Summary
在这里，提出了一个协议，其中结合了多种生物信息学工具来研究 TMEM200A 在癌症中的生物学功能。此外，我们还通过实验验证了生物信息学的预测。
Abstract
TMEM200A，跨膜蛋白已知与人类癌症和免疫浸润有关。在这里，我们通过多组学分析评估了TMEM200A在常见癌症中的功能，并使用胃细胞的体外细胞培养来验证结果。使用UCSC Xena数据库中的RNA-seq数据评估了几种人类癌症类型中TMEM200A的表达。生物信息学分析揭示了TMEM200A作为诊断和预后生物标志物的潜在作用。
培养正常胃细胞系和癌细胞系的培养物，并敲除 TMEM200A 细胞系。采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定 TMEM200A 的表达水平。然后使用 体外 功能丧失研究来确定 TMEM200A 在胃癌 （GC） 细胞恶性行为和肿瘤形成中的作用。Western blot用于评估敲低对GC中上皮-间充质转化（EMT）和PI3K/AKT信号通路的影响。生物信息学分析表明， TMEM200A 在GC中表达水平较高。
TMEM200A敲低抑制了GC细胞的增殖，这也降低了波形蛋白、N-钙粘蛋白和Snai蛋白，并抑制了AKT磷酸化。PI3K/AKT 信号通路似乎也参与了 TMEM200A介导的 GC 发育调节。本文提出的结果表明，TMEM200A通过影响EMT来调节肿瘤微环境。TMEM200A也可能通过PI3K/AKT信号传导影响EMT，从而影响肿瘤微环境。因此，在泛癌，尤其是GC中，TMEM200A可能是一种潜在的生物标志物和癌基因。
Introduction
癌症已成为一个持续存在的公共卫生问题，危害全球人类健康1，因为它在世界范围内发病率和死亡率很高，给社会带来了沉重的经济和医疗负担2。近年来，由于癌症标志物3 的发现，癌症治疗取得了重大进展，研究人员开发了治疗癌症的新诊断方法和新药。然而，由于耐药性、药物副作用和化学敏感性等因素，一些癌症患者的预后仍然较差4.因此，迫切需要确定用于筛查和治疗早期癌症的新生物标志物5.
膜蛋白是可以结合并整合到细胞和细胞器膜中的蛋白质6.根据与膜结合的强度及其位置，这些可分为三类：脂质锚定蛋白、整合蛋白和外周膜蛋白 7,8。跨膜 （TMEM） 蛋白是一种完整的膜蛋白，由至少一个跨膜片段9 组成，该片段完全或部分穿过生物膜。
尽管属于TMEM家族的蛋白质的作用机制尚不清楚，但已知这些蛋白质与几种类型的癌症有关10。几种 TMEM 蛋白与迁移性、增殖性和侵袭性表型相关，它们的表达通常与患者的预后相关11。因此，TMEM家族成员成为研究的对象。对 TMEM 现有报告的全面回顾表明，它们主要与细胞间和细胞内信号转导12、免疫相关疾病和肿瘤发生10 相关。许多TMEM还具有重要的生理功能，例如质膜中的离子通道，信号转导途径的激活，以及细胞趋化性、粘附、凋亡和自噬的介导10。因此，我们假设TMEM蛋白可能是肿瘤检测和治疗的重要预后标志物。
TMEM200A 在胃癌 （GC） 中的表达显著升高。 TMEM200A13 在染色体 6q23.1 上有 8 个外显子，全长为 77.536 kb，其高表达与 GC 病例的总生存期 （OS） 预后较差有关。然而，其表达的变化在肿瘤学研究中很少报道。本文比较和分析了 TMEM200A 作为治疗靶点和肿瘤诊断标志物在各种癌症研究中的有用性，使用不同的公开数据集。我们使用来自UCSC Xena和TCGA数据库的RNA-seq数据，以及实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹，评估 了TMEM200A 作为泛癌诊断和预后生物标志物的有效性及其在各种人类癌症类型中的表达水平。
使用计算工具和数据集网站的组合进一步研究了 TMEM200A 表达水平对突变率、调控过程、肿瘤诊断和预后、免疫浸润和免疫治疗的影响。CBioPortal 和癌细胞体细胞突变目录 （COSMIC） 数据库用于检查 TMEM200A突变。利用 Sangerbox 和 TISIDB 网站来了解 TMEM200A 如何影响免疫浸润。利用肿瘤免疫单细胞中心（Tumor Immune Single Cell Center，TISCH）在线工具和CancerSEA数据库研究 TMEM200A的功能。最后，为了评估 TMEM200A 对GC细胞恶性行为和肿瘤发展功能的影响，在 体外 试验中进行了功能丧失实验。此外，还进行了蛋白质印迹分析，以评估 敲低TMEM200A 如何影响 GC 中的 PI3K/AKT 信号通路和上皮-间充质转化 （EMT）。
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Protocol
1. 癌症基因组图谱（TCGA）数据库
注：癌症基因组图谱 （TCGA） 数据库包含不同肿瘤组织中基因的测序数据14。从UCSC Xena网站15（https://xenabrowser net/datapages/）中提取TCGA中用于研究百万分之一（TPM）格式TMEM200A转录本的RNA-seq数据，并转换log2以比较样品之间的表达。
- 转到 UCSC Xena 网站界面。
- 单击 “启动 Xena ”选项卡。
- 单击屏幕顶部的 “数据集 ”选项卡。
- 从本页的 129 个队列和 1,571 个数据集中，单击选项卡，共查看 33 种癌症，例如 GDC TCGA 急性髓系白血病 （LAML）、GDC TCGA 肾上腺皮质癌 （ACC）、GDC TCGA 胆管癌 （CHOL） 等。
- 从 基因表达 RNAseq 菜单中，选择并单击 HTSeq - FPKM GDC Hub 选项卡。
注意： HTSeq - FPKM GDC Hub 表示已通过同意更正的数据。 - 在 下载 菜单中，单击其相应的链接。
注：通过上述方法，下载了 33 种不同癌症类型的 RNA-Seq 数据。 - 将 33 种不同癌症类型的 RNA-seq 数据的 zip 存档解压缩到计算机桌面文件夹中的单个文件中。
- 将解压缩的 txt 文件统一到同一文件夹中，并将 Perl 脚本放在此文件夹中。
- 打开Perl软件，将文件夹的路径复制粘贴到鼠标光标所在的Perl软件中，按Enter键，输入Perl代码的名称和基因名称（TMEM200A），然后按Enter键获取新的txt文件（singleGeneExp.txt）。
注：这个新的 txt 文件 （singleGeneExp.txt） 包含不同患者 33 种癌症中 TMEM200A 的基因表达。 - 打开 R 代码 （diffR） 并将 singleGeneExp.txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件，运行修改后的 R 代码（diffR），通过“ggpubr”包绘制图片。
2. TIMER2.0 数据库
- 转到 TIMER2.0 （http://timer.cistrome.org）数据库 16 网站界面。
- 单击“癌症探索”选项卡。
- 在搜索框中输入基因ID（TMEM200A），点击 提交 标签页，获取不同类型肿瘤中 TMEM200A 的差异表达图像。
3. 人类蛋白质图谱（HPA）
- 转到 人类蛋白质图谱 （HPA） （www.proteinatlas.org） 17Web 界面。
- 在搜索框中键入 ID （TMEM200A），然后单击“搜索”按钮。选择 TISSUE 子图集。
- 将鼠标悬停在页面上并向下滚动以找到 “蛋白表达概述 ”选项卡。
注： 蛋白质表达概述 部分显示了人体 45 个器官中 TMEM200A 的蛋白质表达水平。
4. HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA甲基化平台阵列
注：HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA甲基化平台芯片用于收集甲基化数据。我们可以使用 SMART （http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/） 数据库18 评估 TMEM200A DNA 甲基化水平。
- 转到 SMART 网站界面。
- 在搜索框中输入基因ID（TMEM200A），即可获得染色体中TMEM200A的分布和不同类型恶性肿瘤中TMEM200A的甲基化水平。
