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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Análisis multiómico de TMEM200A como biomarcador pancancerígeno

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

En este trabajo se presenta un protocolo en el que se combinan múltiples herramientas bioinformáticas para estudiar las funciones biológicas de TMEM200A en cáncer. Además, también validamos experimentalmente las predicciones bioinformáticas.

Abstract

Se sabe que la proteína transmembrana, TMEM200A, está asociada con cánceres humanos e infiltración inmunitaria. Aquí, evaluamos la función de TMEM200A en cánceres comunes mediante análisis multiómico y utilizamos cultivos celulares in vitro de células gástricas para verificar los resultados. La expresión de TMEM200A en varios tipos de cáncer humano se evaluó utilizando los datos de RNA-seq de la base de datos Xena de la UCSC. El análisis bioinformático reveló un papel potencial de TMEM200A como biomarcador diagnóstico y pronóstico.

Se cultivaron cultivos de líneas celulares gástricas y cancerosas normales y se eliminó TMEM200A se eliminó. Los niveles de expresión de TMEM200A se midieron mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real y Western blot. A continuación, se utilizaron estudios de pérdida de función in vitro para determinar las funciones de TMEM200A en el comportamiento maligno y la formación tumoral de las células de cáncer gástrico (GC). Se utilizaron Western blots para evaluar el efecto del knockdown en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la vía de señalización PI3K/AKT en GC. El análisis bioinformático mostró que TMEM200A se expresaba en niveles altos en GC.

La proliferación de las células GC fue inhibida por TMEM200A knockdown, que también disminuyó la vimentina, la N-cadherina y las proteínas Snai, e inhibió la fosforilación de AKT. La vía de señalización PI3K/AKT también parece estar implicada en la regulación mediada por TMEM200A del desarrollo de GC. Los resultados aquí presentados sugieren que TMEM200A regula el microambiente tumoral afectando a la EMT. TMEM200A también puede afectar a la EMT a través de la señalización PI3K/AKT, influyendo así en el microambiente tumoral. Por lo tanto, en los pancánceres, especialmente en los GC, TMEM200A puede ser un biomarcador y un oncogén potenciales.

Introduction

El cáncer se ha convertido en un problema persistente de salud pública que pone en peligro la salud humana en todo el mundo1debido a sus altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, lo que supone una pesada carga financiera y médica para la sociedad2. En los últimos años se han logrado avances significativos en la terapia del cáncer gracias al descubrimiento de marcadores de cáncer3, y los investigadores han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico y nuevos fármacos para tratar el cáncer. Sin embargo, algunos pacientes con cáncer todavía tienen un pronóstico precario debido a factores como la resistencia a los medicamentos, los efectos secundarios de los medicamentos y la sensibilidad química4. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores para el cribado y el tratamiento de los cánceres en estadio temprano5.

Las proteínas de membrana son proteínas que pueden unirse e integrarse en las membranas de las células y orgánulos6. Estas se pueden agrupar en tres categorías dependiendo de la fuerza de unión a la membrana y su localización: proteínas ancladas a lípidos, proteínas integrales y proteínas periféricas de membrana 7,8. Una proteína transmembrana (TMEM) es una proteína de membrana integral que consta de al menos un segmento transmembrana9, que pasa total o parcialmente a través de la membrana biológica.

Aunque los mecanismos de acción de las proteínas pertenecientes a la familia TMEM no se conocen bien, se sabe que estas proteínas están involucradas en varios tipos de cánceres10. Varias proteínas TMEM se asocian con fenotipos migratorios, proliferativos e invasivos, y su expresión a menudo se asocia con el pronóstico del paciente11. Por lo tanto, los miembros de la familia TMEM se han convertido en el objetivo de la investigación. Una revisión exhaustiva de los informes existentes sobre TMEM reveló que se asocian principalmente con la señalización inter e intracelular12, las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y la tumorigénesis10. Muchos TMEM también poseen importantes funciones fisiológicas, por ejemplo, los canales iónicos en la membrana plasmática, la activación de las vías de transducción de señales, así como la mediación de la quimiotaxis celular, la adhesión, la apoptosis y la autofagia10. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las proteínas TMEM pueden ser marcadores pronósticos importantes en la detección y el tratamiento de tumores.

TMEM200A expresión está significativamente elevada en el cáncer gástrico (CG). Una mayor expresión de TMEM200A13, que tiene ocho exones y una longitud total de 77,536 kb en el cromosoma 6q23.1, se ha relacionado con un mal pronóstico de supervivencia global (SG) en los casos de GC. Sin embargo, los cambios en su expresión rara vez se han reportado en estudios oncológicos. En este artículo se compara y analiza la utilidad de la TMEM200A como diana terapéutica y marcador diagnóstico tumoral en diversos estudios oncológicos utilizando diferentes conjuntos de datos disponibles públicamente. Evaluamos la efectividad de TMEM200A como biomarcador diagnóstico y pronóstico pancancerígeno, así como sus niveles de expresión en varios tipos de cáncer humano utilizando datos de RNA-seq de las bases de datos Xena y TCGA de la UCSC, así como mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y Western blot.

El efecto de los niveles de expresión de TMEM200A en las tasas de mutación, los procesos reguladores, el diagnóstico y pronóstico tumoral, la infiltración inmunitaria y la inmunoterapia se investigó más a fondo utilizando una combinación de herramientas computacionales y sitios web de conjuntos de datos. Se utilizaron las bases de datos CBioPortal y el Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC) para examinar las mutaciones en TMEM200A. Se utilizaron los sitios web Sangerbox y TISIDB para comprender cómo influye la TMEM200A en la infiltración inmunitaria. Se utilizó la herramienta en línea Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) y la base de datos CancerSEA para investigar la función de TMEM200A. Finalmente, para evaluar el impacto de la TMEM200A en el comportamiento maligno y la función de desarrollo tumoral de las células GC, se realizó un experimento de pérdida de función en un ensayo in vitro . Además, se realizó Western blot para evaluar cómo TMEM200A knockdown afectaba a la vía de señalización PI3K/AKT y a la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en GC.

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Protocol

1. La base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA)

NOTA: La base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) contiene los datos de secuenciación de genes en diferentes tejidos tumorales14. Los datos de RNA-seq en TCGA para el estudio de los formatos de transcripciones de TMEM200A por parte por millón (TPM) se extrajeron del sitio web de UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) y se transformaron log2 para comparar las expresiones entre muestras.

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de UCSC Xena .
  2. Haga clic en la pestaña Iniciar Xena .
  3. Haga clic en la pestaña CONJUNTOS DE DATOS en la parte superior de la pantalla.
  4. De las 129 cohortes y 1.571 conjuntos de datos de esta página, haga clic en la pestaña para ver un total de 33 tipos de cáncer, como la leucemia mieloide aguda (LAML) GDC TCGA, el cáncer de corteza suprarrenal (ACC) y el cáncer de vías biliares (CHOL) y más.
  5. En el menú RNAseq de expresión génica , seleccione y haga clic en la pestaña HTSeq - FPKM GDC Hub .
    NOTA: HTSeq - FPKM GDC Hub representa los datos que se han corregido mediante consentimiento.
  6. Desde el menú de descargas , haga clic en su enlace correspondiente.
    NOTA: Con el método anterior, se descargaron datos de RNA-Seq para 33 tipos diferentes de cáncer.
  7. Descomprima el archivo zip de datos de RNA-seq para 33 tipos diferentes de cáncer en un solo archivo en la carpeta del escritorio de la computadora.
  8. Unifique los archivos txt descomprimidos en la misma carpeta y coloque los scripts de Perl en esta carpeta.
  9. Abra el software Perl , copie y pegue la ruta de la carpeta en el software Perl donde se encuentra el cursor del mouse, presione la tecla Enter , ingrese el nombre del código Perl y el nombre del gen (TMEM200A), y luego presione la tecla Enter para obtener un nuevo archivo txt (singleGeneExp.txt).
    NOTA: Este nuevo archivo txt (singleGeneExp.txt) contiene la expresión génica de TMEM200A en 33 cánceres en diferentes pacientes.
  10. Abra el código de R (diffR) y copie y pegue la ruta de acceso donde se encuentra el archivo singleGeneExp.txt en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
  11. Abra el software R, ejecute el código R modificado (diffR) y dibuje la imagen a través del paquete "ggpubr".

2. La base de datos TIMER2.0

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de la base de datos TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 16.
  2. Haga clic en la pestaña Exploración del cáncer.
  3. Introduzca el ID del gen (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda y haga clic en la pestaña Enviar para obtener las imágenes de expresión diferencial de TMEM200A en diferentes tipos de tumores.

3. Atlas de proteínas humanas (HPA)

  1. Vaya a la interfaz web del Atlas de Proteínas Humanas (HPA) (www.proteinatlas.org) 17.
  2. Escriba ID (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda y haga clic en el botón Buscar . Seleccione el subatlas TISSUE.
  3. Coloque el cursor sobre la página y desplácese hacia abajo para encontrar la pestaña Descripción general de la expresión de proteínas .
    NOTA: La sección Descripción general de la expresión de proteínas muestra los niveles de expresión de proteínas de TMEM200A en 45 órganos del cuerpo humano.

4. La matriz de plataforma de metilación de ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium

NOTA: Se utilizó la matriz de plataforma de metilación del ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium para recopilar datos sobre la metilación. Pudimos evaluar los niveles TMEM200A de metilación del ADN utilizando la base de datos SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de SMART .
  2. Introduzca el ID del gen (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda para obtener la distribución de TMEM200A en los cromosomas y el nivel de metilación de TMEM200A en diferentes tipos de neoplasias malignas.
  3. Desplácese hacia abajo en la página hasta el menú Haga clic para comprobar la metilación agregada de CpG y haga clic en el botón Trazar . En la parte inferior de la página, busque y haga clic en el botón Descargar figura . Descargue la figura.

