Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

כאן מוצג פרוטוקול שבו משולבים כלים ביואינפורמטיים מרובים כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של TMEM200A בסרטן. בנוסף, אנו גם מאמתים באופן ניסיוני את תחזיות הביואינפורמטיקה.

Abstract

החלבון הטרנסממברנלי, TMEM200A, ידוע כקשור לסרטן אנושי ולחדירה חיסונית. כאן, הערכנו את הפונקציה של TMEM200A בסוגי סרטן נפוצים על ידי ניתוח מולטיומיקס והשתמשנו בתרביות תאי מבחנה של תאי קיבה כדי לאמת את התוצאות. ביטוי TMEM200A במספר סוגי סרטן בבני אדם הוערך באמצעות נתוני RNA-seq ממסד הנתונים UCSC Xena. ניתוח ביואינפורמטי גילה תפקיד פוטנציאלי של TMEM200A כסמן ביולוגי אבחוני ופרוגנוסטי.

תרביות של קווי תאי קיבה וסרטן תקינים גדלו TMEM200A הופל. רמות הביטוי של TMEM200A נמדדו באמצעות תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז וכתמים מערביים. לאחר מכן נעשה שימוש במחקרי אובדן תפקוד במבחנה כדי לקבוע את תפקידי TMEM200A בהתנהגות הממאירה ובהיווצרות הגידול של תאי סרטן הקיבה (GC). כתמים מערביים שימשו להערכת ההשפעה של ההפלה על מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) ומסלול איתות PI3K/AKT ב- GC. ניתוח ביואינפורמטי הראה כי TMEM200A באה לידי ביטוי ברמות גבוהות ב- GC.

התפשטות תאי GC עוכבה על ידי TMEM200A knockdown, אשר גם הפחיתה וימנטין, N-cadherin, וחלבוני Snai, ועיכבה זרחן AKT. נראה כי מסלול האיתות PI3K/AKT מעורב גם ברגולציה בתיווך TMEM200A של פיתוח GC. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך TMEM200A מסדיר את המיקרו-סביבה של הגידול על ידי השפעה על החובש. TMEM200A עשוי להשפיע גם על EMT באמצעות איתות PI3K/AKT, ובכך להשפיע על המיקרו-סביבה של הגידול. לכן, בפאן סרטן, במיוחד GC, TMEM200A עשוי להיות סמן ביולוגי פוטנציאלי אונקוגן.

Introduction

מחלת הסרטן התגלתה כבעיה מתמשכת בתחום בריאות הציבור המסכנת את בריאות האדם בעולם1בשל שיעורי התחלואה והתמותה הגבוהים ברחבי העולם, ומהווה נטל כלכלי ורפואי כבד על החברה2. התקדמות משמעותית בטיפול בסרטן הושגה בשנים האחרונות הודות לגילוי סמני סרטן3, וחוקרים פיתחו שיטות אבחון חדשניות ותרופות חדשות לטיפול בסרטן. עם זאת, לחלק מהחולים עם סרטן עדיין יש פרוגנוזות גרועות בגלל גורמים כגון עמידות לתרופות, תופעות לוואי של תרופות ורגישות כימית4. לכן, יש צורך דחוף בזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים לבדיקות סקר וטיפול בסרטן בשלב מוקדם5.

חלבוני ממברנה הם חלבונים שיכולים להיקשר ולהשתלב בתאים ובקרומי אברונים6. ניתן לקבץ אותם לשלוש קטגוריות בהתאם לחוזק הקשירה לממברנה ומיקומם: חלבונים מעוגני שומנים, חלבונים אינטגרליים וחלבוני קרום היקפי 7,8. חלבון טרנסממברנה (TMEM) הוא חלבון קרום אינטגרלי המורכב לפחות מקטע טרנסממברנהאחד 9, העובר באופן מלא או חלקי דרך הממברנה הביולוגית.

למרות שמנגנוני הפעולה של חלבונים השייכים למשפחת TMEM אינם מובנים היטב, חלבונים אלה ידועים כמעורבים במספר סוגים של סרטן10. מספר חלבוני TMEM קשורים לפנוטיפים נודדים, מתרבים ופולשניים, והביטוי שלהם קשור לעתים קרובות לפרוגנוזה של המטופל11. לכן, בני משפחת TMEM הפכו למטרה למחקר. סקירה מקיפה של דיווחים קיימים על TMEM גילתה כי הם קשורים בעיקר לאיתות בין-תאיותוך-תאי 12, מחלות הקשורות למערכת החיסון וגידולים10. ל-TMEMs רבים יש גם פונקציות פיזיולוגיות חשובות, לדוגמה, תעלות יונים בקרום הפלזמה, הפעלת מסלולי העברת אותות, כמו גם תיווך של כימוטקסיס של תאים, הידבקות, אפופטוזיס ואוטופגיה10. לכן, שיערנו כי חלבוני TMEM עשויים להיות סמנים פרוגנוסטיים חשובים בגילוי וטיפול בגידולים.

ביטוי TMEM200A מוגבר באופן משמעותי בסרטן קיבה (GC). ביטוי גבוה יותר של TMEM200A13, שיש לו שמונה אקסונים ואורך מלא של 77.536 קילו-בתים בכרומוזום 6q23.1, נקשר לפרוגנוזה גרועה להישרדות כוללת (OS) במקרים של GC. עם זאת, השינויים בביטויו כמעט ולא דווחו במחקרים אונקולוגיים. מאמר זה משווה ומנתח את התועלת של TMEM200A כמטרה טיפולית וכסמן אבחוני גידול במחקרי סרטן שונים באמצעות מערכי נתונים שונים הזמינים לציבור. הערכנו את היעילות של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן סרטני אבחוני ופרוגנוסטי וכן את רמות הביטוי שלו בסוגי סרטן שונים בבני אדם באמצעות נתוני RNA-seq ממסדי הנתונים UCSC Xena ו-TCGA, כמו גם על ידי תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qRT-PCR) וכתמים מערביים.

ההשפעה של רמות ביטוי TMEM200A על שיעורי מוטציות, תהליכי ויסות, אבחון ופרוגנוזה של גידולים, חדירה חיסונית ואימונותרפיה נחקרה עוד יותר באמצעות שילוב של כלים חישוביים ואתרי מערכי נתונים. CBioPortal וקטלוג המוטציות הסומטיות בתאי סרטן (COSMIC) שימשו לבחינת מוטציות בשנת TMEM200A. אתרי האינטרנט Sangerbox ו-TISIDB שימשו כדי להבין כיצד TMEM200A משפיע על חדירה חיסונית. הכלי המקוון TISCH (Tumor Immune Single Cell Center) ומסד הנתונים CancerSEA שימשו לחקר תפקודו של TMEM200A. לבסוף, כדי להעריך את ההשפעה של TMEM200A על ההתנהגות הממאירה ותפקוד התפתחות הגידול של תאי GC, נערך ניסוי אובדן תפקוד במבחנה . בנוסף, בוצעה כתם מערבי כדי להעריך כיצד הפלה TMEM200A השפיעה על מסלול האיתות PI3K/AKT ועל המעבר האפיתל-מזנכימלי (EMT) ב- GC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מאגר המידע של אטלס גנום הסרטן (TCGA)

הערה: מסד הנתונים אטלס גנום הסרטן (TCGA) מכיל את נתוני הריצוף של גנים ברקמות גידול שונות14. נתוני RNA-seq ב- TCGA לחקר פורמטים של TMEM200A תעתיקים לחלק למיליון (TPM) חולצו מאתר UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) ו- log2 שהומר להשוואת ביטויים בין דגימות.

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UCSC Xena .
  2. לחץ על הכרטיסייה Launch Xena .
  3. לחץ על הכרטיסייה ערכות נתונים בחלק העליון של המסך.
  4. מתוך 129 קבוצות ו-1,571 מערכי נתונים בדף זה, לחץ על הכרטיסייה עבור סך של 33 סוגי סרטן כגון GDC TCGA לוקמיה מיאלואידית חריפה (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) ועוד.
  5. מתפריט RNAseq של ביטוי גנים , בחר ולחץ על הכרטיסייה HTSeq - FPKM GDC Hub .
    הערה: HTSeq - FPKM GDC Hub מייצג נתונים שתוקנו בהסכמה.
  6. מתפריט ההורדה , לחץ על הקישור המתאים שלו.
    הערה: בשיטה הנ"ל, נתוני RNA-Seq הורדו עבור 33 סוגי סרטן שונים.
  7. לפרוק את ארכיון zip של נתוני RNA-seq עבור 33 סוגי סרטן שונים בקובץ יחיד בתיקיית שולחן העבודה של המחשב.
  8. אחד את קובצי txt הלא דחוסים באותה תיקייה ומקם את סקריפטי Perl בתיקייה זו.
  9. פתח את תוכנת Perl, העתק והדבק את נתיב התיקיה לתוכנת Perl שבה ממוקם סמן העכבר, הקש על מקש Enter, הזן את שם קוד Perl ואת שם הגן (TMEM200A) ולאחר מכן הקש על מקש Enter כדי לקבל קובץ txt חדש(singleGeneExp.txt).
    הערה: קובץ txt חדש זה (singleGeneExp.txt) מכיל ביטוי גנים של TMEM200A ב-33 סוגי סרטן בחולים שונים.
  10. פתח את קוד R (diffR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ singleGeneExp.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  11. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שהשתנה (diffR) וצייר את התמונה באמצעות חבילת "ggpubr".

2. מסד הנתונים TIMER2.0

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של מסד הנתונים TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 16.
  2. לחץ על הכרטיסיה חקר הסרטן.
  3. הזן את מזהה הגן (TMEM200A) בתיבת החיפוש ולחץ על הכרטיסיה שלח כדי לקבל את תמונות הביטוי הדיפרנציאלי של TMEM200A בסוגים שונים של גידולים.

3. אטלס חלבונים אנושי (HPA)

  1. עבור אל אטלס החלבונים האנושי (HPA) (www.proteinatlas.org ) 17ממשק אינטרנט.
  2. הקלד מזהה (TMEM200A) בתיבת החיפוש ולחץ על לחצן חיפוש . בחר TISSUE sub-atlas.
  3. רחף מעל הדף וגלול מטה כדי למצוא את הכרטיסיה סקירה כללית של ביטוי חלבון .
    הערה: המקטע סקירה כללית של ביטוי חלבונים מציג את רמות ביטוי החלבון של TMEM200A ב-45 איברים בגוף האדם.

4. מערך פלטפורמת מתילציית DNA של HumanMethylation450 Illumina Infinium

הערה: מערך פלטפורמת מתילציית DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium שימש לאיסוף נתונים על מתילציה. אנו יכולים להעריך את רמות המתילציה של TMEM200A דנ"א באמצעות מסד הנתונים SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. עבור אל ממשק אתר SMART .
  2. הזן את מזהה הגן (TMEM200A) בתיבת החיפוש כדי לקבל את התפלגות TMEM200A בכרומוזומים ואת רמת המתילציה של TMEM200A בסוגים שונים של ממאירויות.
  3. גלול מטה בדף לתפריט לחץ כדי לבדוק מתילציה מצטברת של CpG ולחץ על עלילה לחצן. בתחתית הדף, מצא ולחץ על כפתור הורד איור . הורד את האיור.

5. מסד הנתונים של UALCAN

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UALCAN .
    הערה: תרשימי קופסאות של רמות המתילציה של מקדם TMEM200A בממאירויות שונות נוצרו באמצעות מסד הנתונים של UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. בחלק העליון של הדף, לחץ על כפתור TCGA .
  3. הזן TMEM200A בתיבת הקלט Gene ID על המסך. בתפריט ערכת הנתונים של TCGA , גלול מטה ובחר את סוג הסרטן שיש לבצע שאילתה.
  4. לאחר לחיצה על כפתור Explore , לחץ על ניתוח תת הקבוצה שלה מתילציה בתפריט קישורים לניתוח כדי לקבל את תוצאות המתילציה של גידול זה.
    הערה: בשיטה זו השגנו תוצאות מתילציה עבור 22 גידולים במסד הנתונים של UALCAN .

6. קטלוג מוטציות סומטיות בתאים סרטניים (מאגר מידע קוסמי)

  1. עבור לממשק האתר קטלוג מוטציות סומטיות בתאים סרטניים (קוסמי).
    הערה: נתונים על קידוד מוטציות, סידורים גנומיים מוטנטיים לא מקודדים וגני היתוך בגנום האנושי זמינים בקטלוג של מוטציות סומטיות בתאי סרטן (COSMIC) מסד נתונים20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), המשמש גם לקביעת התדירות של מוטציות TMEM200A שונות בסוגי סרטן שונים.
  2. הזן את מזהה הגן (TMEM200A) בתיבת החיפוש ולחץ על לחצן חיפוש כדי לעבור למסך חדש.
  3. בתפריט גנים , אתר ולחץ על הקישור שבו מופיע שם מזהה הגן של TMEM200A .
  4. מצא את עמודת קיבוץ הפצת המוטציות בדף החדש כדי לקבל את מצב המוטציה של TMEM200A בגידול.

7. CBioPortal

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של CBioPortal .
    הערה: ניתן למצוא, להוריד, לנתח ולהמחיש נתונים גנומיים של סרטן באמצעות מסד הנתונים cBioPortal (www.cioportal.org). מוטציות סומטיות, שינויים במספר העתקי DNA (CNAs), ביטוי mRNA ומיקרו-רנ"א (miRNA), מתילציה של DNA, שפע חלבונים ושפע פוספופרוטאין הם רק חלק מסוגי הנתונים הגנומיים המשולבים על ידי cBioPortal21. עם cBioPortal, ניתן לבצע מגוון רחב של מחקרים; עם זאת, הדגש העיקרי הוא על ניתוחים שונים הקשורים מוטציות ויזואליזציה שלהם.
  2. בחר את ערכת הנתונים Pan-cancer Analysis of whole genomes מתוך תת-הסעיף PanCancer Studies בסעיף Select Studies for Visualization & Analysis (בחר מחקרים להדמיה וניתוח ). לאחר מכן, לחץ על לחצן שאילתה לפי גן .
  3. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח שאילתה .
  4. לחץ על סוג סרטן מפורט כפתור בחלק העליון של הדף כדי לקבל את המוטציות של TMEM200A בסוגים שונים של סרטן.

8. כלי Sangerbox 3.0

  1. עבור אל ממשק הכלי Sangerbox 3.0 .
    הערה: המתאם של ביטוי TMEM200A עם תאים חודרים למערכת החיסון, חומרים מדכאי חיסון, גורמים אימונוסטימולטוריים ומולקולות MHC (קומפלקס היסטותאימות עיקרי) בכל סוגי הסרטן נותח על ידי חדירת מערכת החיסון CIBERSORT באמצעות נתוני חדירת החיסון הפאן-סרטנית בכלי Sangerbox 3.022 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. מסרגל הכלים בצד שמאל של הדף, בחר ולחץ על הכרטיסייה ניתוח אימונותאי (CIBERSORT) מתפריט ניתוח פאן-סרטן .
  3. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח .

9. מסד נתונים TISIDB

  1. עבור אל ממשק אתר TISIDB .
    הערה: מסד הנתונים TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) שימש לבחינת המתאם של ביטוי TMEM200A עם תאים חודרים למערכת החיסון, חומרים מדכאי חיסון, גורמים אימונוסטימולטוריים ומולקולות MHC בסוגי סרטן שונים.
  2. הזן את סמל גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח .
  3. לחץ על הסעיפים לימפוציטים, אימונומודולטורים, כימוקינים ותת-סוג בראש הדף. הורד את התמונות הרלוונטיות בתחתית העמוד.

10. מסד הנתונים של TIDE

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של TIDE .
    הערה: מסד הנתונים TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) שימש להערכת הפוטנציאל של TMEM200A כסמן ביולוגי לחיזוי תגובה לטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות של גידול.
  2. הזן את כתובת הדוא"ל במסך הראשוני כדי לרשום את החשבון ולהיכנס.
  3. מצא את תת-הסעיף הערכת סמן ביולוגי בראש הדף ולחץ עליו.
  4. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה עבור הזן גנים בתחתית הדף. לאחר מכן, לחץ על שלח לחצן.
  5. בדף, גרור את העכבר כדי להחליק את הדף כלפי מטה כדי למצוא את תוצאות הניתוח.

11. מאגר המידע של CancerSEA

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של CancerSEA .
    הערה: באמצעות נתוני ריצוף של תא בודד נחקרו הקשרים בין ביטוי TMEM200A לבין המצב התפקודי של תאי גידול שונים. זה נעשה באמצעות מסד הנתונים CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. בחלק העליון של הדף, מצא ולחץ על הכרטיסייה חיפוש .
  3. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח .

12. כלי הרשת TISCH (ראשי תיבות של Tumor Immune One-Cell Center)

  1. עבור אל ממשק כלי הרשת TISCH (ראשי תיבות של tumor immune single-cell center).
    הערה: המתאם בין רמות הביטוי של תאי TMEM200A לתאים סרטניים הודגם גם על ידי שימוש בכלי הרשת TISCH (Immune Single Cell Center)25.
  2. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן חקור .
  3. בתפריט סוג סרטן בדף זה, בחר ולחץ על ערכת הנתונים של כל סוגי הסרטן . לאחר מכן, גלול מטה בדף ולחץ על לחצן חיפוש .

13. GeneMANIA

  1. עבור אל ממשק אתר GeneMANIA .
    הערה: המתאם בין TMEM200A לבין הגנים הרלוונטיים מבחינה תפקודית שלו נחזה באמצעות אסטרטגיית האינטגרציה עבור רשת מרובת אסוציאציות גנים אתר GeneMANIA (www.genemania.org)26 לבניית רשתות אינטראקציה בין גנים (GGI).
  2. בתיבת החיפוש בפינה הימנית העליונה של הדף, הזן את מזהה הגן (TMEM200A) ולחץ על כלי חיפוש.
    הערה: כלי האינטרנט GeneMANIA שימש למציאת 20 גנים הקשורים TMEM200A.

14. ניתוח העשרה תפקודית

  1. שמור את מזהי הסמלים של הגנים לניתוח להעשרה בתבנית קובץ txt.
  2. פתח את קוד R (symbolidR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ txt לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  3. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (symbolidR). המר את מזהי הסמלים של גנים אלה ל- entrezIDs באמצעות "org. חבילת Hs.eg.db אינץ'. קבל את קובץ id.txt .
  4. פתח את קוד R (GOR ו- KEGGR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ id.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  5. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (GOR ו- KEGGR). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, נתח גנים אלה להעשרת GO ו- KEGG על ידי החבילות "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db", ו "enrichplot" ו plot את תוצאות העשרה באמצעות החבילה "gglot2".

15. ניתוח ההבדלים בפעילות הגנים

הערה: ניקוד TMEM200A בכל דגימת סרטן חושב באמצעות ssGSEA (Single sample gene set enrichment analysis)27, וניתוח דיפרנציאלי של פעילות גנים TMEM200A ברקמות סרטניות ובריאות בוצע עבור סוגי סרטן שונים.

  1. בהתבסס על נתוני RNA-seq של 33 סוגי גידולים שהורדו בשלב 1.7, פתח את כל הקבצים שהורדו ומקם אותם בתיקיה מאוחדת.
  2. מקם את קובץ merge.txt בתיקייה לעיל.
    הערה: הנתונים בקובץ merge.txt מ- BioWolf (www.biowolf.cn) מכילים ביטוי גנים לכל החולים בכל הגידולים במסד הנתונים אטלס גנום הסרטן (TCGA).
  3. פתח את קוד R (ssGSEAR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  4. קח את השורה שבה geneName נמצא בקוד R (ssGSEAR) והזן את מזהה הגן (TMEM200A).
  5. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (ssGSEAR). קבל את קובץ הניקוד עבור פעילות גנים: scores.txt.
    הערה: בעזרת אלגוריתם ssGSEA אנו בונים תחילה קובץ קבוצת גנים המבוסס על מקדמי המתאם בין גנים בהתאם לנתונים המסופקים בקובץ merge.txt ומזהים את הגנים בעלי מתאם גבוה יותר עם גן המטרה (TMEM200A) מהקובץ. לאחר מכן, הגנים בעלי המתאם הגבוה יותר מאוחדים כגנים הפעילים של TMEM200A, ולבסוף, אנו מקבלים את הניקוד של גנים פעילים בכל דגימה.
  6. פתח את קוד R (scoreDiffR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ scores.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  7. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שהשתנה (scoreDiffR) וצייר את התמונה באמצעות חבילות "plyr", "reshape2" ו- "ggpubr".