- 向下滚动页面到 “单击以检查 CpG 聚集的甲基化 ”菜单，然后单击 “绘图 ”按钮。在页面底部，找到并单击 “下载图 ”按钮。下载图。
5. UALCAN数据库
- 转到 UALCAN 网站界面。
注：通过UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html）生成各种恶性肿瘤中TMEM200A启动子甲基化水平的箱形图19 - 在页面顶部，单击 TCGA 按钮。
- 在屏幕上的基因 ID 输入框中输入 TMEM200A 。在 TCGA 数据集 菜单中，向下滚动并选择要查询的癌症类型。
- 点击“探索”按钮后，点击“分析链接”菜单中的“亚组分析甲基化”，得到该肿瘤的甲基化结果。
注：通过这种方法，我们在 UALCAN 数据库中获得了 22 个肿瘤的甲基化结果。
6. 癌细胞体细胞突变目录（COSMIC）数据库
- 转到 癌细胞体细胞突变目录 （COSMIC） 网站界面。
注：有关人类基因组中编码突变、非编码突变基因组重排和融合基因的数据可从 癌细胞体细胞突变目录 （COSMIC） 数据库20 （https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/） 中获得，该数据库也用于确定各种癌症中各种TMEM200A 突变的频率。 - 在搜索框中输入基因 ID （TMEM200A），然后单击 “搜索 ”按钮进入新屏幕。
- 在 “基因 ”菜单中，找到并单击显示 TMEM200A 基因 ID 名称的链接。
- 在新页面上找到 Mutation distribut grouping 列，获取 肿瘤中TMEM200A 的突变状态。
7. CBio门户
- 进入 CBioPortal 网站界面。
注：可以使用 cBioPortal （www.cioportal.org） 数据库查找、下载、分析和可视化癌症基因组学数据。体细胞突变、DNA 拷贝数变化 （CNA）、mRNA 和 microRNA （miRNA） 表达、DNA 甲基化、蛋白质丰度和磷蛋白丰度只是 cBioPortal21 整合的基因组数据类型中的一小部分。使用cBioPortal，可以进行广泛的研究;然而，主要重点是与突变及其可视化相关的不同分析。 - 从“选择可视化和分析研究”部分的“泛癌研究”小节中选择“全基因组的泛癌分析”数据集。然后，单击“按基因查询”按钮。
- 在“输入基因”的查询框中输入目标基因ID（TMEM200A）。单击“提交查询”按钮。
- 单击页面顶部的 “癌症类型详细信息 ”按钮，以获取各种类型癌症中 TMEM200A 突变。
8. Sangerbox 3.0 工具
- 转到 Sangerbox 3.0 工具 界面。
注：使用Sangerbox 3.0工具22（http://vip.sangerbox.com/ 中的泛癌免疫浸润数据，CIBERSORT免疫浸润分析了TMEM200A表达与所有癌症中免疫浸润细胞，免疫抑制剂，免疫刺激因子和MHC分子（主要组织相容性复合物）的相关性。 - 在页面左侧的工具栏中，选择并单击“泛癌分析”菜单中的“免疫细胞分析（CIBERSORT）”选项卡。
- 在“输入基因”的查询框中输入目标基因ID（TMEM200A）。单击“提交”按钮。
9. TISIDB数据库
- 转到 TISIDB 网站界面。
注： TISIDB 数据库23 （http://cis.hku.hk/TISIDB/） 用于检查TMEM200A 表达与各种癌症中免疫浸润细胞、免疫抑制剂、免疫刺激因子和 MHC 分子的相关性。 - 在“输入基因”的查询框中输入目标基因符号（TMEM200A）。单击“提交”按钮。
- 单击页面顶部的 淋巴细胞、免疫调节剂、趋化因子和 亚型 部分。下载页面底部的相关图片。
10. TIDE数据库
- 转到 TIDE 网站界面。
注：TIDE数据库（http://tide.dfci.harvard.edu/）用于评估TMEM200A 作为预测肿瘤免疫检查点阻断治疗反应的生物标志物的潜力。 - 在初始屏幕上输入电子邮件地址以注册帐户并登录。
- 找到页面顶部的生物 标志物评估 小节，然后单击它。
- 在页面底部的“输入基因”的查询框中输入目标基因 ID （TMEM200A）。然后，单击“提交”按钮。
- 在页面中，拖动鼠标向下滑动页面以查找分析结果。
11. CancerSEA数据库
- 转到 CancerSEA 网站界面。
注：使用单细胞测序数据，研究了 TMEM200A 表达与不同肿瘤细胞功能状态之间的关系。这是使用 CancerSEA 数据库24 （http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/） 完成的。 - 在页面顶部，找到并单击 “搜索 ”选项卡。
- 在“输入基因”的查询框中输入目标基因ID（TMEM200A）。单击“提交”按钮。
12. 肿瘤免疫单细胞中心（TISCH）网络工具
- 进入 肿瘤免疫单细胞中心（TISCH）网络工具 网站界面。
注：使用肿瘤免疫单细胞中心 （TISCH） 网络工具25 也显示了TMEM200A和癌细胞表达水平之间的相关性。 - 在“输入基因”的查询框中输入目标基因ID（TMEM200A）。单击“浏览”按钮。
- 在此页的 “癌症类型 ”菜单中，选择并单击 “所有癌症” 数据集。然后，向下滚动页面并单击 “搜索 ”按钮。
13. 基因狂热
- 转到 GeneMANIA 网站界面。
注：使用基因多关联网络网站 GeneMANIA （www.genemania.org）26 的整合策略预测TMEM200A与其功能相关基因之间的相关性，用于构建基因-基因相互作用 （GGI） 网络。 - 在页面左上角的 搜索 框中，输入基因 ID （TMEM200A），然后单击 搜索工具。
注： GeneMANIA 网络工具用于查找 20 个与 TMEM200A相关的基因。
14. 功能富集分析
- 以 txt 文件格式保存要分析的基因的符号 ID，以便富集。
- 打开 R 代码 （symbolidR） 并将上述 txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码 （symbolidR）。通过“org.Hs.eg.db“包装。获取 id.txt 文件。
- 打开 R 代码（GOR 和 KEGGR），将 id.txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码（GOR 和 KEGGR）。要遵循此协议，请通过软件包“clusterProfiler”，“org”分析这些基因的GO和KEGG富集。Hs.eg.db“和”enrichplot“，并使用包”gglot2“绘制富集结果。
15. 基因活性差异分析
注：使用ssGSEA（单样本基因集富集分析）27计算每个癌症样本中的TMEM200A评分，并对各种癌症的癌性和健康组织中TMEM200A基因活性进行差异分析。
- 基于步骤1.7中下载的33种肿瘤类型的RNA-seq数据，解压缩所有下载的文件，并将它们放在一个统一的文件夹中。
- 将 merge.txt 文件放在上面的文件夹中。
注：来自 BioWolf （www.biowolf.cn） merge.txt文件中的数据包含癌症基因组图谱 （TCGA） 数据库中所有肿瘤中所有患者的基因表达。 - 打开 R 代码 （ssGSEAR） 并将上述文件夹所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 取 R 代码 （ssGSEAR） 中 geneName 所在的行，然后输入基因 ID （TMEM200A）。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码 （ssGSEAR）。获取基因活性的评分文件： scores.txt。
注：使用ssGSEA算法，我们首先根据 merge.txt 文件中提供的数据，根据基因之间的相关系数构建一个基因集文件，并从文件中识别出与目标基因（TMEM200A）相关性较高的基因。然后，将相关性较高的基因统一为 TMEM200A的活性基因，最后得到每个样本中活性基因的评分。 - 打开 R 代码 （scoreDiffR） 并将 scores.txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件，运行修改后的 R 代码（scoreDiffR），通过 “plyr”、“reshape2” 和 “ggpubr” 包绘制图片。
