Мультиомный анализ TMEM200A как панракового биомаркера
Summary
Здесь представлен протокол, в котором объединены несколько биоинформатических инструментов для изучения биологических функций TMEM200A при раке. Кроме того, мы также экспериментально проверяем предсказания биоинформатики.
Abstract
Известно, что трансмембранный белок, TMEM200A, связан с раком человека и иммунной инфильтрацией. Здесь мы оценили функцию TMEM200A при распространенных раковых опухолях с помощью мультиомного анализа и использовали клеточные культуры клеток желудка in vitro для проверки результатов. Экспрессию TMEM200A при нескольких типах рака человека оценивали с использованием данных РНК-секвенирования из базы данных UCSC Xena. Биоинформатический анализ выявил потенциальную роль TMEM200A как диагностического и прогностического биомаркера.
Культивировались культуры нормальных желудочных и раковых клеточных линий , и TMEM200A сбивали. Уровни экспрессии TMEM200A измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и вестерн-блоттинга. Затем исследования потери функции in vitro были использованы для определения роли TMEM200A в злокачественном поведении и опухолевом образовании клеток рака желудка (ГК). Вестерн-блоттинг использовали для оценки влияния нокдауна на эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и сигнальный путь PI3K/AKT при ГК. Биоинформатический анализ показал, что TMEM200A экспрессируется на высоких уровнях в ГХ.
Пролиферация GC-клеток ингибировалась нокдауном TMEM200A, который также снижал количество белков виментина, N-кадгерина и Snai и ингибировал фосфорилирование AKT. Сигнальный путь PI3K/AKT также, по-видимому, участвует в TMEM200A-опосредованной регуляции развития ГК. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что TMEM200A регулирует микроокружение опухоли, воздействуя на ЭМП. TMEM200A также может влиять на ЭМП через передачу сигналов PI3K/AKT, тем самым влияя на микроокружение опухоли. Таким образом, при панраковых опухолях, особенно при ГК, TMEM200A может быть потенциальным биомаркером и онкогеном.
Introduction
Рак превратился в постоянную проблему общественного здравоохранения, угрожающую здоровью человека во всеммире1из-за высокого уровня заболеваемости и смертности во всем мире, что создает тяжелое финансовое и медицинское бремядля общества2. Значительные успехи в терапии рака были достигнуты в последние годы благодаря открытию раковыхмаркеров, и исследователи разработали новые методы диагностики и новые лекарства для лечения рака. Тем не менее, некоторые пациенты с раком по-прежнему имеют плохие прогнозы из-за таких факторов, как лекарственная устойчивость, побочные эффекты лекарств и чувствительность к химическимвеществам. В связи с этим существует острая необходимость в выявлении новых биомаркеров для скрининга и лечения рака на ранних стадиях5.
Мембранные белки – это белки, которые могут связываться и интегрироваться в клетки и мембраны органелл6. Они могут быть сгруппированы в три категории в зависимости от силы связывания с мембраной и их расположения: липидно-якорные белки, интегральные белки и периферические мембранные белки 7,8. Трансмембранный белок (ТМЕМ) представляет собой интегральный мембранный белок, состоящий по меньшей мере из одного трансмембранного сегмента9, который полностью или частично проходит через биологическую мембрану.
Хотя механизмы действия белков, принадлежащих к семейству TMEM, недостаточно изучены, известно, что эти белки участвуют в развитии нескольких типоврака. Некоторые белки ТМЕМ ассоциированы с мигрирующими, пролиферативными и инвазивными фенотипами, и их экспрессия часто связана с прогнозом пациента11. Таким образом, члены семейства ТМЕМ стали объектом исследования. Всесторонний обзор существующих сообщений о ТМЕМ показал, что они в основном связаны с меж- и внутриклеточной сигнализацией12, иммунозависимыми заболеваниями и опухолегенезом10. Многие ТЭМ также обладают важными физиологическими функциями, например, ионными каналами в плазматической мембране, активацией путей передачи сигнала, а также посредничеством клеточного хемотаксиса, адгезии, апоптоза и аутофагии10. Таким образом, мы предположили, что белки ТМЕМ могут быть важными прогностическими маркерами в выявлении и лечении опухолей.
TMEM200A экспрессия значительно повышена при раке желудка (ГК). Более высокая экспрессия TMEM200A13, которая имеет восемь экзонов и полную длину 77,536 kb на хромосоме 6q23.1, была связана с плохим прогнозом общей выживаемости (ОВ) в случаях ГК. Тем не менее, об изменениях в его экспрессии редко сообщалось в онкологических исследованиях. В данной статье сравнивается и анализируется полезность TMEM200A в качестве терапевтической мишени и опухолевого диагностического маркера в различных онкологических исследованиях с использованием различных общедоступных наборов данных. Мы оценивали эффективность TMEM200A как панракового диагностического и прогностического биомаркера, а также уровни его экспрессии при различных типах рака человека с использованием данных РНК-секвенирования из баз данных UCSC Xena и TCGA, а также количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) и вестерн-блоттинга.
Влияние уровней экспрессии TMEM200A на частоту мутаций, регуляторные процессы, диагностику и прогноз опухолей, иммунную инфильтрацию и иммунотерапию было дополнительно изучено с использованием комбинации вычислительных инструментов и веб-сайтов наборов данных. Для изучения мутаций в TMEM200A использовались базы данных CBioPortal и Каталог соматических мутаций в раковых клетках (COSMIC). Для понимания того , как TMEM200A влияет на иммунную инфильтрацию, были использованы веб-сайты Sangerbox и TISIDB. Для исследования функции TMEM200A был использован онлайн-инструмент Центра опухолевого иммунитета (TISCH) и база данных CancerSEA. Наконец, для оценки влияния TMEM200A на злокачественное поведение и функцию развития опухоли ГК-клеток был проведен эксперимент по потере функции в анализе in vitro . Кроме того, был проведен вестерн-блоттинг для оценки влияния нокдауна TMEM200A сигнальный путь PI3K/AKT и эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) при ГК.
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A принадлежит к семейству ТМЭМ, которые необходимы для пролиферации раковых клеток38. Вариабельная экспрессия TMEM200A при различных злокачественных новообразованиях привлекла меньше внимания, и отсутствует тщательное панраковое исследование. Тем не менее, прод…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82160550).
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends–an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
- Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors – Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
- Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
- Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
- Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
- Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
- Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
- Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
- Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
- Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
- Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
- Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
- Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
- Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
- Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
- Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
- Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
- Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
- Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
- Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
- Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
- Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
- Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
- Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
- Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
- Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
- Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
- Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
- Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
- Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
- Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
- Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
- Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
- Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
- Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
- Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
- Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
- Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
- De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
- Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).