16. מתאם קליני וניתוח פרוגנוזה הישרדותית

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UCSC Xena .
  2. לחץ על הכרטיסיה הפעל את זנה .
  3. לחץ על הכרטיסייה ערכות נתונים בחלק העליון של המסך.
  4. רחף מעל הדף וגלול מטה כדי למצוא את הכרטיסיה TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. מתוך 129 קבוצות עוקבות ו- 1,571 ערכות נתונים בדף זה, לחץ על הכרטיסייה TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. מתפריט הפנוטיפ , בחר ולחץ על הכרטיסייה נתונים קליניים אוצרים.
  7. מתפריט ההורדה , לחץ על הקישור המתאים שלו.
    הערה: הורד נתונים קליניים עבור 33 סוגי סרטן ממסד הנתונים של TCGA בקישור לעיל.
  8. חלץ את קובץ הנתונים הקליניים שהורדת ופתח את הקובץ הלא דחוס בתבנית הקובץ xls.
  9. ארגן ושמור את הנתונים הקליניים הדרושים (שלב, גיל, שלב פתולוגי וסטטוס מטופל) בקובץ, מחק את הנתונים הקליניים הנותרים שאינם נחוצים ושמור את הקובץ כולו כקובץ בפורמט txt לאחר שינוי שמו לקליני.
  10. בהתבסס על singleGeneExp.txt שהושג בשלב 1.9, מקם קובץ זה באותה תיקיה שבה נמצא קובץ clinical.txt המאורגן.
  11. חלץ את דחיסת הנתונים הקליניים שהורדו ומקם את קבצי singleGeneExp.txt ו- clinical.txt באותה תיקיה שבה נמצאים הקבצים הקליניים הלא דחוסים.
  12. פתח את קוד R (clinicalDiffR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  13. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שונה (clinicalDiffR), וצייר את התמונה באמצעות חבילת "ggpubr".
  14. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UCSC Xena .
  15. לחץ על הכרטיסיה הפעל את זנה .
  16. לחץ על הכרטיסייה ערכות נתונים בחלק העליון של המסך.
  17. מתוך 129 קבוצות ו-1,571 מערכי נתונים בדף זה, לחץ על הכרטיסייה עבור סך של 33 סוגי סרטן כגון GDC TCGA לוקמיה מיאלואידית חריפה (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) ועוד.
  18. מתפריט הפנוטיפ , בחר ולחץ על הכרטיסייה נתוני הישרדות.
  19. מתפריט ההורדה , לחץ על הקישור המתאים שלו.
  20. פרוק את ארכיון ה- zip של נתוני הישרדות עבור 33 סוגי סרטן שונים בקובץ יחיד בתיקיית שולחן העבודה של המחשב.
  21. מקם את נתוני ההישרדות הלא דחוסים באותה תיקיה שבה נמצא קובץ singleGeneExp.txt שהתקבל בשלב 1.9.
  22. פתח את קוד R (preOSR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  23. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (preOSR). חשב באמצעות חבילת "לימה" כדי לקבל קובץ נתונים על הישרדות TMEM200A בסרטן פאן: expTime.txt.
  24. פתח את קוד R (OSR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ expTime.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  25. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R (OSR) שהשתנה. בצע ניתוח KM באמצעות חבילות "הישרדות" ו- "survminer" בהתבסס על הנתונים בקובץ expTime.txt והתווה את עקומות ההישרדות עבור TMEM200A בסרטן פאן.

17. ניתוחי רגרסיה חד-משתניים ורב-משתנים של קוקס עם בניית חלקות יער

  1. פתח את קוד R (COXR) והעתק והדבק את הנתיב שבו קיבלנו את קובץ expTime.txt מ 16.23 ממוקם לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  2. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (COXR). בהתבסס על הנתונים בקובץ expTime.txt , בצע ניתוחי רגרסיה COX חד-משתניים באמצעות חבילות "הישרדות", "survminer" ו- "forestplot" כדי לשרטט חלקת יער חד-משתנית של TMEM200A בסוגי סרטן שונים.
  3. מקם את קובץ expTime.txt משלב 16.23 ואת קובץ clinical.txt משלב 16.10 באותה תיקיה.
  4. פתח את קוד R (multicoxR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה המכילה את קובץ expTime.txt משלב 16.23 וקובץ clinical.txt משלב 16.10 לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  5. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (multicoxR). בצע ניתוח רגרסיה COX רב-משתני באמצעות חבילות "הישרדות" ו"survminer" כדי לשרטט חלקת יער רב-משתנית של TMEM200A בסוגי סרטן שונים בהתבסס על הנתונים בקבצי expTime.txt ו- clinical.txt .

18. מודל פרוגנוסטי של סרטן קיבה המבוסס על ביטוי TMEM200A ומאפיינים קליניים

  1. מקם את קובץ clinical.txt משלב 16.10 ואת קובץ expTime.txt משלב 16.23 באותה תיקיה.
  2. פתח את קוד R (NomoR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ txt לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  3. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (NomoR). השתמש בחבילות התוכנה "הישרדות", "regplot" ו- "rms" עבור נתוני ביטוי TMEM200A ב- GC ונתונים קליניים כדי לבנות מודל פרוגנוסטי לחיזוי הישרדות המטופל.

19. תרבית תאים והעברת siRNA של TMEM200A

הערה: תאי STAD HGC-27 אנושיים, תאי SGC-7901 ותאי אפיתל רירית קיבה אנושית GES-1 הושגו באופן מסחרי (ראה טבלת החומרים), קמו לתחייה, חוסנו במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 מדיום שלם (המכיל 10% נסיוב בקר עוברי בילוד ותערובת פניצילין 1%), וגודלו בתרבית ב 37 ° C ב 5% CO2 אינקובטור תרביות תאים. מדיום התרבות הוחלף כל 2-3 ימים. התאים במצב גדילה טוב חוסנו בלוחות של שש בארות לפי (2-3) × 105 תאים לכל באר.

  1. ראשית, קח שלושה צינורות מיקרוצנטריפוגות והוסף 8 μL של מגיב transfection (ראה Tמסוגל של חומרים) ו 200 μL של תווך בסיסי לכל צינור. לאחר מכן, הוסף 4 מיקרוגרם של SiRNA1, SiRNA2 ו - SiRNA3 לכל צינור בהתאמה.
    הערה: עבור הפלת TMEM200A , siRNA תוכנן ונרכש (ראה טבלת חומרים).
  2. מערבבים היטב את התערובת בשלושת צינורות המיקרוצנטריפוגות ומוסיפים לכל אחת משלוש הבארות של צלחת 6 הקידוחים. נערו בעדינות את צלחת 6 הבארות כדי לפזר את התערובת באופן שווה. תייגו את שלוש הבארות שבהן נוספה התערובת כ-SiRNA-1, SiRNA-2 ו-SiRNA-3.
  3. כאשר התאים מודגרים במשך 4-6 שעות, יש להחליף מחצית מהתווך בשלוש בארות המשנה בלוח 6 הקידוחים.
    הערה: בעת החלפת מחצית המדיום השלם, יש לשאוף מחצית מהמדיום המלא המקורי ולחדש עם מחצית מהמדיום השלם הטרי.
  4. עשרים וארבע עד 48 שעות מאוחר יותר, השתמשו TMEM200A תאים נגועים ב-siRNA כקבוצת הניסוי ובתאים לא נגועים כקבוצת הביקורת השלילית. בצע תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qRT-PCR, ראה סעיף 20) כדי להעריך את השפעת הטרנספקציה על התאים.

20. תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז

  1. השליכו את מדיום תרבית התאים בכל תת-קבוצה ושטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
  2. בודדו את סך כל הרנ"א באמצעות ערכת בידוד RNA (ראו טבלת חומרים).
  3. להעריך את ריכוז הרנ"א ולסנתז cDNA עם 1 מיקרוגרם RNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA, בהתאם להוראות היצרן.
  4. בצע PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) על דילולים פי 10 של cDNA בתערובת תגובה של 10 μL, כולל פריימרים ספציפיים לבני אדם קדימה ואחורה עבור GAPDH (לתקינה), TMEM200A (ראה טבלת חומרים) ו- qPCR Master Mix, באמצעות מערכת בדיקת PCR בזמן אמת.
    הערה: בצע כל ניסוי בשלשה.
  5. השתמש בתנאי התגובה הבאים של qPCR: אתחול, 95 °C למשך 3 דקות; דנטורציה, 95 °C עבור 10 שניות; חישול, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; והארכה, 80 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; חזור על הדנטורציה, החישול וההרחבה 40x. לקבוע את הביטוי היחסי של כל גן באמצעות טכניקת 2-ΔΔCt 28.
  6. חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג טריפליקטים ביולוגיים.

21. זיהוי כתם מערבי של ביטוי חלבוני רלוונטי

  1. השליכו את מדיום תרבית התאים בכל תת-קבוצה ושטפו בעדינות את התאים עם 2 x 1 מ"ל של PBS.
  2. קררו את צלחות 6 הבארות המכילות את התאים על קרח והוסיפו 150 מיקרוליטר של חיץ ליזיס מסוג RIPA (150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 וקוקטייל מעכב פרוטאז טרי שנוסף). הניחו לליזיס להמשיך על קרח במשך 10 דקות.
  3. באמצעות מגרד תאי פלסטיק, מוציאים תאים נצמדים מהצלחת ומעבירים בעדינות את תמיסת התא לצינור מיקרוצנטריפוגה שמקורר מראש.
  4. צנטריפוגה התא lysate במשך 10 דקות ב 1.5 × 104 גרם ב 4 °C. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  5. השתמש בערכת בדיקת חלבון BCA כדי לקבוע את תכולת החלבון בהתאם להוראות היצרן.
  6. טען 30 גרם חלבון מכל דגימה על ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל פוליאקרילאמיד 10% נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE) והפעל במתח של 80 וולט במשך 0.5 שעות ולאחר מכן 1.5 שעות ב- 120 וולט.
  7. מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) 45 מיקרומטר במתח של 300 mA למשך 1-1.5 שעות.
  8. לאחר הנחת קרום PVDF על שייקר וניעור במשך 3 x 5 דקות, הוסף מלח חוצץ Tris עם Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl ו- 0.1% Tween 20) למיכל המתאים כאשר צד החלבון (צד הג'ל) פונה כלפי מעלה.
  9. מניחים את הממברנה בחיץ החוסם (ראו טבלת חומרים) ודגרים עליה במשך 0.5 שעות בטמפרטורת החדר.
  10. שטפו את הממברנה עם TBST במשך 3 x 10 דקות.
  11. לדגור על הממברנה עם נוגדנים ראשוניים נגד פוספו-AKT (p-AKT; 1:1,000), סך AKT 1:1,000, E-cadherin (E-ca; 1:1,000), N-cadherin (N-ca; 1:1,000), Vimentin 1:1,000, חילזון 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH; 1:1,000), לילה ב-4°C.
  12. שטפו את הממברנה במשך 3X10 דקות ודגרו על הממברנה עם נוגדן משני של ארנב או עכבר (1:5,000) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  13. לדגור על קרום PVDF עם מצע ECL במשך 30 שניות ולזהות את האות באמצעות מערכת הדמיה.

22. בדיקת CCK-8

  1. זרע תאי STAD HGC-27 אנושיים במצב צמיחה טוב בצלחות 96 באר.
  2. כאשר צפיפות התא מגיעה ל 60-70%, להדביק את התאים עם siRNA TMEM200A (כמו בשלב 19.3).
  3. זרעו את התאים הנגועים בצלחות של 96 בארות בצפיפות תאים של 5 × 10 3/well (ספרו תאים בני קיימא באמצעות מונה תאים), מחולקים לקבוצות NC ו-TMEM200A siRNA (עם שלוש בארות משוכפלות בכל קבוצה), ומודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף מגיב CCK-8 לאחר 0, 24, 48, 72 ו 96 שעות ודגור ב 37 ° C במשך 2 שעות. מדוד את הספיגה (450 ננומטר) באמצעות תווית אנזימים רב-תכליתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביטוי TMEM200A בסוגי סרטן שונים
כפי שמודגם באיור 1, תחילה ניתחנו את רמות הביטוי הדיפרנציאליות של TMEM200A בסוגי סרטן שונים באמצעות מסדי נתונים שונים. ביטוי TMEM200A היה מוגבר בכולנגיוקרצינומה (CHOL), קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSC), קרצינומה של תאי כליות צלולים (KIRC), קרצינומה של תאי פפילרי של הכליה (KIRP), קרצינומה הפטוצלולרית (LIHC), STAD וקרצינומה של בלוטת התריס (THCA) בהשוואה לרקמות נורמליות סמוכות בהתבסס אך ורק על נתוני TCGA. עם זאת, ביטוי TMEM200A ירד בקרצינומה של דרכי השתן (BLCA), קרצינומה של תאי קשקש צוואריים ואדנוקרצינומה של צוואר הרחם (CESC), גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM), כרומופוב כליות (KICH), קרצינומה קשקשית ריאות (LUSC), פאוכרומוציטומה ופרגנגליומה (PCPG), אדנוקרצינומה רקטלית (READ) וקרצינומה של קורפוס הרחם (UCEC) (איור 2A). במסד הנתונים TIMER2.0, ביטוי TMEM200A גדל ב- CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC ו- STAD. יתר על כן, ביטוי TMEM200A עלה ב-BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, מלנומה עורית של העור (SKCM) ו-UCEC (איור 2B).