16. 临床病理相关性及生存预后分析
- 转到 UCSC Xena 网站界面。
- 单击 “启动 Xena ”选项卡。
- 单击屏幕顶部的 “数据集 ”选项卡。
- 将鼠标悬停在页面上并向下滚动以找到 TCGA 泛癌 （PANCAN） 选项卡。
- 从此页面上的 129 个队列和 1,571 个数据集中，单击 TCGA 泛癌 （PANCAN） 选项卡。
- 从 表型 菜单中，选择并单击“精选临床数据”选项卡。
- 在 下载 菜单中，单击其相应的链接。
注：通过上述链接从 TCGA 数据库下载 33 种癌症的临床数据。 - 解压缩下载的临床数据文件，然后以 xls 文件格式打开解压缩的文件。
- 将需要的临床数据（分期、年龄、病理分期、患者状态）整理并保留在文件中，删除剩余不需要的临床数据，重命名为临床后将整个文件保存为txt格式文件。
- 根据在步骤 1.9 中获得 的singleGeneExp.txt ，将此文件与有组织的 clinical.txt 文件放在同一文件夹中。
- 解压缩下载的临床数据，并将 singleGeneExp.txt 和 clinical.txt 文件与解压缩的临床文件放在同一文件夹中。
- 打开 R 代码 （clinicalDiffR） 并将上述文件夹所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件，运行修改后的 R 代码 （clinicalDiffR），并使用“ggpubr”包绘制图片。
- 转到 UCSC Xena 网站界面。
- 单击 “启动 Xena ”选项卡。
- 单击屏幕顶部的 “数据集 ”选项卡。
- 从本页的 129 个队列和 1,571 个数据集中，单击选项卡，共查看 33 种癌症，例如 GDC TCGA 急性髓系白血病 （LAML）、GDC TCGA 肾上腺皮质癌 （ACC）、GDC TCGA 胆管癌 （CHOL） 等。
- 从 表型 菜单中，选择并单击生存数据选项卡。
- 在 下载 菜单中，单击其相应的链接。
- 将 33 种不同癌症类型的生存数据的 zip 存档解压缩到计算机桌面文件夹中的单个文件中。
- 将解压缩后的生存数据与步骤 1.9 中获取的 singleGeneExp.txt 文件放在同一个文件夹中。
- 打开 R 代码 （preOSR），将上述文件夹所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码 （preOSR）。通过“limma”包计算，得到一个关于泛癌 TMEM200A 存活的数据文件： expTime.txt。
- 打开 R 代码 （OSR） 并将 expTime.txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码 （OSR）。根据 expTime.txt 文件中的数据，使用“生存”和“survminer”包进行 KM 分析，并绘制泛癌中TMEM200A的生存曲线。
17. 单变量和多变量Cox回归分析与森林样地构建
- 打开 R 代码 （COXR） 并将我们从 16.23 获取expTime.txt文件的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码 （COXR）。根据 expTime.txt 文件中的数据，使用“生存”、“survminer”和“forestplot”包执行单变量 COX 回归分析，以绘制不同癌症中 TMEM200A 的单变量森林图。
- 将步骤 16.23 中的 expTime.txt 文件和步骤 16.10 中的 clinical.txt 文件放在同一个文件夹中。
- 打开 R 代码 （multicoxR），将包含步骤 16.23 中的 expTime.txt 文件和步骤 16.10 中的 clinical.txt 文件的文件夹所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码 （multicoxR）。使用“生存”和“survminer”包执行多变量 COX 回归分析，根据 expTime.txt 和 clinical.txt 文件中的数据绘制不同癌症中TMEM200A的多变量森林图。
18. 基于 TMEM200A 表达和临床特征的胃癌预后模型
- 将步骤 16.10 中的 clinical.txt 文件和步骤 16.23 中的 expTime.txt 文件放在同一文件夹中。
- 打开 R 代码 （NomoR），将上述 txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
- 打开 R 软件并运行修改后的 R 代码 （NomoR）。使用软件包“survival”、“regplot”和“rms” TMEM200A GC中的表达数据和临床数据，构建预后模型以预测患者生存。
19. TMEM200A的细胞培养和siRNA转染
注：人STAD HGC-27细胞，SGC-7901细胞和人胃粘膜上皮 GES-1细胞 通过商业获得（参见 材料表），复活，接种在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640完全培养基（含有10%新生胎牛血清和1%青霉素混合物）中，并在37°C下在5%CO2 中培养细胞培养箱。培养基每2-3天更换一次。根据（2-3）将生长状况良好的细胞接种在六孔板中×每孔105 个细胞。
- 首先，取三个微量离心管，向每个试管中加入 8 μL 转染试剂 （参见材料的 Table）和 200 μL 基础培养基。然后，分别向每个试管中加入 4 μg SiRNA1、SiRNA2 和 SiRNA3 。
注：对于 TMEM200A 敲低，设计并购买了 siRNA（参见 材料表）。 - 将混合物在三个微量离心管中充分混合，并添加到6孔板的三个孔中的每一个孔中。轻轻摇晃 6 孔板以均匀分布混合物。将添加混合物的三个孔标记为 SiRNA-1、SiRNA-2 和 SiRNA-3。
- 当细胞孵育4-6小时后，在6孔板的三个子孔中更换一半的培养基。
注意：更换一半完全培养基时，吸出一半原始完全培养基并补充一半新鲜完全培养基。 - 24 至 48 小时后，使用 TMEM200A siRNA 转染细胞作为实验组，使用未转染细胞作为阴性对照组。 进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR， 参见第20节）以评估转染对细胞的影响。
20. 定量实时聚合酶链反应
- 丢弃每个亚组中的细胞培养基，并用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻洗涤细胞两次。
- 使用RNA分离试剂盒分离总RNA（参见 材料表）。
- 按照制造商的说明，使用 cDNA合成试剂盒估计RNA浓度并用1μgRNA合成cDNA。
- 使用实时荧光定量PCR检测系统，对10 μL反应混合物中10倍稀释的cDNA进行定量实时PCR（qRT-PCR），包括用于GAPDH（用于标准化）、TMEM200A（参见材料表）和qPCR预混液的人特异性正向和反向引物。
注意：一式三份执行每个实验。 - 使用以下qPCR反应条件：初始化，95°C3分钟;变性，95°C，持续10秒;退火，60°C，30秒;和延伸，80°C10秒;重复变性、退火和延伸 40 倍。使用 2-ΔΔCt 技术28 确定每个基因的相对表达。
- 重复实验至少三次以获得生物学一式三份。
21. 蛋白质印迹检测相关蛋白表达
- 丢弃每个亚组中的细胞培养基，并用 2 x 1 mL PBS 轻轻洗涤细胞。
- 在冰上冷却含有细胞的 6 孔板，并加入 150 μL 预冷放射免疫沉淀测定 （RIPA） 裂解缓冲液（150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS、50 mM Tris-HCl pH 8.0 和新添加的蛋白酶抑制剂混合物）。让裂解在冰上进行10分钟。
- 使用塑料细胞刮刀，从培养皿中去除粘附的细胞，并将细胞溶液小心地转移到预冷的微量离心管中。
- 将细胞裂解物在4°C下以1.5×104g离心10分钟。 将上清液转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
- 利用 BCA 蛋白检测试剂盒根据制造商的说明测定蛋白质含量。
- 将每个样品中的30g蛋白质加载到10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上，并在80V下运行0.5小时，然后在120V下运行1.5小时。
- 将蛋白质从凝胶转移到45μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，电压为300mA，持续1-1.5小时。
- 将PVDF膜放在振荡器上并振动3 x 5分钟后，将含有吐温20（TBST，20mM Tris-HCl，pH 7.4,150mM NaCl和0.1%吐温20）的Tris缓冲盐水加入适当的容器中，蛋白质侧（凝胶侧）朝上。
- 将膜置于封闭缓冲液中（参见 材料表）并在室温下孵育0.5小时。
- 用TBST洗涤膜3 x 10分钟。
- 将膜与抗磷酸化AKT（p-AKT;1：1,000），总AKT 1：1,000，E-钙粘蛋白（E-ca;1：1,000），N-钙粘蛋白（N-ca;1：1,000），波形蛋白1：1,000，蜗牛1：1,000，TMEM200A 1：1,000， 甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH;1：1,000）的一抗一起孵育膜，在4°C下过夜。
- 洗涤膜3×10分钟，并在室温下将膜与兔或小鼠二抗（1：5,000）孵育1小时。
- 将PVDF膜与ECL底物孵育30秒，并使用成像系统检测信号。
22. CCK-8测定
- 在96孔板中接种生长状况良好的人STAD HGC-27 细胞。
- 当细胞密度达到60-70%时，用 TMEM200A siRNA 转染细胞（如步骤19.3所示）。
- 将转染的细胞接种到96孔板中，细胞密度为5×10 3 /孔（使用细胞计数仪计数活细胞），分为 NC 组和 TMEM200A siRNA组 （每组有三个重复孔），并在37°C下孵育。
- 在0、24、48、72和96小时后加入CCK-8试剂，并在37°C下孵育2小时。使用多功能酶标记器测量吸光度（450nm）。
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Representative Results
TMEM200A在各种癌症中的表达
如图1所示，我们首先通过不同的数据库分析了各种癌症中TMEM200A的不同表达水平。仅根据 TCGA 数据，与邻近正常组织相比，胆管癌 （CHOL）、头颈部鳞状细胞癌 （HNSC）、肾透明细胞癌 （KIRC）、肾状细胞癌 （KIRP）、肝细胞癌 （LIHC）、STAD 和甲状腺癌 （THCA） TMEM200A表达升高。然而TMEM200A，膀胱尿路上皮癌 （BLCA）、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌 （CESC）、多形性胶质母细胞瘤 （GBM）、肾嗜色症 （KICH）、肺鳞癌 （LUSC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤 （PCPG）、直肠腺癌 （READ） 和子宫体子宫内膜癌 （UCEC） 的表达降低（图 2A）。在 TIMER2.0 数据库中，TMEM200A CHOL、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC 和 STAD 中的表达增加。此外，TMEM200A 在 BLCA、CESC、GBM、KICH、LUSC、PCPG、READ、皮肤黑色素瘤 （SKCM） 和 UCEC 中的表达增加（图 2B）。
通过比较两个数据库的结果，我们发现每个数据库中 TMEM200A 的泛癌表达是相同的。我们从TCGA数据库中获取了33例癌症患者的临床随访资料和RNA测序数据，使用ssGSEA分析法计算了每个癌症样本的 TMEM200A 评分，然后计算 了TMEM200A 肿瘤和正常组织中许多肿瘤的基因活性。我们发现 TMEM200A 在GBM、HNSC、肾KIRC和THCA中高度表达（图2C）;因此， TMEM200A 的基因活性在每个肿瘤组织中排名。结果发现， TMEM200A 的基因活性在KIRC中最高，在葡萄膜黑色素瘤（UVM）中最低（图2D）。随后对人体组织中 TMEM200A 表达水平的HPA数据库评估显示， TMEM200A 表达水平在大多数正常组织中较低，但在肾上腺皮质，直肠，子宫内膜和平滑肌中较高（图2E）。
在正常组织细胞系中，少数细胞系（如颗粒细胞、双极细胞、骨骼肌细胞、子宫内膜基质细胞和 T 细胞）显示出高 TMEM200A 表达，而 TMEM200A 在大多数其他细胞系中表达较低（图 2F）。我们还检查了HPA数据库中的免疫组织化学（IHC）数据，以研究 TMEM200A 在蛋白质水平上的表达。有关染色和强度的数据显示，与正常组织相比，结直肠癌 （CRC）、肺癌 （LUAD）、肝癌 （LIHC）、乳腺癌 （BRCA） 和前列腺癌 （PRAD） 组织中 TMEM200A 表达水平更高、更明显（图 2G）。这些发现表明， TMEM200A 在不同的癌症中广泛表达，并通过不同的机制影响不同肿瘤的癌症发展。
临床病理关系与生存预后
对于 33 例人类恶性肿瘤，我们从 UCSC Xena 数据库网站收集了 TCGA 泛癌 （PanCan） 队列的信息和临床数据，并研究了 PanCan 中 TMEM200A 表达与年龄、病理分级、临床病理分期和患者生存状态之间的相关性。该研究显示，在六种癌症中， TMEM200A 的表达与临床病理分期有关，包括 BLCA、浸润性乳腺癌 （BRCA）、食管癌 （ESCA）、KIRP、SKCM 和睾丸癌 （TGCT）（图 3A）。年龄与六种肿瘤相关，包括浸润性BRCA、GBM、急性髓系白血病（LAML）、SKCM、胸腺癌（THYM）和子宫内膜癌（UCEC）（图3B）。病理分级与六种肿瘤相关，包括食管癌 （ESCA）、HNSC、KIRC、低级别脑胶质瘤 （LGG）、胰腺癌 （PAAD） 和子宫内膜癌 （UCEC）（图 3C）。生存状态与五种肿瘤相关，包括肾上腺皮质癌 （ACC）、BLCA、KIRC、PCPG 和葡萄膜黑色素瘤 （UVM）（图 3D）。
我们使用具有中位组阈值的单因素 Cox 回归分析对 OS、DSS、PFI 和 DFI 的不同癌症进行了研究，以更多地了解TMEM200A表达与预后之间的相关性。OS分析结果显示，在肾上腺皮质癌（ACC）（P=0.037）、BLCA（P=0.036）、急性髓系白血病（LAML）（P=0.011）和GC（STAD）（P=0.005）4种肿瘤中，TMEM200A表达水平较高对OS预后的影响较大。相比之下，较高TMEM200A表达对五种肿瘤的OS预后更好，包括KIRC（P<0.001），KIRP（P = 0.020），低级别脑胶质瘤（LGG）（P = 0.042），PCPG（P = 0.002）和皮肤黑色素瘤（SKCM）（P = 0.043）（图3E，F）。对于DSS，高TMEM200A表达在两种肿瘤类型中预后较差，包括肾上腺皮质癌（ACC）（P=0.026）和BLCA（P=0.015）。高TMEM200A表达在四种肿瘤类型中预后较好，包括 KIRC （P < 0.001）、KIRP （P = 0.001）、低级别脑胶质瘤 （LGG） （P = 0.025） 和 PCPG （P = 0.007）（图 3G）。此外，对于PFI，较高TMEM200A表达在三种肿瘤类型中预后较差，包括肾上腺皮质癌（ACC）（P=0.007）、BLCA（P=0.040）和葡萄膜黑色素瘤（UVM）（P=0.020）。较高TMEM200A表达在两种肿瘤类型中预后较好，包括 KIRC （P < 0.001） 和脑部低级别胶质瘤 （LGG） （P = 0.044）（图 3H）。在 DFI 中，TMEM200A 表达较高的肾上腺皮质癌 （ACC） 预后较差 （P = 0.044）（图 3I）。
随后，我们选择了几种肿瘤（KIRC 和 KIRP）进行多 COX 回归分析。结果显示，与其他临床因素相比，TMEM200A可以单独影响癌症患者的生存率（图3J和K）。这些结果表明，TMEM200A可以作为不同癌症的独立生物预后标志物，影响癌症患者的生存。
DNA甲基化分析
最受关注的表观遗传改变之一是DNA甲基化29。有人认为，一种表观遗传变化，即 DNA 甲基化，对肿瘤生长有显着影响30。因此，使用SMART数据库，我们评估了正常和癌组织中 TMEM200A 的DNA甲基化水平。PAAD和PRAD组织的 TMEM200A DNA甲基化水平高于正常组织。然而， TMEM200A 在COAD、KIRC、KIRP、LIHC、LUSC、READ、THCA和UCEC中的DNA甲基化水平低于正常组织（图4A）。在基于UALCAN数据库的KIRP、PRAD、PCPG和THYM的TCGA数据库中， TMEM200A 的DNA甲基化水平要高得多（图4B），但在BLCA、BRCA、CHOL、COAD、CESC、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、PAAD、READ、TGCT、STAD、THCA和UCEC中则没有。 TMEM200A 甲基化水平在LUSC、PAAD、READ、TGCT、STAD、THCA和UCEC中显著降低（图4C）。为了进一步探讨 TMEM200A 表达水平与DNA甲基化和临床病理因素之间的关系，我们再次利用SMART数据库，发现BLCA、HNSC、LUAD和STAD中 TMEM200A 的DNA甲基化水平随病理阶段的变化而变化（图4D）。临床因素影响上述肿瘤中 TMEM200A 的DNA甲基化水平。
基因突变分析
肿瘤发展的原因之一是基因突变的积累31。因此，通过使用cBioPortal数据库估计泛癌临床样本中TMEM200A突变的频率来分析体细胞TMEM200A突变的频率。TMEM200A在许多癌症中发生突变，例如肺癌、子宫子宫内膜样癌、黑色素瘤、食管胃癌、骨癌、宫颈癌、肝胆癌、成熟 B 细胞淋巴瘤、BRCA、子宫内膜癌、卵巢癌、胚胎肿瘤、胰腺癌、头颈癌、结直肠癌、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、软组织肉瘤和原发性不明的癌症（图 5A).此外，DNA的改变会导致蛋白质水平的结构或氨基酸变化。图5B显示了TMEM200A的3D结构。使用cBioPortal数据库，我们发现了TMEM200A氨基酸中的突变位点;错义突变是最普遍的突变形式（图5C）。
我们使用 Sangerbox 3.0 分析了数据以验证突变位点的准确性，并取得了与之前相同的结果。错义突变是 TMEM200A 中最常见的突变形式，在SKCM中发生率可能高达7.8%（图5D）。错义突变是编码一个氨基酸的密码子经历碱基取代并成为编码另一个氨基酸的密码子，导致多肽链的氨基酸类型和序列发生变化的突变。错义突变的结果通常是多肽链失去其原有的功能。许多蛋白质异常是由错义突变引起的，错义突变是一种常见的肿瘤突变类型。已经发现，错义突变在蛋白质的稳定性中起着关键作用，突变的存在可以对蛋白质之间的结合亲和力产生显着影响32，改变蛋白质与周围相关大分子之间的相互作用33。
因此，错义突变最有可能影响跨膜蛋白200A在不同癌症中的生物学功能。还研究了 TMEM200A 基因突变与癌症患者临床生存预后的相关性。与 TMEM200A突变组相比，OS的可能性增加，但无病组没有增加（图5E）。基因相关性研究表明， TP53、AKAP7、TAAR5、TAAR1、MOXD1、THEMIS、VNN2、ENPP3、TMEM244 和 SLC18B1 是与 TMEM200A 共突变的基因之一（图 5F）。我们能够通过COSMIC数据库鉴定出几种突变类型和单核苷酸变异（SNV），以了解更多关于GC中 TMEM200A 突变的信息。错义替换的频率最高（38.86%）（图5G），SNV数据显示，STAD中最常见的SNV是G>A（31.73%），其次是C>T（26.35%）和G>T（11.73%）（图5H）。
癌症 TMEM200A 的单细胞分析
我们使用 TISCH（肿瘤免疫学单细胞中心）网站分析了不同单细胞中的TMEM200A表达水平。TISCH在线工具在图6A所示的热图中显示了65个数据集和28种细胞类型的TMEM200A表达。研究结果显示，TMEM200A主要在CD8+T细胞和成纤维细胞中表达。GSE72056数据集包括来自转移性皮肤黑色素瘤 （SKCM） 患者的细胞，在这方面值得注意。TMEM200A在 B 细胞、CD4+ T 淋巴细胞、耗尽的 CD8+ T 细胞、内皮细胞、成纤维细胞和 SKCM 微环境中的其他细胞类型中广泛高表达（图 6B，C）。在包含CRC患者细胞的GSE146771数据集中，TMEM200A在B细胞、CD4 + T淋巴细胞、CD8 + T细胞、耗尽的CD8 + T细胞、内皮细胞、成纤维细胞和CRC微环境中的其他细胞类型中广泛高表达（图6D，E）。通过使用CancerSEA数据库，确定了TMEM200A在特定肿瘤细胞中的表达水平和功能状态（图6G）。 TMEM200A表达与一系列癌症的细胞功能状态密切相关，包括胶质母细胞瘤 （GBM）、肺腺癌 （LUAD）、慢性粒细胞白血病 （CML）、结直肠癌、视网膜母细胞瘤 （RB） 和葡萄膜黑色素瘤 （UM）。在大多数肿瘤细胞中，血管生成、凋亡、分化和炎症都与TMEM200A表达呈正相关，而 DNA 损伤、DNA 修复、侵袭和代谢与TMEM200A表达呈负相关（图 6F）。
各种癌症中TMEM200A的功能和通路富集分析
我们使用 GGI 网络检查 了TMEM200A 与具有相似功能的蛋白质之间的联系，以探索 TMEM200A 在不同癌症中的功能（图 7A）。GeneMANIA使用靶基因查询列表分析基因组和蛋白质组信息。通过定位与 TMEM200A相似的基因，发现了与该基因直接相互作用的 40 种蛋白质。这些基因的相关性由PPI网络显示（图7B）。随后，对这20个与 TMEM200A 密切相关的基因进行GO和KEGG富集分析，发现这些相邻基因主要与RNA对基因沉默的负调控有关。KEGG分析显示， TMEM200A 在包括Wnt信号通路和细胞衰老在内的通路中含量丰富（图7C）。GO富集分析表明，在分子功能方面， TMEM200A 主要在钙通道中丰富，RNA对基因沉默的负调控（图7D）。
TMEM200A与免疫浸润的相关性分析
我们进一步研究了TMEM200A表达与免疫细胞浸润之间的相关性，以证明TMEM200A与癌症免疫之间的相关性。我们使用 Sangerbox 3.0 泛癌数据进行了 CIBERSORT 免疫浸润分析。结果显示，泛癌TMEM200A表达与CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、B细胞、辅助性T细胞、自然杀伤细胞、调节性T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞相关（图8A）。随后，我们使用 TISIDB 数据库研究了 TMEM200A 表达与 TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）之间的相关性，显示TMEM200A表达与不同癌症类型中 28 TIL 丰度之间的密切相关性（图 8B）。我们使用TISIDB数据库来评估人类恶性肿瘤中TMEM200A表达与免疫抑制药物之间的相关性，以更彻底地研究免疫调节剂和TMEM200A表达之间的关系。结果显示，TMEM200A表达水平与多种癌症中的免疫抑制剂显著相关（图8C）。在睾丸癌和 UM 中发现TMEM200A表达与某些免疫抑制剂之间存在显着相关性（图 8D-F）。然后，我们使用TISIDB数据库对TMEM200A表达与免疫刺激因子和MHC分子进行了相关性分析（图8G，H）。结果显示，TMEM200A表达与膀胱尿路上皮癌、睾丸癌、肾上腺皮质癌和 UM 中选定的免疫刺激剂和 MHC 分子相关（图 8I-L）。下一步是研究 TISIDB 数据库中 TCGA PanCan 队列中TMEM200A表达与免疫学或分子亚型之间的相关性。我们发现九种不同癌症类型的免疫亚组表达TMEM200A不同，包括 BLCA、UVM、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、TGCT 和 BRCA（图 8M）。此外，具有不同分子亚组的六种不同癌症形式，包括 HNSC、KIRP、LIHC、PCPG、OV 和 LUSC，显示出 TMEM200A 的可变表达（图 8N）。
TMEM200A 和免疫治疗反应分析
PD-1/PD-L1 抑制剂的有效性与 TMB 高度相关，一些肿瘤患者可以使用 TMB 标志物在一定程度上预测免疫治疗的疗效34。微卫星不稳定性 （MSI） 是用于描述缺陷 DNA 错配修复 （MMR） 功能的术语，当微卫星复制错误未固定和累积时，改变微卫星的长度或碱基组成35。MSI 是一种具有临床意义的肿瘤标志物 36。因此，我们通过研究 TMEM200A 表达与TMB或MSI之间的相关性来评估 TMEM200A 表达对免疫治疗的影响。研究结果表明，在THYM、PRAD、OV、LAML、KARP和KIRC中 ，TMEM200A 表达与TMB之间存在显著的正相关，但 TMEM200A 表达与UCEC、PAAD、LUSC、LUAD、LIHC、LGG、HNSC、GBM和BRCA呈负相关（图9A）。MSI 和 TMEM200A 表达在 TGCT 中呈强且有利的相关性，而 TMEM200A 表达与 UCEC、STAD、SKCM、LUSC、LUAD、HNSC 和 CHOL 中的 MSI 呈显著负相关（图 9B）。我们还评估了 TMEM200A 作为生物标志物的潜力，以检查ICB的有效性。结果表明，在25个ICB亚群中，有7个亚群的 TMEM200A 预测ICB反应的准确率>0.5。 TMEM200A 显示出比 T 细胞和 B 细胞克隆更高的预测值，两者的值均为 5。然而， TMEM200A 值低于 TIDE（11 个 ICB 亚群的 AUC > 0.5）、MSI 评分（11 个 ICB 亚群的 AUC > 0.5）、CD274（15 个 ICB 亚群的 AUC > 0.5）、CD8（17 个 ICB 亚群的 AUC > 0.5）、IFNG（16 个 ICB 亚群的 AUC > 0.5）和 Merck18（17 个 ICB 亚群的 AUC > 0.5）（图 9C).ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve、ICB_Gide 2019_PD1 和 ICB_Hugo 2016_PD1 队列的生存预后差与高 TMEM200A 表达相关。然而， TMEM200A 敲低增强了 Kearney 2018 T_PD1 和 Pan 2018 OT1 平均队列中淋巴细胞介导的肿瘤杀伤效力（图 9D）。
不同癌症中 TMEM200A 的GSEA富集分析
我们在 32 种恶性肿瘤中使用 TMEM200A 高表达亚组和 TMEM200A 低表达亚组之间的 DEGs 来探索 与TMEM200A相关的癌症特征。我们发现原发性免疫缺陷、RIG（视黄酸诱导基因）-I 样受体信号通路与泛癌 TMEM200A 表达之间存在显着相关性，尤其是在 BLCA、COAD、KICH、GBM、LUSC、LUAD、MESO、READ、SARC 和 SKCM 中（图 10）。病毒细胞质蛋白核糖核酸通过 RIG-I 样受体信号通路检测。RIG-I 样受体可能通过结合某些细胞内连接蛋白来激活 NF-kB 信号通路，从而影响体内多种炎性细胞因子的产生。因此，跨膜蛋白 200A （TMEM200A） 可能在 RIG-I 样受体募集细胞内蛋白中发挥关键作用。这些发现表明 TMEM200A 表达与免疫浸润之间存在很强的相关性。此外，GSEA 富集分析显示，泛癌 TMEM200A 表达与趋化因子信号传导、细胞粘附、细胞因子受体连接、细胞膜感应通路和自噬控制相关（图 10）。跨膜蛋白除了在控制钙离子从钙储库进入细胞中起关键作用外，还可以作为粘附分子发挥作用，以影响肿瘤微环境 36。因此，从 GSEA 富集分析中获得的结果可能是由于 TMEM200A 参与许多生理过程，包括信号转导途径的激活、质膜离子通道的形成以及细胞趋化性、粘附、凋亡和自噬的调节9。
我们从LinkedOmics数据库中确定了与TMEM200A正相关和负相关的前50个STAD基因，这些基因以热图的形式在STAD中共同表达（图11A，B）。我们评估了 GC 中与 TMEM200A 呈阳性相关的前 5 个基因和与呈负相关的前 5 个基因（图 11C）。结果表明，TMEM200A表达与SPON1（r = 0.51）、CDH11（r = 0.50）、EPB41L2（r = 0.49）、LUM（r = 0.49）、SAMD3（r = 0.49）、OVOL2（r = -0.37）、RASAL1（r = -0.36）、IRX5（r = -0.35）、SLC4A11（r = -0.34）和SYTL1（r = -0.33）共表达相关。我们分析了阈值可视化结果，以进一步了解TMEM200A在STAD中的作用。使用以下标准进行筛选：log2 倍变化 （FC） > 2.0，调整后的 P 值为 0.05。我们发现了 483 个 DEG，其中 385 个上调，98 个下调，我们选择了其中 100 个进行可视化以创建热图（图 11D）。然后，对于满足筛选标准的DEG，我们进行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析结果显示，BP（Biological Process）的富集主要与细胞外基质和结构组织有关，CC（Cellular Component）的富集主要与含胶原蛋白的细胞外基质和基底膜有关，MF（Molecular Function）主要富集于细胞外基质结构和糖胺聚糖结合（图11E和图11G).KEGG分析的富集表明，TMEM200A主要富集在细胞外基质受体相互作用途径、细胞色素P450和肾素-血管紧张素系统中（图11F和图11H）。
基于TMEM200A的胃癌预后模型及临床特征
我们研究了 TMEM200A 与 STAD 患者临床数据之间的相关性，因此通过逻辑回归分析并基于TMEM200A表达水平分析了 TCGA-STAD 队列中患者的临床病理特征（图 12A）。根据单变量Cox回归分析，年龄、临床分期和TMEM200A表达都与STAD患者的OS显著相关（图12B）。多变量Cox回归分析显示，TMEM200A表达可能是STAD患者OS的独立预测因素（HR = 1.282,95%CI = 1.066-1.541，P = 0.008）（图12C）。 我们使用标准柱线图模型结合几个临床参数（图 12D）检查了这些临床病理学特征在 STAD 中预测 1、3 和 5 年后 OS 的潜力。1 年生存概率的校准曲线与柱线图预测概率高度一致（图 12E）。
STAD细胞TMEM200A上调和细胞增殖增强
通过回顾TMEM200A相关文献，我们发现TMEM200A的高表达表明预后不良13，GC免疫微环境可能受到TMEM200A作为粘附分子37的影响，从而促进GC细胞的侵袭和转移。我们检查了STAD细胞系中TMEM200A的蛋白质水平和mRNA转录水平，以确认上述研究的结果。与健康的胃粘膜上皮细胞系GES-1相比，GC细胞系HGC-27在蛋白质和mRNA转录水平上均显著过表达TMEM200A（图13A，B），表明TMEM200A在HGC-27细胞中过表达。结果，使用 HGC-27 细胞进行了以下测试。同时，为了证明实验结果的准确性，我们使用qRT-PCR比较了TMEM200A在人GC细胞SGC-7901和胃粘膜上皮细胞GES-1中的差异mRNA表达，结果表明TMEM200A在SGC-7901细胞中高表达（图13B）。在HGC-27细胞中敲除TMEM200A以检查TMEM200A可能参与STAD（图13C）。基于数据库挖掘结果和我们对TMEM200A的相关性分析，发现TMEM200A主要参与细胞外基质受体相互作用途径，与癌症增殖和侵袭有关。因此，我们采用CCK-8测定法来确定TMEM200A表达如何影响细胞生长。CCK-8 检测显示，与 NC 组相比，TMEM200A敲低组（Si-RNA2 和 Si-RNA3）的细胞活力显着下降（图 13D）。这些发现表明，TMEM200A在STAD中上调，其表达水平可能影响GC细胞的增殖。基于图11F中KEGG富集分析的结果，我们发现TMEM200A与GC中的PI3K/AKT信号通路相关，TMEM200A作为一种细胞粘附因子，可能通过影响EMT来影响胃癌的发生机制。因此，我们使用蛋白质印迹法来验证敲除前后TMEM200A敲低对EMT和PI3K/AKT信号通路的影响。结果显示，与阴性对照组（NC）相比，TMEM200A敲低组（TMEM200A-SiRNA2）的P-AKT蛋白表达降低，而N-钙粘蛋白、波形蛋白和Snai蛋白的水平也降低，E-钙粘蛋白蛋白表达增加（图13E）。所有这些结果表明，TMEM200A可能通过PI3K/AKT信号通路影响EMT，从而在GC中发挥作用。
图1：研究的工作流程。 缩写：TCGA = 癌症基因组图谱数据库;TIMER2.0 = TIMER2.0 数据库;OS=总生存期;PFS = 无进展生存时间;DSS = 疾病特异性生存期;DFS = 无病生存期;TMB = 肿瘤突变负荷;MSI = 微卫星不稳定性;PPI = 蛋白质-蛋白质相互作用;GGI = 基因-基因相互作用;KEGG = 京都基因和基因组百科全书;GO = 基因本体论。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：不同癌症中 TMEM200A 的表达水平。 （A） TCGA数据集中 TMEM200A 在不同人类恶性肿瘤中的表达上调或下调。（B） 使用 TIMER2.0 数据库分析肿瘤和正常组织中的 TMEM200A 表达水平。（C） TCGA数据集中各种人类癌症中 TMEM200A 基因活性的差异分析。（D） 基于ssGSEA评分的 TMEM200A 在各种人类癌症中的基因活性水平排名。（E） TMEM200A 健康组织中HPA数据库的表达水平。（F） HPA数据库在正常细胞系中的 TMEM200A 表达水平。（G） 来自 HPA 数据库的癌症中 TMEM200A 蛋白表达的 IHC 结果。缩写：TCGA = 癌症基因组图谱;ssGSEA = 单样本基因集富集分析;HPA = 人类蛋白质图谱;IHC = 免疫组化。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3： TMEM200A 表达与不同肿瘤临床病理特征和预后的相关性。 （A） 使用 UCSC Xena 数据库分析 TCGA 泛癌 （PanCan） 队列中 TMEM200A 表达与每个肿瘤临床病理分期的相关性。（B） TCGA PANCAN 队列中 TMEM200A 表达与每个肿瘤患者年龄的相关性。（C） TCGA PANCAN 队列中 TMEM200A 表达与每个肿瘤的肿瘤病理分级的相关性。（D） TCGA PanCan 队列中 TMEM200A 表达与每个肿瘤患者生存状态的相关性。（E） 使用Cox回归模型分析 TMEM200A 表达与各种癌症泛癌总生存期的相关性。（F） TCGA PanCan 队列中TMEM200A表达与泛癌 OS 预后的相关性。（G） TMEM200A 表达与疾病特异性生存率之间的相关性。（H） TCGA PanCan 队列中 TMEM200A 表达与无进展间期预后之间的相关性。（I） TMEM200A 表达与无病区间的相关性。（J） 对KIRC进行多因素COX回归分析。（K） 对KIRP进行多因素COX回归分析。缩写：TCGA = 癌症基因组图谱;KIRC：肾透明细胞癌;KIRP：肾状细胞癌;OS = 总生存期;DSS = 疾病特异性生存期;PFI = 无进展间期;DFI = 无病间期。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：不同癌症中 TMEM200A 的DNA甲基化分析。 （A）根据SMART数据库，在几种癌症类型中检查了 TMEM200A 的启动子甲基化水平。（B） 根据 UALCAN 数据库检查不同癌症类型中 TMEM200A 的启动子甲基化水平高于正常组织。 （C）使用UALCAN数据库，确定正常组织在几种癌症类型中具有较低的启动子甲基化 TMEM200A 水平。（四）BLCA、HNSC、LUAD和STAD中 TMEM200A 的DNA甲基化水平随病理阶段的变化而变化。缩写：BLCA=膀胱尿路上皮癌;HNSC=头颈部鳞状细胞癌;LUAD=肺腺癌;STAD= 胃腺癌。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5： TMEM200A 不同癌症的基因突变。 （A）使用cBioPortal数据库分析不同癌症中的 TMEM200A 基因突变类型。（B） TMEM200A的3D蛋白质结构。装订区域由彩色部分表示，而 TMEM200A 的其他部分由灰色部分表示。（C） TMEM200A 体细胞突变的亚型和分布。 X轴，氨基酸位点; y轴， TMEM200A 突变数;绿点，错义突变;和灰点，截断的突变。（D） 使用 Sangerbox 3.0 中的数据验证 TMEM200A 体细胞突变的亚型和分布。（E）对于所有TCGA肿瘤，使用cBioPortal数据库研究突变状态与患者总生存期预测之间的相关性，红色方块表示 TMEM200A 突变组，蓝色方块表示未突变组。（F） 使用 cBioPortal 工具分析与 TMEM200A 共突变的基因：TP53、AKAP7、TAAR5、TAAR1、MOXD1、THEMIS、VNN2、ENPP3、TMEM244 和 SLC18B1。（G） 使用COSMIC数据库分析GC中的 TMEM200A 突变类型。（H） 使用COSMIC数据库对GC中的 TMEM200A SNV类型进行了分析。缩写：TCGA = 癌症基因组图谱;OS = 总生存期;COSMIC = 癌细胞体细胞突变目录;GC = 胃癌。 请点击这里查看此图的较大版本.
图6：不同癌症中 TMEM200A 表达的单细胞相关性分析。 （A） TISCH网站上 TMEM200A 表达的摘要。（B） 转移性皮肤黑色素瘤 GSE72056 数据集中八种不同细胞类型的分布。（C） GSE72056数据集中皮肤转移性黑色素瘤细胞中 TMEM200A 的表达水平。（D） GSE146771 年结直肠癌数据集中 13 种不同细胞类型的分布。（E） TMEM200A GSE146771数据集中结直肠癌细胞的表达水平。（F） 使用 CancerSEA 数据库证明了 TMEM200A 表达与多发肿瘤中单细胞功能状态的相关性。（G） T-SNE 图图，说明单个肿瘤细胞（包括 GBM、LUAD、CML、CRC、RB 和 UM）中 TMEM200A 表达水平。缩写：GBM = 胶质母细胞瘤;LUAD = 肺腺癌;CML = 慢性粒细胞白血病;CRC = 结直肠癌;RB = 视网膜母细胞瘤;UM = 葡萄膜黑色素瘤。 请点击这里查看此图的较大版本.
图7：基因水平上 TMEM200A 的共表达网络和功能富集分析。 （A） TMEM200A 及其共表达基因的GGI网络。（二）PPI网络。（三、四）分析 TMEM200A 和共表达基因的GO和KEGG通路富集。缩写：PPI = 蛋白质-蛋白质相互作用;GGI = 基因-基因相互作用;KEGG = 京都基因和基因组百科全书;GO = 基因本体论。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：TMEM200A与各种癌症类型中免疫细胞、免疫抑制剂、免疫刺激物质和 MHC 分子表达之间的相关性。 （A） Sangerbox 3.0 热图，展示了TMEM200A表达与免疫浸润细胞之间的相关性。（B） 热图显示免疫浸润细胞与 TISIDB 数据库中TMEM200A表达之间的相关性。（C） 热图显示免疫抑制细胞与 TISIDB 数据库中TMEM200A表达之间的相关性。（D-F）睾丸癌和葡萄膜黑色素瘤中TMEM200A表达与某些免疫抑制剂之间的相关性。（G） 热图显示了免疫刺激因子与TISIDB数据库中TMEM200A表达之间的相关性。（H） TISIDB 数据库中TMEM200A表达与 MHC 分子相关性的热图。（I-L）膀胱尿路上皮癌、睾丸癌、肾上腺皮质癌和葡萄膜黑色素瘤中TMEM200A表达与某些免疫刺激因子和 MHC 分子的相关性。（M） 泛癌免疫亚群与TMEM200A表达的相关性。（N） 泛癌分子亚群与TMEM200A表达的相关性。缩写：MHC = 主要组织相容性复合体。请点击这里查看此图的较大版本.
图9：全血细胞减少症中 TMEM200A 的免疫治疗反应分析。 （A）不同癌症中 TMEM200A 表达与TMB的相关性。（B） MSI在泛癌中与 TMEM200A 表达的相关性。（三） TMEM200A作为预测免疫检查点阻断反应的生物标志物的潜力。（D）采用 CRISPR筛选中TMEM200A与ICB存活结果的相关性和对数倍数变化（logFC）的加权平均值进行排序。缩写：TMB = 肿瘤突变负荷;ICB = 免疫检查点阻断;CRISPR =成簇的规则间隔短回文重复序列。 请点击这里查看此图的较大版本.
图10：不同癌症中 TMEM200A 的GSEA富集分析。 通过GSEA富集分析确定了 TMEM200A 在调节32种癌症中发挥主要功能作用的前五条通路。左图显示了 ACC、BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、MESO、OV、PAAD、PCPG、PRAD、READ 和 SARC 中TMEM200A的 GSEA 富集分析结果。右图显示了 SKCM、STAD、TGCT、THCA、THYM、UCEC、UCS 和 UVM 中TMEM200A的 GSEA 富集分析结果。缩写：GSEA =基因集富集分析;ACC = 肾上腺皮质癌;BLCA = 膀胱尿路上皮癌;BRCA = 乳腺浸润性癌;CESC = 宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌;CHOL =胆管癌;COAD = 结肠腺癌;ESCA = 食管癌;GBM = 多形性胶质母细胞瘤;HNSC = 头颈部鳞状细胞癌;KICH = 肾脏发色恐惧症;KIRC = 肾肾透明细胞癌;KIRP = 肾肾状细胞癌;LAML = 急性髓系白血病;LGG = 脑低级别胶质瘤;LIHC = 肝细胞癌;LUAD = 肺腺癌;LUSC = 肺鳞状细胞癌;MESO = 间皮瘤;OV = 卵巢浆液性囊腺癌;PAAD = 胰腺癌;PCPG = 嗜铬细胞瘤和副神经节瘤;PRAD = 前列腺腺癌;阅读：直肠腺癌;SARC=肉瘤;SKCM = 皮肤皮肤黑色素瘤;STAD =胃腺癌;TGCT = 睾丸生殖细胞肿瘤;THCA = 甲状腺癌;THYM = 胸腺瘤;UCEC = 子宫体子宫内膜癌;UCS = 子宫癌肉瘤;UVM = 葡萄膜黑色素瘤。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 11：STAD 中的TMEM200A。 （A） LinkedOmics 数据库发现的与 STAD 中TMEM200A表达呈负相关的前 50 个基因。（B） STAD 中与TMEM200A呈正相关的前 50 个基因。（C） STAD中TMEM200A前5个正相关基因和5个负相关基因。（D） STAD中DEGs的热图。（E-H）使用筛选的 DEG 研究富集的 GO 和 KEGG 通路。缩写：STAD=胃腺癌;DEGs=基因的差异表达;KEGG = 京都基因和基因组百科全书;GO = 基因本体论。请点击这里查看此图的较大版本.
图12：STAD临床特征与 TMEM200A 表达水平之间的相关性。 （A）使用logistic回归分析 TMEM200A 表达水平和STAD临床特征。（乙，三）单个变量和多个变量的 STAD 森林图的 Cox 分析。（D） 基于性别、病理分级、年龄、病理分期和 TMEM200A 表达预测 STAD 患者 OS 的柱线图。（E） 显示柱线图模型校准的校准图。缩写：STAD=胃腺癌;OS=总生存期。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 13：TMEM200A 表达在 STAD 中上调并促进胃癌细胞的增殖。 （A） 通过蛋白质印迹检测胃癌细胞 HGC-27 和胃粘膜上皮细胞 GES-1 中的TMEM200A表达。（B） 通过qRT-PCR检测GC细胞HGC-27和SGC-7901以及胃粘膜上皮细胞GES-1中的TMEM200A表达。（C） qRT-PCR显示，与非敲低组相比，TMEM200A敲低组在GC细胞HGC-27中TMEM200A的表达效率大大降低。（D） 通过CCK8测定测量TMEM200A敲低显着抑制GC细胞的增殖。（E）敲除TMEM200A显著抑制了EMT中的相关蛋白，影响了AKT在PI3K/AKT信号通路中的磷酸化。缩写：GC = 胃癌;qRT-PCR：实时定量聚合酶链反应;EMT=上皮-间充质转化;AKT=蛋白激酶B. 请点击这里查看此图的较大版本。
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Discussion
TMEM200A 属于 TMEM 家族，对癌细胞增殖至关重要38。不同恶性肿瘤中 TMEM200A 的可变表达受到的关注较少，缺乏彻底的泛癌变研究。然而，越来越多的证据表明，TMEM跨膜蛋白家族可能通过与多种蛋白质的相互作用在保持癌细胞恶性方面发挥重要作用，例如，ROCK1/moesin激活TMEM16A Ca2+激活的Cl- 通道促进BRCA转移39。因此，在目前的工作中，我们的分析重点是探索 TMEM200A 作为治疗癌症靶点和肿瘤诊断标志物的可行性。特别是，我们使用 UCSC Xena 数据库的 RNA-seq 数据研究了 33 种恶性肿瘤中 TMEM200A 的表达水平，TIMER2.0 数据库的结果成功验证了 UCSC Xena 数据库中的分析。
随后，使用肿瘤免疫单细胞中心（TISCH）网络工具和CancerSEA数据库分析不同类型单核细胞中 TMEM200A 的表达水平。Sangerbox 和 TISIDB 网站用于帮助了解 TMEM200A 如何影响免疫浸润。我们还通过GSEA富集分析确定了 TMEM200A 在每种癌症中发挥关键作用的信号通路，以了解 TMEM200A 在每种恶性肿瘤中的主要功能作用。
TMEM200A 可作为粘附分子，控制GC的免疫环境，促进GC细胞的侵袭性扩散。因此，我们通过TCGA数据库鉴定了483个与 TMEM200A 表达水平相关的差异表达基因（DEGs），并分析了这483个DEGs的GO和KEGG富集情况。富集结果表明，PI3K/AKT通路在癌症发展中起关键作用，PI3K/AKT通路可能是癌症的驱动因素之一。
此外，在更多地了解 TMEM200A 在驱动癌症发展中的关键作用后，我们进行了细胞和分子测试，以确认 TMEM200A 表达与STAD细胞活性之间的相关性。正如预期的那样，我们发现STAD细胞中下调 TMEM200A 大大降低了细胞增殖，并且癌细胞系的表达水平 TMEM200A 比正常细胞系高得多。通过梳理近年来与跨膜蛋白家族相关的文献，我们发现跨膜蛋白作为细胞粘附分子37，在EMT中具有调节作用。
此外，根据GC中 TMEM200A相关基因的富集分析结果，我们发现 TMEM200A 可能在GC的PI3K/AKT信号通路中具有调节作用。Western blotting实验显示， 敲低TMEM200A 可减少波形蛋白、N-钙粘蛋白和Snai蛋白，抑制AKT磷酸化，提示 TMEM200A 通过影响EMT来调节肿瘤微环境，PI3K/AKT信号通路可能参与 TMEM200A介导的GC发生调控。近年来，一些研究发现，EMT是GC患者化疗耐药的主要原因。上皮间充质可塑性 （EMP） 和肿瘤微环境已被描述为许多癌症类型有效治疗的限制因素40。EMT的发生可使GC细胞失去其特征性，并表现出间充质细胞的特征41。这一特点不仅降低了GC患者对化疗药物的敏感性，而且增强了GC细胞的侵袭性和迁移能力，导致肿瘤转移。因此，基于上述原因，本研究通过探索影响EMT的 TMEM200A 具体作用机制，有助于研究和开发EMT的关键调控点和开发新的靶向治疗方法。
近年来，生物信息学在研究中的使用有所增加，在这项研究中，我们访问了来自几个互联网数据库的数据。这些在线数据库在生物信息学中的使用简化并加快了癌症的研究，它们还为研究人员提供了一种经济实惠的方法来验证他们的结果。
然而，生物信息学技术确实有一定的缺点。当我们利用这些数据库进行分析时，由于许多在线数据库包含来自多个数据集的数据，因此同一研究可能会在多个数据库中提供不一致甚至相互矛盾的结果。此外，许多数据库很长一段时间都没有更新，而且由于版权问题，其内容永远无法扩大;因此，研究人员从这些数据库中获得的分析结果总是受到限制。因此，在这项研究中，我们采用了不同的数据库来共同检查结果，以克服这些限制并确保研究结果的正确性。为了确保我们获得的结果没有发生重大变化，我们在使用不同的数据库进行分析时重复了该过程。蛋白质印迹实验的结果支持了我们的生物信息学预测， 即TMEM200A 可能通过调节PI3K/AKT信号通路来控制GC中的EMT，从而影响GC细胞的增殖。我们结合相关文献，利用生物信息学预测 TMEM200A 的作用机制。
总之，这项工作展示了生物信息学工具如何显着促进实验设计并用于进行许多其他类型的科学研究预测。未来的癌症研究人员可能会采用将实验验证与生物信息学预测相结合的主要范式，这项工作可以作为实现这一目标的良好模型。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（82160550）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
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