5. La base de datos de la UALCAN

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de UALCAN .
    NOTA: A través de la base de datos UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19 se generaron diagramas de caja de los niveles de metilación del promotor TMEM200A en diversas neoplasias malignas
  2. En la parte superior de la página, haga clic en el botón TCGA .
  3. Ingrese TMEM200A en el cuadro de entrada Gene ID en la pantalla. En el menú del conjunto de datos TCGA , desplácese hacia abajo y seleccione el tipo de cáncer que desea consultar.
  4. Después de hacer clic en el botón Explorar , haga clic en su análisis de subgrupos Metilación en el menú Enlaces para análisis para obtener los resultados de metilación de este tumor.
    NOTA: Con este método, obtuvimos resultados de metilación para 22 tumores en la base de datos UALCAN .

6. Base de datos del Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC)

  1. Vaya a la interfaz del sitio web del Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC).
    NOTA: Los datos sobre mutaciones codificantes, reordenamientos genómicos mutantes no codificantes y genes de fusión en el genoma humano están disponibles en la base de datos 20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/ del Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC), que también se utiliza para determinar la frecuencia de varias mutaciones TMEM200A en varios tipos de cáncer.
  2. Ingrese la identificación del gen (TMEM200A) en el cuadro de búsqueda y haga clic en el botón BUSCAR para ir a una nueva pantalla.
  3. En el menú Genes , localice y haga clic en el enlace donde aparece el nombre de identificación del gen del TMEM200A .
  4. Busque la columna Agrupación de distribut de mutación en la nueva página para obtener el estado de mutación de TMEM200A en el tumor.

7. CBioPortal

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de CBioPortal .
    NOTA: Los datos genómicos del cáncer se pueden encontrar, descargar, analizar y visualizar utilizando la base de datos cBioPortal (www.cioportal.org). Las mutaciones somáticas, los cambios en el número de copias del ADN (CNA), la expresión de ARNm y microARN (miARN), la metilación del ADN, la abundancia de proteínas y la abundancia de fosfoproteínas son solo algunos de los tipos de datos genómicos que se integran en cBioPortal21. Con cBioPortal, se puede llevar a cabo una amplia gama de estudios; Sin embargo, el mayor énfasis está en los diferentes análisis relacionados con las mutaciones y su visualización.
  2. Seleccione el conjunto de datos Análisis pancanceroso de genomas completos en la subsección Estudios pancancerígenos de la sección Seleccionar estudios para visualización y análisis . A continuación, haga clic en el botón Consultar por gen .
  3. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar consulta .
  4. Haga clic en el botón Tipo de cáncer detallado en la parte superior de la página para obtener las mutaciones de TMEM200A en varios tipos de cáncer.

8. Herramienta Sangerbox 3.0

  1. Vaya a la interfaz de la herramienta Sangerbox 3.0 .
    NOTA: La correlación de la expresión de TMEM200A con células inmunitarias, agentes inmunosupresores, factores inmunoestimulantes y moléculas MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) en todos los cánceres se analizó mediante infiltración inmune CIBERSORT utilizando los datos de infiltración inmune pancancerígena en la herramienta Sangerbox 3.022 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. En la barra de herramientas de la parte izquierda de la página, seleccione y haga clic en la pestaña Análisis Inmunocelular (CIBERSORT) del menú Análisis Pan-Cáncer .
  3. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar .

9. Base de datos TISIDB

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de TISIDB .
    NOTA: Se empleó la base de datos TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) para examinar la correlación de la expresión de TMEM200A con células inmunitarias, agentes inmunosupresores, factores inmunoestimulantes y moléculas MHC en varios tipos de cáncer.
  2. Introduzca el símbolo genético de destino (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar .
  3. Haga clic en las secciones Linfocitos, Inmunomoduladores, Quimiocinas y Subtipo en la parte superior de la página. Descargue las imágenes relevantes en la parte inferior de la página.

10. La base de datos TIDE

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de TIDE .
    NOTA: La base de datos TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) se utilizó para evaluar el potencial de TMEM200A como biomarcador para predecir la respuesta a la terapia de bloqueo de puntos de control inmunitario tumoral.
  2. Ingrese la dirección de correo electrónico en la pantalla inicial para registrar la cuenta e iniciar sesión.
  3. Busque la subsección Evaluación de biomarcadores en la parte superior de la página y haga clic en ella.
  4. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes en la parte inferior de la página. A continuación, haga clic en el botón Enviar .
  5. En la página, arrastre el ratón para deslizar la página hacia abajo y encontrar los resultados del análisis.

11. La base de datos CancerSEA

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de CancerSEA .
    NOTA: Utilizando datos de secuenciación de una sola célula, se investigaron las relaciones entre la expresión de TMEM200A y el estado funcional de diferentes células tumorales. Esto se hizo utilizando la base de datos CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. En la parte superior de la página, busque y haga clic en la pestaña Buscar .
  3. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar .

12. La herramienta de red de centros unicelulares inmunes al tumor (TISCH)

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de la herramienta de red del centro de células individuales inmunitarias al tumor (TISCH).
    NOTA: La correlación entre los niveles de expresión de TMEM200A y las células cancerosas también se demostró mediante el uso de la herramienta de red de centros unicelulares inmunes al tumor (TISCH)25.
  2. Introduzca el ID del gen objetivo (TMEM200A) en el cuadro de consulta de Introducir genes. Haga clic en el botón Explorar .
  3. En el menú Tipo de cáncer de esta página, seleccione y haga clic en el conjunto de datos Todos los cánceres . Luego, desplácese hacia abajo en la página y haga clic en el botón Buscar .

13. GeneMANIA

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de GeneMANIA .
    NOTA: La correlación entre TMEM200A y sus genes funcionalmente relevantes se predijo utilizando la estrategia de integración de la red de asociación múltiple de genes Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 para la construcción de redes de interacción gen-gen (GGI).
  2. En el cuadro de búsqueda en la parte superior izquierda de la página, ingrese el ID del gen (TMEM200A) y haga clic en Herramientas de búsqueda.
    NOTA: Se utilizó la herramienta web GeneMANIA para encontrar 20 genes asociados con TMEM200A.

14. Análisis de enriquecimiento funcional

  1. Guarde los identificadores de símbolos de los genes que se van a analizar para su enriquecimiento en formato de archivo txt.
  2. Abra el código R (symbolidR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
  3. Abra el software R y ejecute el código R modificado (symbolidR). Convierta los identificadores de símbolos de estos genes en entrezID a través de la "org. Hs.eg.db". Obtener el archivo id.txt .
  4. Abra el código R (GOR y KEGGR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo id.txt a la línea donde se encuentra setwd en el código R.
  5. Abra el software R y ejecute el código R modificado (GOR y KEGGR). Para seguir este protocolo, analice estos genes para el enriquecimiento de GO y KEGG mediante los paquetes "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" y "enrichplot" y graficar los resultados del enriquecimiento utilizando el paquete "gglot2".

15. Análisis de las diferencias en la actividad génica

NOTA: TMEM200A puntuación en cada muestra de cáncer se calculó utilizando ssGSEA (análisis de enriquecimiento del conjunto de genes de una sola muestra)27, y se realizó el análisis diferencial de la actividad de TMEM200A genes en tejidos cancerosos y sanos para varios cánceres.

  1. Con base en los datos de secuenciación de ARN de 33 tipos de tumores descargados en el paso 1.7, descomprima todos los archivos descargados y colóquelos en una carpeta unificada.
  2. Coloque el archivo merge.txt en la carpeta anterior.
    NOTA: Los datos en merge.txt archivo de BioWolf (www.biowolf.cn) contienen la expresión génica de todos los pacientes en todos los tumores en la base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA).
  3. Abra el código R (ssGSEAR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
  4. Tome la línea donde está geneName en el código R (ssGSEAR) e ingrese el ID del gen (TMEM200A).
  5. Abra el software R y ejecute el código R modificado (ssGSEAR). Obtenga el archivo de puntuación de la actividad de los genes: scores.txt.
    NOTA: Con el algoritmo ssGSEA, primero construimos un archivo de conjunto de genes basado en los coeficientes de correlación entre genes de acuerdo con los datos proporcionados en el archivo de merge.txt e identificamos los genes con una mayor correlación con el gen objetivo (TMEM200A) del archivo. Luego, los genes con mayor correlación se unifican como los genes activos de TMEM200A, y finalmente, obtenemos la puntuación de los genes activos en cada muestra.
  6. Abra el código de R (scoreDiffR) y copie y pegue la ruta de acceso donde se encuentra el archivo scores.txt en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
  7. Abra el software R, ejecute el código R modificado (scoreDiffR) y dibuje la imagen a través de los paquetes "plyr", "reshape2" y "ggpubr".

16. Correlación clinicopatológica y análisis pronóstico de supervivencia

  1. Vaya a la interfaz del sitio web de UCSC Xena .
  2. Haga clic en la pestaña Iniciar Xena .
  3. Haga clic en la pestaña CONJUNTOS DE DATOS en la parte superior de la pantalla.
  4. Coloque el cursor sobre la página y desplácese hacia abajo para encontrar la pestaña TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. De las 129 cohortes y 1.571 conjuntos de datos de esta página, haga clic en la pestaña TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. En el menú de fenotipos , seleccione y haga clic en la pestaña Datos clínicos seleccionados.
  7. Desde el menú de descargas , haga clic en su enlace correspondiente.
    NOTA: Descargue los datos clínicos de 33 cánceres de la base de datos TCGA en el enlace anterior.
  8. Descomprima el archivo de datos clínicos descargado y abra el archivo descomprimido en formato de archivo xls.
  9. Organice y conserve los datos clínicos necesarios (estadio, edad, estadio patológico y estado del paciente) en el archivo, elimine los datos clínicos innecesarios restantes y guarde todo el archivo como un archivo en formato txt después de cambiarle el nombre a clínico.
  10. En función de los singleGeneExp.txt obtenidos en el paso 1.9, coloque este archivo en la misma carpeta que el archivo de clinical.txt organizado.
  11. Descomprima los datos clínicos descargados y coloque los archivos singleGeneExp.txt y clinical.txt en la misma carpeta que los archivos clínicos descomprimidos.
  12. Abra el código de R (clinicalDiffR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
  13. Abra el software R, ejecute el código R modificado (clinicalDiffR) y dibuje la imagen usando el paquete "ggpubr".
  14. Vaya a la interfaz del sitio web de UCSC Xena .
  15. Haga clic en la pestaña Iniciar Xena .
  16. Haga clic en la pestaña CONJUNTOS DE DATOS en la parte superior de la pantalla.
  17. De las 129 cohortes y 1.571 conjuntos de datos de esta página, haga clic en la pestaña para ver un total de 33 tipos de cáncer, como la leucemia mieloide aguda (LAML) GDC TCGA, el cáncer de corteza suprarrenal (ACC) y el cáncer de vías biliares (CHOL) y más.
  18. En el menú de fenotipo , seleccione y haga clic en la pestaña de datos de supervivencia.
  19. Desde el menú de descargas , haga clic en su enlace correspondiente.
  20. Descomprima el archivo zip de datos de supervivencia de 33 tipos diferentes de cáncer en un solo archivo en la carpeta del escritorio de la computadora.
  21. Coloque los datos de supervivencia descomprimidos en la misma carpeta que el archivo singleGeneExp.txt obtenido en el paso 1.9.
  22. Abra el código R (preOSR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
  23. Abra el software R y ejecute el código R modificado (preOSR). Calcule a través del paquete "limma" para obtener un archivo de datos sobre la supervivencia del TMEM200A en pancáncer: expTime.txt.
  24. Abra el código de R (OSR) y copie y pegue la ruta de acceso donde se encuentra el archivo expTime.txt en la línea donde se encuentra setwd en el código de R.
  25. Abra el software R y ejecute el código R modificado (OSR). Realice un análisis de KM utilizando los paquetes "survival" y "survminer" en función de los datos del archivo expTime.txt y trace las curvas de supervivencia para TMEM200A en pancáncer.

17. Análisis de regresión de Cox univariante y multivariante con construcción de parcelas forestales

  1. Abra el código R (COXR) y copie y pegue la ruta donde obtuvimos el archivo expTime.txt de 16.23 se encuentra en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
  2. Abra el software R y ejecute el código R modificado (COXR). Con base en los datos del archivo expTime.txt , realice análisis de regresión univariante de COX utilizando los paquetes "survival", "survminer" y "forestplot" para trazar una gráfica univariada de bosque de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer.
  3. Coloque el archivo expTime.txt del paso 16.23 y clinical.txt del paso 16.10 en la misma carpeta.
  4. Abra el código R (multicoxR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra la carpeta que contiene el archivo expTime.txt del paso 16.23 y clinical.txt archivo del paso 16.10 hasta la línea donde se encuentra setwd en el código R.
  5. Abra el software R y ejecute el código R modificado (multicoxR). Realice un análisis de regresión de COX multivariante utilizando los paquetes "survival" y "survminer" para trazar una gráfica de bosque multivariante de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer en función de los datos de los archivos de expTime.txt y clinical.txt .

18. Modelo pronóstico del cáncer gástrico basado en la expresión TMEM200A y las características clínicas

  1. Coloque el archivo clinical.txt del paso 16.10 y el archivo expTime.txt del paso 16.23 en la misma carpeta.
  2. Abra el código R (NomoR) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra setwd en el código R.
  3. Abra el software R y ejecute el código R modificado (NomoR). Utilice los paquetes de software "survival", "regplot" y "rms" para los datos de expresión de TMEM200A en GC y datos clínicos para construir un modelo pronóstico que prediga la supervivencia del paciente.

19. Cultivo celular y transfección de siRNA de TMEM200A

NOTA: Las células humanas STAD HGC-27, las células SGC-7901 y las células epiteliales de la mucosa gástrica humana GES-1 se obtuvieron comercialmente (véase la Tabla de Materiales), se revivieron, se inocularon en un medio completo 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (que contenía un 10% de suero fetal bovino neonatal y una mezcla de penicilina al 1%) y se cultivaron a 37 °C en un 5% de CO2 incubadora de cultivos celulares. El medio de cultivo se cambió cada 2-3 días. Las células en buen estado de crecimiento se inocularon en placas de seis pocillos según (2-3) × 105 células por pocillo.

  1. En primer lugar, se toman tres tubos de microcentrífuga y se añaden 8 μL de reactivo de transfección (véase laT de materiales) y 200 μL de medio basal a cada tubo. A continuación, añade 4 μg de SiRNA1, SiRNA2 y SiRNA3 a cada tubo respectivamente.
    NOTA: Para TMEM200A derribo, se diseñó y compró siRNA (consulte la Tabla de materiales).
  2. Mezcle bien la mezcla en los tres tubos de microcentrífuga y agréguela a cada uno de los tres pocillos de la placa de 6 pocillos. Agite suavemente el plato de 6 pocillos para distribuir la mezcla de manera uniforme. Etiquete los tres pocillos donde se agregó la mezcla como SiRNA-1, SiRNA-2 y SiRNA-3.
  3. Cuando las células se hayan incubado durante 4-6 h, reemplace la mitad del medio en los tres subpocillos de la placa de 6 pocillos.
    NOTA: Cuando reemplace la mitad del medio completo, aspire la mitad del medio completo original y vuelva a llenarlo con la mitad del medio completo nuevo.
  4. Veinticuatro a 48 h más tarde, utilizar células transfectadas TMEM200A con siRNA como grupo experimental y células no transfectadas como grupo de control negativo. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR, ver sección 20) para evaluar el efecto de la transfección en las células.

20. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

  1. Deseche el medio de cultivo celular en cada subgrupo y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Aísle el ARN total utilizando un kit de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales).
  3. Estimar la concentración de ARN y sintetizar ADNc con 1 μg de ARN utilizando un kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Realice PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) en diluciones de ADNc de 10 veces en 10 μL de mezcla de reacción, incluidos cebadores directos e inversos específicos para humanos para GAPDH (para estandarización), TMEM200A (consulte la Tabla de materiales) y qPCR Master Mix, utilizando el sistema de ensayo de PCR en tiempo real.
    NOTA: Realice cada experimento por triplicado.
  5. Utilice las siguientes condiciones de reacción de qPCR: inicialización, 95 °C durante 3 min; desnaturalización, 95 °C durante 10 s; recocido, 60 °C durante 30 s; y extensión, 80 °C durante 10 s; Repita la desnaturalización, el recocido y la extensión 40x. Determinar la expresión relativa de cada gen mediante la técnica 2-ΔΔCt 28.
  6. Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicados biológicos.

21. Detección de Western blot de la expresión de proteínas relevantes

  1. Deseche el medio de cultivo celular en cada subgrupo y lave suavemente las células con 2 x 1 ml de PBS.
  2. Enfríe las placas de 6 pocillos que contienen las células en hielo y agregue 150 μL de tampón de lisis de ensayo de precipitación inmune por radio (RIPA) preenfriado (150 mM de NaCl, Triton X-100 al 0,1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 %, pH 8,0 de Tris-HCl de 50 mM y cóctel de inhibidores de la proteasa recién añadido). Deje que la lisis continúe con hielo durante 10 minutos.
  3. Utilizando un raspador de celdas de plástico, retire las celdas adheridas del plato y transfiera delicadamente la solución celular a un tubo de microcentrífuga que se haya enfriado previamente.
  4. Centrifugar el lisado celular durante 10 min a 1,5 × 104 g a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Utilice un kit de ensayo de proteínas BCA para determinar el contenido de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  6. Cargue 30 g de proteína de cada muestra en un gel de electroforesis en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE) y deje funcionar a 80 V durante 0,5 h seguido de 1,5 h a 120 V.
  7. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 45 μm a un voltaje de 300 mA durante 1-1,5 h.
  8. Después de colocar la membrana de PVDF en un agitador y agitarla durante 3 x 5 minutos, agregue solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST, 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl y 0,1% de Tween 20) en el recipiente apropiado con el lado de la proteína (lado del gel) hacia arriba.
  9. Coloque la membrana en el tampón de bloqueo (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 0,5 h a temperatura ambiente.
  10. Lave la membrana con TBST durante 3 x 10 min.
  11. Incubar la membrana con anticuerpos primarios contra fosfo-AKT (p-AKT; 1:1.000), AKT total 1:1.000, E-cadherina (E-ca; 1:1.000), N-cadherina (N-ca; 1:1.000), Vimentina 1:1.000, caracol 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1:1.000), durante la noche a 4 °C.
  12. Lavar la membrana durante 3 x 10 min e incubar la membrana con un anticuerpo secundario de conejo o ratón (1:5.000) durante 1 h a temperatura ambiente.
  13. Incubar la membrana de PVDF con sustrato ECL durante 30 s y detectar la señal mediante un sistema de imágenes.

22. Ensayo CCK-8

  1. Siembra de células humanas STAD HGC-27 en buenas condiciones de crecimiento en placas de 96 pocillos.
  2. Cuando la densidad celular alcance el 60-70%, transfecte las células con TMEM200A siRNA (como en el paso 19.3).
  3. Siembre las células transfectadas en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 5 × 10 3/pocillo (cuente las células viables utilizando un contador de células), divididas en grupos NC y TMEM200A siRNA (con tres pocillos replicados en cada grupo) e incubadas a 37 °C.
  4. Añadir el reactivo CCK-8 después de 0, 24, 48, 72 y 96 h e incubar a 37 °C durante 2 h. Mida la absorbancia (450 nm) utilizando una etiquetadora enzimática multifuncional.

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Representative Results

Expresión de TMEM200A en varios tipos de cáncer
Como se ilustra en la Figura 1, primero analizamos los niveles de expresión diferencial de TMEM200A en varios cánceres a través de diferentes bases de datos. TMEM200A expresión se elevó en el colangiocarcinoma (CHOL), el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSC), el carcinoma renal de células claras (KIRC), el carcinoma de células papilares renales (KIRP), el carcinoma hepatocelular (LIHC), el STAD y el carcinoma de tiroides (THCA) en comparación con los tejidos normales adyacentes basándose únicamente en los datos de TCGA. Sin embargo, la expresión TMEM200A disminuyó en el carcinoma uroepitelial de vejiga (BLCA), el carcinoma de células escamosas de cuello uterino y el adenocarcinoma de cuello uterino (CESC), el glioblastoma multiforme (GBM), el cromófobo de riñón (KICH), el carcinoma escamoso de pulmón (LUSC), el feocromocitoma y el paraganglioma (PCPG), el adenocarcinoma de recto (READ) y el carcinoma de endometrio del cuerpo uterino (UCEC) (Figura 2A). En la base de datos TIMER2.0, la expresión de TMEM200A aumentó en CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC y STAD. Además, la expresión de TMEM200A aumentó en BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, melanoma cutáneo cutáneo (SKCM) y UCEC (Figura 2B).

Al comparar los resultados de las dos bases de datos, encontramos que la expresión pancancerígena de TMEM200A era la misma en cada base de datos. Obtuvimos los datos de seguimiento clínico y los datos de secuenciación de ARN de 33 pacientes con cáncer de la base de datos TCGA, calculamos TMEM200A puntuación en cada muestra de cáncer mediante el análisis ssGSEA, y luego calculamos TMEM200A actividad génica en el tumor y los tejidos normales en muchos tumores. Descubrimos que TMEM200A estaba altamente expresado en GBM, HNSC, KIRC renal y THCA (Figura 2C); Por lo tanto, la actividad génica de TMEM200A se clasificó en cada tejido tumoral. Se encontró que la actividad génica de TMEM200A fue mayor en KIRC y más baja en melanoma uveal (UVM) (Figura 2D). La evaluación posterior de los niveles de expresión de TMEM200A en la base de datos HPA en tejidos humanos mostró que los niveles de expresión de TMEM200A eran bajos en la mayoría de los tejidos normales, pero altos en la corteza suprarrenal, el recto, el endometrio y el músculo liso (Figura 2E).

En las líneas celulares de tejido normal, unas pocas líneas celulares, como las células de la granulosa, las células bipolares, las células del músculo esquelético, las células del estroma endometrial y las células T, mostraron una alta expresión de TMEM200A, mientras que la expresión de TMEM200A fue baja en la mayoría de las otras líneas celulares (Figura 2F). También examinamos los datos de inmunohistoquímica (IHQ) en la base de datos HPA para observar la expresión de TMEM200A a nivel de proteína. Los datos relativos a la tinción y la intensidad revelaron niveles de expresión de TMEM200A mucho mayores y más pronunciados en los tejidos de cáncer colorrectal (CCR), cáncer de pulmón (LUAD), cáncer de hígado (LIHC), cáncer de mama (BRCA) y cáncer de próstata (PRAD) en comparación con los tejidos normales (Figura 2G). Estos hallazgos sugirieron que TMEM200A se expresaba ampliamente en diferentes tipos de cáncer y afectaba el desarrollo del cáncer a través de diferentes mecanismos en diferentes tumores.

Relación clinicopatológica y pronóstico de supervivencia
Para 33 neoplasias malignas humanas, recopilamos información y datos clínicos en la cohorte TCGA pan-cancer (PanCan) del sitio web de la base de datos Xena de la UCSC e investigamos la correlación entre la expresión de TMEM200A en PanCan y la edad, el grado patológico, el estadio clinicopatológico y el estado de supervivencia del paciente. Este estudio reveló que, en seis cánceres, la expresión de TMEM200A se asoció con el estadio clinicopatológico, incluyendo BLCA, carcinoma de mama invasivo (BRCA), carcinoma de esófago (ESCA), KIRP, SKCM y carcinoma testicular (TGCT) (Figura 3A). La edad se correlacionó con seis tumores, incluidos BRCA invasivo, GBM, leucemia mieloide aguda (LAML), SKCM, carcinoma tímico (THYM) y cáncer de endometrio (UCEC) (Figura 3B). El grado patológico se asoció con seis tumores, incluyendo carcinoma de esófago (ESCA), HNSC, KIRC, glioma cerebral de bajo grado (LGG), adenocarcinoma de páncreas (PAAD) y carcinoma de endometrio (UCEC) (Figura 3C). El estado de supervivencia se asoció con cinco tumores, incluyendo carcinoma de corteza suprarrenal (ACC), BLCA, KIRC, PCPG y melanoma uveal (UVM) (Figura 3D).

Realizamos estudios para diferentes tipos de cáncer en SG, DSS, PFI e IFD mediante un análisis de regresión de Cox de un factor con un umbral de grupo mediano para obtener más información sobre la correlación entre la expresión TMEM200A y el pronóstico. Los resultados del análisis de SG revelaron que, entre los cuatro tumores, una mayor expresión de TMEM200A tuvo un mayor impacto en el pronóstico de SG en cuatro tumores, entre ellos el carcinoma de corteza suprarrenal (CCA) (P = 0,037), el BLCA (P = 0,036), la leucemia mieloide aguda (LAML) (P = 0,011) y el GC (STAD) (P = 0,005). Por el contrario, una expresión más alta de TMEM200A tuvo un mejor pronóstico de SG en cinco tumores, entre ellos KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), glioma cerebral de bajo grado (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) y melanoma cutáneo (SKCM) (P = 0,043) (Figura 3E,F). En el caso de la DSS, la expresión alta de TMEM200A tuvo un pronóstico precario en dos tipos de tumores, incluido el carcinoma de corteza suprarrenal (CCA) (P = 0,026) y el BLCA (P = 0,015). La alta expresión de TMEM200A tuvo un mejor pronóstico en cuatro tipos de tumores, incluidos KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), glioma cerebral de bajo grado (LGG) (P = 0,025) y PCPG (P = 0,007) (Figura 3G). Además, en el caso del PFI, una mayor expresión de TMEM200A tuvo un pronóstico precario en tres tipos de tumores, entre ellos el carcinoma de corteza suprarrenal (ACC) (P = 0,007), el BLCA (P = 0,040) y el melanoma uveal (UVM) (P = 0,020). Una mayor expresión de TMEM200A tuvo un mejor pronóstico en dos tipos de tumores, incluidos el KIRC (P < 0,001) y el glioma de bajo grado (LGG) (P = 0,044) del cerebro (Figura 3H). En el DFI, la mayor expresión de TMEM200A tuvo un peor pronóstico en el carcinoma de corteza suprarrenal (CCA) (p = 0,044) (Figura 3I).

Posteriormente, seleccionamos varios tumores (KIRC y KIRP) para el análisis de regresión multi-COX. Los resultados mostraron que TMEM200A podrían afectar individualmente a la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer en comparación con otros factores clínicos (Figura 3J y K). Estos resultados mostraron que TMEM200A podría utilizarse como marcador biopronóstico independiente en diferentes cánceres para influir en la supervivencia de los pacientes con cáncer.

Análisis de metilación del ADN
Una de las alteraciones epigenéticas que ha recibido la mayor atención es la metilación del ADN29. Se ha sugerido que un tipo de cambio epigenético, la metilación del ADN, tiene un impacto significativo en el crecimiento tumoral30. Por lo tanto, utilizando la base de datos SMART, evaluamos los niveles de metilación del ADN de TMEM200A en tejidos normales y cancerosos. Los tejidos PAAD y PRAD tenían niveles más altos de metilación del ADN de TMEM200A que los tejidos normales. Sin embargo, TMEM200A tenían niveles más bajos de metilación del ADN en COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA y UCEC que en los tejidos normales (Figura 4A). Los niveles de metilación del ADN de TMEM200A fueron sustancialmente más altos en la base de datos TCGA en KIRP, PRAD, PCPG y THYM según la base de datos UALCAN (Figura 4B), pero no en BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA y UCEC. El nivel de metilación de TMEM200A disminuyó significativamente en LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA y UCEC (Figura 4C). Para explorar aún más la relación entre el nivel de expresión de TMEM200A y la metilación del ADN y los factores clinicopatológicos, volvimos a utilizar la base de datos SMART y descubrimos que el nivel de metilación del ADN de TMEM200A en BLCA, HNSC, LUAD y STAD cambiaba con el estadio patológico (Figura 4D). Los factores clínicos influyen en el nivel de metilación del ADN de TMEM200A en los tumores mencionados.

Análisis de mutaciones genéticas
Una de las razones para el desarrollo de tumores es la acumulación de mutaciones genéticas31. Por lo tanto, se analizó la frecuencia de mutaciones somáticas TMEM200A mediante la estimación de la frecuencia de mutaciones TMEM200A en muestras clínicas pancancerosas utilizando la base de datos cBioPortal. TMEM200A está mutado en muchos tipos de cáncer, como el cáncer de pulmón, el carcinoma endometrioide uterino, el melanoma, el cáncer esofagogástrico, el cáncer de huesos, el cáncer de cuello uterino, el cáncer hepatobiliar, el linfoma de células B maduras, el BRCA, el cáncer de endometrio, el cáncer de ovario, el tumor embrionario, el cáncer de páncreas, el cáncer de cabeza y cuello, el CCR, el glioma, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el sarcoma de tejidos blandos y el cáncer de origen primario desconocido (figura 5A). Además, las alteraciones del ADN pueden dar lugar a cambios estructurales o de aminoácidos a nivel proteico. La Figura 5B muestra la estructura 3D de TMEM200A. Utilizando la base de datos cBioPortal, encontramos sitios de mutación en los aminoácidos de TMEM200A; las mutaciones sin sentido fueron la forma más prevalente de mutaciones (Figura 5C).

Analizamos los datos utilizando Sangerbox 3.0 para verificar la precisión de los sitios de mutación y logramos los mismos resultados que antes. Las mutaciones sin sentido son la forma más frecuente de mutaciones en TMEM200A y pueden ocurrir con una frecuencia de hasta el 7,8% en SKCM (Figura 5D). Una mutación sin sentido es una mutación en la que un codón que codifica un aminoácido sufre una sustitución de bases y se convierte en un codón que codifica otro aminoácido, lo que resulta en un cambio en el tipo de aminoácido y la secuencia de la cadena polipeptídica. El resultado de la mutación sin sentido suele ser que la cadena polipeptídica pierde su función original. Muchas anomalías proteicas son causadas por una mutación sin sentido, que es un tipo común de mutación tumoral. Se ha encontrado que las mutaciones sin sentido juegan un papel clave en la estabilidad de las proteínas, y la presencia de mutaciones puede tener un efecto significativo en la afinidad de unión entre las proteínas32, alterando las interacciones entre las proteínas y las macromoléculas correlativas circundantes33.

Por lo tanto, lo más probable es que las mutaciones de cambio de sentido afecten la función biológica de la proteína transmembrana 200A en diferentes tipos de cáncer. También se examinó la correlación entre TMEM200A mutación genética y el pronóstico de supervivencia clínica de los pacientes con cáncer. La probabilidad de SG aumentó en comparación con la del grupo con TMEM200A mutaciones, pero no en el grupo sin enfermedad (Figura 5E). El estudio de las correlaciones génicas reveló que TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 y SLC18B1 se encontraban entre los genes que comutaron con TMEM200A (Figura 5F). Pudimos identificar varios tipos de mutaciones y variaciones de un solo nucleótido (SNV) a través de la base de datos COSMIC para aprender más sobre TMEM200A mutaciones en GC. La frecuencia de sustituciones sin cambio de sentido fue la más alta (38,86%) (Figura 5G), y los datos de SNV mostraron que las SNV más comunes en STAD fueron G>A (31,73%), seguidas de C>T (26,35%) y G>T (11,73%) (Figura 5H).

Análisis unicelular de TMEM200A en cáncer
Analizamos los niveles de expresión de TMEM200A en diferentes células individuales utilizando el sitio web TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center). La herramienta en línea TISCH mostró la expresión de TMEM200A para 65 conjuntos de datos y 28 tipos de celdas en el mapa de calor que se muestra en la Figura 6A. Los hallazgos mostraron que TMEM200A se expresaba principalmente en las células T CD8+ y los fibroblastos. En este sentido, cabe destacar el conjunto de datos GSE72056, que incluye células de pacientes con melanoma cutáneo metastásico (SKCM). TMEM200A se expresó ampliamente en células B, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ agotados, células endoteliales, fibroblastos y otros tipos de células en el microambiente SKCM (Figura 6B, C). En el conjunto de datos GSE146771, que contiene células de pacientes con CCR, TMEM200A se expresó ampliamente en células B, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T CD8+ agotados, células endoteliales, fibroblastos y otros tipos de células en el microambiente del CCR (Figura 6D,E). Mediante el uso de la base de datos CancerSEA, se determinaron los niveles de expresión y el estado funcional de TMEM200A en células tumorales específicas (Figura 6G). TMEM200A expresión se correlacionó fuertemente con el estado funcional celular en una variedad de cánceres, incluidos el glioblastoma (GBM), el adenocarcinoma de pulmón (LUAD), la leucemia granulocítica crónica (LMC), el CCR, el retinoblastoma (RB) y el melanoma uveal (UM). La angiogénesis, la apoptosis, la diferenciación y la inflamación se correlacionaron positivamente con la expresión de TMEM200A en la mayoría de las células tumorales, mientras que el daño en el ADN, la reparación del ADN, la invasión y el metabolismo se correlacionaron negativamente con la expresión TMEM200A (Figura 6F).

Análisis funcional y de enriquecimiento de vías de TMEM200A en varios cánceres
Examinamos la relación entre TMEM200A y proteínas con funciones similares utilizando la red GGI para explorar la función de TMEM200A en diferentes cánceres (Figura 7A). La información genómica y proteómica es analizada por GeneMANIA utilizando una lista de consulta de genes diana. Al localizar genes que funcionan de manera similar a TMEM200A, se descubrieron las 40 proteínas que interactúan directamente con este gen. La correlación de estos genes se muestra en la red PPI (Figura 7B). Posteriormente, los análisis de enriquecimiento de GO y KEGG de estos 20 genes estrechamente relacionados con TMEM200A revelaron que estos genes adyacentes estaban implicados principalmente en la regulación negativa del silenciamiento génico por parte del ARN. El análisis de KEGG reveló que el TMEM200A era abundante en las vías, incluida la vía de señalización Wnt y la senescencia celular (Figura 7C). El análisis de enriquecimiento de GO mostró que, en función molecular, el TMEM200A era principalmente abundante en los canales de calcio y en la regulación negativa del silenciamiento génico por el ARN (Figura 7D).

Análisis de correlación entre TMEM200A e infiltración inmunitaria
Investigamos más a fondo la correlación entre la expresión TMEM200A y la infiltración de células inmunitarias para demostrar la correlación entre la TMEM200A y la inmunidad al cáncer. Realizamos el análisis de infiltración inmune CIBERSORT utilizando los datos pancancerígenos de Sangerbox 3.0. Los resultados mostraron que la expresión de TMEM200A pancancerosas se correlacionó con las células T CD8+, las células T CD4+, las células B, las células T colaboradoras, las células asesinas naturales, las células T reguladoras, los monocitos, los macrófagos, las células dendríticas, los eosinófilos, los basófilos y los granulocitos (Figura 8A). Posteriormente, analizamos la correlación entre la expresión de TMEM200A y los TIL (linfocitos infiltrantes de tumores) utilizando la base de datos TISIDB, mostrando una estrecha correlación entre la expresión de TMEM200A y la abundancia de 28 TIL en diferentes tipos de cáncer (Figura 8B). Utilizamos la base de datos TISIDB para evaluar la correlación entre la expresión de TMEM200A y los fármacos inmunosupresores en neoplasias malignas humanas para investigar más a fondo cómo se relacionaban los inmunomoduladores y la expresión TMEM200A. Los resultados mostraron que los niveles de expresión de TMEM200A se correlacionaron significativamente con agentes inmunosupresores en una variedad de cánceres (Figura 8C). Se encontraron correlaciones significativas entre la expresión de TMEM200A y ciertos agentes inmunosupresores en el cáncer testicular y la UM (Figura 8D-F). A continuación, realizamos un análisis de correlación de la expresión de TMEM200A con factores inmunoestimuladores y moléculas MHC utilizando la base de datos TISIDB (Figura 8G,H). Los resultados mostraron que la expresión de TMEM200A se correlacionó con inmunoestimulantes seleccionados y moléculas MHC en carcinoma urotelial de vejiga, carcinoma testicular, carcinoma de corteza suprarrenal y MU (Figura 8I-L). El siguiente paso fue investigar la correlación entre la expresión TMEM200A y los subtipos inmunológicos o moleculares en la cohorte TCGA PanCan en la base de datos TISIDB. Descubrimos que los subgrupos inmunológicos de nueve tipos distintos de cáncer se expresaban TMEM200A de manera diferente, incluidos BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT y BRCA (Figura 8M). Además, seis formas diferentes de cáncer con diversos subgrupos moleculares, incluidos HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV y LUSC, mostraron una expresión variable de TMEM200A (Figura 8N).

Análisis de la respuesta a TMEM200A e inmunoterapia
La eficacia de los inhibidores de PD-1/PD-L1 está altamente correlacionada con la TMB, y algunos pacientes con tumores pueden predecirse de alguna manera utilizando marcadores de TMB para la eficacia de la inmunoterapia34. La inestabilidad de microsatélites (MSI) es el término utilizado para describir la función defectuosa de reparación de errores de emparejamiento del ADN (MMR) cuando los errores de replicación de microsatélites no se corrigen y se acumulan, cambiando la longitud o la composición de la base de los microsatélites35. La MSI es un marcador tumoral de importancia clínica 36. Por lo tanto, evaluamos el impacto de la expresión de TMEM200A en la inmunoterapia investigando la correlación entre la expresión de TMEM200A y TMB o MSI. Los hallazgos demostraron una correlación positiva sustancial entre la expresión de TMEM200A y TMB en THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP y KIRC, pero TMEM200A expresión se correlacionó negativamente con UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM y BRCA (Figura 9A). La expresión de MSI y TMEM200A se vinculó fuerte y favorablemente en TGCT, mientras que la expresión de TMEM200A se correlacionó significativa y negativamente con MSI en UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC y CHOL (Figura 9B). También evaluamos el potencial de la TMEM200A como biomarcador para examinar la efectividad de la BCI. Los resultados mostraron que TMEM200A por sí sola predijo las respuestas de los BCI con una precisión del Área Bajo la Curva (AUC) > 0,5 en 7 de las 25 subpoblaciones de BCI. TMEM200A mostraron un valor predictivo más alto que los clones de células T y B, los cuales tuvieron un valor de 5. Sin embargo, el valor de TMEM200A fue inferior al de TIDE (AUC > 0,5 en 11 subpoblaciones de BCI), puntuación MSI (AUC > 0,5 en 11 subpoblaciones de BCI), CD274 (AUC > 0,5 en 15 subpoblaciones de BCI), CD8 (AUC > 0,5 en 17 subpoblaciones de BCI), IFNG (AUC > 0,5 en 16 subpoblaciones de BCI) y Merck18 (AUC > 0,5 en 17 subgrupos de BCI) (Figura 9C). El mal pronóstico de supervivencia en las cohortes ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 y ICB_Hugo 2016_PD1 se correlacionó con una alta expresión de TMEM200A . Sin embargo, TMEM200A knockdown aumentó la potencia de destrucción tumoral mediada por linfocitos en la cohorte promedio de Kearney 2018 T_PD1 y Pan 2018 OT1 (Figura 9D).

Análisis de enriquecimiento GSEA de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer
Utilizamos DEG entre TMEM200A subgrupos de alta expresión y TMEM200A de baja expresión en 32 neoplasias malignas para explorar las características del cáncer relacionadas con TMEM200A. Descubrimos una correlación sustancial entre la inmunodeficiencia primaria, la vía de señalización del receptor tipo I (gen inducible por ácido retinoico) y la expresión de TMEM200A en el pancáncer, especialmente en BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC y SKCM (Figura 10). La proteína citoplasmática viral ácido ribonucleico es detectada por la vía de señalización del receptor similar a RIG-I. Los receptores similares a RIG-I pueden influir en la producción de una variedad de citoquinas inflamatorias en el cuerpo mediante la activación de la vía de señalización NF-kB mediante la participación de ciertas proteínas de unión intracelular. Como resultado, la proteína transmembrana 200A (TMEM200A) puede desempeñar un papel crucial en el reclutamiento de proteínas intracelulares por el receptor similar a RIG-I. Estos hallazgos implicaron una fuerte correlación entre la expresión TMEM200A y la infiltración inmunológica. Además, el análisis de enriquecimiento de GSEA mostró que la expresión de TMEM200A pancancerígenos se correlacionó con la señalización de quimiocinas, la adhesión celular, las conexiones de los receptores de citocinas, las vías de detección de la membrana celular y el control de la autofagia (Figura 10). Las proteínas transmembrana pueden funcionar como moléculas de adhesión para afectar el microambiente tumoral, además de desempeñar un papel crítico en el control de la entrada de iones de calcio en la célula desde los reservorios de calcio 36. Por lo tanto, los resultados obtenidos del análisis de enriquecimiento de GSEA pueden deberse a la participación de TMEM200A en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación de las vías de transducción de señales, la formación de canales iónicos de la membrana plasmática y la regulación de la quimiotaxis celular, la adhesión, la apoptosis y la autofagia9.

Identificamos los 50 genes STAD principales correlacionados positiva y negativamente con TMEM200A de la base de datos LinkedOmics, que se coexpresaron en STAD, en forma de mapas de calor (Figura 11A, B). Evaluamos los 5 genes principales positivamente y los 5 genes principales asociados negativamente con TMEM200A en GC (Figura 11C). Nuestros resultados mostraron que TMEM200A expresión se correlacionó con la coexpresión de SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) y SYTL1 (r = -0,33). Analizamos los resultados de la visualización de umbrales para comprender mejor el papel de TMEM200A en STAD. Para el cribado se utilizaron los siguientes criterios: cambio log2 veces (FC) > 2,0 y valor de P ajustado 0,05. Encontramos 483 DEGs, de los cuales 385 estaban regulados al alza y 98 a la baja, y elegimos 100 de ellos para visualizarlos y crear un mapa de calor (Figura 11D). Luego, para los DEG que cumplieron con los criterios de selección, realizamos análisis de enriquecimiento de GO y KEGG. Los resultados del análisis de enriquecimiento de GO mostraron que el enriquecimiento de BP (Proceso Biológico) se asoció principalmente con la matriz extracelular y el tejido estructural, el enriquecimiento de CC (Componente Celular) se asoció principalmente con la matriz extracelular y la membrana basal que contienen colágeno, y MF (Función Molecular) se enriqueció principalmente en una estructura de matriz extracelular y unión a glicosaminoglicanos (Figura 11E y Figura 11G). El enriquecimiento del análisis KEGG mostró que TMEM200A estaba enriquecido principalmente en la vía de interacciones del receptor de la matriz extracelular, el citocromo P450 y el sistema renina-angiotensina (Figura 11F y Figura 11H).

Modelo pronóstico basado en TMEM200A y características clínicas del cáncer de estómago
Se investigó la correlación entre la TMEM200A y los datos clínicos de los pacientes con STAD y, por lo tanto, se analizaron las características clinicopatológicas de los pacientes de la cohorte TCGA-STAD mediante análisis de regresión logística y en función de los niveles de expresión TMEM200A (Figura 12A). La edad, el estadio clínico y la expresión de TMEM200A se correlacionaron sustancialmente con la SG en pacientes con STAD, según un análisis de regresión de Cox univariante (figura 12B). El análisis multivariante de regresión de Cox mostró que la expresión TMEM200A podría ser un factor predictivo independiente de SG en pacientes con STAD (HR = 1,282, IC 95% = 1,066-1,541, P = 0,008) (Figura 12C). Examinamos el potencial de estas características clinicopatológicas para predecir la SG después de 1, 3 y 5 años en STAD utilizando el modelo de diagrama de línea de columna estándar junto con varios parámetros clínicos (Figura 12D). Las curvas de calibración para las probabilidades de supervivencia a 1 año fueron muy consistentes con las probabilidades predichas por el diagrama de columna (Figura 12E).

TMEM200A la regulación positiva en las células STAD y la mejora de la proliferación celular
Al revisar la literatura relacionada con TMEM200A, descubrimos que la alta expresión de TMEM200A indicaba un mal pronóstico 13 y que el microambiente inmune del GC podría estar influenciado por TMEM200A actuando como una molécula de adhesión37, promoviendo así la invasión y metástasis de las células del GC. Examinamos los niveles de proteínas y los niveles de transcripción de ARNm de TMEM200A en líneas celulares STAD para confirmar los hallazgos del estudio antes mencionado. La línea celular GC HGC-27 sobreexpresó dramáticamente TMEM200A en comparación con la línea celular epitelial de la mucosa gástrica sana GES-1 tanto a nivel de proteína como de transcripción de ARNm (Figura 13A, B), lo que indica que TMEM200A se sobreexpresó en las células HGC-27. Como resultado, se realizaron las siguientes pruebas utilizando células HGC-27. Mientras tanto, para demostrar la precisión de los resultados experimentales, utilizamos qRT-PCR para comparar la expresión diferencial de ARNm de TMEM200A en células GC humanas SGC-7901 y células epiteliales de la mucosa gástrica GES-1, y los resultados mostraron que TMEM200A estaba altamente expresada en células SGC-7901 (Figura 13B). TMEM200A se eliminó en células HGC-27 para examinar la posible implicación de TMEM200A en la DATU (Figura 13C). Con base en los resultados de la minería de la base de datos y nuestro análisis de correlación de TMEM200A, se encontró que TMEM200A estaba principalmente involucrado en la vía de interacciones de receptores de matriz extracelular, que se asoció con la proliferación e invasión del cáncer. Por lo tanto, empleamos ensayos de CCK-8 para determinar cómo la expresión TMEM200A afectaba el crecimiento celular. Los ensayos CCK-8 mostraron que TMEM200A grupos knockdown (Si-RNA2 y Si-RNA3) mostraron una caída notable en la viabilidad celular en comparación con el grupo NC (Figura 13D). Estos hallazgos sugirieron que TMEM200A estaba regulada al alza en STAD, y su nivel de expresión podría afectar la proliferación de células GC. Basándonos en los resultados del análisis de enriquecimiento de KEGG en la Figura 11F, encontramos que TMEM200A se asoció con la vía de señalización PI3K/AKT en GC, y TMEM200A, como factor de adhesión celular, puede influir en el mecanismo de carcinogénesis gástrica al afectar a la EMT. Por lo tanto, utilizamos Western blot para verificar los efectos de TMEM200A knockdown en EMT y la vía de señalización PI3K/AKT antes y después de knockdown. Los resultados mostraron que la expresión de la proteína P-AKT disminuyó en el grupo de eliminación TMEM200A (TMEM200A-SiRNA2) en comparación con el grupo de control negativo (NC), mientras que los niveles de proteínas N-cadherina, Vimentina y Snai también disminuyeron y la expresión de la proteína E-cadherina aumentó (Figura 13E). Todos estos resultados sugieren que TMEM200A pueden afectar a la EMT a través de la vía de señalización PI3K/AKT y, por lo tanto, desempeñar un papel en la GC.

Figure 1
Figura 1: El flujo de trabajo del estudio. Abreviaturas: TCGA = Base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer; TIMER2.0 = La base de datos TIMER2.0; SG= supervivencia general; SSP = Tiempo de supervivencia libre de progresión; DSS = Supervivencia específica de la enfermedad; SSE = supervivencia libre de enfermedad; TMB = carga mutacional tumoral; MSI = Inestabilidad de microsatélites; IBP = Interacción proteína-proteína; GGI = Interacción gen-gen; KEGG = Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; GO = Ontología de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Niveles de expresión de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer. (A) Expresión regulada al alza o a la baja de TMEM200A del conjunto de datos TCGA en diferentes neoplasias malignas humanas. (B) Análisis de los niveles de expresión de TMEM200A en tejidos tumorales y normales utilizando la base de datos TIMER2.0. (C) Análisis diferencial de la actividad de TMEM200A genes en varios cánceres humanos a partir del conjunto de datos de TCGA. (D) Clasificación de los niveles de actividad génica de TMEM200A en varios cánceres humanos basada en la puntuación ssGSEA. (E) TMEM200A niveles de expresión de la base de datos de HPA en tejidos sanos. (F) Niveles de expresión TMEM200A de la base de datos HPA en líneas celulares normales. (G) Resultados de IHQ para la expresión de la proteína TMEM200A en el cáncer a partir de la base de datos HPA. Abreviaturas: TCGA = Atlas del Genoma del Cáncer; ssGSEA = Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única; HPA = Atlas de Proteínas Humanas; IHQ = Inmunohistoquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Correlación de la expresión de TMEM200A con las características clinicopatológicas y el pronóstico de diferentes tumores. (A) Se analizó la correlación de la expresión de TMEM200A en la cohorte pancancerígena TCGA (PanCan) con la estadificación clinicopatológica en cada tumor utilizando la base de datos Xena de la UCSC. (B) Correlación de la expresión de TMEM200A en la cohorte TCGA PANCAN con la edad del paciente en cada tumor. (C) Correlación de la expresión de TMEM200A en la cohorte TCGA PANCAN con el grado patológico tumoral en cada tumor. (D) Correlación de la expresión de TMEM200A en la cohorte TCGA PanCan con el estado de supervivencia de los pacientes en cada tumor. (E) Análisis de correlación de la expresión de TMEM200A con la supervivencia global pancancerígena en varios cánceres utilizando el modelo de regresión de Cox. (F) Correlación entre la expresión de TMEM200A y el pronóstico de SG pancancerosa en la cohorte TCGA PanCan. (G) Correlación entre la expresión TMEM200A y la supervivencia específica de la enfermedad. (H) Correlación entre la expresión TMEM200A y el pronóstico de intervalos libres de progresión en la cohorte TCGA PanCan. (I) Correlación entre la expresión TMEM200A y el intervalo libre de enfermedad. (J) Se realizó un análisis multifactorial de regresión de COX en KIRC. (K) Se realizó un análisis multifactorial de regresión de COX en KIRP. Abreviaturas: TCGA = Atlas del Genoma del Cáncer; KIRC: Carcinoma renal renal de células claras; KIRP: Carcinoma renal de células papilares renales; SG = supervivencia general; DSS = supervivencia específica de la enfermedad; PFI = Intervalo libre de progresión; DFI = Intervalo libre de enfermedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de metilación del ADN de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer. (A) Se examinaron los niveles de metilación del promotor de TMEM200A en varios tipos de cáncer, según la base de datos SMART. (B) Se examinaron niveles de metilación del promotor más altos de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer que en los tejidos normales de acuerdo con la base de datos UALCAN. (C) Utilizando la base de datos UALCAN, se determinó que los tejidos normales tenían niveles más bajos de metilación del promotor de TMEM200A en varios tipos de cáncer. (D) El nivel de metilación del ADN de TMEM200A en BLCA, HNSC, LUAD y STAD cambió con el estadio patológico. Abreviaturas: BLCA = Carcinoma urotelial de vejiga; HNSC= Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; LUAD=Adenocarcinoma de pulmón; STAD= Adenocarcinoma de estómago. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: TMEM200A mutaciones genéticas en diferentes tipos de cáncer. (A) Análisis de TMEM200A tipos de mutaciones genéticas en diferentes cánceres utilizando la base de datos cBioPortal. (B) Estructura proteica 3D de TMEM200A. El área de unión se indica con la parte coloreada, mientras que las otras secciones de TMEM200A se muestran con la parte gris. (C) Isoformas y distribución de TMEM200A mutaciones somáticas. Eje X, sitios de aminoácidos; eje y, número de mutaciones TMEM200A ; puntos verdes, mutaciones sin sentido; y puntos grises, mutaciones truncadas. (D) Validación de las isoformas y distribución de TMEM200A mutaciones somáticas utilizando datos de Sangerbox 3.0. (E) Para todos los tumores TCGA, la correlación entre el estado de la mutación y la predicción de la supervivencia general de los pacientes se investigó utilizando la base de datos cBioPortal, con cuadrados rojos que indican el grupo de mutación TMEM200A y cuadrados azules que indican el grupo no mutado. (F) Los genes co-mutados con TMEM200A se analizaron utilizando la herramienta cBioPortal: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 y SLC18B1. (G) Análisis de TMEM200A tipos de mutaciones en GC utilizando la base de datos COSMIC. (H) Se realizó un análisis de TMEM200A tipos de SNV en GC utilizando la base de datos COSMIC. Abreviaturas: TCGA = Atlas del Genoma del Cáncer; SG = supervivencia general; COSMIC = Catálogo de mutaciones somáticas en células cancerosas; GC = Cáncer gástrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Análisis de correlación de células individuales de la expresión de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer. (A) Resumen de la expresión de TMEM200A en el sitio web de TISCH. (B) Distribución de ocho tipos celulares distintos en el conjunto de datos de GSE72056 melanoma cutáneo metastásico. (C) Niveles de expresión de TMEM200A en células de melanoma metastásico cutáneo del conjunto de datos GSE72056. (D) Distribución de 13 tipos celulares distintos en el conjunto de datos de cáncer colorrectal de GSE146771. (E) TMEM200A niveles de expresión en células de cáncer colorrectal a partir del conjunto de datos GSE146771. (F) La correlación de la expresión de TMEM200A con el estado funcional de una sola célula en múltiples tumores se demostró utilizando la base de datos CancerSEA. (G) Mapas T-SNE que ilustran los niveles de expresión de TMEM200A en células tumorales individuales, incluidas GBM, LUAD, CML, CRC, RB y UM. Abreviaturas: GBM = Glioblastoma; LUAD = adenocarcinoma de pulmón; LMC = leucemia granulocítica crónica; CCR = Cáncer colorrectal; RB = Retinoblastoma; UM = melanoma uveal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Red de coexpresión y análisis de enriquecimiento funcional de TMEM200A a nivel génico. (A) Red GGI de TMEM200A y sus genes coexpresados. (B) Red PPI. (C,D) TMEM200A y los genes coexpresados se analizaron para el enriquecimiento de las vías GO y KEGG. Abreviaturas: PPI = Interacción proteína-proteína; GGI = Interacción gen-gen; KEGG = Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; GO = Ontología de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Correlación entre la expresión de células TMEM200A e inmunitarias, agentes inmunosupresores, sustancias inmunoestimulantes y moléculas MHC en varios tipos de cáncer. (A) Mapa de calor Sangerbox 3.0 que demuestra la correlación entre la expresión TMEM200A y las células inmunitarias. (B) Mapa de calor que muestra la correlación entre las células inmunes infiltrantes y la expresión de TMEM200A en la base de datos TISIDB. (C) Mapa de calor que muestra la correlación entre las células inmunosupresoras y la expresión de TMEM200A en la base de datos TISIDB. (D-F) Correlación entre la expresión TMEM200A y ciertos agentes inmunosupresores en el cáncer testicular y el melanoma uveal. (G) Mapa de calor que muestra la correlación entre los factores inmunoestimuladores y la expresión de TMEM200A en la base de datos TISIDB. (H) Mapa de calor de la correlación entre la expresión de TMEM200A y las moléculas MHC en la base de datos TISIDB. (I-L) Correlación entre la expresión de TMEM200A y algunos factores inmunoestimulantes y moléculas MHC en el carcinoma urotelial de vejiga, carcinoma testicular, carcinoma de corteza suprarrenal y melanoma uveal. (M) Correlación entre los subgrupos inmunes pancancerígenos y la expresión TMEM200A. (N) Correlación entre los subgrupos moleculares pancancerígenos y la expresión TMEM200A. Abreviaturas: MHC = Complejo mayor de histocompatibilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Análisis de la respuesta inmunoterapéutica de TMEM200A en pancitopenia. (A) Correlación de la expresión de TMEM200A en diferentes cánceres con TMB. (B) Correlación entre MSI en pan-cáncer y TMEM200A expresión. (C) TMEM200A potencial como biomarcador para predecir la respuesta de bloqueo de puntos de control inmunitario. (D) Para clasificarlo se utilizó la media ponderada de la correlación de TMEM200A con el resultado de supervivencia de la ICB y el cambio de pliegue logarítmico (logFC) en el cribado de CRISPR. Abreviaturas: TMB = Carga mutacional tumoral; BCI = bloqueo de puntos de control inmunitario; CRISPR = Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Análisis de enriquecimiento GSEA de TMEM200A en diferentes tipos de cáncer. Las cinco vías principales en las que TMEM200A desempeñaron un papel funcional importante en la regulación de 32 cánceres se identificaron mediante el análisis de enriquecimiento de GSEA. El panel izquierdo muestra los resultados del análisis de enriquecimiento de GSEA para TMEM200A en ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ y SARC. El panel de la derecha muestra los resultados del análisis de enriquecimiento de GSEA para TMEM200A en SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS y UVM. Abreviaturas: GSEA = Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes; ACC = carcinoma de corteza suprarrenal; BLCA = carcinoma urotelial de vejiga; BRCA = carcinoma invasivo de mama; CESC = carcinoma de células escamosas cervicales y adenocarcinoma endocervical; CHOL = Colangiocarcinoma; COAD = adenocarcinoma de colon; ESCA = carcinoma de esófago; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; KICH = Cromófobo del riñón; KIRC = carcinoma renal de células claras de riñón; KIRP = carcinoma renal de células papilares renales; LAML = leucemia mieloide aguda; LGG = glioma cerebral de grado inferior; LIHC = carcinoma hepático hepatocelular; LUAD = adenocarcinoma de pulmón; LUSC = carcinoma de células escamosas de pulmón; MESO = mesotelioma; OV = cistoadenocarcinoma seroso de ovario; PAAD = adenocarcinoma de páncreas; GPCP = feocromocitoma y paraganglioma; PRAD = adenocarcinoma de próstata; LEA: Adenocarcinoma de recto; SARC=Sarcoma; SKCM = Melanoma cutáneo cutáneo; STAD = adenocarcinoma de estómago; TGCT = tumores testiculares de células germinales; THCA = Carcinoma de tiroides; THYM = timoma; UCEC = Carcinoma de endometrio del cuerpo uterino; SCU = carcinosarcoma uterino; UVM = melanoma uveal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: TMEM200A en STAD. (A) Los 50 genes principales encontrados con una correlación negativa con la expresión de TMEM200A en STAD por la base de datos LinkedOmices. (B) Los 50 genes principales en STAD que se conectaron positivamente con TMEM200A. (C) Los cinco genes principales de TMEM200A correlacionados positivamente y cinco negativamente en STAD. (D) Mapa de calor de los DEG en STAD. (E-H) Investigación de las vías GO y KEGG enriquecidas utilizando los DEG cribados. Abreviaturas: STAD=Adenocarcinoma de estómago; DEGs= Expresión diferencial de genes; KEGG = Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; GO = Ontología de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Correlación entre las características clínicas de STAD y TMEM200A nivel de expresión. (A) Análisis de los niveles de expresión de TMEM200A y de los rasgos clínicos de STAD mediante regresión logística. (B,C) Análisis de Cox de parcelas forestales STAD para variables simples y múltiples. (D) Diagramas de líneas de columna que predicen la SG en pacientes con STAD según el sexo, el grado patológico, la edad, el estadio patológico y la expresión TMEM200A . (E) Gráficos de calibración que muestran la calibración del modelo de gráfico de líneas de columnas. Abreviaturas: STAD= Adenocarcinoma de estómago; SG=supervivencia global. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 13
Figura 13: La expresión de TMEM200A está regulada al alza en STAD y promueve la proliferación de células cancerosas gástricas. (A) Detección de la expresión de TMEM200A en células de cáncer gástrico HGC-27 y células epiteliales de la mucosa gástrica GES-1 mediante Western blot. (B) Detección de la expresión de TMEM200A en células GC HGC-27 y SGC-7901, y células epiteliales de la mucosa gástrica GES-1 mediante qRT-PCR. (C) La eficiencia de expresión de TMEM200A se redujo considerablemente en el grupo de TMEM200A knockdown en comparación con el grupo no knockdown en células GC HGC-27, como se demostró mediante qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown inhibió significativamente la proliferación de las células GC medida por el ensayo CCK8. (E) La eliminación de TMEM200A inhibió significativamente las proteínas relacionadas en EMT y afectó la fosforilación de AKT en la vía de señalización PI3K/AKT. Abreviatura: GC = Cáncer gástrico; qRT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; EMT=Transición epitelio-mesenquimatosa; AKT = Proteína quinasa B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

TMEM200A pertenece a una familia de TMEMs que es esencial para que las células cancerosas proliferen38. La expresión variable de TMEM200A en diferentes neoplasias malignas ha recibido menos atención y falta una investigación exhaustiva del pancáncer. Sin embargo, la evidencia continúa acumulándose, mostrando que la familia de proteínas transmembrana TMEM puede ser importante para mantener las células cancerosas malignas a través de interacciones con varias proteínas, por ejemplo, la activación de los canales de Cl- activados por TMEM16A Ca2+ por ROCK1/moesina promueve la metástasis de BRCA39. Por lo tanto, en el presente trabajo, nuestros análisis se centraron en explorar la viabilidad de la TMEM200A como diana terapéutica del cáncer y marcador diagnóstico tumoral. En particular, investigamos los niveles de expresión de TMEM200A en 33 tumores malignos utilizando datos de RNA-seq de la base de datos Xena de la UCSC, y los resultados de la base de datos TIMER2.0 validaron con éxito los análisis en la base de datos Xena de la UCSC.

Posteriormente, se utilizó la herramienta web Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) y la base de datos CancerSEA para analizar los niveles de expresión de TMEM200A en diferentes tipos de monocitos. Se utilizaron los sitios web de Sangerbox y TISIDB para ayudar a comprender cómo afecta la TMEM200A a la infiltración inmunitaria. También identificamos las vías de señalización en las que TMEM200A desempeña una función clave en cada cáncer mediante el análisis de enriquecimiento de GSEA para comprender los principales roles funcionales de TMEM200A en cada neoplasia maligna.

TMEM200A puede actuar como una molécula de adhesión para controlar el entorno inmunitario de la CG y promover la diseminación invasiva de las células de GC. Por lo tanto, identificamos 483 genes expresados diferencialmente (DEGs) asociados con el nivel de expresión de TMEM200A a través de la base de datos TCGA y analizamos el enriquecimiento de GO y KEGG de estos 483 DEGs. Los resultados del enriquecimiento mostraron que la vía PI3K/AKT desempeña un papel clave en el desarrollo del cáncer, y la vía PI3K/AKT puede ser uno de los factores impulsores del cáncer.

Además, llevamos a cabo pruebas celulares y moleculares después de aprender más sobre la función crucial de la TMEM200A en el impulso del desarrollo del cáncer para confirmar la correlación entre la expresión de TMEM200A y la actividad de las células STAD. Como era de esperar, descubrimos que la regulación negativa de la TMEM200A en las células STAD reducía en gran medida la proliferación celular, y que las líneas celulares cancerosas expresaban TMEM200A a niveles considerablemente mayores que las líneas celulares normales. Al combinar la literatura relacionada con la familia de proteínas transmembrana en los últimos años, encontramos que las proteínas transmembrana, como moléculas de adhesión celular37, tienen un papel regulador en la EMT.

Además, de acuerdo con los resultados del análisis de enriquecimiento de genes relacionados con TMEM200A en GC, encontramos que TMEM200A pueden tener un papel regulador en la vía de señalización PI3K/AKT en GC. Los experimentos de Western blot revelaron que TMEM200A knockdown podría reducir las proteínas Vimentina, N-cadherina y Snai e inhibir la fosforilación de AKT, lo que sugiere que TMEM200A regula el microambiente tumoral al afectar a la EMT, y que la vía de señalización PI3K/AKT puede estar involucrada en la regulación mediada por TMEM200A del desarrollo de GC. En los últimos años, algunos estudios han encontrado que la EMT es la principal causa de resistencia a los medicamentos de quimioterapia en pacientes con GC. La plasticidad epitelio-mesenquimal (PEM) y el microambiente tumoral se han descrito como factores limitantes para un tratamiento eficaz en muchos tipos de cáncer40. La aparición de EMT puede hacer que las células GC pierdan sus propiedades características y muestren las características de las células mesenquimales41. Esta característica no solo reduce la sensibilidad de los pacientes con GC a los fármacos quimioterapéuticos, sino que también mejora la capacidad invasiva y migratoria de las células GC, lo que conduce a la metástasis tumoral. Por lo tanto, por las razones mencionadas anteriormente, nuestro estudio ayuda a la investigación y el desarrollo de puntos regulatorios clave en EMT y al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos dirigidos, mediante la exploración del mecanismo de acción específico de TMEM200A que afectan a EMT.

El uso de la bioinformática para la investigación ha aumentado en los últimos años, y para este estudio se accedió a datos de varias bases de datos de Internet. El uso de estas bases de datos en línea en bioinformática ha simplificado y acelerado el estudio del cáncer, y también proporciona a los investigadores un medio asequible para validar sus resultados.

Sin embargo, la técnica bioinformática tiene ciertos inconvenientes. Cuando utilizamos estas bases de datos para el análisis, el mismo estudio puede proporcionar hallazgos inconsistentes o incluso contradictorios en múltiples bases de datos, ya que muchas bases de datos en línea incluyen datos de varios conjuntos de datos. Además, muchas bases de datos no se actualizan durante mucho tiempo y, debido a las dificultades del derecho de autor, su contenido nunca puede ampliarse; Por lo tanto, los hallazgos analíticos que los investigadores obtienen de estas bases de datos siempre son limitados. Por lo tanto, en esta investigación, empleamos diferentes bases de datos para examinar los resultados colectivamente para superar estas limitaciones y garantizar la exactitud de los hallazgos. Para asegurarnos de que los hallazgos que obtuvimos no se alteraron considerablemente, repetimos el procedimiento utilizando diferentes bases de datos para el análisis. Los resultados de los experimentos de Western blot apoyaron nuestra predicción bioinformática de que TMEM200A pueden controlar la EMT en GC mediante la regulación de la vía de señalización PI3K/AKT, lo que luego afectaría la proliferación de las células GC. Predijimos el mecanismo de acción de TMEM200A utilizando la bioinformática en conjunto con la literatura relacionada.

En resumen, este trabajo demuestra cómo las herramientas bioinformáticas pueden facilitar significativamente el diseño experimental y ser utilizadas para hacer muchos otros tipos de predicciones de investigación científica. Es probable que los futuros investigadores del cáncer adopten el paradigma primario de combinar la validación experimental con la predicción bioinformática, y este trabajo sirve como un buen modelo para este objetivo.

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Disclosures

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82160550).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

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References

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TMEM200A Análisis Multiómico Biomarcador Pancanceroso Proteína Transmembrana Infiltración Inmune Datos de RNA-seq Biomarcador de Diagnóstico Biomarcador de Pronóstico Cáncer Gástrico (GC) Cultivos Celulares In Vitro Knockdown Reacción Cuantitativa en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (qPCR) Western Blotting Comportamiento Maligno Formación de Tumores Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) Vía de Señalización PI3K/AKT Inhibición de la Proliferación
Análisis multiómico de <em>TMEM200A</em> como biomarcador pancancerígeno
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Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

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