על ידי השוואת התוצאות של שני מסדי הנתונים, מצאנו כי הביטוי הפאן-סרטני של TMEM200A היה זהה בכל מסד נתונים. השגנו את נתוני המעקב הקליני וריצוף הרנ"א של 33 חולי סרטן ממסד הנתונים של TCGA, חישבנו TMEM200A ניקוד בכל דגימת סרטן באמצעות ניתוח ssGSEA, ולאחר מכן חישבנו TMEM200A פעילות גנים בגידולים וברקמות תקינות בגידולים רבים. גילינו TMEM200A התבטא מאוד בגליובלסטומה, HNSC, KIRC בכליות ו-THCA (איור 2C); לפיכך, הפעילות הגנטית של TMEM200A דורגה בכל רקמת גידול. נמצא שהפעילות הגנטית של TMEM200A הייתה הגבוהה ביותר ב-KIRC והנמוכה ביותר במלנומה של הענביה (UVM) (איור 2D). הערכה מאוחרת יותר של מסד הנתונים HPA של רמות ביטוי TMEM200A ברקמות אנושיות הראתה שרמות הביטוי TMEM200A היו נמוכות ברוב הרקמות הנורמליות, אך גבוהות בקליפת יותרת הכליה, פי הטבעת, רירית הרחם והשריר החלק (איור 2E).

בקווי תאי רקמה נורמליים, כמה קווי תאים כמו תאי גרנולוזה, תאים דו-קוטביים, תאי שרירי שלד, תאי סטרומה של רירית הרחם ותאי T הראו ביטוי גבוה של TMEM200A, בעוד שהביטוי TMEM200A היה נמוך ברוב קווי התאים האחרים (איור 2F). כמו כן, בחנו נתוני אימונוהיסטוכימיה (IHC) במסד הנתונים של HPA כדי לבחון את ביטוי TMEM200A ברמת החלבון. הנתונים לגבי כתמים ועוצמתם חשפו רמות ביטוי גבוהות ובולטות הרבה יותר של TMEM200A בסרטן המעי הגס והחלחולת (CRC), סרטן ריאות (LUAD), סרטן כבד (LIHC), סרטן השד (BRCA) וסרטן הערמונית (PRAD) בהשוואה לרקמות נורמליות (איור 2G). ממצאים אלה הצביעו על כך TMEM200A התבטא באופן נרחב בסוגי סרטן שונים והשפיע על התפתחות הסרטן באמצעות מנגנונים שונים בגידולים שונים.

קשר קלינופתולוגי ופרוגנוזה הישרדותית
עבור 33 ממאירויות בבני אדם, אספנו מידע ונתונים קליניים בקבוצת TCGA pan-cancer (PanCan) מאתר מסד הנתונים UCSC Xena וחקרנו את הקשר בין ביטוי TMEM200A ב- PanCan לבין גיל, כיתה פתולוגית, שלב קליניקופתולוגי ומצב הישרדות המטופל. מחקר זה גילה כי בשישה סוגי סרטן, ביטוי TMEM200A היה קשור לשלב הקליני-פתולוגי, כולל BLCA, קרצינומה פולשנית של השד (BRCA), קרצינומה של הוושט (ESCA), KIRP, SKCM וקרצינומה של האשכים (TGCT) (איור 3A). הגיל נמצא בקורלציה עם שישה גידולים, כולל BRCA פולשני, GBM, לוקמיה מיאלואידית חריפה (LAML), SKCM, קרצינומה תימית (THYM) וסרטן רירית הרחם (UCEC) (איור 3B). הדרגה הפתולוגית נקשרה לשישה גידולים, כולל קרצינומה של הוושט (ESCA), HNSC, KIRC, גליומה בדרגה נמוכה של המוח (LGG), אדנוקרצינומה של הלבלב (PAAD) וקרצינומה של רירית הרחם (UCEC) (איור 3C). מצב ההישרדות היה קשור לחמישה גידולים, כולל קרצינומה אדרנוקורטיקלית (ACC), BLCA, KIRC, PCPG ומלנומה של הענביה (UVM) (איור 3D).

ערכנו מחקרים עבור סוגי סרטן שונים במערכות הפעלה, DSS, PFI ו-DFI באמצעות ניתוח רגרסיה חד-כיווני של קוקס עם סף חציוני של הקבוצה כדי ללמוד עוד על המתאם בין ביטוי TMEM200A לבין פרוגנוזה. תוצאות ניתוח מערכת ההפעלה גילו כי מבין ארבעת הגידולים, ביטוי TMEM200A גבוה יותר השפיע יותר על הפרוגנוזה של מערכת ההפעלה בארבעה גידולים, כולל קרצינומה אדרנוקורטיקלית (ACC) (P = 0.037), BLCA (P = 0.036), לוקמיה מיאלואידית חריפה (LAML) (P = 0.011) ו- GC (STAD) (P = 0.005). לעומת זאת, לביטוי TMEM200A גבוה יותר הייתה פרוגנוזה טובה יותר עבור מערכת ההפעלה בחמישה גידולים, כולל KIRC (P < 0.001), KIRP (P = 0.020), גליומה בדרגה נמוכה של המוח (LGG) (P = 0.042), PCPG (P = 0.002) ומלנומה עורית (SKCM) (P = 0.043) (איור 3E,F). עבור DSS, ביטוי TMEM200A גבוה היה פרוגנוזה גרועה בשני סוגי גידולים, כולל קרצינומה אדרנוקורטיקלית (ACC) (P = 0.026) ו- BLCA (P = 0.015). ביטוי TMEM200A גבוה היה בעל פרוגנוזה טובה יותר בארבעה סוגי גידולים, כולל KIRC (P < 0.001), KIRP (P = 0.001), גליומה בדרגה נמוכה של המוח (LGG) (P = 0.025), ו- PCPG (P = 0.007) (איור 3G). בנוסף, עבור PFI, ביטוי TMEM200A גבוה יותר היה פרוגנוזה גרועה בשלושה סוגי גידולים, כולל קרצינומה אדרנוקורטיקלית (ACC) (P = 0.007), BLCA (P = 0.040) ומלנומה uveal (UVM) (P = 0.020). לביטוי TMEM200A גבוה יותר הייתה פרוגנוזה טובה יותר בשני סוגי גידולים, כולל KIRC (P < 0.001) וגליומה בדרגה נמוכה (LGG) (P = 0.044) במוח (איור 3H). ב-DFI, ביטוי גבוה יותר של TMEM200A היה בעל פרוגנוזה גרועה יותר בקרצינומה אדרנוקורטיקלית (ACC) (P = 0.044) (איור 3I).

לאחר מכן, בחרנו מספר גידולים (KIRC ו- KIRP) לניתוח רגרסיה multi-COX. התוצאות הראו כי TMEM200A יכולים להשפיע באופן אינדיבידואלי על שיעור ההישרדות של חולי סרטן בהשוואה לגורמים קליניים אחרים (איור 3J ו-K). תוצאות אלה הראו כי TMEM200A יכול לשמש סמן ביופרוגנוסטי עצמאי בסוגי סרטן שונים כדי להשפיע על הישרדותם של חולים עם סרטן.

ניתוח מתילציה של DNA
אחד השינויים האפיגנטיים שקיבל את תשומת הלב המרבית הוא מתילציה DNA29. הוצע כי סוג אחד של שינוי אפיגנטי, מתילציה של DNA, יש השפעה משמעותית על צמיחת הגידול30. לפיכך, באמצעות מסד הנתונים SMART, הערכנו את רמות המתילציה של TMEM200A בדנ"א ברקמות נורמליות וסרטניות. רקמות PAAD ו- PRAD היו רמות גבוהות יותר של מתילציה של DNA של TMEM200A מאשר רקמות נורמליות. אולם היו TMEM200A רמות מתילציה נמוכות יותר של דנ"א ברקמות COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA ו-UCEC מאשר ברקמות רגילות (איור 4A). רמות המתילציה של TMEM200A בדנ"א היו גבוהות משמעותית במסד הנתונים של TCGA ב-KIRP, PRAD, PCPG ו-THYM בהתבסס על מסד הנתונים של UALCAN (איור 4B), אך לא ב-BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA ו-UCEC. רמת המתילציה של TMEM200A ירדה באופן משמעותי ב-LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA ו-UCEC (איור 4C). כדי לחקור עוד יותר את הקשר בין רמת הביטוי של TMEM200A לבין מתילציה של דנ"א וגורמים קלינאופתולוגיים, השתמשנו שוב במסד הנתונים SMART ומצאנו שרמת המתילציה של TMEM200A בדנ"א ב-BLCA, HNSC, LUAD ו-STAD השתנתה עם השלב הפתולוגי (איור 4D). גורמים קליניים משפיעים על רמת מתילציה של DNA של TMEM200A בגידולים הנ"ל.

ניתוח מוטציות גנטיות
אחת הסיבות להתפתחות גידולים היא הצטברות מוטציות גנטיות31. לכן, תדירות המוטציות TMEM200A סומטיות נותחה על ידי הערכת שכיחות המוטציות TMEM200A בדגימות קליניות פאן-סרטניות באמצעות מסד הנתונים cBioPortal. TMEM200A עובר מוטציה בסוגי סרטן רבים, כגון סרטן ריאות, קרצינומה של רירית הרחם, מלנומה, סרטן הוושט, סרטן העצמות, סרטן צוואר הרחם, סרטן הכבד, לימפומה בוגרת של תאי B, BRCA, סרטן רירית הרחם, סרטן השחלות, גידול עוברי, סרטן הלבלב, סרטן הראש והצוואר, CRC, גליומה, סרטן ריאות של תאים לא קטנים, סרקומה של רקמות רכות וסרטן ראשוני לא ידוע (איור 5A). בנוסף, שינויים בדנ"א יכולים להוביל לשינויים מבניים או חומצות אמינו ברמת החלבון. איור 5B מראה את המבנה התלת-ממדי של TMEM200A. באמצעות מסד הנתונים cBioPortal מצאנו אתרי מוטציות בחומצות האמינו של TMEM200A; מוטציות בחוש מוטעה היו הצורה הנפוצה ביותר של מוטציות (איור 5C).

ניתחנו את הנתונים באמצעות Sangerbox 3.0 כדי לאמת את הדיוק של אתרי המוטציות והשגנו את אותן תוצאות כמו קודם. מוטציות מיססנס הן הצורה השכיחה ביותר של מוטציות ב-TMEM200A , והן עשויות להתרחש בתדירות של 7.8% ב-SKCM (איור 5D). מוטציה מוטעית היא מוטציה שבה קודון המקודד לחומצת אמינו אחת עובר החלפת בסיס והופך לקודון המקודד לחומצת אמינו אחרת, וכתוצאה מכך משתנה סוג חומצת האמינו והרצף של שרשרת הפוליפפטידים. התוצאה של מוטציה מוטעית היא בדרך כלל ששרשרת הפוליפפטיד מאבדת את תפקידה המקורי. הפרעות חלבוניות רבות נגרמות על ידי מוטציה מוטעית, שהיא סוג נפוץ של מוטציה סרטנית. נמצא כי מוטציות מוטעיות ממלאות תפקיד מפתח ביציבות החלבונים, ולנוכחות מוטציות יכולה להיות השפעה משמעותית על הזיקה הקושרת בין חלבונים32, ולשנות את יחסי הגומלין בין חלבונים לבין המקרומולקולות המתאמות הסובבות אותם33.

לפיכך, מוטציות שגויות משפיעות ככל הנראה על התפקוד הביולוגי של חלבון טרנסממברנה 200A בסוגי סרטן שונים. כמו כן נבדק הקשר בין מוטציה בגן TMEM200A לבין פרוגנוזת ההישרדות הקלינית של חולי סרטן. הסבירות למערכת ההפעלה עלתה בהשוואה לזו של הקבוצה שעברה מוטציה TMEM200A, אך לא בקבוצה נטולת המחלה (איור 5E). המחקר של מתאמי גנים גילה כי TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 ו-SLC18B1 היו בין הגנים שעברו מוטציה משותפת עם TMEM200A (איור 5F). הצלחנו לזהות כמה סוגי מוטציות ווריאציות של נוקלאוטידים בודדים (SNVs) באמצעות מסד הנתונים הקוסמי כדי ללמוד עוד על מוטציות TMEM200A ב-GC. התדירות של החלפות מוטעיות הייתה הגבוהה ביותר (38.86%) (איור 5G), ונתוני SNV הראו כי ה-SNV הנפוצים ביותר ב-STAD היו G>A (31.73%), ואחריו C>T (26.35%) ו-G>T (11.73%) (איור 5H).

אנליזה חד-תאית של TMEM200A בסרטן
ניתחנו TMEM200A רמות הביטוי בתאים בודדים שונים באמצעות אתר TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center). הכלי המקוון TISCH הציג את הביטוי של TMEM200A עבור 65 מערכי נתונים ו-28 סוגי תאים במפת החום המוצגת באיור 6A. הממצאים הראו כי TMEM200A התבטא בעיקר בתאי T CD8+ ופיברובלסטים. מערך הנתונים GSE72056, הכולל תאים מחולים עם מלנומה עורית גרורתית (SKCM), ראוי לציון בהקשר זה. TMEM200A התבטא באופן נרחב בתאי B, לימפוציטים מסוג CD4+ T, תאי T CD8+ מדולדלים, תאי אנדותל, פיברובלסטים וסוגי תאים אחרים במיקרו-סביבה SKCM (איור 6B,C). במערך הנתונים GSE146771, המכיל תאים מחולים עם CRC, TMEM200A התבטא באופן נרחב בתאי B, לימפוציטים מסוג CD4+ T, תאי T מסוג CD8+, תאי T CD8+ מדולדלים, תאי אנדותל, פיברובלסטים וסוגי תאים אחרים במיקרו-סביבה CRC (איור 6D,E). באמצעות שימוש במסד הנתונים CancerSEA נקבעו רמות הביטוי והמצב התפקודי של TMEM200A בתאי גידול ספציפיים (איור 6G). ביטוי TMEM200A נמצא בקורלציה חזקה עם המצב התפקודי התאי במגוון סוגי סרטן, כולל גליובלסטומה (GBM), אדנוקרצינומה של הריאות (LUAD), לוקמיה גרנולוציטית כרונית (CML), CRC, רטינובלסטומה (RB) ומלנומה של הענבל (UM). אנגיוגנזה, אפופטוזיס, התמיינות ודלקת היו כולם בקורלציה חיובית עם ביטוי TMEM200A ברוב תאי הגידול, בעוד שנזק לדנ"א, תיקון דנ"א, פלישה ומטבוליזם היו בקורלציה שלילית עם ביטוי TMEM200A (איור 6F).

ניתוח תפקודי והעשרה מסלולית של TMEM200A בסוגי סרטן שונים
בחנו את הקשר בין TMEM200A וחלבונים בעלי תפקודים דומים באמצעות רשת GGI כדי לחקור את תפקוד TMEM200A בסוגי סרטן שונים (איור 7A). מידע גנומי ופרוטאומי מנותח על ידי GeneMANIA באמצעות רשימת שאילתות של גני מטרה. על ידי איתור גנים הפועלים בדומה TMEM200A, התגלו 40 החלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם גן זה. המתאם בין הגנים האלה מוצג על-ידי רשת PPI (איור 7B). לאחר מכן, ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG של 20 גנים אלה הקשורים באופן הדוק ל-TMEM200A גילו כי גנים סמוכים אלה היו מעורבים בעיקר בוויסות השלילי של הרנ"א את השתקת הגנים. ניתוח KEGG גילה כי TMEM200A היה בשפע במסלולים, כולל מסלול איתות Wnt והזדקנות תאית (איור 7C). ניתוח העשרת GO הראה כי בתפקוד המולקולרי, TMEM200A היה נפוץ בעיקר בתעלות הסידן ובוויסות שלילי של השתקת גנים על ידי RNA (איור 7D).

ניתוח מתאם בין TMEM200A לחדירה חיסונית
בהמשך חקרנו את הקשר בין ביטוי TMEM200A לבין חדירת תאי מערכת החיסון כדי להדגים את הקשר בין TMEM200A לחסינות לסרטן. ערכנו ניתוח חדירה חיסונית של CIBERSORT באמצעות נתוני Sangerbox 3.0 פאן-סרטניים. התוצאות הראו כי ביטוי TMEM200A פאן-סרטני היה מתואם עם תאי T CD8+, תאי T CD4+, תאי B, תאי T עוזרים, תאי הרג טבעי, תאי T רגולטוריים, מונוציטים, מקרופאגים, תאים דנדריטיים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים (איור 8A). לאחר מכן, הסתכלנו על המתאם בין ביטוי TMEM200A לבין TIL (לימפוציטים חודרי גידול) באמצעות מסד הנתונים TISIDB, והראינו מתאם הדוק בין ביטוי TMEM200A לבין שפע של 28 TIL בסוגי סרטן שונים (איור 8B). השתמשנו במסד הנתונים TISIDB כדי להעריך את הקשר בין ביטוי TMEM200A לבין תרופות לדיכוי מערכת החיסון בממאירויות אנושיות כדי לחקור באופן יסודי יותר כיצד אימונומודולטורים וביטוי TMEM200A היו קשורים. התוצאות הראו כי רמות ביטוי TMEM200A היו בקורלציה מובהקת עם חומרים מדכאי חיסון במגוון סוגי סרטן (איור 8C). מתאמים מובהקים בין ביטוי TMEM200A לבין חומרים מסוימים המדכאים את מערכת החיסון נמצאו בסרטן האשכים וב-UM (איור 8D-F). לאחר מכן ביצענו ניתוח מתאם של ביטוי TMEM200A עם גורמים אימונוסטימולטוריים ומולקולות MHC באמצעות מסד הנתונים TISIDB (איור 8G,H). התוצאות הראו כי ביטוי TMEM200A היה מתואם עם אימונוסטימולנטים נבחרים ומולקולות MHC בקרצינומה של דרכי השתן של שלפוחית השתן, קרצינומה של האשכים, קרצינומה אדרנוקורטיקלית ו-UM (איור 8I-L). השלב הבא היה לחקור את המתאם בין ביטוי TMEM200A לבין תת-סוגים אימונולוגיים או מולקולריים בקבוצת TCGA PanCan במסד הנתונים TISIDB. מצאנו שתת-קבוצות אימונולוגיות של תשעה סוגי סרטן שונים באו לידי ביטוי TMEM200A באופן שונה, כולל BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT ו-BRCA (איור 8M). בנוסף, שש צורות סרטן שונות עם תת-קבוצות מולקולריות מגוונות, כולל HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV ו-LUSC, הציגו ביטוי משתנה של TMEM200A (איור 8N).

ניתוח תגובת TMEM200A ואימונותרפיה
היעילות של מעכבי PD-1/PD-L1 נמצאת בקורלציה גבוהה עם TMB, וחלק מהחולים עם גידולים ניתנים לחיזוי מסוים באמצעות סמני TMB ליעילות של אימונותרפיה34. אי יציבות מיקרו-לוויינים (באנגלית: Microsatellite instability או MSI) הוא מונח המשמש לתיאור פונקציית תיקון אי-התאמה בדנ"א (MMR) כאשר טעויות שכפול מיקרו-לוויינים אינן מתוקנות ומצטברות, ומשנות את האורך או הרכב הבסיס של מיקרו-לוויינים35. MSI הוא סמן גידול בעל משמעות קלינית 36. לפיכך הערכנו את ההשפעה של ביטוי TMEM200A על אימונותרפיה על ידי חקירת הקשר בין ביטוי TMEM200A לבין TMB או MSI. הממצאים הראו מתאם חיובי מובהק בין ביטוי TMEM200A לבין TMB ב-THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP ו-KIRC, אך ביטוי TMEM200A נמצא בקורלציה שלילית עם UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM ו-BRCA (איור 9A). MSI וביטוי TMEM200A היו קשורים באופן חזק וחיובי ב-TGCT, בעוד שהביטוי TMEM200A היה מתואם באופן מובהק ושלילי עם MSI ב-UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC ו-CHOL (איור 9B). כמו כן, הערכנו את הפוטנציאל של TMEM200A כסמן ביולוגי לבחינת היעילות של ICB. התוצאות הראו כי TMEM200A לבדו ניבא את תגובות ה-ICB בדיוק של Area Under Curve (AUC) >-0.5 מתוך 7 מתוך 25 תת-אוכלוסיות של ICB. TMEM200A הראה ערך ניבוי גבוה יותר משיבוטים של תאי T ו-B, שלשניהם היה ערך של 5. עם זאת, הערך עבור TMEM200A היה נמוך מזה של TIDE (AUC > 0.5 ב-11 תת-אוכלוסיות ICB), ציון MSI (AUC >-0.5 ב-11 תת-אוכלוסיות ICB), CD274 (AUC > 0.5 ב-15 תת-אוכלוסיות ICB), CD8 (AUC > 0.5 ב-17 תת-אוכלוסיות ICB), IFNG (AUC > 0.5 ב-16 תת-אוכלוסיות ICB) ו-Merck18 (AUC > 0.5 ב-17 תת-קבוצות ICB) (איור 9C). פרוגנוזה גרועה של הישרדות בקבוצות ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 ו-ICB_Hugo 2016_PD1 נמצאה בקורלציה עם ביטוי TMEM200A גבוה. עם זאת, הפלה TMEM200A שיפרה את עוצמת הריגת הגידול בתיווך לימפוציטים בקבוצה הממוצעת של Kearney 2018 T_PD1 ו-Pan 2018 OT1 (איור 9D).

ניתוח העשרה GSEA של TMEM200A בסוגי סרטן שונים
השתמשנו ב-DEGs בין תת-קבוצות TMEM200A בעלות ביטוי גבוה לתת-קבוצות TMEM200A בעלות ביטוי נמוך ב-32 ממאירויות כדי לחקור מאפייני סרטן הקשורים TMEM200A. גילינו מתאם משמעותי בין כשל חיסוני ראשוני, מסלול איתות קולטן דמוי I (RIG (Retinoic acid-inducible gene), וביטוי TMEM200A בסרטן פאן, במיוחד ב-BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC ו-SKCM (איור 10). החלבון הציטופלזמי הנגיפי חומצה ריבונוקלאית מזוהה על ידי מסלול איתות קולטן דמוי RIG-I. קולטנים דמויי RIG-I עשויים להשפיע על הייצור של מגוון ציטוקינים דלקתיים בגוף על ידי הפעלת מסלול האיתות NF-kB על ידי הפעלת חלבוני צומת תוך-תאיים מסוימים. כתוצאה מכך, החלבון הטרנסממברנלי 200A (TMEM200A) עשוי למלא תפקיד מכריע בגיוס חלבונים תוך-תאיים על ידי קולטן דמוי RIG-I. ממצאים אלה הצביעו על מתאם חזק בין ביטוי TMEM200A לבין חדירה חיסונית. נוסף על כך, ניתוח העשרת GSEA הראה כי ביטוי TMEM200A פאן-סרטניים נמצא בקורלציה עם איתות כימוקיני, הידבקות תאים, חיבורי קולטני ציטוקינים, מסלולי חישת קרום התא ובקרת אוטופגיה (איור 10). חלבונים טרנסממברנליים עשויים לתפקד כמולקולות הידבקות כדי להשפיע על המיקרו-סביבה של הגידול, בנוסף למילוי תפקיד קריטי בבקרת הכניסה של יוני סידן לתא ממאגרי סידן 36. לכן, התוצאות המתקבלות מניתוח העשרה של GSEA עשויות לנבוע ממעורבות של TMEM200A בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת מסלולי העברת אותות, היווצרות תעלות יונים של קרום הפלזמה, וויסות של כימוטקסיס תאי, הידבקות, אפופטוזיס ואוטופגיה9.

זיהינו את 50 הגנים המובילים של STAD הן באופן חיובי והן באופן שלילי עם TMEM200A ממסד הנתונים LinkedOmics, אשר בוטאו במשותף ב-STAD, בצורה של מפות חום (איור 11A,B). הערכנו את 5 הגנים המובילים באופן חיובי ואת 5 הגנים המובילים הקשורים באופן שלילי TMEM200A ב-GC (איור 11C). התוצאות שלנו הראו כי ביטוי TMEM200A היה מתואם עם SPON1 (r = 0.51), CDH11 (r = 0.50), EPB41L2 (r = 0.49), LUM (r = 0.49), SAMD3 (r = 0.49), OVOL2 (r = -0.37), RASAL1 (r = -0.36), IRX5 (r = -0.35), SLC4A11 (r = -0.34) ו- SYTL1 (r = -0.33). ניתחנו את תוצאות הדמיית הסף כדי להבין עוד יותר את התפקיד של TMEM200A ב- STAD. הקריטריונים הבאים שימשו להקרנה: שינוי log2-fold (FC) > 2.0 וערך P מותאם 0.05. מצאנו 483 DEGs, מתוכם 385 עברו upregulated ו-98 downregulated, ובחרנו 100 מהם להדמיה כדי ליצור מפת חום (איור 11D). לאחר מכן, עבור ה-DEGs שעמדו בקריטריוני המיון, הרצנו ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG. תוצאות ניתוח העשרת GO הראו כי העשרת BP (תהליך ביולוגי) הייתה קשורה בעיקר למטריצה חוץ-תאית ולרקמה מבנית, העשרת CC (רכיב תאי) הייתה קשורה בעיקר למטריצה חוץ-תאית המכילה קולגן וקרום מרתף, ו-MF (פונקציה מולקולרית) הועשר בעיקר במבנה מטריצה חוץ-תאי וקישור גליקוזאמינוגליקן (איור 11E ואיור 11G). ההעשרה של ניתוח KEGG הראתה כי TMEM200A מועשר בעיקר במסלול אינטראקציות קולטן מטריצה חוץ-תאיים, ציטוכרום P450, ומערכת רנין-אנגיוטנסין (איור 11F ואיור 11H).

מודל פרוגנוסטי מבוסס TMEM200A ותכונות קליניות של סרטן הקיבה
חקרנו את המתאם בין TMEM200A לנתונים הקליניים של מטופלים עם STAD ולכן ניתחנו את המאפיינים הקליניים-פתולוגיים של מטופלים בקבוצת TCGA-STAD באמצעות ניתוח רגרסיה לוגיסטית ובהתבסס על רמות ביטוי TMEM200A (איור 12A). גיל, שלב קליני וביטוי TMEM200A היו כולם בקורלציה משמעותית עם מערכת ההפעלה בחולים עם STAD, על פי ניתוח רגרסיה חד-משתני של קוקס (איור 12B). ניתוח הרגרסיה הרב-משתנית של קוקס הראה כי ביטוי TMEM200A עשוי להיות גורם ניבוי עצמאי עבור מערכת ההפעלה בחולים עם STAD (HR = 1.282, 95% CI = 1.066-1.541, P = 0.008) (איור 12C). בחנו את הפוטנציאל של המאפיינים הקלינאופתולוגיים האלה לחזות את מערכת ההפעלה לאחר 1, 3 ו-5 שנים ב-STAD באמצעות מודל התוויית קו עמודה סטנדרטי בשילוב עם מספר פרמטרים קליניים (איור 12D). עקומות הכיול של הסתברויות הישרדות של שנה אחת היו עקביות מאוד עם הסתברויות חזויות של קווי עמודה (איור 12E).

TMEM200A upregulation בתאי STAD ושיפור התפשטות תאים
על ידי סקירת הספרות הקשורה TMEM200A, גילינו כי הביטוי הגבוה של TMEM200A מצביע על פרוגנוזה גרועה 13 והמיקרו-סביבה החיסונית של GC עשויה להיות מושפעת מכך TMEM200A פועלת כמולקולת היצמדות37, ובכך מקדמת פלישה וגרורות של תאי GC. בחנו את רמות החלבונים ואת רמות התמליל של mRNA של TMEM200A בשורות תאי STAD כדי לאשר את ממצאי המחקר הנ"ל. קו תאי ה-GC HGC-27 ביטא באופן דרמטי TMEM200A יתר על המידה בהשוואה לקו תאי האפיתל הבריא של רירית הקיבה GES-1 הן ברמת החלבון והן ברמת התמליל של mRNA (איור 13A,B), מה שמצביע על כך TMEM200A היה ביטוי יתר בתאי HGC-27. כתוצאה מכך נערכו הבדיקות הבאות באמצעות תאי HGC-27. בינתיים, כדי להוכיח את דיוק תוצאות הניסוי, השתמשנו ב- qRT-PCR כדי להשוות את ביטוי ה- mRNA הדיפרנציאלי של TMEM200A בתאי GC אנושיים SGC-7901 ובתאי אפיתל רירית הקיבה GES-1, והתוצאות הראו כי TMEM200A התבטא מאוד בתאי SGC-7901 (איור 13B). TMEM200A הופל בתאי HGC-27 כדי לבחון את המעורבות האפשרית של TMEM200A ב-STAD (איור 13C). בהתבסס על תוצאות כריית מסד הנתונים וניתוח המתאם שלנו של TMEM200A, נמצא כי TMEM200A היה מעורב בעיקר במסלול אינטראקציות קולטני מטריצה חוץ-תאיים, שהיה קשור לשגשוג ופלישה של סרטן. לכן השתמשנו במבחני CCK-8 כדי לוודא כיצד ביטוי TMEM200A השפיע על גדילת תאים. מבחני CCK-8 הראו שקבוצות TMEM200A (Si-RNA2 ו-Si-RNA3) הראו ירידה ניכרת בכדאיות התא בהשוואה לקבוצת NC (איור 13D). ממצאים אלה הצביעו על כך TMEM200A היה מווסת ב- STAD, ורמת הביטוי שלו יכולה להשפיע על התפשטות תאי GC. בהתבסס על תוצאות ניתוח העשרת KEGG באיור 11F, מצאנו כי TMEM200A קשורה למסלול האיתות PI3K/AKT ב-GC, ו-TMEM200A, כגורם להידבקות תאים, עשויה להשפיע על המנגנון של קרצינוגנזה בקיבה על-ידי השפעה על EMT. לכן, השתמשנו בכתמים מערביים כדי לאמת את ההשפעות של הפלת TMEM200A על EMT ומסלול האיתות PI3K/AKT לפני ואחרי הפלה. התוצאות הראו כי ביטוי חלבון P-AKT ירד בקבוצת ה-TMEM200A (TMEM200A-SiRNA2) בהשוואה לקבוצת הביקורת השלילית (NC), בעוד שרמות החלבונים N-cadherin, Vimentin ו-Snai ירדו גם הן וביטוי חלבון E-cadherin עלה (איור 13E). כל התוצאות הללו מצביעות על כך TMEM200A עשוי להשפיע על EMT דרך מסלול איתות PI3K / AKT ובכך לשחק תפקיד GC.

Figure 1
איור 1: זרימת העבודה של המחקר. קיצורים: TCGA = מסד הנתונים של אטלס גנום הסרטן; TIMER2.0 = מסד הנתונים TIMER2.0; OS= הישרדות כוללת; PFS = זמן הישרדות ללא התקדמות; DSS = הישרדות ספציפית למחלה; DFS = הישרדות ללא מחלות; TMB = נטל מוטציה גידולית; MSI = חוסר יציבות מיקרו-לוויינים; PPI = אינטראקציה חלבון-חלבון; GGI = אינטראקציה גן-גן; KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים; GO = אונטולוגיה גנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: רמות ביטוי של TMEM200A בסוגי סרטן שונים. (A) ביטוי מווסת מעלה או מטה של TMEM200A ממערך הנתונים של TCGA בממאירויות אנושיות שונות. (B) ניתוח רמות ביטוי TMEM200A בגידולים וברקמות תקינות באמצעות מסד הנתונים TIMER2.0. (C) ניתוח דיפרנציאלי של פעילות גנים TMEM200A בסוגי סרטן שונים בבני אדם מתוך מערך הנתונים של TCGA. (D) דירוג רמות הפעילות הגנטית של TMEM200A בסוגי סרטן שונים בבני אדם בהתבסס על ניקוד ssGSEA. (E) TMEM200A רמות ביטוי ממסד הנתונים HPA ברקמות בריאות. (F) רמות ביטוי TMEM200A של מסד נתונים HPA בשורות תאים רגילות. (G) תוצאות IHC עבור ביטוי חלבון TMEM200A בסרטן מתוך מסד הנתונים של HPA. קיצורים: TCGA = אטלס גנום הסרטן; ssGSEA = ניתוח העשרת ערכת גנים מדגם יחיד; HPA = אטלס חלבונים אנושי; IHC = אימונוהיסטוכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מתאם של ביטוי TMEM200A עם מאפיינים קליניים-פתולוגיים ופרוגנוזה של גידולים שונים. (A) מתאם של ביטוי TMEM200A בקבוצת TCGA pan-cancer (PanCan) עם היערכות קלינית-פתולוגית בכל גידול נותח באמצעות מסד הנתונים UCSC Xena. (B) מתאם של ביטוי TMEM200A בקבוצת TCGA PANCAN עם גיל המטופל בכל גידול. (C) מתאם של ביטוי TMEM200A בקבוצת TCGA PANCAN עם ציון פתולוגי של הגידול בכל גידול. (D) מתאם של ביטוי TMEM200A בקבוצת TCGA PanCan עם מצב ההישרדות של החולים בכל גידול. (E) ניתוח מתאם של ביטוי TMEM200A עם הישרדות כוללת של פאן-סרטן בסוגי סרטן שונים באמצעות מודל רגרסיה של קוקס. (F) מתאם בין ביטוי TMEM200A לבין פרוגנוזה של מערכת ההפעלה הפאן-סרטנית בקבוצת TCGA PanCan. (G) מתאם בין ביטוי TMEM200A לבין הישרדות ספציפית למחלה. (H) מתאם בין ביטוי TMEM200A לבין פרוגנוזה של מרווח ללא התקדמות בקבוצת TCGA PanCan. (I) מתאם בין ביטוי TMEM200A לבין מרווח ללא מחלה. (J) ניתוח רגרסיה רב-גורמית של COX בוצע ב-KIRC. (K) ניתוח רגרסיה רב-פקטוריאלית של COX בוצע על KIRP. קיצורים: TCGA = אטלס גנום הסרטן; KIRC: קרצינומה של תאים צלולים בכליות; KIRP: קרצינומה של תאי כליות פפילריים; OS = הישרדות כוללת; DSS = הישרדות ספציפית למחלה; PFI = מרווח ללא התקדמות; DFI = מרווח ללא מחלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח מתילציה של TMEM200A בדנ"א בסוגי סרטן שונים. (A) רמות מתילציה מקדם של TMEM200A נבדקו במספר סוגי סרטן, על פי מסד הנתונים SMART. (B) רמות גבוהות יותר של מתילציה מקדם של TMEM200A בסוגי סרטן שונים מאשר ברקמות נורמליות נבדקו בהתאם למסד הנתונים של UALCAN. (C) באמצעות מסד הנתונים של UALCAN, נקבע כי לרקמות נורמליות היו רמות מתילציה נמוכות יותר של TMEM200A במספר סוגי סרטן. (ד) רמת המתילציה של הדנ "א של TMEM200A ב- BLCA, HNSC, LUAD ו- STAD השתנתה עם השלב הפתולוגי. קיצורים: BLCA = קרצינומה של שלפוחית השתן; HNSC= קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר; LUAD = אדנוקרצינומה ריאות; STAD= אדנוקרצינומה בקיבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: TMEM200A מוטציות גנטיות בסוגי סרטן שונים. (A) ניתוח של סוגי מוטציות גנטיות TMEM200A בסוגי סרטן שונים באמצעות מסד הנתונים cBioPortal. (B) מבנה חלבון תלת-ממדי של TMEM200A. אזור הקשירה מסומן על ידי החלק הצבעוני, ואילו שאר חלקי TMEM200A מוצגים על ידי החלק האפור. (C) איזופורמים והתפלגות של מוטציות סומטיות TMEM200A . ציר X, אתרי חומצות אמינו; ציר Y, מספר מוטציות TMEM200A ; נקודות ירוקות, מוטציות שגויות; ונקודות אפורות, מוטציות קטועות. (D) אימות האיזופורמים והתפלגותם של מוטציות סומטיות TMEM200A באמצעות נתונים ב-Sangerbox 3.0. (E) עבור כל גידולי TCGA, המתאם בין מצב המוטציה לבין חיזוי ההישרדות הכולל של החולים נחקר באמצעות מסד הנתונים cBioPortal, עם ריבועים אדומים המציינים את קבוצת המוטציות TMEM200A וריבועים כחולים המציינים את הקבוצה שלא עברה מוטציה. (F) גנים שעברו מוטציה משותפת עם TMEM200A נותחו באמצעות הכלי cBioPortal: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 ו-SLC18B1. (G) ניתוח סוגי מוטציות TMEM200A ב-GC באמצעות מסד הנתונים הקוסמי. (H) ניתוח של TMEM200A סוגי SNV ב-GC נערך באמצעות מסד הנתונים הקוסמי. קיצורים: TCGA = אטלס גנום הסרטן; OS = הישרדות כוללת; קוסמי = קטלוג מוטציות סומטיות בתאים סרטניים; GC = סרטן קיבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ניתוח מתאם חד-תאי של ביטוי TMEM200A בסוגי סרטן שונים. (א) סיכום הבעת TMEM200A באתר TISCH. (B) התפלגות של שמונה סוגי תאים שונים במערך הנתונים של מלנומה עורית גרורתית GSE72056. (C) רמות ביטוי של TMEM200A בתאי מלנומה גרורתית עורית ממערך הנתונים GSE72056. (D) התפלגות של 13 סוגי תאים שונים במערך הנתונים של סרטן המעי הגס משנת GSE146771. (E) TMEM200A רמות הביטוי בתאי סרטן המעי הגס מתוך מערך הנתונים GSE146771. (F) מתאם בין ביטוי TMEM200A למצב תפקודי של תא בודד בגידולים מרובים הודגם באמצעות מסד הנתונים CancerSEA. (G) מפות T-SNE המדגימות את רמות ביטוי TMEM200A בתאי גידול בודדים, כולל GBM, LUAD, CML, CRC, RB ו-UM. קיצורים: GBM = גליובלסטומה; LUAD = אדנוקרצינומה ריאות; CML = לוקמיה גרנולוציטית כרונית; CRC = סרטן המעי הגס; RB = רטינובלסטומה; UM = מלנומה של Uveal. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: רשת ביטוי משותף וניתוח העשרה תפקודית של TMEM200A ברמת הגן. (A) רשת GGI של TMEM200A והגנים המבוטאים במשותף שלה. (ב) רשת PPI. (ג,ד) TMEM200A והגנים המבוטאים במשותף נותחו להעשרת מסלולי GO ו-KEGG. קיצורים: PPI = אינטראקציה חלבון-חלבון; GGI = אינטראקציה גן-גן; KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים; GO = אונטולוגיה גנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: מתאם בין ביטוי של תאי TMEM200A ותאי מערכת החיסון, חומרים מדכאי חיסון, חומרים ממריצים ומולקולות MHC בסוגי סרטן שונים. (A) מפת חום Sangerbox 3.0 המדגימה את המתאם בין ביטוי TMEM200A לבין תאים חודרים למערכת החיסון. (B) מפת חום המציגה את המתאם בין תאים חודרים למערכת החיסון לבין ביטוי TMEM200A במסד הנתונים TISIDB. (C) מפת חום המציגה את המתאם בין תאים מדכאי חיסון לבין ביטוי TMEM200A במסד הנתונים TISIDB. (ד-ו) מתאם בין ביטוי TMEM200A לבין חומרים מדכאי חיסון מסוימים בסרטן האשכים ובמלנומה של הענבה. (G) מפת חום המציגה את המתאם בין גורמים אימונוסטימולטוריים לבין ביטוי TMEM200A במסד הנתונים TISIDB. (H) מפת חום של המתאם בין ביטוי TMEM200A לבין מולקולות MHC במסד הנתונים TISIDB. (ט-ל) מתאם בין ביטוי TMEM200A לבין גורמים אימונוסטימולטוריים מסוימים ומולקולות MHC בקרצינומה של דרכי השתן של שלפוחית השתן, קרצינומה של האשכים, קרצינומה אדרנוקורטיקלית ומלנומה של הענבה. (M) מתאם בין תת-קבוצות חיסוניות פאן-סרטניות לבין ביטוי TMEM200A. (N) מתאם בין תת-קבוצות מולקולריות פאן-סרטניות לבין ביטוי TMEM200A. קיצורים: MHC = קומפלקס היסטותאימות ראשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: ניתוח תגובה אימונותרפית של TMEM200A בפנציטופניה. (A) מתאם של ביטוי TMEM200A בסוגי סרטן שונים עם TMB. (B) מתאם בין MSI בפאן סרטן לבין ביטוי TMEM200A . (ג) הפוטנציאל של TMEM200A כסמן ביולוגי לחיזוי תגובת חסימת נקודות בקרה חיסוניות. (D) ממוצע משוקלל של מתאם TMEM200A עם תוצאת הישרדות ICB ושינוי קיפול לוגריתמי (logFC) בבדיקת CRISPR שימשו לדירוג זה. קיצורים: TMB = נטל מוטציה גידולית; ICB = חסימת מחסום חיסוני; CRISPR = Clustered באופן קבוע בין חזרות פלינדרומיות קצרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: ניתוח העשרת GSEA של TMEM200A בסוגי סרטן שונים. חמשת המסלולים המובילים שבהם TMEM200A מילאו תפקיד פונקציונלי מרכזי בוויסות 32 סוגי סרטן זוהו על ידי ניתוח העשרה של GSEA. הפאנל השמאלי מציג את תוצאות ניתוח ההעשרה של GSEA עבור TMEM200A ב- ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ ו- SARC. הפאנל הימני מציג את תוצאות ניתוח העשרת GSEA עבור TMEM200A ב- SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS ו- UVM. קיצורים: GSEA = ניתוח העשרת סט גנים; ACC = קרצינומה אדרנוקורטיקלית; BLCA = קרצינומה של שלפוחית השתן; BRCA = קרצינומה פולשנית של השד; CESC = קרצינומה של תאי קשקש צוואר הרחם ואדנוקרצינומה אנדוצרביקלית; CHOL = כולנגיוקרצינומה; COAD = אדנוקרצינומה של המעי הגס; ESCA = קרצינומה של הוושט; GBM = גליובלסטומה מולטיפורמה; HNSC = קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר; KICH = כרומופוב כליות; KIRC = קרצינומה של תאים צלולים בכליות; KIRP = קרצינומה של תאי פפילרי כליות; LAML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; LGG = גליומה בדרגה נמוכה יותר במוח; LIHC = קרצינומה הפטוצלולרית בכבד; LUAD = אדנוקרצינומה ריאות; LUSC = קרצינומה של תאי קשקש ריאתיים; MESO = מזותליומה; OV = ציסטאדנוקרצינומה סרוסית שחלתית; PAAD = אדנוקרצינומה של הלבלב; PCPG = Pheochromocytoma ו Paraganglioma; PRAD = אדנוקרצינומה של הערמונית; קרא אדנוקרצינומה פי הטבעת; SARC=סרקומה; SKCM = מלנומה עורית בעור; STAD = אדנוקרצינומה בקיבה; TGCT = גידולי תאי נבט האשכים; THCA = קרצינומה של בלוטת התריס; THYM = Thymoma; UCEC = קרצינומה של קורפוס הרחם; UCS = קרצינוסרקומה של הרחם; UVM = מלנומה ענבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: TMEM200A ב-STAD. (A) 50 הגנים המובילים שנמצאו עם מתאם שלילי עם ביטוי TMEM200A ב-STAD על ידי מסד הנתונים LinkedOmics. (B) 50 הגנים המובילים ב-STAD שהיו קשורים באופן חיובי ל-TMEM200A. (C) חמשת הגנים המובילים TMEM200A במתאם חיובי וחמישה גנים בעלי מתאם שלילי ב-STAD. (D) מפת חום של DEGs ב- STAD. (ה-ה) חקירת מסלולי GO ו-KEGG מועשרים באמצעות ה-DEGs המוקרנים. קיצורים: STAD=אדנוקרצינומה בקיבה; DEGs= ביטוי דיפרנציאלי של גנים; KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים; GO = אונטולוגיה גנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 12
איור 12: מתאם בין המאפיינים הקליניים של STAD לבין רמת ביטוי TMEM200A . (A) ניתוח רמות ביטוי TMEM200A ותכונות קליניות של STAD באמצעות רגרסיה לוגיסטית. (ב,ג) ניתוח קוקס של חלקות יער STAD עבור משתנים בודדים ומרובים. (D) תרשימי שורת עמודה המנבאים מערכת הפעלה בחולים עם STAD בהתבסס על מין, ציון פתולוגי, גיל, שלב פתולוגי וביטוי TMEM200A . (E) תרשימי כיול המציגים את הכיול של מודל תרשים קו העמודה. קיצורים: STAD= אדנוקרצינומה בקיבה; OS=הישרדות כוללת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 13
איור 13: ביטוי TMEM200A מווסת ב-STAD ומקדם שגשוג של תאי סרטן קיבה. (A) זיהוי ביטוי TMEM200A בתאי סרטן קיבה HGC-27 ובתאי אפיתל רירית הקיבה GES-1 על-ידי כתם מערבי. (B) זיהוי ביטוי TMEM200A בתאי GC HGC-27 ו-SGC-7901, ובתאי אפיתל רירית קיבה GES-1 על ידי qRT-PCR. (C) יעילות הביטוי של TMEM200A הופחתה מאוד בקבוצת ה-TMEM200A בהשוואה לקבוצה הלא-נוק-דאון בתאי GC HGC-27, כפי שהודגם על-ידי qRT-PCR. (D) הפלות TMEM200A עיכבו באופן משמעותי את התפשטות תאי GC כפי שנמדדו על ידי בדיקת CCK8. (E) הפלת TMEM200A עיכבה באופן משמעותי את החלבונים הקשורים ב- EMT והשפיעה על הזרחן של AKT במסלול האיתות PI3K/AKT. קיצור: GC = סרטן קיבה; qRT-PCR: תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת; EMT=מעבר אפיתל-מזנכימלי; AKT=חלבון קינאז B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TMEM200A שייך למשפחה של TMEMs החיונית לתאי סרטן להתרבות38. הביטוי המשתנה של TMEM200A בממאירויות שונות קיבל פחות תשומת לב, וחקירה פאן-סרטנית יסודית לוקה בחסר. עם זאת, עדויות ממשיכות להצטבר, ומראות כי משפחת החלבונים הטרנסממברנליים TMEM עשויה להיות חשובה בשמירה על תאי סרטן ממאירים באמצעות אינטראקציות עם מספר חלבונים, לדוגמה, הפעלה של TMEM16A Ca2+ מופעל Cl- ערוצים על ידי ROCK1/moesin מקדם גרורות BRCA39. לכן, בעבודה הנוכחית, הניתוחים שלנו התמקדו בבחינת ההיתכנות של TMEM200A כיעד טיפולי לסרטן וכסמן אבחוני לגידול. בפרט, חקרנו את רמות הביטוי של TMEM200A ב-33 גידולים ממאירים באמצעות נתוני RNA-seq ממסד הנתונים UCSC Xena, והתוצאות ממסד הנתונים TIMER2.0 אימתו בהצלחה את הניתוחים במסד הנתונים UCSC Xena.

לאחר מכן, כלי האינטרנט TISCH (Tumor Immune Single Cell Center) ומסד הנתונים CancerSEA שימשו לניתוח רמות הביטוי של TMEM200A בסוגים שונים של מונוציטים. אתרי האינטרנט Sangerbox ו-TISIDB שימשו כדי להבין כיצד TMEM200A משפיע על חדירה חיסונית. זיהינו גם את מסלולי האיתות שבהם TMEM200A ממלא תפקיד מפתח בכל סרטן על ידי ניתוח העשרה של GSEA כדי להבין את התפקידים התפקודיים העיקריים של TMEM200A בכל ממאירות.

TMEM200A עשוי לפעול כמולקולת הידבקות כדי לשלוט בסביבה החיסונית של GC ולקדם את ההתפשטות הפולשנית של תאי GC. לכן, זיהינו 483 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים לרמת הביטוי של TMEM200A באמצעות מסד הנתונים TCGA וניתחנו את העשרת GO ו- KEGG של 483 DEGs אלה. תוצאות ההעשרה הראו כי מסלול PI3K/AKT ממלא תפקיד מפתח בהתפתחות סרטן, ומסלול PI3K/AKT עשוי להיות אחד הגורמים המניעים לסרטן.

יתר על כן, ביצענו בדיקות תאיות ומולקולריות לאחר שלמדנו יותר על התפקיד המכריע של TMEM200A בהנעת התפתחות סרטן כדי לאשר את הקשר בין ביטוי TMEM200A לבין פעילות תאי STAD. כצפוי, גילינו כי הפחתת ויסות TMEM200A בתאי STAD הפחיתה מאוד את התפשטות התאים, וכי קווי תאים סרטניים ביטאו TMEM200A ברמות גבוהות בהרבה משורות תאים רגילות. על ידי סריקת הספרות הקשורה למשפחת החלבונים הטרנסממברנליים בשנים האחרונות, מצאנו כי לחלבונים טרנסממברנלים, כמולקולות היצמדות תאים37, יש תפקיד רגולטורי ב- EMT.

יתר על כן, על פי תוצאות ניתוח העשרה של גנים הקשורים TMEM200A ב- GC, מצאנו כי TMEM200A עשוי להיות תפקיד רגולטורי במסלול האיתות PI3K/AKT ב- GC. ניסויי כתם מערביים גילו כי הפלת TMEM200A יכולה להפחית חלבוני וימנטין, N-קדהרין וסנאי ולעכב זרחן AKT, דבר המצביע על כך TMEM200A מווסת את המיקרו-סביבה של הגידול על ידי השפעה על ה- EMT, וכי מסלול האיתות PI3K/AKT עשוי להיות מעורב בוויסות בתיווך TMEM200A של התפתחות GC. בשנים האחרונות, כמה מחקרים מצאו כי EMT הוא הגורם העיקרי לעמידות לתרופות כימותרפיות בחולי GC. פלסטיות אפיתל-מזנכימלית (EMP) ומיקרו-סביבה של הגידול תוארו כגורמים מגבילים לטיפול יעיל בסוגי סרטן רבים40. המופע של EMT יכול לגרום לתאי GC לאבד את המאפיינים האופייניים שלהם ולהראות את המאפיינים של תאים mesenchymal41. תכונה זו לא רק מפחיתה את הרגישות של חולי GC לתרופות כימותרפיות, אלא גם משפרת את היכולת הפולשנית והנדידה של תאי GC, מה שמוביל לגרורות סרטניות. לכן, מהסיבות שהוזכרו לעיל, המחקר שלנו מסייע במחקר ופיתוח של נקודות רגולטוריות מרכזיות ב- EMT ופיתוח גישות טיפוליות ממוקדות חדשניות, על ידי חקירת מנגנון הפעולה הספציפי של TMEM200A המשפיעים על EMT.

השימוש בביואינפורמטיקה למחקר גדל בשנים האחרונות, ולצורך מחקר זה ניגשנו לנתונים ממספר מאגרי מידע באינטרנט. השימוש במאגרי מידע מקוונים אלה בביואינפורמטיקה ייעל והאיץ את חקר הסרטן, והם גם מספקים לחוקרים אמצעי זול לאמת את תוצאותיהם.

עם זאת, לטכניקת הביואינפורמטיקה יש חסרונות מסוימים. כאשר אנו משתמשים במאגרי מידע אלה לניתוח, אותו מחקר עשוי לספק ממצאים לא עקביים או אפילו סותרים במסדי נתונים מרובים, שכן מאגרי מידע מקוונים רבים כוללים נתונים ממספר מערכי נתונים. יתר על כן, מאגרי מידע רבים אינם מתעדכנים במשך זמן רב מאוד, ובשל קשיי זכויות יוצרים, לא ניתן להגדיל את תוכנם; לכן, הממצאים האנליטיים שהחוקרים מקבלים ממאגרי מידע אלה מוגבלים תמיד. לכן, במחקר זה השתמשנו במאגרי מידע שונים כדי לבחון את התוצאות באופן קולקטיבי כדי להתגבר על אילוצים אלה ולוודא את נכונות הממצאים. כדי להיות בטוחים שהממצאים שקיבלנו לא השתנו במידה ניכרת, חזרנו על הנוהל בעת שימוש במאגרי מידע שונים לניתוח. התוצאות של ניסויי כתם מערביים תמכו בתחזית הביואינפורמטית שלנו כי TMEM200A עשוי לשלוט ב- EMT ב- GC על ידי ויסות מסלול האיתות PI3K/AKT, אשר ישפיע לאחר מכן על התפשטות תאי GC. חזינו את מנגנון הפעולה של TMEM200A באמצעות ביואינפורמטיקה בשילוב עם ספרות קשורה.

לסיכום, עבודה זו מדגימה כיצד כלים ביואינפורמטיים עשויים להקל באופן משמעותי על תכנון ניסויים ולשמש לביצוע סוגים רבים אחרים של תחזיות מחקר מדעי. חוקרי סרטן עתידיים עשויים לאמץ את הפרדיגמה העיקרית של שילוב אימות ניסויי עם חיזוי ביואינפורמטיקה, ועבודה זו משמשת מודל טוב למטרה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82160550).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Tags

TMEM200A ניתוח מולטיומיקס סמן ביולוגי פאן-סרטני חלבון טרנסממברנה הסננה חיסונית נתוני RNA-seq סמן ביולוגי אבחנתי סמן ביולוגי פרוגנוסטי סרטן קיבה (GC) תרביות תאים חוץ גופיות הפלה תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR) כתמים מערביים התנהגות ממאירה היווצרות גידולים מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) מסלול איתות PI3K/AKT עיכוב התפשטות
ניתוח מולטיומיקס של <em>TMEM200A</em> כסמן ביולוגי פאן-סרטני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter