognosen i fire tumorer, herunder adrenokortikalt karcinom (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), akut myeloid leukæmi (LAML) (P = 0,011) og GC (STAD) (P = 0,005). I modsætning hertil havde højere TMEM200A ekspression en bedre prognose for OS i fem tumorer, herunder KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), lavgradig gliom i hjernen (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) og kutant melanom (SKCM ) (P = 0,043) (figur 3E, F). For DSS havde høj TMEM200A ekspression en dårlig prognose i to tumortyper, herunder adrenokortikalt karcinom (ACC) (P = 0,026) og BLCA (P = 0,015). Høj TMEM200A ekspression havde en bedre prognose i fire tumortyper, herunder KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), lavgradig gliom i hjernen (LGG) (P = 0,025) og PCPG (P = 0,007) (figur 3G). Derudover havde højere TMEM200A ekspression for PFI en dårlig prognose i tre tumortyper, herunder adrenokortikalt karcinom (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) og uvealt melanom (UVM ) (P = 0,020). Højere TMEM200A ekspression havde en bedre prognose i to tumortyper, herunder KIRC (P < 0,001) og lavgradig gliom (LGG) (P = 0,044) i hjernen (figur 3H). I DFI havde højere ekspression af TMEM200A en dårligere prognose ved adrenokortikalt karcinom (ACC) (P = 0,044) (figur 3I).

Efterfølgende udvalgte vi flere tumorer (KIRC og KIRP) til multi-COX regressionsanalyse. Resultaterne viste, at TMEM200A individuelt kunne påvirke kræftpatienters overlevelsesrate sammenlignet med andre kliniske faktorer (figur 3J og K). Disse resultater viste, at TMEM200A kunne bruges som en uafhængig bioprognostisk markør i forskellige kræftformer for at påvirke overlevelsen hos patienter med kræft.

DNA-methyleringsanalyse
En af de epigenetiske ændringer, der har fået maksimal opmærksomhed, er DNA-methylering29. Det er blevet foreslået, at en type epigenetisk ændring, DNA-methylering, har en betydelig indvirkning på tumorvækst30. Derfor evaluerede vi DNA-methyleringsniveauerne for TMEM200A i normalt væv og kræftvæv ved hjælp af SMART-databasen. PAAD- og STAD-væv havde højere niveauer af DNA-methylering af TMEM200A end normalt væv. TMEM200A havde imidlertid lavere DNA-methyleringsniveauer i COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA og UCEC end i normalt væv (figur 4A). DNA-methyleringsniveauerne for TMEM200A var væsentligt højere i TCGA-databasen i KIRP, PRAD, PCPG og THYM baseret på UALCAN-databasen (figur 4B), men ikke i BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA og UCEC. Methyleringsniveauet for TMEM200A faldt signifikant i LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA og UCEC (figur 4C). For at undersøge forholdet mellem ekspressionsniveauet for TMEM200A og DNA-methylering og kliniskpatologiske faktorer endnu mere brugte vi igen SMART-databasen og fandt ud af, at DNA-methyleringsniveauet for TMEM200A i BLCA, HNSC, LUAD og STAD ændrede sig med det patologiske stadium (figur 4D). Kliniske faktorer påvirker niveauet af DNA-methylering af TMEM200A i ovennævnte tumorer.

Genmutation analyse
En af grundene til udviklingen af tumorer er akkumuleringen af genmutationer31. Derfor blev hyppigheden af somatiske TMEM200A mutationer analyseret ved at estimere hyppigheden af TMEM200A mutationer i pan-cancer kliniske prøver ved hjælp af cBioPortal-databasen. TMEM200A er muteret i mange kræftformer, såsom lungekræft, livmoderendometrioidkarcinom, melanom, esophagogastrisk kræft, knoglekræft, livmoderhalskræft, hepatobiliær kræft, modent B-celle lymfom, BRCA, endometriecancer, ovariecancer, embryonal tumor, kræft i bugspytkirtlen, hoved- og halskræft, CRC, gliom, ikke-småcellet lungekræft, bløddelssarkom og kræft af ukendt primær (figur 5A). Derudover kan DNA-ændringer føre til strukturelle eller aminosyreændringer på proteinniveau. Figur 5B viser 3D-strukturen af TMEM200A. Ved hjælp af cBioPortal-databasen fandt vi mutationssteder i aminosyrerne i TMEM200A; missensemutationer var den mest udbredte form for mutationer (figur 5C).

Vi analyserede dataene ved hjælp af Sangerbox 3.0 for at verificere nøjagtigheden af mutationsstederne og opnåede de samme resultater som tidligere. Missensemutationer er den hyppigste form for mutationer i TMEM200A og de kan forekomme så ofte som 7,8% i SKCM (figur 5D). En missensemutation er en mutation, hvor et kodon, der koder for en aminosyre, gennemgår en basesubstitution og bliver et kodon, der koder for en anden aminosyre, hvilket resulterer i en ændring i aminosyretypen og sekvensen af polypeptidkæden. Resultatet af missensemutation er normalt, at polypeptidkæden mister sin oprindelige funktion. Mange protein abnormiteter er forårsaget af missense mutation, som er en almindelig type tumor mutation. Det har vist sig, at missensemutationer spiller en nøglerolle i proteinernes stabilitet, og tilstedeværelsen af mutationer kan have en signifikant effekt på bindingsaffiniteten mellem proteiner32, hvilket ændrer interaktionerne mellem proteiner og de omgivende korrelative makromolekyler33.

Således påvirker missensemutationer sandsynligvis den biologiske funktion af transmembranprotein 200A i forskellige kræftformer. Sammenhængen mellem TMEM200A genmutation og den kliniske overlevelsesprognose for patienter med kræft blev også undersøgt. Sandsynligheden for OS steg sammenlignet med den i den TMEM200A-muterede gruppe, men ikke i den sygdomsfrie gruppe (figur 5E). Undersøgelsen af genkorrelationer afslørede , at TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 og SLC18B1 var blandt de gener, der co-muterede med TMEM200A (figur 5F). Vi var i stand til at identificere flere mutationstyper og enkeltnukleotidvariationer (SNV'er) gennem COSMIC-databasen for at lære mere om TMEM200A mutationer i GC. Hyppigheden af missense-substitutioner var den højeste (38,86%) (figur 5G), og SNV-data viste, at de mest almindelige SNV'er i STAD var G>A (31,73%), efterfulgt af C>T (26,35%) og G>T (11,73%) (figur 5H).

Enkeltcelleanalyse af TMEM200A i kræft
Vi analyserede TMEM200A ekspressionsniveauer i forskellige enkeltceller ved hjælp af TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center) hjemmeside. Onlineværktøjet TISCH viste udtrykket af TMEM200A for 65 datasæt og 28 celletyper i varmekortet vist i figur 6A. Resultaterne viste, at TMEM200A for det meste blev udtrykt i CD8 + T-celler og fibroblaster. GSE72056-datasættet, som omfatter celler fra patienter med metastatisk kutant melanom (SKCM), er bemærkelsesværdigt i denne henseende. TMEM200A blev bredt udtrykt i B-celler, CD4 + T-lymfocytter, udarmede CD8 + T-celler, endotelceller, fibroblaster og andre celletyper i SKCM-mikromiljøet (figur 6B, C). I GSE146771-datasættet, som indeholder celler fra patienter med CRC, blev TMEM200A bredt udtrykt i B-celler, CD4 + T-lymfocytter, CD8 + T-celler, udtømte CD8 + T-celler, endotelceller, fibroblaster og andre celletyper i CRC-mikromiljøet (figur 6D, E). Ved hjælp af CancerSEA-databasen blev ekspressionsniveauerne og funktionsstatus for TMEM200A i specifikke tumorceller bestemt (figur 6G). TMEM200A ekspression var stærkt korreleret med den cellulære funktionelle tilstand i en række kræftformer, herunder glioblastom (GBM), lungeadenokarcinom (LUAD), kronisk granulocytisk leukæmi (CML), CRC, retinoblastom (RB) og uvealt melanom (UM). Angiogenese, apoptose, differentiering og inflammation var alle positivt korreleret med TMEM200A ekspression i et flertal af tumorceller, mens DNA-skader, DNA-reparation, invasion og metabolisme var negativt korreleret med TMEM200A ekspression (figur 6F).

Funktionel og pathway berigelsesanalyse af TMEM200A i forskellige kræftformer
Vi undersøgte sammenhængen mellem TMEM200A og proteiner med lignende funktioner ved hjælp af GGI-netværket for at undersøge funktionen af TMEM200A i forskellige kræftformer (figur 7A). Genomisk og proteomisk information analyseres af GeneMANIA ved hjælp af en forespørgselsliste over målgener. Ved at lokalisere gener, der fungerer på samme måde som TMEM200A, blev de 40 proteiner, der direkte interagerer med dette gen, opdaget. Korrelationen mellem disse gener er vist af PPI-netværket (figur 7B). Efterfølgende afslørede GO- og KEGG-berigelsesanalyser af disse 20 gener, der var nært beslægtede med TMEM200A , at disse tilstødende gener for det meste var impliceret i RNA'ets negative regulering af genhæmning. KEGG-analyse afslørede, at TMEM200A var rigeligt i veje, herunder Wnt-signalvejen og cellulær ældning (figur 7C). GO-berigelsesanalyse viste, at TMEM200A i molekylær funktion hovedsageligt var rigeligt i calciumkanalerne og negativ regulering af genhæmning med RNA (figur 7D).

Korrelationsanalyse mellem TMEM200A og immuninfiltration
Vi undersøgte yderligere sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og immuncelleinfiltration for at demonstrere sammenhængen mellem TMEM200A og kræftimmunitet. Vi udførte CIBERSORT immuninfiltrationsanalyse ved hjælp af Sangerbox 3.0 pan-cancer data. Resultaterne viste, at pan-cancer TMEM200A ekspression var korreleret med CD8 + T-celler, CD4 + T-celler, B-celler, hjælper T-celler, naturlige dræberceller, regulatoriske T-celler, monocytter, makrofager, dendritiske celler, eosinofiler, basofiler og granulocytter (figur 8A). Derefter kiggede vi på sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) ved hjælp af TISIDB-databasen, der viste en tæt sammenhæng mellem TMEM200A ekspression og 28 TIL-overflod i forskellige kræfttyper (figur 8B). Vi brugte TISIDB-databasen til at vurdere sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og immunsuppressive lægemidler i humane maligniteter for mere grundigt at undersøge, hvordan immunmodulatorer og TMEM200A ekspression var relateret. Resultaterne viste, at TMEM200A ekspressionsniveauer var signifikant korreleret med immunsuppressive midler i en række kræftformer (figur 8C). Signifikante korrelationer mellem TMEM200A ekspression og visse immunsuppressive midler blev fundet i testikelkræft og UM (figur 8D-F). Vi udførte derefter en korrelationsanalyse af TMEM200A ekspression med immunstimulerende faktorer og MHC-molekyler ved hjælp af TISIDB-databasen (figur 8G, H). Resultaterne viste, at TMEM200A ekspression var korreleret med udvalgte immunostimulerende midler og MHC-molekyler i urothelial carcinom i blæren, testikelkarcinom, adrenokortikalt karcinom og UM (figur 8I-L). Næste skridt var at undersøge sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og immunologiske eller molekylære undertyper i TCGA PanCan-kohorten i TISIDB-databasen. Vi fandt, at de immunologiske undergrupper af ni forskellige kræfttyper udtrykte sig TMEM200A forskelligt, herunder BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT og BRCA (figur 8M). Derudover viste seks forskellige kræftformer med forskellige molekylære undergrupper, herunder HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV og LUSC, variabel ekspression af TMEM200A (figur 8N).

TMEM200A og immunterapi respons analyse
Effektiviteten af PD-1/PD-L1-hæmmere er stærkt korreleret med TMB, og nogle patienter med tumorer kan i nogen grad forudsiges ved hjælp af TMB-markører for effekten af immunterapi34. Mikrosatellit ustabilitet (MSI) er det udtryk, der bruges til at beskrive den defekte DNA-mismatch reparationsfunktion (MMR), når mikrosatellitreplikationsfejl ikke rettes og akkumuleres, hvilket ændrer længden eller basesammensætningen af mikrosatellitter35. MSI er en tumormarkør af klinisk betydning 36. Vi vurderede således effekten af TMEM200A ekspression på immunterapi ved at undersøge sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og TMB eller MSI. Resultaterne viste en signifikant positiv korrelation mellem TMEM200A ekspression og TMB i THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP og KIRC, men TMEM200A udtryk var negativt korreleret med UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM og BRCA (figur 9A). MSI og TMEM200A udtryk var stærkt og positivt forbundet i TGCT, mens TMEM200A udtryk var signifikant og negativt korreleret med MSI i UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC og CHOL (figur 9B). Vi vurderede også potentialet for TMEM200A som biomarkør for at undersøge effektiviteten af ICB. Resultaterne viste, at TMEM200A alene forudsagde ICB-responser med en nøjagtighed på Area Under Curve (AUC) > 0,5 i 7 ud af 25 ICB-subpopulationer. TMEM200A viste en højere prædiktiv værdi end T- og B-cellekloner, som begge havde en værdi på 5. Værdien for TMEM200A var imidlertid lavere end for TIDE (AUC > 0,5 i 11 ICB-subpopulationer), MSI-score (AUC > 0,5 i 11 ICB-subpopulationer), CD274 (AUC > 0,5 i 15 ICB-subpopulationer), CD8 (AUC > 0,5 i 17 ICB-subpopulationer), IFNG (AUC > 0,5 i 16 ICB-subpopulationer) og Merck18 (AUC > 0,5 i 17 ICB-undergrupper) (figur 9C). Dårlig overlevelsesprognose i ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 og ICB_Hugo 2016_PD1 kohorter var korreleret med høj TMEM200A ekspression. Imidlertid forbedrede TMEM200A knockdown lymfocytmedieret tumordræbende styrke i den gennemsnitlige kohorte af Kearney 2018 T_PD1 og Pan 2018 OT1 (figur 9D).

GSEA berigelsesanalyse af TMEM200A i forskellige kræftformer
Vi brugte DEG'er mellem TMEM200A undergrupper med højt udtryk og TMEM200A lavt udtryk i 32 maligniteter for at udforske TMEM200A-relaterede kræftegenskaber. Vi opdagede en betydelig sammenhæng mellem primær immundefekt, RIG (retinsyre-inducerbart gen)-I-lignende receptorsignalvej og TMEM200A ekspression i pancancer, især i BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC og SKCM (figur 10). Det virale cytoplasmatiske protein ribonukleinsyre detekteres af den RIG-I-lignende receptorsignalvej. RIG-I-lignende receptorer kan påvirke produktionen af en række inflammatoriske cytokiner i kroppen ved at aktivere NF-kB-signalvejen ved at engagere visse intracellulære forbindelsesproteiner. Som følge heraf kan transmembranproteinet 200A (TMEM200A) spille en afgørende rolle i rekrutteringen af intracellulære proteiner af den RIG-I-lignende receptor. Disse resultater antydede en stærk sammenhæng mellem TMEM200A ekspression og immunologisk infiltration. Derudover viste GSEA-berigelsesanalyse, at TMEM200A ekspression af pancancer var korreleret med kemokinsignalering, celleadhæsion, cytokinreceptorforbindelser, cellemembransensorveje og autofagikontrol (figur 10). Transmembranproteiner kan fungere som vedhæftningsmolekyler for at påvirke tumormikromiljøet ud over at spille en kritisk rolle i styringen af calciumionernes indgang i cellen fra calciumreservoirer 36. Derfor kan resultaterne opnået fra GSEA-berigelsesanalyse skyldes involvering af TMEM200A i mange fysiologiske processer, herunder aktivering af signaltransduktionsveje, dannelse af plasmamembranionkanaler og regulering af cellekemotaxis, vedhæftning, apoptose og autofagi9.

Vi identificerede de 50 bedste STAD-gener både positivt og negativt korreleret med TMEM200A fra LinkedOmics-databasen, som blev co-udtrykt i STAD, i form af varmekort (figur 11A, B). Vi evaluerede de øverste 5 gener positivt og de top 5 gener, der er negativt forbundet med TMEM200A i GC (figur 11C). Vores resultater viste, at TMEM200A udtryk var korreleret med SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) og SYTL1 (r = -0,33) co-ekspression. Vi analyserede tærskelvisualiseringsresultaterne for yderligere at forstå TMEM200A rolle i STAD. Følgende kriterier blev anvendt til screening: log2-fold ændring (FC) > 2,0 og justeret P-værdi 0,05. Vi fandt 483 DEG'er, hvoraf 385 blev opreguleret og 98 blev nedreguleret, og vi valgte 100 af dem, der skulle visualiseres for at skabe et varmekort (figur 11D). Derefter kørte vi GO- og KEGG-berigelsesanalyser for de DEG'er, der opfyldte screeningskriterierne. Resultaterne af GO-berigelsesanalyse viste, at berigelsen af BP (biologisk proces) hovedsageligt var forbundet med ekstracellulær matrix og strukturelt væv, berigelsen af CC (cellulær komponent) var hovedsageligt forbundet med kollagenholdig ekstracellulær matrix og kældermembran, og MF (molekylær funktion) blev hovedsageligt beriget i en ekstracellulær matrixstruktur og glycosaminoglycanbinding (figur 11E og figur 11G). Berigelsen af KEGG-analysen viste, at TMEM200A hovedsageligt var beriget i den ekstracellulære matrixreceptorinteraktionsvej, cytokrom P450 og renin-angiotensinsystemet (figur 11F og figur 11H).

TMEM200A-baseret prognostisk model og kliniske træk ved mavekræft
Vi undersøgte sammenhængen mellem TMEM200A og de kliniske data for patienter med STAD og analyserede derfor de kliniskpatologiske egenskaber hos patienter i TCGA-STAD-kohorten ved logistisk regressionsanalyse og baseret på TMEM200A ekspressionsniveauer (figur 12A). Alder, klinisk stadium og TMEM200A ekspression var alle væsentligt korreleret med OS hos patienter med STAD, ifølge en univariat Cox-regressionsanalyse (figur 12B). Den multivariate Cox-regressionsanalyse viste, at TMEM200A ekspression kan være en selvstændig prædiktiv faktor for OS hos patienter med STAD (HR = 1,282, 95% CI = 1,066-1,541, P = 0,008) (figur 12C). Vi undersøgte potentialet af disse kliniskpatologiske egenskaber til at forudsige OS efter 1, 3 og 5 år i STAD ved hjælp af standardkolonnelinjeplotmodellen sammen med flere kliniske parametre (figur 12D). Kalibreringskurverne for 1-års overlevelsessandsynligheder var meget konsistente med kolonnelinjeplot-forudsagte sandsynligheder (figur 12E).

TMEM200A opregulering i STAD-celler og forbedring af celleproliferation
Ved at gennemgå litteraturen relateret til TMEM200A opdagede vi, at det høje udtryk for TMEM200A indikerede en dårlig prognose 13, og GC-immunmikromiljøet kunne påvirkes af TMEM200A, der fungerer som et vedhæftningsmolekyle37, hvilket fremmer invasionen og metastasen af GC-celler. Vi undersøgte proteinniveauerne og mRNA-transkriptionsniveauerne af TMEM200A i STAD-cellelinjer for at bekræfte resultaterne af den førnævnte undersøgelse. GC-cellelinjen HGC-27 overudtrykte dramatisk TMEM200A sammenlignet med den sunde gastriske slimhindeepitelcellelinje GES-1 på både protein- og mRNA-transkriptionsniveauerne (figur 13A, B), hvilket indikerer, at TMEM200A blev overudtrykt i HGC-27-celler. Følgende tests blev udført under anvendelse af HGC-27-celler som følge heraf. I mellemtiden, for at bevise nøjagtigheden af de eksperimentelle resultater, brugte vi qRT-PCR til at sammenligne differentiel mRNA-ekspression af TMEM200A i humane GC-celler SGC-7901 og maveslimhindeepitelceller GES-1, og resultaterne viste, at TMEM200A var stærkt udtrykt i SGC-7901-celler (figur 13B). TMEM200A blev slået ned i HGC-27-celler for at undersøge den mulige involvering af TMEM200A i STAD (figur 13C). Baseret på resultaterne af databasemining og vores korrelationsanalyse af TMEM200A blev det konstateret, at TMEM200A hovedsageligt var involveret i den ekstracellulære matrixreceptorinteraktionsvej, som var forbundet med kræftspredning og invasion. Vi anvendte således CCK-8-assays for at fastslå, hvordan TMEM200A ekspression påvirkede cellevækst. CCK-8-assays viste, at TMEM200A knockdown-grupper (Si-RNA2 og Si-RNA3) viste et bemærkelsesværdigt fald i cellelevedygtighed sammenlignet med NC-gruppen (figur 13D). Disse resultater antydede, at TMEM200A blev opreguleret i STAD, og dets ekspressionsniveau kunne påvirke spredningen af GC-celler. Baseret på resultaterne af KEGG-berigelsesanalyse i figur 11F fandt vi, at TMEM200A var forbundet med PI3K / AKT-signalvejen i GC, og TMEM200A som en celleadhæsionsfaktor kan påvirke mekanismen for gastrisk carcinogenese ved at påvirke EMT. Derfor brugte vi western blotting til at verificere virkningerne af TMEM200A knockdown på EMT og PI3K / AKT signalvejen før og efter knockdown. Resultaterne viste, at P-AKT proteinekspression blev reduceret i TMEM200A knockdown-gruppen (TMEM200A-SiRNA2) sammenlignet med den negative kontrolgruppe (NC), mens niveauerne af N-cadherin-, Vimentin- og Snai-proteiner også blev reduceret, og E-cadherinproteinekspression blev øget (figur 13E). Alle disse resultater tyder på, at TMEM200A kan påvirke EMT gennem PI3K / AKT signalvejen og dermed spille en rolle i GC.

Figure 1
Figur 1: Undersøgelsens arbejdsgang. Forkortelser: TCGA = Cancer Genome Atlas databasen; TIMER2.0 = TIMER2.0-databasen; OS= Samlet overlevelse; PFS = progressionsfri overlevelsestid; DSS = sygdomsspecifik overlevelse; DFS = sygdomsfri overlevelse; TMB = tumormutationsbyrde; MSI = mikrosatellit ustabilitet; PPI = Protein-protein interaktion; GGI = Gen-gen interaktion; KEGG = Kyoto encyklopædi af gener og genomer; GO = Gen ontologi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Ekspressionsniveauer af TMEM200A i forskellige kræftformer. (A) Op- eller nedreguleret ekspression af TMEM200A fra TCGA-datasættet i forskellige humane maligniteter. (B) Analyse af TMEM200A ekspressionsniveauer i tumor og normalt væv ved hjælp af TIMER2.0-databasen. (C) Differentiel analyse af TMEM200A genaktivitet i forskellige humane kræftformer fra TCGA-datasættet . (D) Rangordning af genaktivitetsniveauer for TMEM200A i forskellige humane kræftformer baseret på ssGSEA-score. E) TMEM200A ekspressionsniveauer fra HPA-databasen i sundt væv. (F) HPA-databasens TMEM200A ekspressionsniveauer i normale cellelinjer. (G) IHC-resultater for TMEM200A proteinekspression i kræft fra HPA-databasen. Forkortelser: TCGA = Cancer Genome Atlas; ssGSEA = analyse af genberigelse af gensæt med en enkelt prøve; HPA = humant proteinatlas; IHC = Immunhistokemi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Korrelation af TMEM200A ekspression med kliniskpatologiske egenskaber og prognose for forskellige tumorer. (A) Korrelation af TMEM200A ekspression i TCGA pan-cancer (PanCan) kohorten med klinisk patologisk stadieinddeling i hver tumor blev analyseret ved hjælp af UCSC Xena databasen. (B) Korrelation af TMEM200A ekspression i TCGA PANCAN-kohorten med patientens alder i hver tumor. (C) Korrelation af TMEM200A ekspression i TCGA PANCAN-kohorten med tumorpatologisk grad i hver tumor. (D) Korrelation af TMEM200A ekspression i TCGA PanCan-kohorten med overlevelsesstatus for patienter i hver tumor. (E) Korrelationsanalyse af TMEM200A ekspression med pan-cancer samlet overlevelse i forskellige kræftformer ved hjælp af Cox-regressionsmodellen. (F) Korrelation mellem TMEM200A ekspression og pan-cancer OS-prognose i TCGA PanCan-kohorten. G) Korrelation mellem TMEM200A ekspression og sygdomsspecifik overlevelse. (H) Korrelation mellem TMEM200A ekspression og progressionsfri intervalprognose i TCGA PanCan-kohorten. (I) Korrelation mellem TMEM200A ekspression og sygdomsfrit interval. (J) Der blev udført en multifaktoriel COX-regressionsanalyse på KIRC. (K) Der blev udført en multifaktoriel COX-regressionsanalyse på KIRP. Forkortelser: TCGA = Cancer Genome Atlas; KIRC: Nyre renal klar cellekarcinom; KIRP: Nyre renal papillærcellekarcinom; OS = Samlet overlevelse; DSS = Sygdomsspecifik overlevelse; PFI = progressionsfrit interval; DFI = Sygdomsfrit interval. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: DNA-methyleringsanalyse af TMEM200A i forskellige kræftformer. (A) Promotormethyleringsniveauer af TMEM200A blev undersøgt i flere kræfttyper ifølge SMART-databasen. B) Højere promotormethyleringsniveauer af TMEM200A i forskellige kræfttyper end i normalt væv blev undersøgt i overensstemmelse med UALCAN-databasen. (C) Ved hjælp af UALCAN-databasen blev det fastslået, at normale væv havde lavere promotormethyleringsniveauer på TMEM200A i flere kræfttyper. d) DNA-methyleringsniveauet for TMEM200A i BLCA, HNSC, LUAD og STAD ændrede sig med det patologiske stadium. Forkortelser: BLCA = blæreurothelial carcinom; HNSC = pladecellekarcinom i hoved og hals; LUAD = Lungeadenokarcinom; STAD= Adenokarcinom i maven. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: TMEM200A genmutationer i forskellige kræftformer. (A) Analyse af TMEM200A genmutationstyper i forskellige kræftformer ved hjælp af cBioPortal-databasen. B) 3D-proteinstruktur af TMEM200A. Bindingsområdet er angivet med den farvede del, mens de andre sektioner af TMEM200A vises med den grå del. C) Isoformer og fordeling af TMEM200A somatiske mutationer. X-akse, aminosyresteder; y-aksen, antal TMEM200A mutationer; grønne prikker, missense mutationer; og grå prikker, afkortede mutationer. D) Validering af isoformerne og fordeling af TMEM200A somatiske mutationer ved hjælp af data i Sangerbox 3.0. (E) For alle TCGA-tumorer blev sammenhængen mellem mutationsstatus og patienternes samlede overlevelsesforudsigelse undersøgt ved hjælp af cBioPortal-databasen med røde firkanter, der angiver den TMEM200A mutationsgruppe og blå firkanter, der angiver den umuterede gruppe. (F) Gener sammuteret med TMEM200A blev analyseret ved hjælp af cBioPortal-værktøjet: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 og SLC18B1. (G) Analyse af TMEM200A mutationstyper i GC ved hjælp af COSMIC-databasen. (H) En analyse af TMEM200A SNV-typer i GC blev udført ved hjælp af COSMIC-databasen. Forkortelser: TCGA = Cancer Genome Atlas; OS = Samlet overlevelse; COSMIC = katalog over somatiske mutationer i kræftceller; GC = Gastrisk kræft. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Enkeltcellekorrelationsanalyse af TMEM200A ekspression i forskellige kræftformer. (A) Resumé af udtrykket af TMEM200A på TISCH's websted. (B) Fordeling af otte forskellige celletyper i det metastatiske kutane melanom GSE72056 datasæt. C) Ekspressionsniveauer af TMEM200A i kutane metastatiske melanomceller fra GSE72056 datasæt. (D) Fordeling af 13 forskellige celletyper i kolorektal cancer-datasættet fra GSE146771. E) TMEM200A ekspressionsniveauer i kolorektal cancerceller fra GSE146771 datasættet. (F) Korrelation af TMEM200A ekspression med enkeltcelle funktionel status i flere tumorer blev demonstreret ved hjælp af CancerSEA databasen. (G) T-SNE kort, der illustrerer niveauerne af TMEM200A ekspression i individuelle tumorceller, herunder GBM, LUAD, CML, CRC, RB og UM. Forkortelser: GBM = glioblastom; LUAD = Lunge adenocarcinom; CML = kronisk granulocytisk leukæmi; CRC = kolorektal cancer; RB = Retinoblastom; UM = Uveal melanom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Co-ekspressionsnetværk og funktionel berigelsesanalyse af TMEM200A på genniveau. A) GGI-netværk af TMEM200A og dets samudtrykte gener. B) PPI-netværk. (C,D) TMEM200A og de co-udtrykte gener blev analyseret for GO- og KEGG-vejberigelse. Forkortelser: PPI = Protein-protein interaktion; GGI = Gen-gen interaktion; KEGG = Kyoto encyklopædi af gener og genomer; GO = Gen ontologi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Korrelation mellem ekspression af TMEM200A og immunceller, immunsuppressive midler, immunstimulerende stoffer og MHC-molekyler i forskellige kræftformer. (A) Sangerbox 3.0 varmekort, der viser sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og immuninfiltrerende celler. (B) Varmekort, der viser sammenhængen mellem immuninfiltrerende celler og TMEM200A ekspression i TISIDB-databasen. (C) Varmekort, der viser sammenhængen mellem immunsuppressive celler og TMEM200A ekspression i TISIDB-databasen. (D-F) Korrelation mellem TMEM200A ekspression og visse immunsuppressive midler i testikelkræft og uveal melanom. G) Varmekort, der viser korrelationen mellem immunstimulerende faktorer og TMEM200A ekspression i TISIDB-databasen. (H) Varmekort over korrelationen mellem TMEM200A ekspression og MHC-molekyler i TISIDB-databasen. (I-L) Korrelation mellem TMEM200A ekspression og nogle immunstimulerende faktorer og MHC-molekyler i blærens urotheliale karcinom, testikelkarcinom, adrenokortikalt karcinom og uvealt melanom. (M) Korrelation mellem pan-cancer immun undergrupper og TMEM200A ekspression. (N) Korrelation mellem pan-cancer molekylære undergrupper og TMEM200A ekspression. Forkortelser: MHC = Større histokompatibilitetskompleks. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Analyse af immunterapeutisk respons af TMEM200A i pancytopeni. (A) Korrelation af TMEM200A ekspression i forskellige kræftformer med TMB. (B) Korrelation mellem MSI i pancancer og TMEM200A ekspression. c) TMEM200A er potentiale som en biomarkør til forudsigelse af immun checkpoint blokaderespons. (D) Vægtet gennemsnit af TMEM200A's korrelation med ICB-overlevelsesresultat og logaritmisk foldændring (logFC) i CRISPR-screening blev brugt til at rangordne det. Forkortelser: TMB = Tumormutationsbyrde; ICB = immunkontrolpunktblokade; CRISPR = Grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: GSEA-berigelsesanalyse af TMEM200A i forskellige kræftformer. Top fem veje, hvor TMEM200A spillede en vigtig funktionel rolle i reguleringen af 32 kræftformer, blev identificeret ved GSEA-berigelsesanalyse. Det venstre panel viser resultaterne af GSEA-berigelsesanalyse for TMEM200A i ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ og SARC. Det højre panel viser resultaterne af GSEA-berigelsesanalyse for TMEM200A i SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS og UVM. Forkortelser: GSEA = Gene Set Enrichment Analysis; ACC = Adrenokortikalt karcinom; BLCA = blære urothelial carcinom; BRCA = Brystinvasivt karcinom; CESC = Cervikal pladecellekarcinom og endocervikalt adenokarcinom; CHOL = cholangiocarcinom; COAD = Colon adenocarcinom; ESCA = Esophageal carcinom; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = Hoved og hals pladecellekarcinom; KICH = nyrekromofob; KIRC = nyre renal klar cellekarcinom; KIRP = nyrepapillærcellekarcinom; LAML = akut myeloid leukæmi; LGG = hjerne lavere kvalitet gliom; LIHC = lever hepatocellulært karcinom; LUAD = Lunge adenocarcinom; LUSC = Lungepladecellekarcinom; MESO = Mesotheliom; OV = ovarie serøst cystadenocarcinom; PAAD = Pancreas adenocarcinom; PCPG = Fæokromocytom og paragangliom; PRAD = Prostata adenokarcinom; LÆS Endetarm adenocarcinom; SAC = Sarkom; SKCM = hud kutant melanom; STAD = Mave adenocarcinom; TGCT = testikulære kimcelletumorer; THCA = Skjoldbruskkirtlen carcinom; THYM = Thymom; UCEC = livmoderkorpus endometriecarcinom; UCS = livmodercarcinosarcoma; UVM = Uveal melanom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: TMEM200A i STAD. (A) Top 50 gener fundet med en negativ korrelation med TMEM200A ekspression i STAD af LinkedOmics-databasen. (B) Top 50 gener i STAD, der var positivt forbundet med TMEM200A. (C) TMEM200A er top fem positivt og fem negativt korrelerede gener i STAD. (D) Varmekort over DEG'er i STAD. (E-H) Undersøgelse af berigede GO- og KEGG-veje ved hjælp af de screenede DEG'er. Forkortelser: STAD = Mave adenocarcinom; DEG'er = differentiel ekspression af gener; KEGG = Kyoto encyklopædi af gener og genomer; GO = Gen ontologi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 12
Figur 12: Korrelation mellem de kliniske træk ved STAD og TMEM200A ekspressionsniveau. (A) Analyse af TMEM200A ekspressionsniveauer og STAD kliniske træk ved hjælp af logistisk regression. (B,C) Cox-analyse af STAD-skovområder for enkelte og flere variabler. (D) Kolonnelinjediagrammer, der forudsiger OS hos patienter med STAD baseret på køn, patologisk grad, alder, patologisk stadium og TMEM200A ekspression. E) Kalibreringsdiagrammer, der viser kalibreringen af søjlelinjediagrammodellen. Forkortelser: STAD = Mave adenokarcinom; OS=Samlet overlevelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 13
Figur 13: TMEM200A ekspression er opreguleret i STAD og fremmer spredning af gastriske kræftceller. (A) Påvisning af TMEM200A ekspression i gastriske kræftceller HGC-27 og gastrisk slimhindeepitelceller GES-1 ved western blotting. (B) Påvisning af TMEM200A ekspression i GC-celler HGC-27 og SGC-7901 og gastrisk slimhindeepitelceller GES-1 ved qRT-PCR. (C) Ekspressionseffektiviteten af TMEM200A blev stærkt reduceret i den TMEM200A knockdown-gruppe sammenlignet med ikke-knockdown-gruppen i GC-celler HGC-27, som demonstreret ved qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown hæmmede signifikant proliferation af GC-celler målt ved CCK8-assay. (E) Knockdown af TMEM200A hæmmede signifikant de relaterede proteiner i EMT og påvirkede phosphoryleringen af AKT i PI3K / AKT signalvejen. Forkortelse: GC = Gastrisk kræft; qRT-PCR: Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid; EMT = epitel-mesenkymal overgang; AKT=Proteinkinase B. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TMEM200A tilhører en familie af TMEM'er, der er afgørende for, at kræftceller kan sprede sig38. Det variable udtryk for TMEM200A i forskellige maligniteter har fået mindre opmærksomhed, og der mangler en grundig pancancerundersøgelse. Imidlertid fortsætter beviser med at akkumulere, hvilket viser, at TMEM-transmembranproteinfamilien kan være vigtig for at holde kræftceller ondartede gennem interaktioner med flere proteiner, for eksempel fremmer aktivering af TMEM16A Ca2+-aktiverede Cl-kanaler af ROCK1 / moesin BRCA-metastase39. Derfor fokuserede vores analyser i det aktuelle arbejde på at undersøge gennemførligheden af TMEM200A som terapeutisk kræftmål og tumordiagnostisk markør. Vi undersøgte især ekspressionsniveauerne for TMEM200A i 33 maligne tumorer ved hjælp af RNA-seq-data fra UCSC Xena-databasen, og resultaterne fra TIMER2.0-databasen validerede analyserne i UCSC Xena-databasen.

Derefter blev webværktøjet Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) og CancerSEA-databasen brugt til at analysere ekspressionsniveauerne for TMEM200A i forskellige typer monocytter. Sangerbox- og TISIDB-webstederne blev brugt til at hjælpe med at forstå, hvordan TMEM200A påvirker immuninfiltration. Vi identificerede også de signalveje, hvor TMEM200A spiller en nøglefunktion i hver kræftform ved GSEA-berigelsesanalyse for at forstå de vigtigste funktionelle roller TMEM200A i hver malignitet.

TMEM200A kan fungere som et vedhæftningsmolekyle til at kontrollere GC's immunsystem og fremme den invasive spredning af GC-celler. Derfor identificerede vi 483 differentielt udtrykte gener (DEG'er) forbundet med ekspressionsniveauet for TMEM200A gennem TCGA-databasen og analyserede GO- og KEGG-berigelsen af disse 483 DEG'er. Berigelsesresultaterne viste, at PI3K / AKT-vejen spiller en nøglerolle i kræftudvikling, og PI3K / AKT-vejen kan være en af de drivende faktorer for kræft.

Desuden udførte vi cellulære og molekylære tests efter at have lært mere om TMEM200A afgørende funktion i at drive kræftudvikling for at bekræfte sammenhængen mellem TMEM200A ekspression og STAD-celleaktivitet . Som forventet opdagede vi, at nedregulering af TMEM200A i STAD-celler i høj grad reducerede celleproliferation, og at kræftcellelinjer udtrykte TMEM200A på betydeligt større niveauer end normale cellelinjer. Ved at kæmme litteraturen relateret til transmembranproteinfamilien i de senere år fandt vi, at transmembranproteiner, som celleadhæsionsmolekyler37, har en regulerende rolle i EMT.

Ifølge resultaterne af berigelsesanalysen af TMEM200A-relaterede gener i GC fandt vi endvidere, at TMEM200A kan have en regulerende rolle i PI3K / AKT-signalvejen i GC. Western blotting-eksperimenter afslørede, at TMEM200A knockdown kunne reducere Vimentin-, N-cadherin- og Snai-proteiner og hæmme AKT-phosphorylering, hvilket tyder på, at TMEM200A regulerer tumormikromiljøet ved at påvirke EMT, og at PI3K / AKT-signalvejen kan være involveret i TMEM200A-medieret regulering af GC-udvikling. I de senere år har nogle undersøgelser vist, at EMT er hovedårsagen til kemoterapiresistens hos GC-patienter. Epitel-mesenkymal plasticitet (EMP) og tumormikromiljø er blevet beskrevet som begrænsende faktorer for effektiv behandling i mange kræfttyper40. Forekomsten af EMT kan få GC-celler til at miste deres karakteristiske egenskaber og vise egenskaberne ved mesenkymale celler41. Denne funktion reducerer ikke kun GC-patienters følsomhed over for kemoterapeutiske lægemidler, men forbedrer også GC-cellernes invasive og vandrende evne, hvilket fører til tumormetastase. Derfor hjælper vores undersøgelse af ovennævnte forskning og udvikling af centrale reguleringspunkter i EMT og udvikling af nye målrettede terapeutiske tilgange ved at udforske den specifikke virkningsmekanisme for TMEM200A , der påvirker EMT.

Brugen af bioinformatik til forskning er steget i de senere år, og til denne undersøgelse fik vi adgang til data fra flere internetdatabaser. Brugen af disse online databaser inden for bioinformatik har strømlinet og fremskyndet undersøgelsen af kræft, og de giver også forskere et overkommeligt middel til at validere deres resultater.

Bioinformatikteknikken har dog visse ulemper. Når vi bruger disse databaser til analyse, kan den samme undersøgelse give inkonsekvente eller endda modstridende fund i flere databaser, da mange online databaser indeholder data fra flere datasæt. Desuden opdateres mange databaser ikke i meget lang tid, og på grund af ophavsretlige vanskeligheder kan deres indhold aldrig udvides; Derfor er de analytiske resultater, som forskere får fra disse databaser, altid begrænsede. Derfor anvendte vi i denne forskning forskellige databaser til at undersøge resultaterne kollektivt for at overvinde disse begrænsninger og sikre, at resultaterne var korrekte. For at sikre, at de resultater, vi opnåede, ikke blev ændret væsentligt, gentog vi proceduren, når vi brugte forskellige databaser til analyse. Resultaterne af western blot-eksperimenter understøttede vores bioinformatikforudsigelse om, at TMEM200A kan kontrollere EMT i GC ved at regulere PI3K / AKT-signalvejen, hvilket derefter ville påvirke spredningen af GC-celler. Vi forudsagde virkningsmekanismen for TMEM200A ved hjælp af bioinformatik i forbindelse med relateret litteratur.

Sammenfattende demonstrerer dette arbejde, hvordan bioinformatikværktøjer kan lette eksperimentelt design betydeligt og bruges til at lave mange andre typer videnskabelige forskningsforudsigelser. Fremtidige kræftforskere vil sandsynligvis vedtage det primære paradigme med at kombinere eksperimentel validering med bioinformatikforudsigelse, og dette arbejde tjener som en god model for dette mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82160550).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Tags

TMEM200A Multiomics-analyse Pan-cancer biomarkør transmembranprotein immuninfiltration RNA-seq-data diagnostisk biomarkør prognostisk biomarkør gastrisk kræft (GC) In vitro-cellekulturer knockdown kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qPCR) Western blotting ondartet adfærd tumordannelse epitel-mesenkymal overgang (EMT) PI3K / AKT signalvej proliferation hæmning
Multiomics analyse af <em>TMEM200A</em> som en pan-cancer biomarkør
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter