Multiomics analyse av TMEM200A som en pan-kreft biomarkør
Summary
Her presenteres en protokoll der flere bioinformatiske verktøy kombineres for å studere de biologiske funksjonene til TMEM200A i kreft. I tillegg validerer vi også eksperimentelt bioinformatikkprediksjonene.
Abstract
Det transmembrane proteinet, TMEM200A, er kjent for å være assosiert med humane kreftformer og immuninfiltrasjon. Her vurderte vi funksjonen til TMEM200A i vanlige kreftformer ved multiomics-analyse og brukt in vitro-cellekulturer av mageceller for å verifisere resultatene. Uttrykket av TMEM200A i flere humane krefttyper ble vurdert ved hjelp av RNA-seq-data fra UCSC Xena-databasen. Bioinformatisk analyse avslørte en potensiell rolle for TMEM200A som en diagnostisk og prognostisk biomarkør.
Kulturer av normale mage- og kreftcellelinjer ble dyrket og TMEM200A ble slått ned. Ekspresjonsnivåene av TMEM200A ble målt ved bruk av kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon og vestlig blotting. In vitro tap av funksjon studier ble deretter brukt til å bestemme rollene til TMEM200A i ondartet oppførsel og tumordannelse av magekreft (GC) celler. Western blots ble brukt til å vurdere effekten av knockdown på epithelial-mesenkymal overgang (EMT) og PI3K / AKT signalvei i GC. Bioinformatisk analyse viste at TMEM200A ble uttrykt i høye nivåer i GC.
Spredningen av GC-celler ble hemmet av TMEM200A knockdown, som også reduserte vimentin-, N-cadherin- og Snai-proteiner, og hemmet AKT-fosforylering. PI3K/AKT-signalveien syntes også å være involvert i TMEM200A-mediert regulering av GC-utvikling. Resultatene som presenteres her tyder på at TMEM200A regulerer tumormikromiljøet ved å påvirke EMT. TMEM200A kan også påvirke EMT gjennom PI3K/AKT-signalering, og dermed påvirke tumormikromiljøet. Derfor, i pan-kreft, spesielt GC, kan TMEM200A være en potensiell biomarkør og onkogen.
Introduction
Kreft har dukket opp som et vedvarende folkehelseproblem som truer menneskers helse globalt1på grunn av sin høye sykelighet og dødelighet over hele verden, og utgjør en tung økonomisk og medisinsk byrde for samfunnet2. Betydelige fremskritt innen kreftbehandling har blitt oppnådd de siste årene takket være oppdagelsen av kreftmarkører3, og forskere har utviklet nye diagnostiske metoder og nye medisiner for å behandle kreft. Noen pasienter med kreft har imidlertid fortsatt dårlige prognoser på grunn av faktorer som medisineringsresistens, bivirkninger av legemidler og kjemisk følsomhet4. Derfor er det et presserende behov for å identifisere nye biomarkører for screening og behandling av kreft i tidlig stadium5.
Membranproteiner er proteiner som kan binde seg og integreres i celler og organelle membraner6. Disse kan grupperes i tre kategorier avhengig av styrken av binding til membranen og deres plassering: lipidforankrede proteiner, integrerte proteiner og perifere membranproteiner 7,8. Et transmembranprotein (TMEM) er et integrert membranprotein som består av minst ett transmembransegment9, som passerer helt eller delvis gjennom den biologiske membranen.
Selv om virkningsmekanismene til proteiner som tilhører TMEM-familien ikke er godt forstått, er disse proteinene kjent for å være involvert i flere typer kreft10. Flere TMEM-proteiner er assosiert med migrerende, proliferative og invasive fenotyper, og deres uttrykk er ofte forbundet med pasientens prognose11. Derfor har TMEM-familiemedlemmer blitt målet for forskning. En omfattende gjennomgang av eksisterende rapporter om TMEM viste at de hovedsakelig er assosiert med inter- og intracellulær signalering12, immunrelaterte sykdommer og tumorigenese10. Mange TMEMer har også viktige fysiologiske funksjoner, for eksempel ionekanaler i plasmamembranen, aktivering av signaltransduksjonsveier, samt formidling av cellekjemotaksis, adhesjon, apoptose og autofagi10. Derfor antydet vi at TMEM-proteiner kan være viktige prognostiske markører i påvisning og behandling av svulster.
TMEM200A uttrykket er signifikant forhøyet i gastrisk kreft (GC). Høyere uttrykk av TMEM200A13, som har åtte eksoner og en full lengde på 77.536 kb på kromosom 6q23.1, har vært knyttet til en dårlig prognose for total overlevelse (OS) i tilfeller av GC. Likevel har endringene i uttrykket sjelden blitt rapportert i onkologiske studier. Denne artikkelen sammenligner og analyserer nytten av TMEM200A som terapeutisk mål og tumordiagnostisk markør i ulike kreftstudier ved hjelp av forskjellige offentlig tilgjengelige datasett. Vi vurderte effektiviteten av TMEM200A som en pan-kreftdiagnostisk og prognostisk biomarkør, samt dens ekspresjonsnivåer i forskjellige humane krefttyper ved hjelp av RNA-seq-data fra UCSC Xena- og TCGA-databasene, samt ved sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) og vestlig blotting.
Effekten av TMEM200A ekspresjonsnivåer på mutasjonshastigheter, regulatoriske prosesser, tumordiagnose og prognose, immuninfiltrasjon og immunterapi ble videre undersøkt ved hjelp av en blanding av beregningsverktøy og datasettnettsteder. CBioPortal og databasene Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) ble brukt til å undersøke mutasjoner i TMEM200A. Sangerbox og TISIDB nettsteder ble brukt til å forstå hvordan TMEM200A påvirker immuninfiltrasjon. Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) online verktøy og CancerSEA database ble brukt til å undersøke funksjonen til TMEM200A. Til slutt, for å vurdere virkningen av TMEM200A på den ondartede oppførselen og tumorutviklingsfunksjonen til GC-celler, ble det utført et funksjonstapseksperiment i en in vitro-analyse . I tillegg ble det utført western blotting for å vurdere hvordan TMEM200A knockdown påvirket PI3K/AKT-signalveien og epithelial-mesenkymalovergangen (EMT) i GC.
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A tilhører en familie av TMEMs som er avgjørende for at kreftceller skal spre seg38. Det variable uttrykket av TMEM200A ved ulike maligniteter har fått mindre oppmerksomhet, og grundig pan-cancer utredning mangler. Imidlertid fortsetter bevis å akkumulere, noe som viser at TMEM-transmembranproteinfamilien kan være viktig for å holde kreftceller ondartede gjennom interaksjoner med flere proteiner, for eksempel aktivering av TMEM16A Ca2+-aktiverte Cl-ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82160550).
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends–an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
- Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors – Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
- Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
- Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
- Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
- Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
- Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
- Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
- Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
- Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
- Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
- Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
- Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
- Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
- Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
- Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
- Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
- Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
- Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
- Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
- Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
- Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
- Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
- Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
- Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
- Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
- Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
- Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
- Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
- Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
- Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
- Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
- Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
- Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
- Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
- Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
- Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
- Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
- De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
- Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).
