Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحليل Multiomics ل TMEM200A كمؤشر حيوي شامل للسرطان

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول يتم فيه الجمع بين أدوات المعلوماتية الحيوية المتعددة لدراسة الوظائف البيولوجية TMEM200A في السرطان. بالإضافة إلى ذلك ، نقوم أيضا بالتحقق تجريبيا من صحة تنبؤات المعلوماتية الحيوية.

Abstract

TMEM200A ، من المعروف أن البروتين عبر الغشاء مرتبط بالسرطانات البشرية والتسلل المناعي. هنا ، قمنا بتقييم وظيفة TMEM200A في السرطانات الشائعة عن طريق تحليل multiomics واستخدامها في مزارع الخلايا المختبرية لخلايا المعدة للتحقق من النتائج. تم تقييم التعبير عن TMEM200A في العديد من أنواع السرطان البشري باستخدام بيانات RNA-seq من قاعدة بيانات UCSC Xena . كشف تحليل المعلوماتية الحيوية عن دور محتمل ل TMEM200A كعلامة حيوية تشخيصية وتنبؤية.

نمت مزارع خطوط خلايا المعدة والسرطان الطبيعية وتم هدم TMEM200A . تم قياس مستويات التعبير عن TMEM200A باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي والنشاف الغربي. ثم تم استخدام دراسات فقدان الوظيفة في المختبر لتحديد أدوار TMEM200A في السلوك الخبيث وتكوين الورم لخلايا سرطان المعدة (GC). تم استخدام البقع الغربية لتقييم تأثير ضربة قاضية على الانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) ومسار إشارات PI3K / AKT في GC. أظهر تحليل المعلوماتية الحيوية أنه تم التعبير عن TMEM200A بمستويات عالية في GC.

تم تثبيط تكاثر خلايا GC عن طريق ضربة قاضية TMEM200A ، والتي قللت أيضا من بروتينات vimentin و N-cadherin و Snai ، وتثبط فسفرة AKT. كما يبدو أن مسار إشارات PI3K / AKT يشارك في التنظيم بوساطة TMEM200A لتطوير GC. تشير النتائج المقدمة هنا إلى أن TMEM200A ينظم البيئة المكروية للورم من خلال التأثير على EMT. قد يؤثر TMEM200A أيضا على EMT من خلال إشارات PI3K / AKT ، وبالتالي التأثير على البيئة المكروية للورم. لذلك ، في السرطانات الشاملة ، وخاصة GC ، قد يكون TMEM200A علامة حيوية محتملة وجين ورمي.

Introduction

برز السرطان كقضية صحية عامة مستمرة تعرض صحة الإنسان للخطر على مستوىالعالم 1بسبب ارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم ، مما يشكل عبئا ماليا وطبيا ثقيلا على المجتمع2. تم تحقيق تقدم كبير في علاج السرطان في السنوات الأخيرة بفضل اكتشاف علامات السرطان3 ، وطور الباحثون طرقا تشخيصية جديدة وعقاقير جديدة لعلاج السرطان. ومع ذلك ، لا يزال بعض مرضى السرطان يعانون من توقعات سيئة بسبب عوامل مثل مقاومة الأدوية والآثار الجانبية للأدوية والحساسية الكيميائية4. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتحديد مؤشرات حيوية جديدة لفحص وعلاج السرطانات في المراحل المبكرة5.

البروتينات الغشائية هي بروتينات يمكن أن ترتبط وتندمج في الخلايا وأغشية العضيات6. يمكن تجميعها في ثلاث فئات اعتمادا على قوة الارتباط بالغشاء وموقعها: البروتينات المثبتة على الدهون ، والبروتينات المتكاملة ، وبروتينات الغشاء المحيطي 7,8. البروتين عبر الغشاء (TMEM) هو بروتين غشائي متكامل يتكون من جزء واحد على الأقل عبر الغشاء9 ، والذي يمر إما كليا أو جزئيا عبر الغشاء البيولوجي.

على الرغم من أن آليات عمل البروتينات التي تنتمي إلى عائلة TMEM ليست مفهومة جيدا ، فمن المعروف أن هذه البروتينات تشارك في عدة أنواع من السرطانات10. ترتبط العديد من بروتينات TMEM بالأنماط الظاهرية المهاجرة والتكاثرية والغازية ، وغالبا ما يرتبط تعبيرها بتشخيص المريض11. لذلك ، أصبح أفراد عائلة TMEM هدفا للبحث. كشفت مراجعة شاملة للتقارير الحالية حول TMEM أنها ترتبط في الغالب بالإشارات بين الخلاياوداخلها 12 ، والأمراض المرتبطة بالمناعة ، وتكوين الأورام10. تمتلك العديد من TMEMs أيضا وظائف فسيولوجية مهمة ، على سبيل المثال ، القنوات الأيونية في غشاء البلازما ، وتفعيل مسارات نقل الإشارات ، بالإضافة إلى وساطة الانجذاب الكيميائي للخلايا ، والالتصاق ، وموت الخلايا المبرمج ، والالتهام الذاتي10. لذلك ، افترضنا أن بروتينات TMEM قد تكون علامات تنبؤية مهمة في اكتشاف الأورام وعلاجها.

TMEM200A التعبير مرتفع بشكل ملحوظ في سرطان المعدة (GC). تم ربط التعبير الأعلى عن TMEM200A 13 ، والذي يحتوي على ثمانية إكسونات وطول كامل يبلغ 77.536 كيلو بايت على الكروموسوم 6q23.1 ، بسوء تشخيص البقاء على قيد الحياة بشكل عام (OS) في حالات GC. ومع ذلك ، نادرا ما تم الإبلاغ عن التغييرات في تعبيره في دراسات الأورام. تقارن هذه المقالة وتحلل فائدة TMEM200A كهدف علاجي وعلامة تشخيصية للورم في دراسات السرطان المختلفة باستخدام مجموعات بيانات مختلفة متاحة للجمهور. قمنا بتقييم فعالية TMEM200A كمؤشر حيوي تشخيصي وتنبؤي للسرطان بالإضافة إلى مستويات تعبيره في أنواع مختلفة من السرطان البشري باستخدام بيانات RNA-seq من قواعد بيانات UCSC Xena و TCGA ، وكذلك عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) والنشاف الغربي.

تم التحقيق في تأثير مستويات التعبير TMEM200A على معدلات الطفرات ، والعمليات التنظيمية ، وتشخيص الورم والتشخيص ، وتسلل المناعة ، والعلاج المناعي باستخدام مزيج من الأدوات الحسابية ومواقع مجموعة البيانات. تم استخدام CBioPortal وكتالوج الطفرات الجسدية في الخلايا السرطانية (COSMIC) لفحص الطفرات في TMEM200A. تم استخدام مواقع Sangerbox و TISIDB لفهم كيفية تأثير TMEM200A على تسلل المناعة. تم استخدام أداة مركز الخلية الواحدة المناعية للورم (TISCH) عبر الإنترنت وقاعدة بيانات CancerSEA للتحقيق في وظيفة TMEM200A. أخيرا ، لتقييم تأثير TMEM200A على السلوك الخبيث ووظيفة تطور الورم لخلايا GC ، أجريت تجربة فقدان الوظيفة في فحص في المختبر . بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء النشاف الغربي لتقييم كيفية تأثير ضربة قاضية TMEM200A على مسار إشارات PI3K / AKT والانتقال الظهاري الوسيط-الوسيطة (EMT) في GC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA)

ملاحظة: تحتوي قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA) على بيانات تسلسل الجينات في أنسجة الورم المختلفة14. تم استخراج بيانات RNA-seq في TCGA لدراسة TMEM200A نسخة لكل جزء في المليون (TPM) من موقع UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net / datapages /) وتم تحويل log2 لمقارنة التعبيرات بين العينات.

  1. انتقل إلى واجهة موقع UCSC Xena على الويب.
  2. انقر فوق علامة التبويب Launch Xena .
  3. انقر فوق علامة التبويب مجموعات البيانات في الجزء العلوي من الشاشة.
  4. من بين 129 مجموعة و 1,571 مجموعة بيانات في هذه الصفحة ، انقر فوق علامة التبويب لما مجموعه 33 سرطانا مثل GDC TCGA سرطان الدم النخاعي الحاد (LAML) وسرطان القشرة الكظرية GDC TCGA (ACC) وسرطان القناة الصفراوية GDC TCGA (CHOL) والمزيد.
  5. من قائمة التعبير الجيني RNAseq ، حدد وانقر فوق علامة التبويب HTSeq - FPKM GDC Hub .
    ملاحظة: HTSeq - FPKM GDC Hub يمثل البيانات التي تم تصحيحها بالموافقة.
  6. من قائمة التنزيل ، انقر فوق الارتباط المقابل لها.
    ملاحظة: بالطريقة المذكورة أعلاه ، تم تنزيل بيانات RNA-Seq ل 33 نوعا مختلفا من السرطان.
  7. قم بفك ضغط الأرشيف المضغوط لبيانات RNA-seq ل 33 نوعا مختلفا من السرطان في ملف واحد في مجلد سطح المكتب بالكمبيوتر.
  8. قم بتوحيد ملفات txt التي تم فك ضغطها في نفس المجلد وضع نصوص Perl النصية في هذا المجلد.
  9. افتح برنامج Perl ، وانسخ والصق مسار المجلد في برنامج Perl حيث يوجد مؤشر الماوس ، واضغط على مفتاح Enter ، وأدخل اسم رمز Perl واسم الجين (TMEM200A) ، ثم اضغط على مفتاح Enter للحصول على ملف txt جديد (singleGeneExp.txt).
    ملاحظة: يحتوي ملف txt الجديد هذا (singleGeneExp.txt) على تعبير جيني عن TMEM200A في 33 سرطانا في مرضى مختلفين.
  10. افتح رمز R (diffR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف singleGeneExp.txt إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  11. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل رمز R المعدل (diffR) ، وارسم الصورة من خلال حزمة "ggpubr".

2. قاعدة بيانات TIMER2.0

  1. انتقل إلى واجهة موقع قاعدة بيانات TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 16.
  2. انقر فوق علامة التبويب استكشاف السرطان.
  3. أدخل معرف الجين (TMEM200A) في مربع البحث وانقر فوق علامة التبويب إرسال للحصول على صور التعبير التفاضلي TMEM200A في أنواع مختلفة من الأورام.

3. أطلس البروتين البشري (HPA)

  1. انتقل إلى واجهة الويب أطلس البروتين البشري (HPA) (www.proteinatlas.org) 17.
  2. اكتب ID (TMEM200A) في مربع البحث وانقر فوق الزر بحث . حدد أطلس الأنسجة الفرعي.
  3. مرر مؤشر الماوس فوق الصفحة ومرر لأسفل للعثور على علامة التبويب نظرة عامة على تعبير البروتين .
    ملاحظة: يعرض قسم "نظرة عامة على تعبير البروتين " مستويات تعبير البروتين TMEM200A في 45 عضوا في جسم الإنسان.

4. مجموعة منصة مثيلة الحمض النووي HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA

ملاحظة: تم استخدام مصفوفة منصة مثيلة الحمض النووي HumanMethylation450 Illumina Infinium لجمع البيانات حول المثيلة. يمكننا تقييم مستويات مثيلة الحمض النووي TMEM200A باستخدام قاعدة بيانات SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. انتقل إلى واجهة موقع SMART على الويب.
  2. أدخل معرف الجين (TMEM200A) في مربع البحث للحصول على توزيع TMEM200A في الكروموسومات ومستوى مثيلة TMEM200A في أنواع مختلفة من الأورام الخبيثة.
  3. قم بالتمرير لأسفل الصفحة إلى قائمة انقر للتحقق من قائمة المثيلة المجمعة CpG وانقر فوق الزر رسم . في أسفل الصفحة ، ابحث عن زر تنزيل الشكل وانقر عليه. قم بتنزيل الشكل.

5. قاعدة بيانات UALCAN

  1. انتقل إلى واجهة موقع UALCAN .
    ملاحظة: تم إنشاء مخططات صندوقية لمستويات مثيلة المروج TMEM200A في مختلف الأورام الخبيثة من خلال قاعدة بيانات UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. في الجزء العلوي من الصفحة ، انقر فوق الزر TCGA .
  3. أدخل TMEM200A في مربع إدخال معرف الجينات على الشاشة. في قائمة مجموعة بيانات TCGA ، قم بالتمرير لأسفل وحدد نوع السرطان المراد الاستعلام عنه.
  4. بعد النقر فوق الزر "استكشاف " ، انقر فوق تحليل المجموعة الفرعية الخاصة به مثيلة في قائمة روابط التحليل للحصول على نتائج مثيلة هذا الورم.
    ملاحظة: بهذه الطريقة ، حصلنا على نتائج مثيلة ل 22 ورما في قاعدة بيانات UALCAN .

6. كتالوج الطفرات الجسدية في الخلايا السرطانية (COSMIC) قاعدة بيانات

  1. انتقل إلى كتالوج الطفرات الجسدية في الخلايا السرطانية (COSMIC) واجهة موقع الويب.
    ملاحظة: تتوفر بيانات عن الطفرات المشفرة ، وإعادة ترتيب الجينوم الطافر غير المشفر ، وجينات الاندماج في الجينوم البشري من كتالوج الطفرات الجسدية في الخلايا السرطانية (COSMIC) قاعدة البيانات20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/) ، والتي تستخدم أيضا لتحديد تواتر الطفرات TMEM200A المختلفة في مختلف أنواع السرطان.
  2. أدخل معرف الجين (TMEM200A) في مربع البحث وانقر فوق الزر بحث للانتقال إلى شاشة جديدة.
  3. في قائمة الجينات ، حدد موقع وانقر على الرابط حيث يظهر اسم معرف الجين الخاص TMEM200A .
  4. ابحث عن عمود تجميع توزيع الطفرات في الصفحة الجديدة للحصول على حالة الطفرة TMEM200A في الورم.

7. سي بيوبورتال

  1. انتقل إلى واجهة موقع CBioPortal .
    ملاحظة: يمكن العثور على بيانات جينوم السرطان وتنزيلها وتحليلها وتصورها باستخدام قاعدة بيانات cBioPortal (www.cioportal.org). الطفرات الجسدية ، وتغيرات عدد نسخ الحمض النووي (CNAs) ، وتعبير mRNA و microRNA (miRNA) ، ومثيلة الحمض النووي ، ووفرة البروتين ، ووفرة البروتين الفوسفاتي ليست سوى عدد قليل من أنواع البيانات الجينومية التي تم دمجها بواسطة cBioPortal21. مع cBioPortal ، يمكن إجراء مجموعة واسعة من الدراسات ؛ ومع ذلك ، ينصب التركيز الرئيسي على التحليلات المختلفة المتعلقة بالطفرات وتصورها.
  2. حدد تحليل عموم السرطان لمجموعة بيانات الجينوم الكامل من القسم الفرعي PanCancer Studies في قسم تحديد الدراسات للتصور والتحليل . ثم ، انقر فوق الزر استعلام حسب الجينات .
  3. أدخل معرف الجين الهدف (TMEM200A) في مربع الاستعلام في إدخال الجينات. انقر فوق الزر إرسال استعلام .
  4. انقر فوق الزر "مفصل نوع السرطان " أعلى الصفحة للحصول على طفرات TMEM200A في أنواع مختلفة من السرطانات.

8. أداة سانجربوكس 3.0

  1. انتقل إلى واجهة أداة Sangerbox 3.0 .
    ملاحظة: تم تحليل ارتباط التعبير TMEM200A مع الخلايا المتسللة المناعية ، والعوامل المثبطة للمناعة ، وعوامل التحفيز المناعي ، وجزيئات MHC (مجمع التوافق النسيجي الرئيسي) في جميع أنواع السرطان بواسطة تسلل CIBERSORT المناعي باستخدام بيانات التسلل المناعي للسرطان في أداة Sangerbox 3.022 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. من شريط الأدوات الموجود على الجانب الأيسر من الصفحة ، حدد وانقر فوق علامة التبويب التحليل المناعي (CIBERSORT) من قائمة تحليل عموم السرطان .
  3. أدخل معرف الجين الهدف (TMEM200A) في مربع الاستعلام في إدخال الجينات. انقر فوق الزر إرسال .

9. قاعدة بيانات TISIDB

  1. انتقل إلى واجهة موقع TISIDB .
    ملاحظة: تم استخدام قاعدة بيانات TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) لفحص ارتباط التعبير TMEM200A بالخلايا المتسللة المناعية والعوامل المثبطة للمناعة وعوامل التحفيز المناعي وجزيئات MHC في أنواع مختلفة من السرطان.
  2. أدخل رمز الجين الهدف (TMEM200A) في مربع الاستعلام الخاص بإدخال الجينات. انقر فوق الزر إرسال .
  3. انقر فوق أقسام الخلايا الليمفاوية ومضادات المناعة والكيموكينات والنوع الفرعي في أعلى الصفحة. قم بتنزيل الصور ذات الصلة في أسفل الصفحة.

10. قاعدة بيانات المد والجزر

  1. انتقل إلى واجهة موقع TIDE .
    ملاحظة: تم استخدام قاعدة بيانات TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) لتقييم إمكانات TMEM200A كمؤشر حيوي للتنبؤ بالاستجابة لعلاج حصار نقطة التفتيش المناعية للورم.
  2. أدخل عنوان البريد الإلكتروني على الشاشة الأولية لتسجيل الحساب وتسجيل الدخول.
  3. ابحث عن القسم الفرعي تقييم العلامات الحيوية في أعلى الصفحة وانقر عليه.
  4. أدخل معرف الجين الهدف (TMEM200A) في مربع الاستعلام لإدخال الجينات في أسفل الصفحة. ثم ، انقر فوق الزر إرسال .
  5. في الصفحة، اسحب الماوس لتحريك الصفحة لأسفل للعثور على نتائج التحليل.

11. قاعدة بيانات السرطان SEA

  1. انتقل إلى واجهة موقع CancerSEA على الويب.
    ملاحظة: باستخدام بيانات تسلسل الخلية الواحدة ، تم التحقيق في العلاقات بين التعبير TMEM200A والحالة الوظيفية للخلايا السرطانية المختلفة. تم ذلك باستخدام قاعدة بيانات CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. في الجزء العلوي من الصفحة ، ابحث عن علامة التبويب بحث وانقر عليها.
  3. أدخل معرف الجين الهدف (TMEM200A) في مربع الاستعلام في إدخال الجينات. انقر فوق الزر إرسال .

12. أداة شبكة مركز الخلية الواحدة المناعي للورم (TISCH)

  1. انتقل إلى واجهة موقع ويب أداة شبكة مركز الخلية الواحدة المناعي للورم (TISCH ).
    ملاحظة: تم أيضا إظهار العلاقة بين مستويات التعبير للخلايا TMEM200A والسرطانية باستخدام أداة شبكة مركز الخلية الواحدة المناعية للورم (TISCH)25.
  2. أدخل معرف الجين الهدف (TMEM200A) في مربع الاستعلام في إدخال الجينات. انقر فوق الزر استكشاف .
  3. في قائمة نوع السرطان في هذه الصفحة ، حدد وانقر فوق مجموعة بيانات جميع أنواع السرطان. ثم قم بالتمرير لأسفل الصفحة وانقر فوق الزر "بحث ".

13. جين مانيا

  1. انتقل إلى واجهة موقع GeneMANIA .
    ملاحظة: تم التنبؤ بالعلاقة بين TMEM200A وجيناته ذات الصلة وظيفيا باستخدام استراتيجية التكامل لموقع شبكة الجينات متعددة الجمعيات GeneMANIA (www.genemania.org)26 لبناء شبكات التفاعل الجيني الجيني (GGI ).
  2. في مربع البحث أعلى يمين الصفحة، أدخل معرف الجين (TMEM200A) وانقر على أدوات البحث.
    ملاحظة: تم استخدام أداة الويب GeneMANIA للعثور على 20 جينا مرتبطا ب TMEM200A.

14. تحليل الإثراء الوظيفي

  1. احفظ معرفات الرموز للجينات المراد تحليلها للإثراء بتنسيق ملف txt.
  2. افتح رمز R (symbolidR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف txt أعلاه إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  3. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (symbolidR). قم بتحويل معرفات الرموز لهذه الجينات إلى معرفات entrezID عبر "org. حزمة Hs.eg.db بوصة. احصل على ملف id.txt .
  4. افتح رمز R (GOR و KEGGR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف id.txt إلى السطر حيث يوجد setwd في كود R.
  5. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (GOR و KEGGR). لاتباع هذا البروتوكول ، قم بتحليل هذه الجينات لتخصيب GO و KEGG بواسطة الحزم "clusterProfiler" و "org. Hs.eg.db" و "enrichplot" ورسم نتائج التخصيب باستخدام الحزمة "gglot2".

15. تحليل الاختلافات في نشاط الجينات

ملاحظة: تم حساب TMEM200A الدرجات في كل عينة سرطان باستخدام ssGSEA (تحليل إثراء مجموعة الجينات لعينة واحدة)27 ، وتم إجراء التحليل التفاضلي لنشاط الجينات TMEM200A في الأنسجة السرطانية والسليمة لمختلف أنواع السرطان.

  1. استنادا إلى بيانات RNA-seq ل 33 نوعا من الأورام التي تم تنزيلها في الخطوة 1.7 ، قم بفك ضغط جميع الملفات التي تم تنزيلها ووضعها في مجلد موحد.
  2. ضع ملف merge.txt في المجلد أعلاه.
    ملاحظة: تحتوي البيانات الموجودة في ملف merge.txt من BioWolf (www.biowolf.cn) على تعبير جيني لجميع المرضى في جميع الأورام في قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA).
  3. افتح رمز R (ssGSEAR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد المجلد أعلاه إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  4. خذ السطر الذي يوجد فيه اسم الجين في رمز R (ssGSEAR) وأدخل معرف الجين (TMEM200A).
  5. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (ssGSEAR). احصل على ملف التسجيل لنشاط الجينات: scores.txt.
    ملاحظة: باستخدام خوارزمية ssGSEA ، نقوم أولا بإنشاء ملف مجموعة جينات بناء على معاملات الارتباط بين الجينات وفقا للبيانات المقدمة في ملف merge.txt وتحديد الجينات ذات الارتباط الأعلى مع الجين المستهدف (TMEM200A) من الملف. بعد ذلك، تتحد الجينات ذات الارتباط الأعلى في صورة الجينات النشطة ل TMEM200A، وأخيرا، نحصل على درجات الجينات النشطة في كل عينة.
  6. افتح رمز R (scoreDiffR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف scores.txt إلى السطر حيث يوجد setwd في كود R.
  7. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل رمز R المعدل (scoreDiffR) ، وارسم الصورة من خلال حزم "plyr" و "reshape2" و "ggpubr".

16. الارتباط السريري المرضي وتحليل تشخيص البقاء على قيد الحياة

  1. انتقل إلى واجهة موقع UCSC Xena على الويب.
  2. انقر فوق علامة التبويب تشغيل Xena .
  3. انقر فوق علامة التبويب مجموعات البيانات في الجزء العلوي من الشاشة.
  4. مرر مؤشر الماوس فوق الصفحة وانتقل لأسفل للعثور على علامة التبويب TCGA Pan-Cancer (PANCAN ).
  5. من بين 129 مجموعة و1,571 مجموعة بيانات في هذه الصفحة، انقر على علامة التبويب TCGA Pan-Cancer (PANCAN ).
  6. من قائمة النمط الظاهري ، حدد وانقر فوق علامة التبويب البيانات السريرية المنسقة.
  7. من قائمة التنزيل ، انقر فوق الارتباط المقابل لها.
    ملاحظة: قم بتنزيل البيانات السريرية ل 33 سرطانا من قاعدة بيانات TCGA على الرابط أعلاه.
  8. قم بفك ضغط ملف البيانات السريرية الذي تم تنزيله وافتح الملف الذي تم فك ضغطه بتنسيق ملف xls.
  9. تنظيم البيانات السريرية المطلوبة والاحتفاظ بها (المرحلة والعمر والمرحلة المرضية وحالة المريض) في الملف ، وحذف البيانات السريرية المتبقية غير الضرورية ، وحفظ الملف بأكمله كملف بتنسيق txt بعد إعادة تسميته سريريا.
  10. استنادا إلى singleGeneExp.txt التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.9 ، ضع هذا الملف في نفس المجلد مثل ملف clinical.txt المنظم.
  11. قم بفك ضغط البيانات السريرية التي تم تنزيلها ووضع ملفات singleGeneExp.txt و clinical.txt في نفس المجلد مثل الملفات السريرية التي تم فك ضغطها.
  12. افتح رمز R (clinicalDiffR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد المجلد أعلاه إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  13. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل رمز R المعدل (clinicalDiffR) ، وارسم الصورة باستخدام حزمة "ggpubr".
  14. انتقل إلى واجهة موقع UCSC Xena على الويب.
  15. انقر فوق علامة التبويب تشغيل Xena .
  16. انقر فوق علامة التبويب مجموعات البيانات في الجزء العلوي من الشاشة.
  17. من بين 129 مجموعة و 1,571 مجموعة بيانات في هذه الصفحة ، انقر فوق علامة التبويب لما مجموعه 33 سرطانا مثل GDC TCGA سرطان الدم النخاعي الحاد (LAML) وسرطان القشرة الكظرية GDC TCGA (ACC) وسرطان القناة الصفراوية GDC TCGA (CHOL) والمزيد.
  18. من قائمة النمط الظاهري ، حدد وانقر فوق علامة التبويب بيانات البقاء على قيد الحياة.
  19. من قائمة التنزيل ، انقر فوق الارتباط المقابل لها.
  20. قم بفك ضغط الأرشيف المضغوط لبيانات البقاء على قيد الحياة ل 33 نوعا مختلفا من السرطان في ملف واحد في مجلد سطح المكتب الخاص بالكمبيوتر.
  21. ضع بيانات البقاء على قيد الحياة التي تم فك ضغطها في نفس المجلد مثل ملف singleGeneExp.txt الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.9.
  22. افتح رمز R (preOSR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد المجلد أعلاه إلى السطر الذي يوجد به setwd في كود R.
  23. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (preOSR). احسب من خلال حزمة "limma" للحصول على ملف بيانات حول بقاء TMEM200A في عموم السرطان: expTime.txt.
  24. افتح رمز R (OSR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف expTime.txt إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  25. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (OSR). قم بإجراء تحليل KM باستخدام حزم "البقاء على قيد الحياة" و "survminer" بناء على البيانات الموجودة في ملف expTime.txt ورسم منحنيات البقاء على قيد الحياة TMEM200A في عموم السرطان.

17. تحليلات انحدار كوكس أحادية المتغير ومتعددة المتغيرات مع بناء قطعة أرض الغابات

  1. افتح رمز R (COXR) وانسخ والصق المسار الذي حصلنا عليه expTime.txt الملف من 16.23 الموجود في السطر الذي يوجد به setwd في رمز R.
  2. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (COXR). استنادا إلى البيانات الموجودة في ملف expTime.txt ، قم بإجراء تحليلات انحدار COX أحادية المتغير باستخدام حزم "البقاء على قيد الحياة" و "survminer" و "forestplot" لرسم مخطط غابة أحادي المتغير TMEM200A في سرطانات مختلفة.
  3. ضع الملف expTime.txt من الخطوة 16.23 و clinical.txt من الخطوة 16.10 في نفس المجلد.
  4. افتح رمز R (multicoxR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد المجلد الذي يحتوي على ملف expTime.txt من الخطوة 16.23 وملف clinical.txt من الخطوة 16.10 إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  5. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (multicoxR). قم بإجراء تحليل انحدار COX متعدد المتغيرات باستخدام حزم "البقاء على قيد الحياة" و "survminer" لرسم مخطط غابات متعدد المتغيرات من TMEM200A في سرطانات مختلفة بناء على البيانات الموجودة في ملفات expTime.txt و clinical.txt .

18. نموذج النذير لسرطان المعدة على أساس التعبير TMEM200A والسمات السريرية

  1. ضع الملف clinical.txt من الخطوة 16.10 والملف expTime.txt من الخطوة 16.23 في نفس المجلد.
  2. افتح رمز R (NomoR) وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف txt أعلاه إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  3. افتح برنامج R وقم بتشغيل رمز R المعدل (NomoR). استخدم حزم البرامج "البقاء على قيد الحياة" و "regplot" و "rms" للحصول على بيانات التعبير TMEM200A في GC والبيانات السريرية لبناء نموذج تنبؤي للتنبؤ ببقاء المريض.

19. زراعة الخلايا ونقل siRNA من TMEM200A

ملاحظة: تم الحصول على خلايا STAD HGC-27 البشرية وخلايا SGC-7901 وخلايا GES-1 الظهارية المخاطية البشرية في المعدة تجاريا (انظر جدول المواد) ، وتم إحياؤها وتلقيحها في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط كامل (يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني حديث الولادة و 1٪ خليط بنسلين) ، وزرعت عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة زراعة الخلايا. تم تغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام. تم تلقيح الخلايا في حالة نمو جيدة في ألواح سداسية الآبار وفقا ل (2-3) × 105 خلايا لكل بئر.

  1. أولا ، خذ ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة وأضف 8 ميكرولتر من كاشف النقل (انظرT able of Materials) و 200 ميكرولتر من الوسط القاعدي لكل أنبوب. ثم أضف 4 ميكروغرام من SiRNA1 و SiRNA2 و SiRNA3 إلى كل أنبوب على التوالي.
    ملاحظة: بالنسبة للضربة القاضية TMEM200A ، تم تصميم siRNA وشرائه (انظر جدول المواد).
  2. امزج الخليط في أنابيب الطرد المركزي الثلاثة الدقيقة جيدا وأضفه إلى كل من الآبار الثلاثة للوحة المكونة من 6 آبار. رج الطبق المكون من 6 آبار برفق لتوزيع الخليط بالتساوي. قم بتسمية الآبار الثلاثة التي أضيف إليها الخليط على أنها SiRNA-1 و SiRNA-2 و SiRNA-3.
  3. عندما يتم تحضين الخلايا لمدة 4-6 ساعات ، استبدل نصف الوسط في الآبار الفرعية الثلاثة في لوحة 6 آبار.
    ملاحظة: عند استبدال نصف الوسط الكامل ، قم بنضح نصف الوسط الكامل الأصلي وقم بتجديده بنصف الوسط الكامل الجديد.
  4. بعد أربعة وعشرين إلى 48 ساعة ، استخدم الخلايا المنقولة TMEM200A siRNA كمجموعة تجريبية والخلايا غير المنقولة كمجموعة تحكم سلبية. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR ، انظر القسم 20) لتقييم تأثير النقل على الخلايا.

20. تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الحقيقي

  1. تخلص من وسط زراعة الخلايا في كل مجموعة فرعية واغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. اعزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  3. تقدير تركيز الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تخليق cDNA ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) على تخفيفات 10 أضعاف من cDNA في 10 ميكرولتر من مزيج التفاعل ، بما في ذلك البادئات الأمامية والخلفية الخاصة بالإنسان ل GAPDH (للتوحيد القياسي) ، TMEM200A (انظر جدول المواد) ، و qPCR Master Mix ، باستخدام نظام فحص PCR في الوقت الفعلي.
    ملاحظة: قم بإجراء كل تجربة في ثلاث نسخ.
  5. استخدم شروط تفاعل qPCR التالية: التهيئة ، 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ تمسخ ، 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ التلدين ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ والتمديد ، 80 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ كرر التمسخ والتلدين والتمديد 40x. حدد التعبير النسبي لكل جين باستخدام تقنية 2-ΔΔCt 28.
  6. كرر التجارب ثلاث مرات على الأقل للحصول على ثلاث نسخ بيولوجية.

21. الكشف عن اللطخة الغربية لتعبير البروتين ذي الصلة

  1. تخلص من وسط زراعة الخلايا في كل مجموعة فرعية واغسل الخلايا برفق باستخدام 2 × 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. قم بتبريد الألواح المكونة من 6 آبار التي تحتوي على الخلايا الموجودة على الجليد وأضف 150 ميكرولتر من محلول تحلل مقايسة الترسيب المناعي الراديوي المبرد مسبقا (RIPA) (150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ Triton X-100 ، 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم ، 0.1٪ SDS ، 50 مللي متر Tris-HCl pH 8.0 ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني المضاف حديثا). اترك التحلل يستمر على الجليد لمدة 10 دقائق.
  3. باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية ، قم بإزالة الخلايا الملتصقة من الطبق وانقل محلول الخلية بدقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق تم تبريده مسبقا.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخلية محللة لمدة 10 دقائق عند 1.5 × 104 جم عند 4 درجات مئوية. نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
  5. استخدم مجموعة فحص البروتين BCA لتحديد محتوى البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  6. قم بتحميل 30 جم من البروتين من كل عينة على هلام كهربائي 10٪ من كبريتات دوديسيل بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) من الصوديوم وقم بتشغيله عند 80 فولت لمدة 0.5 ساعة متبوعا ب 1.5 ساعة عند 120 فولت.
  7. نقل البروتينات من الجل إلى غشاء 45 ميكرومتر ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) بجهد 300 مللي أمبير لمدة 1-1.5 ساعة.
  8. بعد وضع غشاء PVDF على شاكر ورجه لمدة 3 × 5 دقائق ، أضف محلول ملحي مخزن Tris مع Tween 20 (TBST ، 20 mM Tris-HCl ، pH 7.4 ، 150 mM NaCl ، و 0.1٪ Tween 20) إلى الحاوية المناسبة مع توجيه جانب البروتين (جانب الهلام) لأعلى.
  9. ضع الغشاء في المخزن المؤقت المانع (انظر جدول المواد) واحتضانه لمدة 0.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل الغشاء باستخدام TBST لمدة 3 × 10 دقائق.
  11. احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية ضد phospho-AKT (p-AKT ؛ 1: 1,000) ، إجمالي AKT 1: 1,000 ، E-cadherin (E-ca ؛ 1: 1,000) ، N-cadherin (N-ca ؛ 1: 1,000) ، Vimentin 1: 1,000 ، الحلزون 1: 1,000 ، TMEM200A 1: 1,000 ، غليسيرالدهيد 3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH ؛ 1: 1,000) ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  12. اغسل الغشاء لمدة 3 × 10 دقائق واحتضن الغشاء بجسم مضاد ثانوي للأرنب أو الفأر (1: 5000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  13. احتضان غشاء PVDF مع ركيزة ECL لمدة 30 ثانية واكتشاف الإشارة باستخدام نظام التصوير.

22. فحص CCK-8

  1. بذر خلايا STAD HGC-27 البشرية في حالة نمو جيدة في 96 لوحة بئر.
  2. عندما تصل كثافة الخلية إلى 60-70٪ ، قم بنقل الخلايا باستخدام TMEM200A siRNA (كما في الخطوة 19.3).
  3. قم بزرع الخلايا المنقولة إلى 96 صفيحة بئر بكثافة خلية 5 × 10 3 / بئر (عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام عداد الخلايا) ، مقسمة إلى مجموعات NC و TMEM200A siRNA (مع ثلاثة آبار مكررة في كل مجموعة) ، ويتم تحضينها عند 37 درجة مئوية.
  4. أضف كاشف CCK-8 بعد 0 و 24 و 48 و 72 و 96 ساعة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. قم بقياس الامتصاص (450 نانومتر) باستخدام جهاز لصق إنزيم متعدد الوظائف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التعبير عن TMEM200A في أنواع مختلفة من السرطان
كما هو موضح في الشكل 1 ، قمنا أولا بتحليل مستويات التعبير التفاضلي ل TMEM200A في أنواع مختلفة من السرطان من خلال قواعد بيانات مختلفة. كان التعبير TMEM200A مرتفعا في سرطان القنوات الصفراوية (CHOL) ، وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSC) ، وسرطان الخلايا الكلوية الصافية (KIRC) ، وسرطان الخلايا الحليمية الكلوية (KIRP) ، وسرطان الخلايا الكبدية (LIHC) ، و STAD ، وسرطان الغدة الدرقية (THCA) مقارنة بالأنسجة الطبيعية المجاورة بناء على بيانات TCGA فقط. ومع ذلك ، انخفض التعبير TMEM200A في سرطان الظهارة البولية المثانة (BLCA) ، وسرطان الخلايا الحرشفية العنقية وسرطان الغدة العنقية (CESC) ، والورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) ، وكروموفوب الكلى (KICH) ، وسرطان الرئة الحرشفية (LUSC) ، وورم القواتم وورم المستقتمات (PCPG) ، وسرطان غدي المستقيم (READ) ، وسرطان بطانة الرحم الرحمي (UCEC) (الشكل 2 أ). في قاعدة بيانات TIMER2.0 ، زاد تعبير TMEM200A في CHOL و HNSC و KIRC و KIRP و LIHC و STAD. علاوة على ذلك ، زاد التعبير TMEM200A في BLCA و CESC و GBM و KICH و LUSC و PCPG و READ وسرطان الجلد الجلدي (SKCM) و UCEC (الشكل 2 ب).

من خلال مقارنة نتائج قاعدتي البيانات ، وجدنا أن تعبير TMEM200A الشامل للسرطان كان هو نفسه في كل قاعدة بيانات. حصلنا على بيانات المتابعة السريرية وبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي ل 33 مريضا مصابا بالسرطان من قاعدة بيانات TCGA ، وتم حسابها TMEM200A تسجيل في كل عينة سرطان باستخدام تحليل ssGSEA ، ثم حسبنا TMEM200A نشاط الجينات في الورم والأنسجة الطبيعية في العديد من الأورام. اكتشفنا أن TMEM200A تم التعبير عنها بشكل كبير في GBM و HNSC و KIRC الكلوي و THCA (الشكل 2C) ؛ ومن ثم ، تم تصنيف النشاط الجيني ل TMEM200A في كل نسيج ورمي. وجد أن النشاط الجيني ل TMEM200A كان الأعلى في كيرك والأدنى في سرطان الجلد العنبي (UVM) (الشكل 2D). أظهر تقييم قاعدة بيانات HPA اللاحقة لمستويات التعبير TMEM200A في الأنسجة البشرية أن مستويات التعبير TMEM200A كانت منخفضة في معظم الأنسجة الطبيعية ولكنها مرتفعة في قشرة الغدة الكظرية والمستقيم وبطانة الرحم والعضلات الملساء (الشكل 2E).

في خطوط خلايا الأنسجة الطبيعية ، أظهرت بعض خطوط الخلايا مثل الخلايا الحبيبية والخلايا ثنائية القطب وخلايا العضلات الهيكلية وخلايا انسجة بطانة الرحم والخلايا التائية تعبيرا عاليا عن TMEM200A ، بينما كان التعبير TMEM200A منخفضا في معظم خطوط الخلايا الأخرى (الشكل 2F). قمنا أيضا بفحص بيانات الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) في قاعدة بيانات HPA للنظر في التعبير عن TMEM200A على مستوى البروتين. كشفت البيانات المتعلقة بالتلوين والشدة عن مستويات تعبير أكبر بكثير وأكثر وضوحا من TMEM200A في أنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC) وسرطان الرئة (LUAD) وسرطان الكبد (LIHC) وسرطان الثدي (BRCA) وسرطان البروستاتا (PRAD) مقارنة بالأنسجة الطبيعية (الشكل 2G). تشير هذه النتائج إلى أنه تم التعبير عن TMEM200A على نطاق واسع في أنواع مختلفة من السرطان وأثر على تطور السرطان عبر آليات مختلفة في أورام مختلفة.

العلاقة السريرية المرضية وتشخيص البقاء على قيد الحياة
بالنسبة ل 33 خباثة بشرية ، قمنا بجمع المعلومات والبيانات السريرية في مجموعة TCGA pan-cancer (PanCan) من موقع قاعدة بيانات UCSC Xena وحققنا في العلاقة بين التعبير TMEM200A في PanCan والعمر والدرجة المرضية والمرحلة السريرية المرضية وحالة بقاء المريض. كشفت هذه الدراسة أنه في ستة أنواع من السرطان ، ارتبط التعبير عن TMEM200A بالمرحلة السريرية المرضية ، بما في ذلك BLCA ، وسرطان الثدي الغازي (BRCA) ، وسرطان المريء (ESCA) ، و KIRP ، و SKCM ، وسرطان الخصية (TGCT) (الشكل 3 أ). ارتبط العمر بستة أورام ، بما في ذلك BRCA الغازية ، GBM ، سرطان الدم النخاعي الحاد (LAML) ، SKCM ، سرطان الغدة الصعترية (THYM) ، وسرطان بطانة الرحم (UCEC) (الشكل 3 ب). ارتبطت الدرجة المرضية بستة أورام ، بما في ذلك سرطان المريء (ESCA) ، و HNSC ، و KIRC ، والورم الدبقي منخفض الدرجة في الدماغ (LGG) ، وسرطان البنكرياس الغدي (PAAD) ، وسرطان بطانة الرحم (UCEC) (الشكل 3C). ارتبطت حالة البقاء على قيد الحياة بخمسة أورام ، بما في ذلك سرطان القشرة الكظرية (ACC) ، و BLCA ، و KIRC ، و PCPG ، وسرطان الجلد العنبي (UVM) (الشكل 3D).

أجرينا دراسات لسرطانات مختلفة على OS و DSS و PFI و DFI باستخدام تحليل انحدار كوكس أحادي الاتجاه مع عتبة مجموعة متوسطة لمعرفة المزيد حول العلاقة بين التعبير TMEM200A والتشخيص. كشفت نتائج تحليل نظام التشغيل أنه من بين الأورام الأربعة ، كان للتعبير TMEM200A الأعلى تأثير أكبر على تشخيص نظام التشغيل في أربعة أورام ، بما في ذلك سرطان القشرة الكظرية (ACC) (P = 0.037) ، BLCA (P = 0.036) ، سرطان الدم النخاعي الحاد (LAML) (P = 0.011) ، و GC (STAD) (P = 0.005). في المقابل ، كان للتعبير TMEM200A الأعلى تشخيص أفضل لنظام التشغيل في خمسة أورام ، بما في ذلك KIRC (P < 0.001) ، KIRP (P = 0.020) ، الورم الدبقي منخفض الدرجة في الدماغ (LGG) (P = 0.042) ، PCPG (P = 0.002) ، وسرطان الجلد الجلدي (SKCM) (P = 0.043) (الشكل 3E ، F). بالنسبة ل DSS ، كان للتعبير TMEM200A العالي تشخيص ضعيف في نوعين من الأورام ، بما في ذلك سرطان القشرة الكظرية (ACC) (P = 0.026) و BLCA (P = 0.015). كان للتعبير TMEM200A العالي تشخيص أفضل في أربعة أنواع من الأورام ، بما في ذلك KIRC (P < 0.001) ، KIRP (P = 0.001) ، الورم الدبقي منخفض الدرجة في الدماغ (LGG) (P = 0.025) ، و PCPG (P = 0.007) (الشكل 3G). بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة ل PFI ، كان للتعبير TMEM200A الأعلى تشخيص ضعيف في ثلاثة أنواع من الأورام ، بما في ذلك سرطان القشرة الكظرية (ACC) (P = 0.007) ، BLCA (P = 0.040) ، وسرطان الجلد العنبي (UVM) (P = 0.020). كان للتعبير TMEM200A الأعلى تشخيص أفضل في نوعين من الأورام ، بما في ذلك KIRC (P < 0.001) والورم الدبقي منخفض الدرجة (LGG) (P = 0.044) للدماغ (الشكل 3H). في DFI ، كان للتعبير الأعلى عن TMEM200A تشخيص أسوأ في سرطان القشرة الكظرية (ACC) (P = 0.044) (الشكل 3I).

بعد ذلك ، اخترنا العديد من الأورام (KIRC و KIRP) لتحليل الانحدار متعدد COX. أظهرت النتائج أن TMEM200A يمكن أن يؤثر بشكل فردي على معدل بقاء مرضى السرطان مقارنة بالعوامل السريرية الأخرى (الشكل 3J و K). أظهرت هذه النتائج أنه يمكن استخدام TMEM200A كعلامة بيولوجية مستقلة في أنواع مختلفة من السرطان للتأثير على بقاء مرضى السرطان.

تحليل مثيلة الحمض النووي
واحدة من التغيرات اللاجينية التي حظيت بأقصى قدر من الاهتمام هي مثيلة الحمض النووي29. وقد اقترح أن نوعا واحدا من التغيير اللاجيني ، مثيلة الحمض النووي ، له تأثير كبير على نمو الورم30. ومن ثم ، باستخدام قاعدة بيانات SMART ، قمنا بتقييم مستويات مثيلة الحمض النووي TMEM200A في الأنسجة الطبيعية والسرطانية. كان لدى أنسجة PAAD و PRAD مستويات أعلى من مثيلة الحمض النووي TMEM200A من الأنسجة الطبيعية. ومع ذلك ، كان لدى TMEM200A مستويات مثيلة الحمض النووي أقل في COAD و KIRC و KIRP و LIHC و LUSC و READ و THCA و UCEC مقارنة بالأنسجة الطبيعية (الشكل 4 أ). كانت مستويات مثيلة الحمض النووي TMEM200A أعلى بكثير في قاعدة بيانات TCGA في KIRP و PRAD و PCPG و THYM بناء على قاعدة بيانات UALCAN (الشكل 4B) ولكن ليس في BLCA و BRCA و CHOL و COAD و CESC و ESCA و GBM و HNSC و KIRC و LIHC و LUAD و LUSC و PAAD و READ و TGCT و STAD و THCA و UCEC. انخفض مستوى مثيلة TMEM200A بشكل ملحوظ في LUSC و PAAD و READ و TGCT و STAD و THCA و UCEC (الشكل 4C). لاستكشاف العلاقة بين مستوى التعبير عن TMEM200A ومثيلة الحمض النووي والعوامل السريرية المرضية بشكل أكبر ، استخدمنا مرة أخرى قاعدة بيانات SMART ووجدنا أن مستوى مثيلة الحمض النووي TMEM200A في BLCA و HNSC و LUAD و STAD تغير مع المرحلة المرضية (الشكل 4D). العوامل السريرية تؤثر على مستوى مثيلة الحمض النووي من TMEM200A في الأورام المذكورة أعلاه.

تحليل الطفرات الجينية
أحد أسباب تطور الأورام هو تراكم الطفرات الجينية31. لذلك ، تم تحليل تواتر طفرات TMEM200A الجسدية من خلال تقدير تواتر الطفرات TMEM200A في العينات السريرية للسرطان باستخدام قاعدة بيانات cBioPortal. يتحور TMEM200A في العديد من أنواع السرطان ، مثل سرطان الرئة ، وسرطان بطانة الرحم الرحمي ، وسرطان الجلد ، وسرطان المريء المعدي ، وسرطان العظام ، وسرطان عنق الرحم ، وسرطان الكبد الصفراوي ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الناضجة ، BRCA ، وسرطان بطانة الرحم ، وسرطان المبيض ، والورم الجنيني ، وسرطان البنكرياس ، وسرطان الرأس والرقبة ، و CRC ، والورم الدبقي ، وسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، وساركوما الأنسجة الرخوة ، وسرطان أولي غير معروف (الشكل 5 أ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي تغيرات الحمض النووي إلى تغييرات هيكلية أو أحماض أمينية على مستوى البروتين. يوضح الشكل 5B بنية 3D ل TMEM200A. باستخدام قاعدة بيانات cBioPortal ، وجدنا مواقع الطفرات في الأحماض الأمينية في TMEM200A. كانت الطفرات الخاطئة هي الشكل الأكثر انتشارا للطفرات (الشكل 5C).

قمنا بتحليل البيانات باستخدام Sangerbox 3.0 للتحقق من دقة مواقع الطفرات وحققنا نفس النتائج السابقة. الطفرات الخاطئة هي الشكل الأكثر شيوعا للطفرات في TMEM200A وقد تحدث بنسبة تصل إلى 7.8٪ في SKCM (الشكل 5D). الطفرة الخاطئة هي طفرة يخضع فيها ترميز كودون لحمض أميني واحد لاستبدال أساسي ويصبح كودون يشفر لحمض أميني آخر، مما يؤدي إلى تغير في نوع الأحماض الأمينية وتتابع سلسلة عديد الببتيد. عادة ما تكون نتيجة طفرة سوء الفهم هي أن سلسلة عديد الببتيد تفقد وظيفتها الأصلية. تحدث العديد من تشوهات البروتين بسبب طفرة خاطئة ، وهي نوع شائع من طفرات الورم. لقد وجد أن الطفرات الخاطئة تلعب دورا رئيسيا في استقرار البروتينات ، ويمكن أن يكون لوجود الطفرات تأثير كبير على تقارب الارتباط بين البروتينات32 ، مما يغير التفاعلات بين البروتينات والجزيئات الكبيرة المرتبطةالمحيطة 33.

وبالتالي ، فإن الطفرات الخاطئة تؤثر على الأرجح على الوظيفة البيولوجية للبروتين عبر الغشاء 200A في أنواع مختلفة من السرطان. كما تم فحص العلاقة بين TMEM200A طفرة جينية وتشخيص البقاء السريري لمرضى السرطان. زاد احتمال حدوث نظام التشغيل مقارنة بالمجموعة TMEM200A المتحورة ، ولكن ليس في المجموعة الخالية من الأمراض (الشكل 5E). كشفت دراسة الارتباطات الجينية أن TP53 و AKAP7 و TAAR5 و TAAR1 و MOXD1 و THEMIS و VNN2 و ENPP3 و TMEM244 و SLC18B1 كانت من بين الجينات التي تحورت مع TMEM200A (الشكل 5F). تمكنا من تحديد العديد من أنواع الطفرات واختلافات النوكليوتيدات المفردة (SNVs) من خلال قاعدة البيانات الكونية لمعرفة المزيد عن الطفرات TMEM200A في GC. كان تواتر البدائل الخاطئة هو الأعلى (38.86٪) (الشكل 5G) ، وأظهرت بيانات SNV أن SNVs الأكثر شيوعا في STAD كانت G > A (31.73٪) ، تليها C >T (26.35٪) و G>T (11.73٪) (الشكل 5H).

تحليل الخلية الواحدة TMEM200A في السرطان
قمنا بتحليل مستويات التعبير TMEM200A في خلايا مفردة مختلفة باستخدام موقع TISCH (مركز الخلايا المفردة لعلم المناعة السرطانية). عرضت أداة TISCH عبر الإنترنت تعبير TMEM200A ل 65 مجموعة بيانات و 28 نوعا من الخلايا في الخريطة الحرارية الموضحة في الشكل 6A. أظهرت النتائج أن TMEM200A تم التعبير عنها في الغالب في خلايا CD8 + T والخلايا الليفية. مجموعة بيانات GSE72056 ، التي تتضمن خلايا من المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد النقيلي (SKCM) ، جديرة بالملاحظة في هذا الصدد. تم التعبير عن TMEM200A على نطاق واسع في الخلايا البائية ، والخلايا الليمفاوية CD4 + T ، والخلايا التائية CD8 + المستنفدة ، والخلايا البطانية ، والخلايا الليفية ، وأنواع الخلايا الأخرى في البيئة المكروية SKCM (الشكل 6B ، C). في مجموعة بيانات GSE146771 ، التي تحتوي على خلايا من مرضى CRC ، تم التعبير عن TMEM200A على نطاق واسع في الخلايا البائية ، والخلايا الليمفاوية CD4 + T ، وخلايا CD8 + T ، وخلايا CD8 + T المستنفدة ، والخلايا البطانية ، والخلايا الليفية ، وأنواع الخلايا الأخرى في البيئة المكروية CRC (الشكل 6D ، E). باستخدام قاعدة بيانات CancerSEA ، تم تحديد مستويات التعبير والحالة الوظيفية TMEM200A في خلايا سرطانية معينة (الشكل 6G). ارتبط TMEM200A التعبير ارتباطا وثيقا بالحالة الوظيفية الخلوية في مجموعة من السرطانات ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي (GBM) ، وسرطان الرئة الغدي (LUAD) ، وسرطان الدم المحبب المزمن (CML) ، و CRC ، والورم الأرومي الشبكي (RB) ، وسرطان الجلد العنبي (UM). ارتبط تكوين الأوعية الدموية ، وموت الخلايا المبرمج ، والتمايز ، والالتهاب بشكل إيجابي مع التعبير TMEM200A في غالبية الخلايا السرطانية ، في حين أن تلف الحمض النووي ، وإصلاح الحمض النووي ، والغزو ، والتمثيل الغذائي كانت مرتبطة سلبا بالتعبير TMEM200A (الشكل 6F).

التحليل الوظيفي وإثراء المسار TMEM200A في أنواع مختلفة من السرطان
درسنا العلاقة بين TMEM200A والبروتينات ذات الوظائف المتشابهة باستخدام شبكة GGI لاستكشاف وظيفة TMEM200A في أنواع السرطان المختلفة (الشكل 7 أ). يتم تحليل المعلومات الجينومية والبروتينية بواسطة GeneMANIA باستخدام قائمة استعلام للجينات المستهدفة. من خلال تحديد الجينات التي تعمل بشكل مشابه ل TMEM200A ، تم اكتشاف 40 بروتينا تتفاعل مباشرة مع هذا الجين. يظهر ارتباط هذه الجينات من خلال شبكة PPI (الشكل 7B). في وقت لاحق ، كشفت تحليلات التخصيب GO و KEGG لهذه الجينات ال 20 المرتبطة ارتباطا وثيقا ب TMEM200A أن هذه الجينات المجاورة متورطة في الغالب في التنظيم السلبي للحمض النووي الريبي لإسكات الجينات. كشف تحليل KEGG أن TMEM200A كانت وفيرة في المسارات ، بما في ذلك مسار إشارات Wnt والشيخوخة الخلوية (الشكل 7C). أظهر تحليل التخصيب GO أنه في الوظيفة الجزيئية ، كان TMEM200A وفيرا بشكل أساسي في قنوات الكالسيوم والتنظيم السلبي لإسكات الجينات بواسطة الحمض النووي الريبي (الشكل 7 د).

تحليل الارتباط بين TMEM200A والتسلل المناعي
قمنا بمزيد من التحقيق في العلاقة بين التعبير TMEM200A وتسلل الخلايا المناعية لإثبات العلاقة بين مناعة TMEM200A والسرطان. أجرينا تحليل التسلل المناعي CIBERSORT باستخدام بيانات Sangerbox 3.0 لعموم السرطان. أظهرت النتائج أن تعبير TMEM200A لعموم السرطان كان مرتبطا بالخلايا التائية CD8 + ، والخلايا التائية CD4 + ، والخلايا البائية ، والخلايا التائية المساعدة ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، والخلايا التائية التنظيمية ، والوحيدات ، والبلاعم ، والخلايا المتغصنة ، والحمضات ، والخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة (الشكل 8 أ). بعد ذلك ، نظرنا في العلاقة بين التعبير TMEM200A و TIL (الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم) باستخدام قاعدة بيانات TISIDB ، مما يدل على وجود علاقة وثيقة بين التعبير TMEM200A ووفرة 28 TIL في أنواع مختلفة من السرطان (الشكل 8B). استخدمنا قاعدة بيانات TISIDB لتقييم العلاقة بين التعبير TMEM200A والأدوية المثبطة للمناعة في الأورام الخبيثة البشرية للتحقيق بشكل أكثر شمولا في كيفية ارتباط مضادات المناعة والتعبير TMEM200A. أظهرت النتائج أن مستويات التعبير TMEM200A كانت مرتبطة بشكل كبير بالعوامل المثبطة للمناعة في مجموعة متنوعة من السرطانات (الشكل 8C). تم العثور على ارتباطات كبيرة بين التعبير TMEM200A وبعض العوامل المثبطة للمناعة في سرطان الخصية و UM (الشكل 8D-F). ثم أجرينا تحليل ارتباط التعبير TMEM200A مع عوامل التحفيز المناعي وجزيئات MHC باستخدام قاعدة بيانات TISIDB (الشكل 8G ، H). أظهرت النتائج أن التعبير TMEM200A كان مرتبطا بالمنشطات المناعية المختارة وجزيئات MHC في سرطان الظهارة البولية في المثانة وسرطان الخصية وسرطان القشرة الكظرية و UM (الشكل 8I-L). كانت الخطوة التالية هي التحقيق في العلاقة بين التعبير TMEM200A والأنواع الفرعية المناعية أو الجزيئية في مجموعة TCGA PanCan في قاعدة بيانات TISIDB. وجدنا أن المجموعات الفرعية المناعية لتسعة أنواع متميزة من السرطان عبرت عن TMEM200A بشكل مختلف ، بما في ذلك BLCA و UVM و KIRC و LIHC و LUAD و LUSC و PRAD و TGCT و BRCA (الشكل 8M). بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت ستة أشكال مختلفة من السرطان مع مجموعات فرعية جزيئية متنوعة ، بما في ذلك HNSC و KIRP و LIHC و PCPG و OV و LUSC ، تعبيرا متغيرا عن TMEM200A (الشكل 8N).

تحليل استجابة TMEM200A والعلاج المناعي
ترتبط فعالية مثبطات PD-1 / PD-L1 ارتباطا وثيقا ب TMB ، ويمكن التنبؤ ببعض المرضى الذين يعانون من الأورام إلى حد ما باستخدام علامات TMB لفعالية العلاج المناعي34. عدم استقرار السواتل الصغرى (MSI) هو المصطلح المستخدم لوصف وظيفة إصلاح عدم تطابق الحمض النووي الخاطئة (MMR) عندما لا يتم إصلاح أخطاء تكرار السواتل الصغرى وتتراكم ، مما يؤدي إلى تغيير الطول أو التكوين الأساسي للسواتل الصغرى35. MSI هو علامة ورم ذات أهمية سريرية 36. وبالتالي قمنا بتقييم تأثير التعبير TMEM200A على العلاج المناعي من خلال التحقيق في العلاقة بين التعبير TMEM200A و TMB أو MSI. أظهرت النتائج وجود علاقة إيجابية كبيرة بين تعبير TMEM200A و TMB في THYM و PRAD و OV و LML و KIRP و KIRC ، ولكن TMEM200A التعبير كان مرتبطا سلبا ب UCEC و PAAD و LUSC و LUAD و LIHC و LGG و HNSC و GBM و BRCA (الشكل 9 أ). كان تعبير MSI و TMEM200A مرتبطين بقوة وإيجابية في TGCT ، في حين كان التعبير TMEM200A مرتبطا بشكل كبير وسلبي مع MSI في UCEC و STAD و SKCM و LUSC و LUAD و HNSC و CHOL (الشكل 9 ب). قمنا أيضا بتقييم إمكانات TMEM200A كمؤشر حيوي لفحص فعالية ICB. أظهرت النتائج أن TMEM200A وحدها تنبأت باستجابات ICB بدقة المنطقة تحت المنحنى (AUC) > 0.5 في 7 من أصل 25 مجموعة سكانية فرعية من ICB. أظهر TMEM200A قيمة تنبؤية أعلى من استنساخ الخلايا التائية والبائية ، وكلاهما له قيمة 5. ومع ذلك ، كانت قيمة TMEM200A أقل من قيمة TIDE (AUC > 0.5 في 11 مجموعة سكانية فرعية من ICB) ، ودرجة MSI (AUC > 0.5 في 11 مجموعة سكانية فرعية من ICB) ، CD274 (AUC > 0.5 في 15 مجموعة سكانية فرعية ICB) ، CD8 (AUC > 0.5 في 17 مجموعة سكانية فرعية ICB) ، IFNG (AUC > 0.5 في 16 مجموعة فرعية من ICB) ، و Merck18 (AUC > 0.5 في 17 مجموعة فرعية ICB) (الشكل 9C). ارتبط سوء تشخيص البقاء على قيد الحياة في ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve و ICB_Gide 2019_PD1 ومجموعات ICB_Hugo 2016_PD1 بالتعبير العالي عن TMEM200A . ومع ذلك ، عززت ضربة قاضية TMEM200A فعالية قتل الورم بوساطة الخلايا الليمفاوية في متوسط مجموعة Kearney 2018 T_PD1 و Pan 2018 OT1 (الشكل 9D).

تحليل إثراء GSEA TMEM200A في أنواع مختلفة من السرطان
استخدمنا DEGs بين TMEM200A مجموعة فرعية عالية التعبير و TMEM200A منخفضة التعبير في 32 ورم خبيث لاستكشاف خصائص السرطان المرتبطة TMEM200A. اكتشفنا وجود علاقة كبيرة بين نقص المناعة الأولية ، ومسار إشارات المستقبلات الشبيهة ب RIG (الجين المحرض لحمض الريتينويك) ، والتعبير TMEM200A في عموم السرطان ، خاصة في BLCA و COAD و KICH و GBM و LUSC و LUAD و MESO و READ و SARC و SKCM (الشكل 10). يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي للبروتين السيتوبلازمي الفيروسي بواسطة مسار إشارات المستقبلات الشبيهة ب RIG-I. قد تؤثر المستقبلات الشبيهة ب RIG-I على إنتاج مجموعة متنوعة من السيتوكينات الالتهابية في الجسم عن طريق تنشيط مسار إشارات NF-kB عن طريق إشراك بعض بروتينات التوصيل داخل الخلايا. نتيجة لذلك ، قد يلعب البروتين عبر الغشاء 200A (TMEM200A) دورا حاسما في تجنيد البروتينات داخل الخلايا بواسطة مستقبلات تشبه RIG-I. تضمنت هذه النتائج وجود علاقة قوية بين التعبير TMEM200A والتسلل المناعي. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل إثراء GSEA أن تعبير TMEM200A لعموم السرطان كان مرتبطا بإشارات الكيموكين ، والتصاق الخلايا ، ووصلات مستقبلات السيتوكين ، ومسارات استشعار غشاء الخلية ، والتحكم في الالتهام الذاتي (الشكل 10). قد تعمل البروتينات عبر الغشاء كجزيئات التصاق للتأثير على البيئة المكروية للورم بالإضافة إلى لعب دور حاسم في التحكم في دخول أيونات الكالسيوم إلى الخلية من خزانات الكالسيوم 36. لذلك ، قد تكون النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل إثراء GSEA بسبب مشاركة TMEM200A في العديد من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك تنشيط مسارات نقل الإشارة ، وتشكيل قنوات أيون غشاء البلازما ، وتنظيم الانجذاب الكيميائي للخلايا ، والالتصاق ، وموت الخلايا المبرمج ، والالتهام الذاتي9.

حددنا أفضل 50 جينا من STAD مرتبطة بشكل إيجابي وسلبي مع TMEM200A من قاعدة بيانات LinkedOmics ، والتي تم التعبير عنها بشكل مشترك في STAD ، في شكل خرائط حرارية (الشكل 11A ، B). قمنا بتقييم أفضل 5 جينات بشكل إيجابي وأعلى 5 جينات مرتبطة سلبا ب TMEM200A في GC (الشكل 11C). أظهرت نتائجنا أن تعبير TMEM200A كان مرتبطا ب SPON1 (r = 0.51) و CDH11 (r = 0.50) و EPB41L2 (r = 0.49) و LUM (r = 0.49) و SAMD3 (r = 0.49) و OVOL2 (r = -0.37) و RASAL1 (r = -0.36) و IRX5 (r = -0.35) و SLC4A11 (r = -0.34) و SYTL1 (r = -0.33). قمنا بتحليل نتائج تصور العتبة لفهم دور TMEM200A في STAD بشكل أكبر. تم استخدام المعايير التالية للفحص: تغيير log2-fold (FC) > 2.0 وقيمة P المعدلة 0.05. وجدنا 483 DEGs ، منها 385 تم تنظيمها و 98 تم تنظيمها ، واخترنا 100 منها ليتم تصورها لإنشاء خريطة حرارية (الشكل 11D). بعد ذلك ، بالنسبة ل DEGs التي استوفت معايير الفحص ، أجرينا تحليلات التخصيب GO و KEGG. أظهرت نتائج تحليل التخصيب GO أن إثراء BP (العملية البيولوجية) كان مرتبطا بشكل أساسي بالمصفوفة خارج الخلية والأنسجة الهيكلية ، وكان إثراء CC (المكون الخلوي) مرتبطا بشكل أساسي بالمصفوفة خارج الخلية المحتوية على الكولاجين والغشاء القاعدي ، وتم إثراء MF (الوظيفة الجزيئية) بشكل أساسي في بنية مصفوفة خارج الخلية وربط الجليكوزامينوجليكان (الشكل 11E والشكل 11G). أظهر إثراء تحليل KEGG أن TMEM200A تم تخصيبه بشكل أساسي في مسار تفاعلات مستقبلات المصفوفة خارج الخلية ، والسيتوكروم P450 ، ونظام الرينين أنجيوتنسين (الشكل 11F والشكل 11H).

نموذج النذير القائم على TMEM200A والسمات السريرية لسرطان المعدة
قمنا بالتحقيق في العلاقة بين TMEM200A والبيانات السريرية للمرضى الذين يعانون من STAD ، وبالتالي قمنا بتحليل الخصائص السريرية المرضية للمرضى في مجموعة TCGA-STAD من خلال تحليل الانحدار اللوجستي واستنادا إلى مستويات التعبير TMEM200A (الشكل 12 أ). ارتبط العمر والمرحلة السريرية والتعبير TMEM200A ارتباطا كبيرا ب OS في المرضى الذين يعانون من STAD ، وفقا لتحليل انحدار كوكس أحادي المتغير (الشكل 12 ب). أظهر تحليل انحدار كوكس متعدد المتغيرات أن التعبير TMEM200A قد يكون عاملا تنبؤيا مستقلا لنظام التشغيل في المرضى الذين يعانون من STAD (HR = 1.282 ، 95٪ CI = 1.066-1.541 ، P = 0.008) (الشكل 12C). درسنا إمكانات هذه الخصائص السريرية المرضية للتنبؤ بنظام التشغيل بعد 1 و 3 و 5 سنوات في STAD باستخدام نموذج مخطط خط العمود القياسي بالتزامن مع العديد من المعلمات السريرية (الشكل 12D). كانت منحنيات المعايرة لاحتمالات البقاء على قيد الحياة لمدة عام واحد متسقة للغاية مع الاحتمالات المتوقعة لمخطط خط العمود (الشكل 12E).

التنظيم TMEM200A في الخلايا المنقولة بالاتصال الجنسي وتعزيز تكاثر الخلايا
من خلال مراجعة الأدبيات المتعلقة TMEM200A ، اكتشفنا أن التعبير العالي عن TMEM200A يشير إلى تشخيص سيئ 13 وأن البيئة الدقيقة المناعية GC قد تتأثر ب TMEM200A تعمل كجزيء التصاق37 ، وبالتالي تعزيز غزو وورم خبيث لخلايا GC. قمنا بفحص مستويات البروتين ومستويات نسخ mRNA من TMEM200A في خطوط خلايا STAD لتأكيد نتائج الدراسة المذكورة أعلاه. خط خلية GC HGC-27 مفرط بشكل كبير في التعبير عن TMEM200A مقارنة بخط الخلايا الظهارية المخاطية في المعدة السليمة GES-1 في كل من مستويات البروتين ونسخة mRNA (الشكل 13A ، B) ، مما يشير إلى أن TMEM200A تم التعبير عنها بشكل مفرط في خلايا HGC-27. تم إجراء الاختبارات التالية باستخدام خلايا HGC-27 نتيجة لذلك. وفي الوقت نفسه ، لإثبات دقة النتائج التجريبية ، استخدمنا qRT-PCR لمقارنة تعبير mRNA التفاضلي عن TMEM200A في خلايا GC البشرية SGC-7901 والخلايا الظهارية المخاطية في المعدة GES-1 ، وأظهرت النتائج أن TMEM200A تم التعبير عنه بشكل كبير في خلايا SGC-7901 (الشكل 13B). تم هدم TMEM200A في خلايا HGC-27 لفحص احتمال تورط TMEM200A في STAD (الشكل 13C). استنادا إلى نتائج تعدين قاعدة البيانات وتحليل ارتباطنا TMEM200A ، وجد أن TMEM200A كان متورطا بشكل أساسي في مسار تفاعلات مستقبلات المصفوفة خارج الخلية ، والذي كان مرتبطا بانتشار السرطان وغزوه. وبالتالي استخدمنا مقايسات CCK-8 للتأكد من مدى تأثير TMEM200A التعبير على نمو الخلايا. أظهرت فحوصات CCK-8 أن مجموعات ضربة قاضية TMEM200A (Si-RNA2 و Si-RNA3) أظهرت انخفاضا ملحوظا في صلاحية الخلية مقارنة بمجموعة NC (الشكل 13D). أشارت هذه النتائج إلى أن TMEM200A تم تنظيمه في STAD ، ويمكن أن يؤثر مستوى تعبيره على تكاثر خلايا GC. استنادا إلى نتائج تحليل التخصيب KEGG في الشكل 11F ، وجدنا أن TMEM200A كان مرتبطا بمسار إشارات PI3K / AKT في GC ، وقد يؤثر TMEM200A ، كعامل التصاق خلوي ، على آلية سرطنة المعدة من خلال التأثير على EMT. لذلك ، استخدمنا النشاف الغربي للتحقق من آثار ضربة قاضية TMEM200A على EMT ومسار إشارات PI3K / AKT قبل وبعد الضربة القاضية. أظهرت النتائج أن تعبير بروتين P-AKT قد انخفض في مجموعة ضربة قاضية TMEM200A (TMEM200A-SiRNA2) مقارنة بمجموعة التحكم السلبية (NC) ، بينما انخفضت أيضا مستويات بروتينات N-cadherin و Vimentin و Snai وزاد تعبير بروتين E-cadherin (الشكل 13E). تشير كل هذه النتائج إلى أن TMEM200A قد يؤثر على EMT من خلال مسار إشارات PI3K / AKT وبالتالي يلعب دورا في GC.

Figure 1
الشكل 1: سير عمل الدراسة. الاختصارات: TCGA = قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان. TIMER2.0 = قاعدة بيانات TIMER2.0 ؛ OS = البقاء على قيد الحياة بشكل عام ؛ PFS = وقت البقاء على قيد الحياة بدون تقدم ؛ DSS = البقاء على قيد الحياة خاصة بالمرض ؛ DFS = البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض ؛ TMB = عبء طفري الورم. MSI = عدم استقرار السواتل الصغيرة ؛ PPI = تفاعل البروتين والبروتين ؛ GGI = التفاعل بين الجينات والجينات ؛ KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. GO = علم الجينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مستويات التعبير عن TMEM200A في أنواع السرطان المختلفة. (أ) التعبير عن TMEM200A من مجموعة بيانات TCGA في الأورام الخبيثة البشرية المختلفة. (ب) تحليل مستويات التعبير TMEM200A في الورم والأنسجة الطبيعية باستخدام قاعدة بيانات TIMER2.0. (ج) التحليل التفريقي لنشاط الجينات TMEM200A في مختلف أنواع السرطان البشرية من مجموعة بيانات TCGA. (د) ترتيب مستويات النشاط الجيني TMEM200A في مختلف أنواع السرطان البشرية بناء على درجات ssGSEA. ه: TMEM200A مستويات التعبير من قاعدة بيانات HPA في الأنسجة السليمة. (F) مستويات التعبير TMEM200A لقاعدة بيانات HPA في خطوط الخلايا الطبيعية. (ز) نتائج IHC لتعبير البروتين TMEM200A في السرطان من قاعدة بيانات HPA. الاختصارات: TCGA = أطلس جينوم السرطان. ssGSEA = تحليل إثراء مجموعة الجينات عينة واحدة ؛ HPA = أطلس البروتين البشري ؛ IHC = الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ارتباط التعبير TMEM200A بالخصائص المرضية السريرية وتشخيص الأورام المختلفة. (أ) تم تحليل ارتباط التعبير TMEM200A في مجموعة TCGA لعموم السرطان (PanCan) مع التدريج السريري المرضي في كل ورم باستخدام قاعدة بيانات UCSC Xena . (ب) ارتباط التعبير TMEM200A في مجموعة TCGA PANCAN مع عمر المريض في كل ورم. (ج) ارتباط التعبير TMEM200A في مجموعة TCGA PANCAN مع الدرجة المرضية للورم في كل ورم. (د) ارتباط تعبير TMEM200A في مجموعة TCGA PanCan مع حالة بقاء المرضى في كل ورم. (ه) تحليل الارتباط بين التعبير TMEM200A والبقاء على قيد الحياة بشكل عام للسرطان في مختلف أنواع السرطان باستخدام نموذج تحوف كوكس. (و) العلاقة بين التعبير TMEM200A وتشخيص نظام التشغيل الشامل للسرطان في مجموعة TCGA PanCan. (ز) العلاقة بين التعبير TMEM200A وبقاء المرض على قيد الحياة. (ح) العلاقة بين التعبير TMEM200A وتشخيص الفاصل الزمني الخالي من التقدم في مجموعة TCGA PanCan. (ط) العلاقة بين التعبير TMEM200A والفاصل الزمني الخالي من الأمراض. (ي) أجري تحليل متعدد العوامل لانحدار كوكس على كيرك. (ك) أجري تحليل متعدد العوامل لانحدار كوكس على KIRP. الاختصارات: TCGA = أطلس جينوم السرطان. KIRC: سرطان الخلايا الكلوية الصافية في الكلى. KIRP: سرطان الخلايا الحليمية الكلوية الكلوية. OS = البقاء على قيد الحياة بشكل عام ؛ DSS = البقاء على قيد الحياة خاصة بالمرض ؛ PFI = فاصل زمني خال من التقدم ؛ DFI = فترة خالية من الأمراض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل مثيلة الحمض النووي TMEM200A في أنواع السرطان المختلفة. (أ) تم فحص مستويات مثيلة المروج TMEM200A في العديد من أنواع السرطان ، وفقا لقاعدة بيانات SMART. (ب) تم فحص مستويات مثيلة المروج الأعلى TMEM200A في أنواع مختلفة من السرطان مقارنة بالأنسجة الطبيعية وفقا لقاعدة بيانات UALCAN. (ج) باستخدام قاعدة بيانات UALCAN ، تم تحديد أن الأنسجة الطبيعية لديها مستويات مثيلة محفزة أقل من TMEM200A في العديد من أنواع السرطان. (د) تغير مستوى مثيلة الحمض النووي TMEM200A في BLCA و HNSC و LUAD و STAD مع المرحلة المرضية. الاختصارات: BLCA = سرطان الظهارة البولية المثانة. HNSC = سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. LUAD = سرطان الرئة الغدي. STAD = سرطان المعدة الغدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: TMEM200A الطفرات الجينية في أنواع السرطان المختلفة. (أ) تحليل TMEM200A أنواع الطفرات الجينية في أنواع مختلفة من السرطان باستخدام قاعدة بيانات cBioPortal. ب: تركيب بروتين 3D ل TMEM200A. يشار إلى منطقة الربط بالجزء الملون ، بينما تظهر الأقسام الأخرى من TMEM200A بالجزء الرمادي. ج: الأشكال المتماثلة وتوزيع الطفرات الجسدية TMEM200A . المحور X ، مواقع الأحماض الأمينية ؛ المحور الصادي ، عدد الطفرات TMEM200A ؛ النقاط الخضراء ، الطفرات الخاطئة ؛ والنقاط الرمادية ، الطفرات المقطوعة. (د) التحقق من صحة الأشكال المتماثلة وتوزيع الطفرات الجسدية TMEM200A باستخدام البيانات الواردة في Sangerbox 3.0. (ه) بالنسبة لجميع أورام TCGA ، تم التحقيق في العلاقة بين حالة الطفرة والتنبؤ العام ببقاء المرضى على قيد الحياة باستخدام قاعدة بيانات cBioPortal ، مع مربعات حمراء تشير إلى مجموعة الطفرات TMEM200A والمربعات الزرقاء التي تشير إلى المجموعة غير المتحورة. (F) تم تحليل الجينات التي تحورت مع TMEM200A باستخدام أداة cBioPortal: TP53 و AKAP7 و TAAR5 و TAAR1 و MOXD1 و THEMIS و VNN2 و ENPP3 و TMEM244 و SLC18B1. (ز) تحليل أنواع الطفرات TMEM200A في GC باستخدام قاعدة البيانات الكونية. (ح) أجري تحليل لأنواع SNV TMEM200A في GC باستخدام قاعدة البيانات الكونية. الاختصارات: TCGA = أطلس جينوم السرطان. نظام التشغيل = البقاء على قيد الحياة بشكل عام ؛ COSMIC = كتالوج الطفرات الجسدية في الخلايا السرطانية ؛ GC = سرطان المعدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تحليل ارتباط الخلية الواحدة للتعبير TMEM200A في أنواع السرطان المختلفة. (أ) ملخص التعبير عن TMEM200A على موقع TISCH. ب: توزيع ثمانية أنواع مختلفة من الخلايا في الورم الميلانيني الجلدي النقيلي GSE72056 مجموعة البيانات. ج: مستويات التعبير عن TMEM200A في خلايا الورم الميلانيني النقيلي الجلدي من مجموعة بيانات GSE72056. د: توزيع 13 نوعا متميزا من الخلايا في مجموعة بيانات سرطان القولون والمستقيم من GSE146771. ه: مستويات التعبير TMEM200A في خلايا سرطان القولون والمستقيم من مجموعة بيانات GSE146771. (F) تم إثبات ارتباط تعبير TMEM200A بالحالة الوظيفية للخلية الواحدة في أورام متعددة باستخدام قاعدة بيانات CancerSEA. (ز) خرائط T-SNE توضح مستويات التعبير TMEM200A في الخلايا السرطانية الفردية ، بما في ذلك GBM و LUAD و CML و CRC و RB و UM. الاختصارات: GBM = الورم الأرومي الدبقي. LUAD = سرطان الرئة الغدي. CML = سرطان الدم المحبب المزمن. CRC = سرطان القولون والمستقيم. RB = الورم الأرومي الشبكي. UM = سرطان الجلد العنبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: شبكة التعبير المشترك وتحليل الإثراء الوظيفي TMEM200A على مستوى الجينات. أ: شبكة GGI من TMEM200A وجيناتها المعبر عنها بشكل مشترك. (ب) شبكة PPI. (ج، د) تم تحليل TMEM200A والجينات المعبر عنها بشكل مشترك لإثراء مسار GO و KEGG. الاختصارات: PPI = تفاعل البروتين والبروتين. GGI = التفاعل بين الجينات والجينات ؛ KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. GO = علم الجينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: العلاقة بين التعبير عن TMEM200A والخلايا المناعية، والعوامل المثبطة للمناعة، والمواد المحفزة للمناعة، وجزيئات بروتين التوافق النسيجي (MHC) في أنواع مختلفة من السرطان. (أ) خريطة حرارية لصندوق سانجربوكس 3.0 توضح العلاقة بين التعبير TMEM200A والخلايا المتسللة المناعية. (ب) خريطة حرارية توضح العلاقة بين الخلايا المتسللة المناعية والتعبير TMEM200A في قاعدة بيانات TISIDB. (ج) خريطة حرارية توضح العلاقة بين الخلايا المثبطة للمناعة والتعبير TMEM200A في قاعدة بيانات TISIDB. (مد-واو) العلاقة بين التعبير TMEM200A وبعض العوامل المثبطة للمناعة في سرطان الخصية وسرطان الجلد العنبي. (ز) خريطة حرارية تبين العلاقة بين عوامل التحفيز المناعي والتعبير TMEM200A في قاعدة بيانات TISIDB. (ح) خريطة حرارية للعلاقة بين تعبير TMEM200A وجزيئات MHC في قاعدة بيانات TISIDB. (I-L) العلاقة بين التعبير TMEM200A وبعض العوامل المناعية وجزيئات MHC في سرطان الظهارة البولية في المثانة وسرطان الخصية وسرطان القشرة الكظرية وسرطان الجلد العنبي. (م) العلاقة بين المجموعات الفرعية المناعية للسرطان والتعبير TMEM200A. (N) الارتباط بين المجموعات الفرعية الجزيئية للسرطان الشامل والتعبير TMEM200A. الاختصارات: MHC = مجمع التوافق النسيجي الرئيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تحليل الاستجابة المناعية TMEM200A في قلة الكريات الشاملة. (أ) ارتباط التعبير TMEM200A في أنواع مختلفة من السرطان مع TMB. (ب) العلاقة بين MSI في عموم السرطان والتعبير TMEM200A . (ج) إمكانات TMEM200A كمؤشر حيوي للتنبؤ باستجابة حصار نقاط التفتيش المناعية. (د) تم استخدام المتوسط المرجح لارتباط TMEM200A مع نتيجة بقاء ICB وتغيير الطي اللوغاريتمي (logFC) في فحص كريسبر لترتيبه. الاختصارات: TMB = عبء طفرات الورم. ICB = حصار نقطة التفتيش المناعية ؛ CRISPR = التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: تحليل إثراء GSEA ل TMEM200A في أنواع السرطان المختلفة. تم تحديد المسارات الخمسة الأولى التي لعبت فيها TMEM200A دورا وظيفيا رئيسيا في تنظيم 32 سرطانا من خلال تحليل إثراء GSEA. تظهر اللوحة اليسرى نتائج تحليل التخصيب GSEA ل TMEM200A في ACC و BLCA و BRCA و CESC و CHOL و COAD و ESCA و GBM و HNSC و KICH و KIRC و KIRP و LAML و LGG و LIHC و LUAD و LUSC و MESO و OV و PAAD و PCPG و PRAD و READ و SARC. تظهر اللوحة اليمنى نتائج تحليل التخصيب GSEA ل TMEM200A في SKCM و STAD و TGCT و THCA و THYM و UCEC و UCS و UVM. الاختصارات: GSEA = تحليل إثراء مجموعة الجينات ؛ ACC = سرطان القشرة الكظرية. BLCA = سرطان الظهارة البولية المثانة. BRCA = سرطان الثدي الغازية. CESC = سرطان الخلايا الحرشفية العنقية وسرطان غدي باطن عنق الرحم. CHOL = سرطان القنوات الصفراوية. COAD = سرطان القولون الغدي. ESCA = سرطان المريء. GBM = الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال. HNSC = سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. KICH = كروموفوبيا الكلى. KIRC = سرطان الخلايا الكلوية الصافية في الكلى. KIRP = سرطان الخلايا الحليمية الكلوية في الكلى. LAML = سرطان الدم النخاعي الحاد. LGG = ورم دبقي من الدرجة السفلى في الدماغ. LIHC = سرطان الكبد الكبدي. LUAD = سرطان الرئة الغدي. LUSC = سرطان الخلايا الحرشفية في الرئة. MESO = ورم الظهارة المتوسطة. OV = سرطان المثانة المصلي المبيض. PAAD = سرطان البنكرياس الغدي. PCPG = ورم القواتم وورم المستقتمات. PRAD = سرطان البروستاتا الغدي. اقرأ سرطان غدي المستقيم. SARC = ساركوما ؛ SKCM = سرطان الجلد الجلدي. STAD = سرطان المعدة الغدي. TGCT = أورام الخلايا الجرثومية الخصية. THCA = سرطان الغدة الدرقية. THYM = ثيموما. UCEC = سرطان بطانة الرحم في الجسم الرحمي. UCS = سرطان الرحم. UVM = سرطان الجلد العنبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: TMEM200A في STAD. (أ) تم العثور على أفضل 50 جينا لها علاقة سلبية مع التعبير TMEM200A في STAD بواسطة قاعدة بيانات LinkedOmics. (ب) أفضل 50 جينا في STAD ترتبط ارتباطا إيجابيا TMEM200A. (ج) الجينات الخمسة الأولى في TMEM200A إيجابية وخمسة جينات مرتبطة سلبا في STAD. (د) خريطة حرارية ل DEGs في STAD. (ه-ح) التحقيق في مسارات GO و KEGG المخصبة باستخدام DEGs التي تم فحصها. الاختصارات: STAD = سرطان المعدة الغدي. DEGs = التعبير التفاضلي للجينات ؛ KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. GO = علم الجينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 12
الشكل 12: العلاقة بين السمات السريرية ل STAD ومستوى التعبير TMEM200A . (أ) تحليل مستويات التعبير TMEM200A والسمات السريرية STAD باستخدام الانحدار اللوجستي. (ب، ج) تحليل كوكس لقطع الغابات STAD للمتغيرات الفردية والمتعددة. (د) مخططات خط العمود التي تتنبأ ب OS في المرضى الذين يعانون من STAD على أساس الجنس والدرجة المرضية والعمر والمرحلة المرضية والتعبير TMEM200A . (ه) مخططات معايرة توضح معايرة نموذج الرسم البياني لخط العمود. الاختصارات: STAD = سرطان المعدة الغدي. OS = البقاء على قيد الحياة بشكل عام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 13
الشكل 13: يتم تنظيم التعبير TMEM200A في STAD ويعزز تكاثر خلايا سرطان المعدة. أ: الكشف عن TMEM200A التعبير في خلايا سرطان المعدة HGC-27 والخلايا الظهارية المخاطية في المعدة GES-1 عن طريق النشاف الغربي. (ب) الكشف عن التعبير TMEM200A في خلايا GC HGC-27 و SGC-7901 ، والخلايا الظهارية المخاطية في المعدة GES-1 بواسطة qRT-PCR. (ج) انخفضت كفاءة التعبير عن TMEM200A بشكل كبير في مجموعة ضربة قاضية TMEM200A مقارنة بالمجموعة غير الضربة القاضية في خلايا GC HGC-27 ، كما هو موضح بواسطة qRT-PCR. (د) TMEM200A الضربة القاضية تمنع بشكل كبير تكاثر خلايا GC كما تم قياسها بواسطة مقايسة CCK8. (ه) أدت ضربة قاضية TMEM200A إلى تثبيط البروتينات ذات الصلة بشكل كبير في EMT وأثرت على فسفرة AKT في مسار إشارات PI3K / AKT. اختصار: GC = سرطان المعدة. qRT-PCR: تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي ؛ EMT = الانتقال الظهاري الوسيط. AKT = بروتين كيناز ب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ينتمي TMEM200A إلى عائلة من TMEMs الضرورية لتكاثر الخلايا السرطانية38. حظي التعبير المتغير عن TMEM200A في الأورام الخبيثة المختلفة باهتمام أقل ، ولا يوجد تحقيق شامل في جميع أنحاء السرطان. ومع ذلك ، تستمر الأدلة في التراكم ، مما يدل على أن عائلة بروتين TMEM عبر الغشاء قد تكون مهمة في الحفاظ على الخلايا السرطانية خبيثة من خلال التفاعلات مع العديد من البروتينات ، على سبيل المثال ، تنشيط قنوات Cl- المنشطة TMEM16A Ca2+ بواسطة ROCK1 / moesin يعزز ورم خبيث BRCA39. لذلك ، في العمل الحالي ، ركزت تحليلاتنا على استكشاف جدوى TMEM200A كهدف علاجي للسرطان وعلامة تشخيصية للورم. على وجه الخصوص ، قمنا بالتحقيق في مستويات التعبير عن TMEM200A في 33 ورما خبيثا باستخدام بيانات RNA-seq من قاعدة بيانات UCSC Xena ، ونجحت النتائج من قاعدة بيانات TIMER2.0 في التحقق من صحة التحليلات في قاعدة بيانات UCSC Xena .

بعد ذلك ، تم استخدام أداة الويب الخاصة بمركز الخلية الواحدة المناعية للورم (TISCH) وقاعدة بيانات CancerSEA لتحليل مستويات التعبير عن TMEM200A في أنواع مختلفة من الخلايا الوحيدة. تم استخدام مواقع Sangerbox و TISIDB للمساعدة في فهم كيفية تأثير TMEM200A على تسلل المناعة. حددنا أيضا مسارات الإشارات التي يلعب فيها TMEM200A وظيفة رئيسية في كل سرطان من خلال تحليل إثراء GSEA لفهم الأدوار الوظيفية الرئيسية ل TMEM200A في كل ورم خبيث.

قد يعمل TMEM200A كجزيء التصاق للتحكم في البيئة المناعية ل GC وتعزيز الانتشار الغازي لخلايا GC. لذلك ، حددنا 483 جينا معبرا عنه تفاضليا (DEGs) مرتبطا بمستوى التعبير عن TMEM200A من خلال قاعدة بيانات TCGA وقمنا بتحليل إثراء GO و KEGG لهذه 483 DEGs. أظهرت نتائج التخصيب أن مسار PI3K / AKT يلعب دورا رئيسيا في تطور السرطان ، وقد يكون مسار PI3K / AKT أحد العوامل الدافعة للسرطان.

علاوة على ذلك ، أجرينا اختبارات خلوية وجزيئية بعد معرفة المزيد عن الوظيفة الحاسمة TMEM200A في دفع تطور السرطان لتأكيد العلاقة بين التعبير TMEM200A ونشاط خلايا STAD. كما هو متوقع ، اكتشفنا أن خفض تنظيم TMEM200A في خلايا STAD قلل بشكل كبير من تكاثر الخلايا ، وأن خطوط الخلايا السرطانية عبرت عن TMEM200A بمستويات أكبر بكثير من خطوط الخلايا الطبيعية. من خلال تمشيط الأدبيات المتعلقة بعائلة البروتين عبر الغشاء في السنوات الأخيرة ، وجدنا أن البروتينات عبر الغشاء ، مثل جزيئات التصاق الخلايا37 ، لها دور تنظيمي في EMT.

علاوة على ذلك ، وفقا لنتائج تحليل التخصيب للجينات المرتبطة TMEM200A في GC ، وجدنا أن TMEM200A قد يكون لها دور تنظيمي في مسار إشارات PI3K / AKT في GC. كشفت تجارب النشاف الغربية أن ضربة قاضية يمكن أن تقلل TMEM200A بروتينات Vimentin و N-cadherin و Snai وتمنع فسفرة AKT ، مما يشير إلى أن TMEM200A ينظم البيئة المكروية للورم من خلال التأثير على EMT ، وأن مسار إشارات PI3K / AKT قد يشارك في التنظيم بوساطة TMEM200A لتطوير GC. في السنوات الأخيرة ، وجدت بعض الدراسات أن EMT هو السبب الرئيسي لمقاومة أدوية العلاج الكيميائي لدى مرضى GC. تم وصف اللدونة الظهارية المتوسطة (EMP) والبيئة الدقيقة للورم كعوامل مقيدة للعلاج الفعال في العديد من أنواع السرطان40. حدوث EMT يمكن أن يجعل خلايا GC تفقد خصائصها المميزة وتظهر خصائص خلايا اللحمة المتوسطة41. لا تقلل هذه الميزة من حساسية مرضى GC لأدوية العلاج الكيميائي فحسب ، بل تعزز أيضا القدرة الغازية والمهاجرة لخلايا GC ، مما يؤدي إلى ورم خبيث للورم. لذلك ، للأسباب المذكورة أعلاه ، تساعد دراستنا في البحث والتطوير للنقاط التنظيمية الرئيسية في EMT وتطوير مناهج علاجية مستهدفة جديدة ، من خلال استكشاف آلية عمل محددة TMEM200A تؤثر على EMT.

ازداد استخدام المعلوماتية الحيوية للبحث في السنوات الأخيرة ، وفي هذه الدراسة ، وصلنا إلى بيانات من العديد من قواعد بيانات الإنترنت. أدى استخدام قواعد البيانات هذه عبر الإنترنت في المعلوماتية الحيوية إلى تبسيط وتسريع دراسة السرطان ، كما أنها توفر للباحثين وسيلة ميسورة التكلفة للتحقق من صحة نتائجهم.

ومع ذلك ، فإن تقنية المعلوماتية الحيوية لها عيوب معينة. عندما نستخدم قواعد البيانات هذه للتحليل ، قد توفر نفس الدراسة نتائج غير متسقة أو حتى متضاربة في قواعد بيانات متعددة نظرا لأن العديد من قواعد البيانات عبر الإنترنت تتضمن بيانات من عدة مجموعات بيانات. وعلاوة على ذلك، لا يتم تحديث العديد من قواعد البيانات لفترة طويلة جدا، وبسبب صعوبات حقوق التأليف والنشر، لا يمكن أبدا توسيع محتوياتها؛ لذلك ، فإن النتائج التحليلية التي يحصل عليها الباحثون من قواعد البيانات هذه مقيدة دائما. لذلك ، في هذا البحث ، استخدمنا قواعد بيانات مختلفة لفحص النتائج بشكل جماعي للتغلب على هذه القيود وضمان صحة النتائج. للتأكد من أن النتائج التي حصلنا عليها لم تتغير بشكل كبير ، كررنا الإجراء عند استخدام قواعد بيانات مختلفة للتحليل. دعمت نتائج تجارب اللطخة الغربية تنبؤنا بالمعلوماتية الحيوية بأن TMEM200A قد تتحكم في EMT في GC من خلال تنظيم مسار إشارات PI3K / AKT ، مما سيؤثر بعد ذلك على تكاثر خلايا GC. توقعنا آلية عمل TMEM200A باستخدام المعلوماتية الحيوية جنبا إلى جنب مع الأدبيات ذات الصلة.

باختصار ، يوضح هذا العمل كيف يمكن لأدوات المعلوماتية الحيوية أن تسهل بشكل كبير التصميم التجريبي ويمكن استخدامها لعمل العديد من الأنواع الأخرى من تنبؤات البحث العلمي. من المرجح أن يتبنى باحثو السرطان في المستقبل النموذج الأساسي للجمع بين التحقق التجريبي والتنبؤ بالمعلوماتية الحيوية ، وهذا العمل بمثابة نموذج جيد لهذا الهدف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82160550).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Tags

TMEM200A ، تحليل Multiomics ، العلامات الحيوية للسرطان الشامل ، البروتين عبر الغشاء ، التسلل المناعي ، بيانات RNA-seq ، العلامات الحيوية التشخيصية ، العلامات الحيوية النذير ، سرطان المعدة (GC) ، مزارع الخلايا في المختبر ، ضربة قاضية ، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، النشاف الغربي ، السلوك الخبيث ، تكوين الورم ، الانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) ، مسار إشارات PI3K / AKT ، تثبيط الانتشار
تحليل Multiomics ل <em>TMEM200A</em> كمؤشر حيوي شامل للسرطان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter