Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiomics-analys av TMEM200A som en pan-cancerbiomarkör

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

Här presenteras ett protokoll där flera bioinformatiska verktyg kombineras för att studera de biologiska funktionerna hos TMEM200A i cancer. Dessutom validerar vi experimentellt bioinformatikens förutsägelser.

Abstract

Det transmembrana proteinet, TMEM200A, är känt för att vara associerat med cancer hos människor och immuninfiltration. Här utvärderade vi funktionen av TMEM200A i vanliga cancerformer genom multiomics-analys och använde in vitro-cellkulturer av magceller för att verifiera resultaten. Uttrycket av TMEM200A i flera humana cancertyper utvärderades med hjälp av RNA-seq-data från UCSC:s Xena-databas. Bioinformatisk analys avslöjade en potentiell roll för TMEM200A som en diagnostisk och prognostisk biomarkör.

Kulturer av normala mag- och cancercellinjer odlades och TMEM200A slogs ner. Uttrycksnivåerna av TMEM200A mättes med hjälp av kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid och western blotting. In vitro-studier av funktionsförlust användes sedan för att bestämma TMEM200A roll i malignt beteende och tumörbildning av magcancerceller (GC). Western blots användes för att bedöma effekten av knockdown på epitel-mesenkymal övergång (EMT) och PI3K/AKT-signalvägen i GC. Bioinformatisk analys visade att TMEM200A uttrycktes i höga nivåer i GC.

Tillväxten av GC-celler hämmades av TMEM200A knockdown, vilket också minskade vimentin-, N-cadherin- och Snai-proteinerna och hämmade AKT-fosforyleringen. PI3K/AKT-signalvägen verkade också vara involverad i TMEM200A-medierad reglering av GC-utveckling. Resultaten som presenteras här tyder på att TMEM200A reglerar tumörens mikromiljö genom att påverka EMT. TMEM200A kan också påverka EMT genom PI3K/AKT-signalering, vilket påverkar tumörens mikromiljö. Därför kan TMEM200A vara en potentiell biomarkör och onkogen.

Introduction

Cancer har blivit ett ihållande folkhälsoproblem som äventyrar människors hälsa globalt1på grund av dess höga sjuklighet och dödlighet över hela världen, vilket utgör en tung ekonomisk och medicinsk börda för samhället2. Betydande framsteg inom cancerterapi har uppnåtts under de senaste åren tack vare upptäckten av cancermarkörer3, och forskare har utvecklat nya diagnostiska metoder och nya läkemedel för att behandla cancer. Vissa patienter med cancer har dock fortfarande dålig prognos på grund av faktorer som läkemedelsresistens, biverkningar av läkemedel och kemisk känslighet4. Därför finns det ett akut behov av att identifiera nya biomarkörer för screening och behandling av cancer i tidiga stadier5.

Membranproteiner är proteiner som kan binda och integreras i celler och organellmembran6. Dessa kan grupperas i tre kategorier beroende på styrkan i bindningen till membranet och deras placering: lipidförankrade proteiner, integralproteiner och perifera membranproteiner 7,8. Ett transmembranprotein (TMEM) är ett integrerat membranprotein som består av minst ett transmembransegment9, som passerar antingen helt eller delvis genom det biologiska membranet.

Även om verkningsmekanismerna för proteiner som tillhör TMEM-familjen inte är väl kända, är dessa proteiner kända för att vara involverade i flera typer av cancer10. Flera TMEM-proteiner är associerade med migrerande, proliferativa och invasiva fenotyper, och deras uttryck är ofta associerat med en patients prognos11. Därför har TMEM-familjemedlemmar blivit föremål för forskning. En omfattande genomgång av befintliga rapporter om TMEM visade att de främst är associerade med inter- och intracellulär signalering12, immunrelaterade sjukdomar och tumörbildning10. Många TMEM har också viktiga fysiologiska funktioner, till exempel jonkanaler i plasmamembranet, aktivering av signaltransduktionsvägar, samt förmedling av cellkemotaxi, adhesion, apoptos och autofagi10. Därför antog vi att TMEM-proteiner kan vara viktiga prognostiska markörer vid upptäckt och behandling av tumörer.

TMEM200A uttrycket är signifikant förhöjt vid magcancer (GC). Högre uttryck av TMEM200A13, som har åtta exoner och en full längd på 77,536 kb på kromosom 6q23.1, har kopplats till en dålig prognos för total överlevnad (OS) vid GC. Ändå har förändringarna i dess uttryck sällan rapporterats i onkologiska studier. Den här artikeln jämför och analyserar användbarheten av TMEM200A som ett terapeutiskt mål och tumördiagnostisk markör i olika cancerstudier med hjälp av olika offentligt tillgängliga datamängder. Vi utvärderade effektiviteten av TMEM200A som en pan-cancer diagnostisk och prognostisk biomarkör samt dess uttrycksnivåer i olika humana cancertyper med hjälp av RNA-seq-data från UCSC:s Xena- och TCGA-databaser, samt genom kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qRT-PCR) och western blotting.

Effekten av TMEM200A uttrycksnivåer på mutationshastigheter, regulatoriska processer, tumördiagnos och prognos, immuninfiltration och immunterapi undersöktes ytterligare med hjälp av en blandning av beräkningsverktyg och datamängdswebbplatser. Databaserna CBioPortal och Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) användes för att undersöka mutationer i TMEM200A. Sangerbox och TISIDB webbplatser användes för att förstå hur TMEM200A påverkar immuninfiltration. Onlineverktyget Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) och CancerSEA-databasen användes för att undersöka funktionen hos TMEM200A. Slutligen, för att bedöma effekten av TMEM200A på GC-cellernas maligna beteende och tumörutvecklingsfunktion, genomfördes ett funktionsförlustexperiment i en in vitro-analys . Dessutom utfördes western blotting för att bedöma hur TMEM200A knockdown påverkade PI3K/AKT-signalvägen och den epitelial-mesenkymala övergången (EMT) i GC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Databasen Cancer Genome Atlas (TCGA)

OBS: Databasen Cancer Genome Atlas (TCGA) innehåller sekvenseringsdata för gener i olika tumörvävnader14. RNA-seq-data i TCGA för studier av TMEM200A transkript per miljondel (TPM) extraherades från UCSC Xena-webbplatsen 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) och log2 transformerades för att jämföra uttrycken mellan proverna.

  1. Gå till UCSC Xenas webbplatsgränssnitt.
  2. Klicka på fliken Starta Xena .
  3. Klicka på fliken DATAMÄNGDER högst upp på skärmen.
  4. Från de 129 kohorterna och 1 571 datauppsättningarna på den här sidan klickar du på fliken för totalt 33 cancerformer som GDC TCGA akut myeloisk leukemi (LAML), GDC TCGA binjurebarkscancer (ACC), GDC TCGA Galle Duct Cancer (CHOL) och mer.
  5. Från genuttrycks-RNAseq-menyn , välj och klicka på fliken HTSeq - FPKM GDC Hub .
    HTSeq - FPKM GDC Hub representerar data som har korrigerats genom samtycke.
  6. Från nedladdningsmenyn klickar du på motsvarande länk.
    OBS: Med ovanstående metod laddades RNA-Seq-data ner för 33 olika cancertyper.
  7. Packa upp zip-arkivet med RNA-seq-data för 33 olika cancertyper i en enda fil i datorns skrivbordsmapp.
  8. Förena de uppackade txt-filerna i samma mapp och placera Perl-skripten i den här mappen.
  9. Öppna Perl-programvaran , kopiera och klistra in sökvägen till mappen i Perl-programvaran där muspekaren är placerad, tryck på Enter-tangenten , skriv in namnet på Perl-koden och namnet på genen (TMEM200A), och tryck sedan på Enter-tangenten för att få en ny txt-fil(singleGeneExp.txt).
    OBS: Denna nya txt-fil (singleGeneExp.txt) innehåller genuttryck av TMEM200A i 33 cancerformer hos olika patienter.
  10. Öppna R-koden (diffR) och kopiera och klistra in sökvägen där den singleGeneExp.txt filen finns på raden där setwd finns i R-koden.
  11. Öppna R-programvaran, kör den modifierade R-koden (diffR) och rita bilden genom paketet "ggpubr".

2. TIMER2.0-databasen

  1. Gå till TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) databas 16 webplatsgränssnitt.
  2. Klicka på fliken Utforskning av cancer.
  3. Ange gen-ID (TMEM200A) i sökrutan och klicka på fliken Skicka för att få differentiella uttrycksbilder av TMEM200A i olika typer av tumörer.

3. Human Protein Atlas (HPA)

  1. Gå till Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) 17web gränssnitt.
  2. Skriv ID (TMEM200A) i sökrutan och klicka på knappen Sök . Välj TISSUE sub-atlas.
  3. Håll muspekaren över sidan och scrolla ner för att hitta fliken Översikt över proteinuttryck .
    OBS: Avsnittet Översikt över proteinuttryck visar proteinuttrycksnivåerna av TMEM200A i 45 organ i människokroppen.

4. Plattformen HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-metyleringsplattform

OBS: HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-metyleringsplattform användes för att samla in data om metylering. Vi kunde bedöma de TMEM200A DNA-metyleringsnivåerna med hjälp av SMART-databasen (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. Gå till SMARTs webbplatsgränssnitt.
  2. Ange gen-ID (TMEM200A) i sökrutan för att få fördelningen av TMEM200A i kromosomer och metyleringsnivån av TMEM200A i olika typer av maligniteter.
  3. Bläddra ner på sidan till menyn Klicka för att kontrollera CpG-aggregerad metylering och klicka på knappen Plotta . Längst ner på sidan hittar du och klickar på knappen Ladda ner figur . Ladda ner figuren.

5. UALCAN-databasen

  1. Gå till UALCAN :s webbplatsgränssnitt.
    OBS: Box plots av de TMEM200A promotormetyleringsnivåerna i olika maligniteter genererades genom UALCAN-databasen (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. Högst upp på sidan klickar du på TCGA-knappen .
  3. Ange TMEM200A i inmatningsrutan Gene ID på skärmen. I TCGA-datauppsättningsmenyn bläddrar du nedåt och väljer vilken typ av cancer som ska efterfrågas.
  4. Efter att ha klickat på knappen Utforska , klicka på dess subgruppsanalys Metylering i menyn Länkar för analys för att få metyleringsresultaten för denna tumör.
    OBS: Med denna metod fick vi metyleringsresultat för 22 tumörer i UALCAN-databasen .

6. Databasen Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC)

  1. Gå till gränssnittet på webbplatsen för katalogen över somatiska mutationer i cancerceller (COSMIC).
    OBS: Data om kodande mutationer, icke-kodande mutanta genomiska omarrangemang och fusionsgener i det mänskliga genomet finns tillgängliga från databasen Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) 20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), som också används för att bestämma frekvensen av olika TMEM200A mutationer i olika cancerformer.
  2. Ange gen-ID (TMEM200A) i sökrutan och klicka på SÖK-knappen för att gå till en ny skärm.
  3. I menyn Gener letar du upp och klickar på länken där gen-ID-namnet för TMEM200A visas.
  4. Leta reda på kolumnen Mutationsfördelningsgruppering på den nya sidan för att få mutationsstatus för TMEM200A i tumören.

7. CBioPortal

  1. Gå till CBioPortals webbplatsgränssnitt.
    OBS: Cancergenomikdata kan hittas, laddas ner, analyseras och visualiseras med hjälp av databasen cBioPortal (www.cioportal.org). Somatiska mutationer, DNA-kopienummerförändringar (CNA), mRNA- och mikroRNA-uttryck (miRNA), DNA-metylering, proteinförekomst och fosfoproteinförekomst är bara några av de genomiska datatyper som integreras av cBioPortal21. Med cBioPortal kan ett brett spektrum av studier utföras; Tyngdpunkten ligger dock på olika analyser av mutationer och deras visualisering.
  2. Välj datauppsättningen Pan-cancer analysis of whole genomes från underavsnittet PanCancer Studies i avsnittet Välj studier för visualisering och analys . Klicka sedan på knappen Fråga efter gen .
  3. Ange målgen-ID (TMEM200A) i frågerutan för Ange gener. Klicka på knappen Skicka fråga .
  4. Klicka på knappen Detaljerad cancertyp högst upp på sidan för att få mutationerna av TMEM200A i olika typer av cancer.

8. Sangerbox 3.0-verktyg

  1. Gå till Sangerbox 3.0-verktygsgränssnittet .
    OBS: Korrelationen mellan TMEM200A uttryck med immuninfiltrerande celler, immunsuppressiva medel, immunstimulerande faktorer och MHC-molekyler (major histocompatibility complex) i alla cancerformer analyserades med CIBERSORT immuninfiltration med hjälp av pan-cancer immuninfiltrationsdata i Sangerbox 3.0 verktyg22 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. I verktygsfältet till vänster på sidan väljer du och klickar på fliken Immunocellulär analys (CIBERSORT) i menyn Pan-Cancer Analysis .
  3. Ange målgen-ID (TMEM200A) i frågerutan för Ange gener. Klicka på knappen Skicka .

9. TISIDB-databasen

  1. Gå till TISIDB :s webbplatsgränssnitt.
    TISIDB-databasen23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) användes för att undersöka korrelationen mellan TMEM200A uttryck och immuninfiltrerande celler, immunsuppressiva medel, immunstimulerande faktorer och MHC-molekyler i olika cancerformer.
  2. Ange målgensymbolen (TMEM200A) i frågerutan för Ange gener. Klicka på knappen Skicka .
  3. Klicka på avsnitten Lymfocyter, Immunmodulatorer, Kemokiner och Subtyp högst upp på sidan. Ladda ner relevanta bilder längst ner på sidan.

10. TIDE-databasen

  1. Gå till TIDE webplatsgränssnitt.
    OBS: TIDE-databasen (http://tide.dfci.harvard.edu/) användes för att utvärdera potentialen för TMEM200A som en biomarkör för att förutsäga svar på immunkontrollpunktsblockadbehandling av tumörer.
  2. Ange e-postadressen på startskärmen för att registrera kontot och logga in.
  3. Hitta underavsnittet Utvärdering av biomarkörer högst upp på sidan och klicka på det.
  4. Ange målgen-ID (TMEM200A) i frågerutan för Ange gener längst ned på sidan. Klicka sedan på knappen Skicka .
  5. Dra musen på sidan för att dra sidan nedåt för att hitta resultatet av analysen.

11. Databasen CancerSEA

  1. Gå till CancerSEA: s webbplatsgränssnitt.
    OBS: Med hjälp av sekvenseringsdata undersöktes sambanden mellan TMEM200A uttryck och det funktionella tillståndet hos olika tumörceller. Detta gjordes med hjälp av CancerSEA-databasen24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. Högst upp på sidan hittar du och klickar på fliken Sök .
  3. Ange målgen-ID (TMEM200A) i frågerutan för Ange gener. Klicka på knappen Skicka .

12. Nätverksverktyget för tumörimmunt encellscenter (TISCH)

  1. Gå till webbgränssnittet för nätverksverktyget Tumor Immune One-Cell Center (TISCH).
    OBS: Korrelationen mellan uttrycksnivåerna av TMEM200A och cancerceller visades också genom att använda nätverksverktyget Tumor Immune One-Cell Center (TISCH)25.
  2. Ange målgen-ID (TMEM200A) i frågerutan för Ange gener. Klicka på knappen Utforska .
  3. I menyn Cancertyp på den här sidan väljer du och klickar på datauppsättningen Alla cancerformer . Scrolla sedan ner på sidan och klicka på knappen Sök .

13. GeneMANIA

  1. Gå till GeneMANIAs webbplatsgränssnitt.
    OBS: Korrelationen mellan TMEM200A och dess funktionellt relevanta gener förutspåddes med hjälp av integrationsstrategin för genmultiassociationsnätverket Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 för att konstruera gen-geninteraktionsnätverk (GGI).
  2. I sökrutan längst upp till vänster på sidan anger du gen-ID (TMEM200A) och klickar på Sökverktyg.
    OBS: Webbverktyget GeneMANIA användes för att hitta 20 gener som är associerade med TMEM200A.

14. Analys av funktionell berikning

  1. Spara symbol-ID:n för de gener som ska analyseras för berikning i txt-filformat.
  2. Öppna R-koden (symbolidR) och kopiera och klistra in sökvägen där txt-filen ovan finns till raden där setwd finns i R-koden.
  3. Öppna R-programvaran och kör den ändrade R-koden (symbolidR). Konvertera symbol-id:n för dessa gener till entrezID:n via "org. Hs.eg.db"-paketet. Hämta id.txt filen.
  4. Öppna R-koden (GOR och KEGGR) och kopiera och klistra in sökvägen där id.txt-filen finns till raden där setwd finns i R-koden.
  5. Öppna R-programvaran och kör den modifierade R-koden (GOR och KEGGR). För att följa detta protokoll, analysera dessa gener för GO- och KEGG-berikning av paketen "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" och "enrichplot" och plotta berikningsresultaten med hjälp av paketet "gglot2".

15. Analys av skillnader i genaktivitet

OBS: TMEM200A poängsättning i varje cancerprov beräknades med hjälp av ssGSEA (single-sample gene set enrichment analysis)27, och differentialanalysen av TMEM200A genaktivitet i cancerösa och friska vävnader utfördes för olika cancerformer.

  1. Baserat på RNA-seq-data för 33 tumörtyper som laddades ner i steg 1.7, packa upp alla nedladdade filer och placera dem i en enhetlig mapp.
  2. Placera merge.txt file i mappen ovan.
    OBS: Data i merge.txt fil från BioWolf (www.biowolf.cn) innehåller genuttryck för alla patienter i alla tumörer i databasen The Cancer Genome Atlas (TCGA).
  3. Öppna R-koden (ssGSEAR) och kopiera och klistra in sökvägen där mappen ovan finns till raden där setwd finns i R-koden.
  4. Ta raden där geneName finns i R-koden (ssGSEAR) och ange gen-ID (TMEM200A).
  5. Öppna R-programvaran och kör den ändrade R-koden (ssGSEAR). Hämta poängfilen för genaktivitet: scores.txt.
    OBS: Med ssGSEA-algoritmen konstruerar vi först en genuppsättningsfil baserad på korrelationskoefficienterna mellan gener enligt de data som tillhandahålls i merge.txt-filen och identifierar de gener som har en högre korrelation med målgenen (TMEM200A) från filen. Sedan förenas generna med högre korrelation som de aktiva generna i TMEM200A, och slutligen får vi poängsättningen av aktiva gener i varje prov.
  6. Öppna R-koden (scoreDiffR) och kopiera och klistra in sökvägen där scores.txt-filen finns på raden där setwd finns i R-koden.
  7. Öppna R-programvaran, kör den modifierade R-koden (scoreDiffR) och rita bilden genom paketen "plyr", "reshape2" och "ggpubr".

16. Analys av klinisk-patologisk korrelation och överlevnadsprognos

  1. Gå till UCSC Xenas webbplatsgränssnitt.
  2. Klicka på fliken Starta Xena .
  3. Klicka på fliken DATAMÄNGDER högst upp på skärmen.
  4. Håll muspekaren över sidan och scrolla ner för att hitta fliken TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. Från de 129 kohorterna och 1 571 datauppsättningarna på den här sidan klickar du på fliken TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. Från fenotypmenyn , välj och klicka på fliken Kuraterade kliniska data.
  7. Från nedladdningsmenyn klickar du på motsvarande länk.
    OBS: Ladda ner kliniska data för 33 cancerformer från TCGA-databasen på länken ovan.
  8. Packa upp den nedladdade kliniska datafilen och öppna den uppackade filen i xls-filformat.
  9. Organisera och behåll nödvändiga kliniska data (stadium, ålder, patologiskt stadium och patientstatus) i filen, ta bort återstående onödiga kliniska data och spara hela filen som en txt-formatfil efter att ha bytt namn på den klinisk.
  10. Baserat på de singleGeneExp.txt som erhölls i steg 1.9 placerar du den här filen i samma mapp som den organiserade clinical.txt-filen .
  11. Packa upp de nedladdade kliniska data och placera singleGeneExp.txt - och clinical.txt filerna i samma mapp som de uppackade kliniska filerna.
  12. Öppna R-koden (clinicalDiffR) och kopiera och klistra in sökvägen där mappen ovan finns på raden där setwd finns i R-koden.
  13. Öppna R-programvaran, kör den ändrade R-koden (clinicalDiffR) och rita bilden med hjälp av paketet "ggpubr".
  14. Gå till UCSC Xenas webbplatsgränssnitt.
  15. Klicka på fliken Starta Xena .
  16. Klicka på fliken DATAMÄNGDER högst upp på skärmen.
  17. Från de 129 kohorterna och 1 571 datauppsättningarna på den här sidan klickar du på fliken för totalt 33 cancerformer som GDC TCGA akut myeloisk leukemi (LAML), GDC TCGA binjurebarkscancer (ACC), GDC TCGA Galle Duct Cancer (CHOL) och mer.
  18. Från fenotypmenyn , välj och klicka på fliken överlevnadsdata.
  19. Från nedladdningsmenyn klickar du på motsvarande länk.
  20. Packa upp zip-arkivet med överlevnadsdata för 33 olika cancertyper i en enda fil i datorns skrivbordsmapp.
  21. Lägg de uppackade överlevnadsdata i samma mapp som den singleGeneExp.txt filen som erhölls i steg 1.9.
  22. Öppna R-koden (preOSR) och kopiera och klistra in sökvägen där mappen ovan finns till raden där setwd finns i R-koden.
  23. Öppna R-programvaran och kör den ändrade R-koden (preOSR). Beräkna genom "limma"-paketet för att få en datafil om överlevnaden av TMEM200A i pancancer: expTime.txt.
  24. Öppna R-koden (OSR) och kopiera och klistra in sökvägen där expTime.txt-filen finns till raden där setwd finns i R-koden.
  25. Öppna R-programvaran och kör den ändrade R-koden (OSR). Utför en KM-analys med hjälp av paketen "survival" och "survminer" baserat på data i expTime.txt-filen och plotta överlevnadskurvorna för TMEM200A i pancancer.

17. Univariata och multivariata Cox-regressionsanalyser med skogstomtskonstruktion

  1. Öppna R-koden (COXR) och kopiera och klistra in sökvägen där vi fick expTime.txt-filen från 16.23 till raden där setwd finns i R-koden.
  2. Öppna R-programvaran och kör den ändrade R-koden (COXR). Baserat på data i expTime.txt-filen , utför univariata COX-regressionsanalyser med hjälp av paketen "survival", "survminer" och "forestplot" för att plotta ett univariat-skogsdiagram med TMEM200A i olika cancerformer.
  3. Placera expTime.txt filen från steg 16.23 och clinical.txt från steg 16.10 i samma mapp.
  4. Öppna R-koden (multicoxR) och kopiera och klistra in sökvägen där mappen som innehåller expTime.txt-filen från steg 16.23 och clinical.txt filen från steg 16.10 finns på raden där setwd finns i R-koden.
  5. Öppna R-programvaran och kör den ändrade R-koden (multicoxR). Utför en multivariat COX-regressionsanalys med hjälp av paketen "survival" och "survminer" för att plotta ett multivariat skogsdiagram av TMEM200A i olika cancerformer baserat på data i expTime.txt - och clinical.txt-filerna .

18. Prognostisk modell för magsäckscancer baserad på TMEM200A uttryck och kliniska egenskaper

  1. Placera clinical.txt-filen från steg 16.10 och den expTime.txt filen från steg 16.23 i samma mapp.
  2. Öppna R-koden (NomoR) och kopiera och klistra in sökvägen där txt-filen ovan finns på raden där setwd finns i R-koden.
  3. Öppna R-programvaran och kör den ändrade R-koden (NomoR). Använd programvarupaketen "survival", "regplot" och "rms" för TMEM200A uttrycksdata i GC och kliniska data för att konstruera en prognostisk modell för att förutsäga patientöverlevnad.

19. Cellodling och siRNA-transfektion av TMEM200A

OBS: Humana STAD HGC-27-celler, SGC-7901-celler och humana magslemhinneepitelceller GES-1 erhölls kommersiellt (se materialtabellen), återupplivades, inokulerades i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 komplett medium (innehållande 10 % neonatalt fetalt bovint serum och 1 % penicillinblandning) och odlades vid 37 °C i en 5 % CO2 Inkubator för cellodling. Odlingsmediet byttes var 2-3:e dag. Cellerna i god tillväxtkondition inokulerades i plattor med sex brunnar enligt (2-3) × 105 celler per brunn.

  1. Ta först tre mikrocentrifugrör och tillsätt 8 μL transfektionsreagens (seMaterial t) och 200 μL basalt medium till varje rör. Tillsätt sedan 4 μg SiRNA1, SiRNA2 respektive SiRNA3 till varje rör.
    OBS: För TMEM200A knockdown designades och köptes siRNA (se materialtabellen).
  2. Blanda blandningen i de tre mikrocentrifugrören noggrant och tillsätt till var och en av de tre brunnarna på 6-hålsplattan. Skaka försiktigt 6-hålsplattan för att fördela blandningen jämnt. Märk de tre brunnarna där blandningen tillsattes som SiRNA-1, SiRNA-2 och SiRNA-3.
  3. När cellerna har inkuberats i 4-6 timmar, byt ut hälften av mediet i de tre underbrunnarna i 6-hålsplattan.
    OBS: När du byter ut hälften av det kompletta mediet, aspirera hälften av det ursprungliga kompletta mediet och fyll på med hälften av det färska kompletta mediet.
  4. Tjugofyra till 48 timmar senare, använd TMEM200A siRNA-transfekterade celler som experimentgrupp och icke-transfekterade celler som negativ kontrollgrupp. Utför kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qRT-PCR, se avsnitt 20) för att bedöma effekten av transfektion på cellerna.

20. Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid

  1. Kassera cellodlingsmediet i varje undergrupp och tvätta försiktigt cellerna två gånger med 1 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
  2. Isolera totalt RNA med hjälp av ett RNA-isoleringskit (se materialtabellen).
  3. Uppskatta RNA-koncentrationen och syntetisera cDNA med 1 μg RNA med hjälp av ett cDNA-synteskit, enligt tillverkarens instruktioner.
  4. Utför kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) på 10-faldiga utspädningar av cDNA i 10 μL reaktionsblandning, inklusive människospecifika framåt- och bakåtprimrar för GAPDH (för standardisering), TMEM200A (se materialtabellen) och qPCR Master Mix, med hjälp av realtids-PCR-analyssystemet.
    OBS: Utför varje experiment i tre exemplar.
  5. Använd följande qPCR-reaktionsbetingelser: initiering, 95 °C i 3 min; denaturering, 95 °C i 10 s; glödgning, 60 °C i 30 s; och förlängning, 80 °C i 10 s. Upprepa denatureringen, glödgningen och förlängningen 40 gånger. Bestäm det relativa uttrycket av varje gen med hjälp av 2-ΔΔCt-tekniken 28.
  6. Upprepa experimenten minst tre gånger för att få fram biologiska trilikat.

21. Western blot-detektion av relevant proteinuttryck

  1. Kassera cellodlingsmediet i varje undergrupp och tvätta försiktigt cellerna med 2 x 1 ml PBS.
  2. Kyl plattorna med 6 brunnar som innehåller cellerna på is och tillsätt 150 μL förkyld radioimmunutfällningsanalys (RIPA) lyseringsbuffert (150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,5 % natriumdeoxikolat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 och nytillsatt cocktail av proteashämmare). Låt lyseringen fortsätta på is i 10 minuter.
  3. Använd en plastcellskrapa, ta bort vidhäftande celler från skålen och överför försiktigt celllösningen till ett mikrocentrifugrör som har förkylts.
  4. Centrifugera celllysatet i 10 minuter vid 1,5 × 104 g vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  5. Använd ett BCA-proteinanalyskit för att bestämma proteinhalten enligt tillverkarens instruktioner.
  6. Ladda 30 g protein från varje prov på en 10 % natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) gel och kör vid 80 V i 0,5 timmar följt av 1,5 timmar vid 120 V.
  7. Överför proteinerna från gelen till ett 45 μm polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) vid en spänning på 300 mA i 1-1,5 timmar.
  8. Efter att ha placerat PVDF-membranet på en shaker och skakat det i 3 x 5 minuter, tillsätt Tris-buffrad koksaltlösning med Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl och 0,1 % Tween 20) i lämplig behållare med proteinsidan (gelsidan) uppåt.
  9. Placera membranet i blockeringsbufferten (se materialtabellen) och inkubera det i 0.5 timmar vid rumstemperatur.
  10. Tvätta membranet med TBST i 3 x 10 min.
  11. Inkubera membranet med primära antikroppar mot fosfo-AKT (p-AKT; 1:1 000), totalt AKT 1:1 000, E-cadherin (E-ca; 1:1 000), N-cadherin (N-ca; 1:1 000), Vimentin 1:1 000, snigel 1:1 000, TMEM200A 1:1 000, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH; 1:1 000), över natten vid 4 °C.
  12. Tvätta membranet i 3 x 10 minuter och inkubera membranet med en sekundär antikropp från kanin eller mus (1:5 000) i 1 timme i rumstemperatur.
  13. Inkubera PVDF-membranet med ECL-substrat i 30 s och detektera signalen med hjälp av ett bildsystem.

22. CCK-8-analys

  1. Frö humana STAD HGC-27-celler i god tillväxtkondition i 96-brunnars plattor.
  2. När celltätheten når 60-70 % transfekterar du cellerna med TMEM200A siRNA (som i steg 19.3).
  3. Frö de transfekterade cellerna till 96-brunnars plattor med en celltäthet på 5 × 10 3/brunn (räkna livsdugliga celler med hjälp av en cellräknare), uppdelade i NC - och TMEM200A siRNA-grupper (med tre replikatbrunnar i varje grupp) och inkubera vid 37 °C.
  4. Tillsätt CCK-8-reagens efter 0, 24, 48, 72 och 96 timmar och inkubera vid 37 °C i 2 timmar. Mät absorbansen (450 nm) med hjälp av en multifunktionell enzymetikett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uttryck av TMEM200A vid olika cancerformer
Som illustreras i figur 1 analyserade vi först de differentiella uttrycksnivåerna av TMEM200A i olika cancerformer genom olika databaser. TMEM200A uttryck var förhöjt vid kolangiokarcinom (CHOL), skivepitelcancer i huvud och hals (HNSC), renal klarcellscancer (KIRC), renal papillär cellcancer (KIRP), hepatocellulärt karcinom (LIHC), STAD och sköldkörtelcancer (THCA) jämfört med intilliggande normal vävnad enbart baserat på TCGA-data. Uttrycket minskade dock TMEM200A i urinblåsans uroepitelcancer (BLCA), cervikal skivepitelcancer och cervikal adenokarcinom (CESC), glioblastoma multiforme (GBM), njurkromofob (KICH), lungskivepitelcancer (LUSC), feokromocytom och paragangliom (PCPG), rektalt adenokarcinom (READ) och livmoderkroppskroppscancer (UCEC) (Figur 2A). I TIMER2.0-databasen ökade TMEM200A uttryck i CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC och STAD. Dessutom ökade TMEM200A uttryck i BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, hudmelanom (SKCM) och UCEC (figur 2B).

Genom att jämföra resultaten från de två databaserna fann vi att pancanceruttrycket av TMEM200A var detsamma i båda databaserna. Vi erhöll kliniska uppföljningsdata och RNA-sekvenseringsdata från 33 patienter med cancer från TCGA-databasen, beräknade TMEM200A poängsättning i varje cancerprov med hjälp av ssGSEA-analys och beräknade sedan TMEM200A genaktivitet i tumör och normala vävnader i många tumörer. Vi upptäckte att TMEM200A uttrycktes i hög grad i GBM, HNSC, njur-KIRC och THCA (Figur 2C); Därför rankades genaktiviteten hos TMEM200A i varje tumörvävnad. Det visade sig att genaktiviteten hos TMEM200A var högst i KIRC och lägst i uvealt melanom (UVM) (Figur 2D). Efterföljande utvärdering av TMEM200A uttrycksnivåer i mänsklig vävnad visade att TMEM200A uttrycksnivåer var låga i de flesta normala vävnader men höga i binjurebarken, ändtarmen, endometrium och glatt muskulatur (Figur 2E).

I normala vävnadscellinjer uppvisade ett fåtal cellinjer såsom granulosaceller, bipolära celler, skelettmuskelceller, endometriestromaceller och T-celler högt uttryck av TMEM200A, medan TMEM200A uttryck var lågt i de flesta andra cellinjer (Figur 2F). Vi undersökte också immunohistokemidata (IHC) i HPA-databasen för att titta på uttrycket av TMEM200A på proteinnivå. Data avseende färgning och intensitet avslöjade mycket större och mer uttalade uttrycksnivåer av TMEM200A i kolorektalcancer (CRC), lungcancer (LUAD), levercancer (LIHC), bröstcancer (BRCA) och prostatacancer (PRAD) vävnader jämfört med normala vävnader (Figur 2G). Dessa fynd tydde på att TMEM200A uttrycktes i stor utsträckning i olika cancerformer och påverkade cancerutvecklingen via olika mekanismer i olika tumörer.

Klinisk-patologiskt samband och överlevnadsprognos
För 33 humana maligniteter samlade vi in information och kliniska data i TCGA-kohorten för pancancer (PanCan) från UCSC:s Xena-databaswebbplats och undersökte korrelationen mellan TMEM200A uttryck i PanCan och ålder, patologisk grad, kliniskt patologiskt stadium och patientöverlevnadsstatus. Denna studie visade att i sex cancerformer var uttrycket av TMEM200A associerat med det klinisk-patologiska stadiet, inklusive BLCA, invasivt bröstkarcinom (BRCA), esofaguscancer (ESCA), KIRP, SKCM och testikelcancer (TGCT) (Figur 3A). Ålder korrelerades med sex tumörer, inklusive invasiv BRCA, GBM, akut myeloisk leukemi (LAML), SKCM, tymuscancer (THYM) och endometriecancer (UCEC) (Figur 3B). Den patologiska graden var associerad med sex tumörer, inklusive esofaguscancer (ESCA), HNSC, KIRC, låggradigt gliom i hjärnan (LGG), pankreasadenokarcinom (PAAD) och endometriecancer (UCEC) (Figur 3C). Överlevnadsstatus var associerad med fem tumörer, inklusive binjurebarkscancer (ACC), BLCA, KIRC, PCPG och uvealt melanom (UVM) (Figur 3D).

Vi genomförde studier för olika cancerformer på OS, DSS, PFI och DFI med hjälp av envägs Cox-regressionsanalys med en mediangruppströskel för att lära oss mer om korrelationen mellan TMEM200A uttryck och prognos. Resultaten av OS-analysen visade att bland de fyra tumörerna hade högre TMEM200A uttryck en större inverkan på OS-prognosen i fyra tumörer, inklusive binjurebarkscancer (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), akut myeloisk leukemi (LAML) (P = 0,011) och GC (STAD) (P = 0,005). Däremot hade högre TMEM200A uttryck en bättre prognos för OS i fem tumörer, inklusive KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), låggradigt gliom i hjärnan (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) och kutant melanom (SKCM) (P = 0,043) (Figur 3E,F). För DSS hade högt TMEM200A uttryck en dålig prognos i två tumörtyper, inklusive binjurebarkscancer (ACC) (P = 0,026) och BLCA (P = 0,015). Högt TMEM200A uttryck hade en bättre prognos i fyra tumörtyper, inklusive KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), låggradigt gliom i hjärnan (LGG) (P = 0,025) och PCPG (P = 0,007) (Figur 3G). Dessutom, för PFI, hade högre TMEM200A uttryck en dålig prognos i tre tumörtyper, inklusive binjurebarkscancer (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) och uvealt melanom (UVM) (P = 0,020). Högre TMEM200A uttryck hade en bättre prognos i två tumörtyper, inklusive KIRC (P < 0,001) och låggradigt gliom (LGG) (P = 0,044) i hjärnan (Figur 3H). Vid DFI hade högre uttryck av TMEM200A en sämre prognos vid binjurebarkscancer (ACC) (P = 0,044) (Figur 3I).

Därefter valde vi ut flera tumörer (KIRC och KIRP) för multi-COX regressionsanalys. Resultaten visade att TMEM200A individuellt kunde påverka överlevnaden hos cancerpatienter jämfört med andra kliniska faktorer (Figur 3J och K). Dessa resultat visade att TMEM200A kunde användas som en oberoende bioprognostisk markör i olika cancerformer för att påverka överlevnaden hos patienter med cancer.

DNA-metyleringsanalys
En av de epigenetiska förändringar som har fått mest uppmärksamhet är DNA-metylering29. Det har föreslagits att en typ av epigenetisk förändring, DNA-metylering, har en signifikant inverkan påtumörtillväxt. Med hjälp av SMART-databasen utvärderade vi därför DNA-metyleringsnivåerna av TMEM200A i normal vävnad och cancervävnad. PAAD- och PRAD-vävnader hade högre nivåer av DNA-metylering av TMEM200A än normala vävnader. TMEM200A hade dock lägre DNA-metyleringsnivåer i COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA och UCEC än i normal vävnad (figur 4A). DNA-metyleringsnivåerna för TMEM200A var betydligt högre i TCGA-databasen i KIRP, PRAD, PCPG och THYM baserat på UALCAN-databasen (figur 4B) men inte i BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA och UCEC. Metyleringsnivån av TMEM200A minskade signifikant i LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA och UCEC (figur 4C). För att ytterligare undersöka förhållandet mellan uttrycksnivån av TMEM200A och DNA-metylering och klinisk-patologiska faktorer använde vi återigen SMART-databasen och fann att DNA-metyleringsnivån för TMEM200A i BLCA, HNSC, LUAD och STAD förändrades med det patologiska stadiet (Figur 4D). Kliniska faktorer påverkar nivån av DNA-metylering av TMEM200A i ovanstående tumörer.

Analys av genmutationer
En av orsakerna till utvecklingen av tumörer är ackumuleringen av genmutationer31. Därför analyserades frekvensen av somatiska TMEM200A mutationer genom att uppskatta frekvensen av TMEM200A mutationer i kliniska prover från pancancer med hjälp av databasen cBioPortal. TMEM200A är muterat i många cancerformer, såsom lungcancer, endometrioidcancer i livmodern, melanom, matstrupscancer, skelettcancer, livmoderhalscancer, levercancer, moget B-cellslymfom, BRCA, endometriecancer, äggstockscancer, embryonal tumör, bukspottkörtelcancer, huvud- och halscancer, CRC, gliom, icke-småcellig lungcancer, mjukdelssarkom och cancer av okänd primär art (figur 5A). Dessutom kan DNA-förändringar leda till strukturella förändringar eller aminosyraförändringar på proteinnivå. Figur 5B visar 3D-strukturen för TMEM200A. Med hjälp av databasen cBioPortal hittade vi mutationsställen i aminosyrorna hos TMEM200A; Missense-mutationer var den vanligaste formen av mutationer (Figur 5C).

Vi analyserade data med Sangerbox 3.0 för att verifiera noggrannheten hos mutationsställena och uppnådde samma resultat som tidigare. Missense-mutationer är den vanligaste formen av mutationer i TMEM200A och de kan förekomma så ofta som 7,8 % i SKCM (Figur 5D). En missense-mutation är en mutation där ett kodon som kodar för en aminosyra genomgår en bassubstitution och blir ett kodon som kodar för en annan aminosyra, vilket resulterar i en förändring av aminosyratypen och sekvensen i polypeptidkedjan. Resultatet av missense-mutation är vanligtvis att polypeptidkedjan förlorar sin ursprungliga funktion. Många proteinavvikelser orsakas av missense-mutation, som är en vanlig typ av tumörmutation. Det har visat sig att missense-mutationer spelar en nyckelroll i proteiners stabilitet, och närvaron av mutationer kan ha en signifikant effekt på bindningsaffiniteten mellan proteiner32, vilket förändrar interaktionerna mellan proteiner och de omgivande korrelativa makromolekylerna33.

Således påverkar missense-mutationer sannolikt den biologiska funktionen av transmembranprotein 200A i olika cancerformer. Sambandet mellan TMEM200A genmutation och den kliniska överlevnadsprognosen för patienter med cancer undersöktes också. Sannolikheten för totalöverlevnad ökade jämfört med den i den TMEM200A-muterade gruppen, men inte i den sjukdomsfria gruppen (Figur 5E). Studien av genkorrelationer visade att TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 och SLC18B1 var bland de gener som sammuterade med TMEM200A (Figur 5F). Vi kunde identifiera flera mutationstyper och enkelnukleotidvariationer (SNV) genom COSMIC-databasen för att lära oss mer om TMEM200A mutationer i GC. Frekvensen av missense-substitutioner var högst (38,86 %) (Figur 5G), och SNV-data visade att de vanligaste SNVs i STAD var G>A (31,73 %), följt av C>T (26,35 %) och G>T (11,73 %) (Figur 5H).

Encellsanalys av TMEM200A i cancer
Vi analyserade TMEM200A uttrycksnivåer i olika enskilda celler med hjälp av webbplatsen TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center). Onlineverktyget TISCH visade uttrycket för TMEM200A för 65 datauppsättningar och 28 celltyper i värmekartan som visas i figur 6A. Resultaten visade att TMEM200A främst uttrycktes i CD8+ T-celler och fibroblaster. Det GSE72056 datasetet, som inkluderar celler från patienter med metastaserande hudmelanom (SKCM), är anmärkningsvärt i detta avseende. TMEM200A uttrycktes i stor utsträckning i B-celler, CD4+ T-lymfocyter, utarmade CD8+ T-celler, endotelceller, fibroblaster och andra celltyper i SKCM-mikromiljön (Figur 6B,C). I den GSE146771 datauppsättningen, som innehåller celler från patienter med CRC, uttrycktes TMEM200A i stor utsträckning i B-celler, CD4+ T-lymfocyter, CD8+ T-celler, utarmade CD8+ T-celler, endotelceller, fibroblaster och andra celltyper i CRC-mikromiljön (Figur 6D,E). Med hjälp av CancerSEA-databasen bestämdes uttrycksnivåer och funktionsstatus för TMEM200A i specifika tumörceller (Figur 6G). TMEM200A uttryck var starkt korrelerat med det cellulära funktionella tillståndet i en rad cancerformer, inklusive glioblastom (GBM), lungadenokarcinom (LUAD), kronisk granulocytär leukemi (KML), CRC, retinoblastom (RB) och uvealt melanom (UM). Angiogenes, apoptos, differentiering och inflammation var alla positivt korrelerade med TMEM200A uttryck i en majoritet av tumörcellerna, medan DNA-skador, DNA-reparation, invasion och metabolism var negativt korrelerade med TMEM200A uttryck (Figur 6F).

Funktionell och signalvägsberikningsanalys av TMEM200A i olika cancerformer
Vi undersökte kopplingen mellan TMEM200A och proteiner med liknande funktioner med hjälp av GGI-nätverket för att utforska funktionen av TMEM200A i olika cancerformer (Figur 7A). Genomisk och proteomisk information analyseras av GeneMANIA med hjälp av en frågelista över målgener. Genom att lokalisera gener som fungerar på liknande sätt som TMEM200A upptäcktes de 40 proteiner som direkt interagerar med denna gen. Korrelationen mellan dessa gener visas av PPI-nätverket (figur 7B). Senare visade GO- och KEGG-anrikningsanalyser av dessa 20 gener som är nära besläktade med TMEM200A att dessa intilliggande gener till största delen var inblandade i RNA:s negativa reglering av nedtystning av gener. KEGG-analys visade att TMEM200A var rikligt förekommande i signalvägar, inklusive Wnt-signalvägen och cellulär senescens (Figur 7C). GO-anrikningsanalys visade att TMEM200A i molekylär funktion huvudsakligen var rikligt förekommande i kalciumkanalerna och negativ reglering av nedtystning av gener av RNA (Figur 7D).

Korrelationsanalys mellan TMEM200A och immuninfiltration
Vi undersökte vidare korrelationen mellan TMEM200A uttryck och immuncellsinfiltration för att visa sambandet mellan TMEM200A och cancerimmunitet. Vi genomförde CIBERSORT immuninfiltrationsanalys med hjälp av Sangerbox 3.0 pan-cancerdata. Resultaten visade att pancancerns TMEM200A uttryck var korrelerat med CD8+ T-celler, CD4+ T-celler, B-celler, hjälpar-T-celler, naturliga mördarceller, regulatoriska T-celler, monocyter, makrofager, dendritiska celler, eosinofiler, basofiler och granulocyter (Figur 8A). Därefter tittade vi på korrelationen mellan TMEM200A uttryck och TIL (tumörinfiltrerande lymfocyter) med hjälp av TISIDB-databasen, vilket visar en nära korrelation mellan TMEM200A uttryck och 28 TIL-förekomst i olika cancertyper (Figur 8B). Vi använde TISIDB-databasen för att bedöma korrelationen mellan TMEM200A uttryck och immunsuppressiva läkemedel i humana maligniteter för att mer ingående undersöka hur immunmodulatorer och TMEM200A uttryck var relaterade. Resultaten visade att TMEM200A uttrycksnivåer var signifikant korrelerade med immunsuppressiva medel i en mängd olika cancerformer (Figur 8C). Signifikanta korrelationer mellan TMEM200A uttryck och vissa immunsuppressiva medel hittades vid testikelcancer och UM (Figur 8D-F). Vi utförde sedan en korrelationsanalys av TMEM200A uttryck med immunstimulerande faktorer och MHC-molekyler med hjälp av TISIDB-databasen (Figur 8G,H). Resultaten visade att TMEM200A uttryck var korrelerat med utvalda immunstimulerande medel och MHC-molekyler vid urotelcancer i urinblåsan, testikelcancer, binjurebarkscancer och UM (Figur 8I-L). Nästa steg var att undersöka korrelationen mellan TMEM200A uttryck och immunologiska eller molekylära subtyper i TCGA PanCan-kohorten i TISIDB-databasen. Vi fann att de immunologiska undergrupperna av nio distinkta cancertyper uttryckte TMEM200A olika, inklusive BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT och BRCA (Figur 8M). Dessutom uppvisade sex olika cancerformer med olika molekylära undergrupper, inklusive HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV och LUSC, variabelt uttryck av TMEM200A (Figur 8N).

Analys av TMEM200A och immunterapirespons
Effekten av PD-1/PD-L1-hämmare är starkt korrelerad med TMB, och vissa patienter med tumörer kan i viss mån förutsägas med hjälp av TMB-markörer för effekten av immunterapi34. Mikrosatellitinstabilitet (MSI) är den term som används för att beskriva den felaktiga DNA-felmatchningsfunktionen (MMR) när mikrosatellitreplikationsfel inte åtgärdas och ackumuleras, vilket ändrar längden eller bassammansättningen av mikrosatelliter35. MSI är en tumörmarkör av klinisk betydelse 36. Vi bedömde därför effekten av TMEM200A uttryck på immunterapi genom att undersöka korrelationen mellan TMEM200A uttryck och TMB eller MSI. Resultaten visade en signifikant positiv korrelation mellan TMEM200A uttryck och TMB i THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP och KIRC, men TMEM200A uttryck var negativt korrelerat med UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM och BRCA (Figur 9A). MSI och TMEM200A uttryck var starkt och gynnsamt kopplade till TGCT, medan TMEM200A uttryck var signifikant och negativt korrelerat med MSI i UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC och CHOL (Figur 9B). Vi bedömde också potentialen hos TMEM200A som biomarkör för att undersöka effektiviteten av ICB. Resultaten visade att TMEM200A ensamt förutspådde ICB-svar med en noggrannhet på Area Under Curve (AUC) > 0,5 i 7 av 25 ICB-subpopulationer. TMEM200A visade ett högre prediktivt värde än T- och B-cellskloner, som båda hade ett värde på 5. Värdet för TMEM200A var dock lägre än för TIDE (AUC > 0,5 i 11 ICB-subpopulationer), MSI-poäng (AUC > 0,5 i 11 ICB-subpopulationer), CD274 (AUC > 0,5 i 15 ICB-subpopulationer), CD8 (AUC > 0,5 i 17 ICB-subpopulationer), IFNG (AUC > 0,5 i 16 ICB-subpopulationer) och Merck18 (AUC > 0,5 i 17 ICB-subpopulationer) (Figur 9C). Dålig överlevnadsprognos i kohorterna ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 och ICB_Hugo 2016_PD1 var korrelerad med högt TMEM200A uttryck. Knockdown ökade dock TMEM200A lymfocytmedierad tumördödande styrka i den genomsnittliga kohorten av Kearney 2018 T_PD1 och Pan 2018 OT1 (Figur 9D).

GSEA-anrikningsanalys av TMEM200A i olika cancerformer
Vi använde DEG mellan TMEM200A undergrupper med högt uttryck och TMEM200A undergrupper med lågt uttryck i 32 maligniteter för att utforska TMEM200A-relaterade canceregenskaper. Vi upptäckte en betydande korrelation mellan primär immunbrist, RIG (Retinoic acid-inducible gene)-I-liknande receptorsignalvägen och TMEM200A uttryck i pancancer, särskilt i BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC och SKCM (Figur 10). Det virala cytoplasmatiska proteinet ribonukleinsyra detekteras av den RIG-I-liknande receptorsignalvägen. RIG-I-liknande receptorer kan påverka produktionen av en mängd olika inflammatoriska cytokiner i kroppen genom att aktivera NF-kB-signalvägen genom att engagera vissa intracellulära korsningsproteiner. Som ett resultat kan det transmembrana proteinet 200A (TMEM200A) spela en avgörande roll i rekryteringen av intracellulära proteiner av den RIG-I-liknande receptorn. Dessa fynd tydde på en stark korrelation mellan TMEM200A uttryck och immunologisk infiltration. Dessutom visade GSEA-anrikningsanalys att pan-cancer TMEM200A uttryck var korrelerat med kemokinsignalering, celladhesion, cytokinreceptoranslutningar, cellmembranavkänningsvägar och autofagikontroll (figur 10). Transmembranproteiner kan fungera som vidhäftningsmolekyler för att påverka tumörens mikromiljö förutom att spela en avgörande roll för att kontrollera inträdet av kalciumjoner i cellen från kalciumreservoarer 36. Därför kan resultaten från GSEA-anrikningsanalys bero på involvering av TMEM200A i många fysiologiska processer, inklusive aktivering av signaltransduktionsvägar, bildning av plasmamembranjonkanaler och reglering av cellkemotaxi, vidhäftning, apoptos och autofagi9.

Vi identifierade de 50 bästa STAD-generna både positivt och negativt korrelerade med TMEM200A från LinkedOmics-databasen, som samuttrycktes i STAD, i form av värmekartor (Figur 11A,B). Vi utvärderade de 5 bästa generna positivt och de 5 bästa generna negativt associerade med TMEM200A i GC (Figur 11C). Våra resultat visade att TMEM200A uttryck var korrelerat med SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) och SYTL1 (r = -0,33) samuttryck. Vi analyserade resultaten från visualiseringen av tröskelvärden för att ytterligare förstå TMEM200A roll i STAD. Följande kriterier användes för screening: log2-faldig förändring (FC) > 2,0 och justerat P-värde 0,05. Vi hittade 483 DEG:er, varav 385 var uppreglerade och 98 var nedreglerade, och vi valde ut 100 av dem som skulle visualiseras för att skapa en värmekarta (Figur 11D). Sedan, för de DEG som uppfyllde screeningkriterierna, körde vi BEG- och KEGG-berikningsanalyser. Resultaten av GO-anrikningsanalysen visade att anrikningen av BP (biologisk process) huvudsakligen var associerad med extracellulär matris och strukturell vävnad, anrikningen av CC (cellulär komponent) var huvudsakligen associerad med kollageninnehållande extracellulär matris och basalmembran, och MF (molekylär funktion) var huvudsakligen anrikad i en extracellulär matrisstruktur och glykosaminoglykanbindning (Figur 11E och Figur 11G). Berikningen av KEGG-analysen visade att TMEM200A huvudsakligen var anrikat i den extracellulära matrixreceptorinteraktionsvägen, cytokrom P450 och renin-angiotensinsystemet (Figur 11F och Figur 11H).

TMEM200A-baserad prognostisk modell och kliniska tecken på magsäckscancer
Vi undersökte korrelationen mellan TMEM200A och kliniska data för patienter med STAD och analyserade därför de klinisk-patologiska egenskaperna hos patienter i TCGA-STAD-kohorten genom logistisk regressionsanalys och baserat på TMEM200A uttrycksnivåer (Figur 12A). Ålder, kliniskt stadium och TMEM200A uttryck var alla signifikant korrelerade med totalöverlevnad hos patienter med STAD, enligt en univariat Cox-regressionsanalys (Figur 12B). Den multivariata Cox-regressionsanalysen visade att TMEM200A uttryck kan vara en fristående prediktiv faktor för totalöverlevnad hos patienter med STAD (HR = 1,282, 95 % KI = 1,066-1,541, P = 0,008) (Figur 12C). Vi undersökte potentialen hos dessa klinisk-patologiska egenskaper för att förutsäga OS efter 1, 3 och 5 år i STAD med hjälp av standardmodellen för kolumndiagram i kombination med flera kliniska parametrar (Figur 12D). Kalibreringskurvorna för 1-årsöverlevnad överensstämde i hög grad med sannolikheterna för predikterade kurvor (Figur 12E).

TMEM200A uppreglering i STAD-celler och cellproliferationsförbättring
Genom att granska litteraturen relaterad till TMEM200A upptäckte vi att det höga uttrycket av TMEM200A indikerade en dålig prognos 13 och GC-immunmikromiljön kan påverkas av TMEM200A som fungerar som en vidhäftningsmolekyl37, vilket främjar invasionen och metastaseringen av GC-celler. Vi undersökte proteinnivåerna och mRNA-transkriptnivåerna av TMEM200A i STAD-cellinjer för att bekräfta resultaten av den tidigare nämnda studien. GC-cellinjen HGC-27 överuttrycktes dramatiskt TMEM200A jämfört med den friska magslemhinneepitelcellinjen GES-1 på både protein- och mRNA-transkriptnivåerna (Figur 13A,B), vilket indikerar att TMEM200A överuttrycktes i HGC-27-celler. Följande tester utfördes med HGC-27-celler som ett resultat. Under tiden, för att bevisa noggrannheten i de experimentella resultaten, använde vi qRT-PCR för att jämföra det differentiella mRNA-uttrycket av TMEM200A i humana GC-celler SGC-7901 och magslemhinneepitelceller GES-1, och resultaten visade att TMEM200A uttrycktes i hög grad i SGC-7901-celler (Figur 13B). TMEM200A slogs ner i HGC-27-celler för att undersöka eventuell inblandning av TMEM200A i STAD (Figur 13C). Baserat på databasutvinningsresultaten och vår korrelationsanalys av TMEM200A fann man att TMEM200A huvudsakligen var involverad i den extracellulära matrixreceptorinteraktionsvägen, som var associerad med cancerproliferation och invasion. Vi använde därför CCK-8-analyser för att fastställa hur TMEM200A uttryck påverkade celltillväxten. CCK-8-analyserna visade att TMEM200A knockdown-grupperna (Si-RNA2 och Si-RNA3) uppvisade en anmärkningsvärd minskning av cellviabiliteten jämfört med NC-gruppen (Figur 13D). Dessa fynd tydde på att TMEM200A var uppreglerat i STAD, och dess uttrycksnivå kunde påverka spridningen av GC-celler. Baserat på resultaten av KEGG-anrikningsanalysen i figur 11F fann vi att TMEM200A var associerad med PI3K/AKT-signalvägen i GC, och TMEM200A, som en celladhesionsfaktor, kan påverka mekanismen för magcancerogenes genom att påverka EMT. Därför använde vi western blotting för att verifiera effekterna av TMEM200A knockdown på EMT och PI3K/AKT-signalvägen före och efter knockdown. Resultaten visade att P-AKT-proteinuttrycket minskade i den TMEM200A knockdown-gruppen (TMEM200A-SiRNA2) jämfört med den negativa kontrollgruppen (NC), medan nivåerna av N-cadherin-, Vimentin- och Snai-proteiner också minskade och E-cadherin-proteinuttrycket ökade (Figur 13E). Alla dessa resultat tyder på att TMEM200A kan påverka EMT genom PI3K/AKT-signalvägen och därmed spela en roll i GC.

Figure 1
Figur 1: Studiens arbetsflöde. Förkortningar: TCGA = The Cancer Genome Atlas database; TIMER2.0 = TIMER2.0 databasen; OS= Total överlevnad; PFS = Progressionsfri överlevnadstid; DSS = Sjukdomsspecifik överlevnad; DFS = Sjukdomsfri överlevnad; TMB = Tumörmutationsbörda; MSI = Instabilitet i mikrosatelliter; PPI = Protein-proteininteraktion; GGI = Interaktion mellan gener och gener; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GO = Gene Ontology. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Uttrycksnivåer av TMEM200A i olika cancerformer. (A) Upp- eller nedreglerat uttryck av TMEM200A från TCGA-datasetet i olika humana maligniteter. (B) Analys av TMEM200A uttrycksnivåer i tumör och normal vävnad med hjälp av TIMER2.0-databasen. (C) Differentiell analys av TMEM200A genaktivitet i olika humana cancerformer från TCGA-datasetet. (D) Rangordning av genaktivitetsnivåer för TMEM200A i olika humana cancerformer baserat på ssgsea-poängsättning. E) TMEM200A uttrycksnivåer från HPA-databasen i frisk vävnad. (F) HPA-databasens TMEM200A uttrycksnivåer i normala cellinjer. (G) IHC-resultat för TMEM200A proteinuttryck i cancer från HPA-databasen. Förkortningar: TCGA = The Cancer Genome Atlas; ssGSEA = Analys av genuppsättning med ett enda prov; HPA = Human Protein Atlas; IHC = Immunhistokemi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Korrelation mellan TMEM200A uttryck och klinisk-patologiska egenskaper och prognos för olika tumörer. (A) Korrelation mellan TMEM200A uttryck i TCGA-pancancerkohorten (PanCan) med klinisk-patologisk stadieindelning i varje tumör analyserades med hjälp av UCSC:s Xena-databas. (B) Korrelation mellan TMEM200A uttryck i TCGA PANCAN-kohorten med patientens ålder i varje tumör. (C) Korrelation mellan TMEM200A uttryck i TCGA PANCAN-kohorten med tumörpatologisk grad i varje tumör. (D) Korrelation mellan TMEM200A uttryck i TCGA PanCan-kohorten med överlevnadsstatus för patienter i varje tumör. (E) Korrelationsanalys av TMEM200A uttryck med pan-cancer total överlevnad i olika cancerformer med hjälp av Cox regressionsmodell. (F) Korrelation mellan TMEM200A uttryck och prognos för pan-cancer OS i TCGA PanCan-kohorten. (G) Korrelation mellan TMEM200A uttryck och sjukdomsspecifik överlevnad. (H) Korrelation mellan TMEM200A uttryck och prognos för progressionsfria intervall i TCGA PanCan-kohorten. (I) Korrelation mellan TMEM200A uttryck och sjukdomsfritt intervall. (J) En multifaktoriell COX-regressionsanalys utfördes på KIRC. (K) En multifaktoriell COX-regressionsanalys utfördes på KIRP. Förkortningar: TCGA = The Cancer Genome Atlas; KIRC: Njurcancer i renal cell; KIRP: Papillärcellscancer i njurarna; OS = Total överlevnad; DSS = Sjukdomsspecifik överlevnad; PFI = Progressionsfritt intervall; DFI = Sjukdomsfritt intervall. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: DNA-metyleringsanalys av TMEM200A i olika cancerformer. (A) Promotormetyleringsnivåer av TMEM200A undersöktes i flera cancertyper, enligt SMART-databasen. (B) Högre promotormetyleringsnivåer av TMEM200A i olika cancertyper än i normal vävnad undersöktes i enlighet med UALCAN-databasen. (C) Med hjälp av UALCAN-databasen fastställdes att normala vävnader hade lägre promotormetyleringsnivåer av TMEM200A i flera cancertyper. (D) DNA-metyleringsnivån för TMEM200A i BLCA, HNSC, LUAD och STAD förändrades med det patologiska stadiet. Förkortningar: BLCA = Urinblåsecancer HNSC= Skivepitelcancer i huvud och hals; LUAD = Lungadenokarcinom; STAD= Magsäckscancer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: TMEM200A genmutationer i olika cancerformer. (A) Analys av TMEM200A genmutationstyper i olika cancerformer med hjälp av databasen cBioPortal. (B) 3D-proteinstruktur av TMEM200A. Bindningsområdet indikeras av den färgade delen, medan de andra delarna av TMEM200A visas av den grå delen. (C) Isoformer och fördelning av TMEM200A somatiska mutationer. X-axeln, aminosyraplatser; y-axel, antal TMEM200A mutationer; gröna prickar, missensmutationer; och grå prickar, stympade mutationer. (D) Validering av isoformer och fördelning av TMEM200A somatiska mutationer med hjälp av data i Sangerbox 3.0. (E) För alla TCGA-tumörer undersöktes korrelationen mellan mutationsstatus och patienternas totala överlevnadsförutsägelse med hjälp av cBioPortal-databasen, där röda fyrkanter indikerar den TMEM200A mutationsgruppen och blå rutor indikerar den omuterade gruppen. (F) Gener sammuterade med TMEM200A analyserades med hjälp av cBioPortal-verktyget: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 och SLC18B1. (G) Analys av TMEM200A mutationstyper i GC med hjälp av COSMIC-databasen. (H) En analys av TMEM200A SNV-typerna i GC genomfördes med hjälp av COSMIC-databasen. Förkortningar: TCGA = The Cancer Genome Atlas; OS = Total överlevnad; COSMIC = katalog över somatiska mutationer i cancerceller; GC = Magsäckscancer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Encellskorrelationsanalys av TMEM200A uttryck i olika cancerformer. (A) Sammanfattning av uttrycket av TMEM200A på TISCH:s webbplats. (B) Fördelning av åtta distinkta celltyper i det metastaserande kutana melanomet GSE72056 dataset. (C) Uttrycksnivåer av TMEM200A i kutana metastaserande melanomceller från GSE72056-datasetet. (D) Fördelning av 13 distinkta celltyper i kolorektalcancerdatasetet från GSE146771. (E) TMEM200A uttrycksnivåer i kolorektala cancerceller från GSE146771-datasetet. (F) Korrelation mellan TMEM200A uttryck och encellsfunktionell status i multipla tumörer visades med hjälp av CancerSEA-databasen. (G) T-SNE-kartor som illustrerar nivåerna av TMEM200A uttryck i enskilda tumörceller, inklusive GBM, LUAD, CML, CRC, RB och UM. Förkortningar: GBM = glioblastom; LUAD = Lungadenokarcinom; KML = Kronisk granulocytär leukemi; CRC = Tjock- och ändtarmscancer; RB = Retinoblastom; UM = Uvealt melanom. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Samuttrycksnätverk och funktionell berikningsanalys av TMEM200A på gennivå. (A) GGI-nätverk av TMEM200A och dess samuttryckta gener. (B) PPI-nätverk. (C,D) TMEM200A och de samuttryckta generna analyserades för berikning av GO- och KEGG-vägar. Förkortningar: PPI = Protein-protein interaction; GGI = Interaktion mellan gener och gener; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GO = Gene Ontology. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Korrelation mellan uttrycket av TMEM200A och immunceller, immunsuppressiva medel, immunstimulerande substanser och MHC-molekyler i olika cancertyper. (A) Sangerbox 3.0 värmekarta som visar korrelationen mellan TMEM200A uttryck och immuninfiltrerande celler. (B) Värmekarta som visar korrelationen mellan immuninfiltrerande celler och TMEM200A uttryck i TISIDB-databasen. C) Värmekarta som visar korrelationen mellan immunsuppressiva celler och TMEM200A uttryck i TISIDB-databasen. (D-F) Korrelation mellan TMEM200A uttryck och vissa immunsuppressiva medel vid testikelcancer och uvealt melanom. G) Värmekarta som visar korrelationen mellan immunstimulerande faktorer och TMEM200A uttryck i TISIDB-databasen. (H) Värmekarta över korrelationen mellan TMEM200A uttryck och MHC-molekyler i TISIDB-databasen. (I-L) Korrelation mellan TMEM200A uttryck och vissa immunstimulerande faktorer och MHC-molekyler i urinblåsans urotelcancer, testikelcancer, binjurebarkscancer och uvealt melanom. (M) Korrelation mellan pancancerimmuna undergrupper och TMEM200A uttryck. (N) Korrelation mellan pan-cancer molekylära undergrupper och TMEM200A uttryck. Förkortningar: MHC = Major histocompatibility complex. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Analys av immunoterapeutiskt svar av TMEM200A vid pancytopeni. (A) Korrelation av TMEM200A uttryck i olika cancerformer med TMB. (B) Korrelation mellan MSI vid pancancer och TMEM200A uttryck. (C) TMEM200A potential som en biomarkör för att förutsäga immuncheckpoint-blockadsvar. (D) Viktat medelvärde av TMEM200A:s korrelation med ICB-överlevnadsresultat och logaritmisk veckförändring (logFC) i CRISPR-screening användes för att rangordna det. Förkortningar: TMB = Tumor mutational burden; ICB = Immun Checkpoint Blockad; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: GSEA-anrikningsanalys av TMEM200A i olika cancerformer. De fem viktigaste signalvägarna där TMEM200A spelade en viktig funktionell roll i regleringen av 32 cancerformer identifierades genom GSEA-anrikningsanalys. Den vänstra panelen visar resultaten av GSEA-anrikningsanalys för TMEM200A i ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ och SARC. Den högra panelen visar resultaten av GSEA-anrikningsanalys för TMEM200A i SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS och UVM. Förkortningar: GSEA =Gene Set Enrichment Analysis; ACC = Binjurebarkscancer; BLCA = Urinblåseurotelkarcinom; BRCA = Bröstinvasivt karcinom; CESC = Cervikal skivepitelcancer och endocervikalt adenokarcinom; CHOL = kolangiokarcinom; COAD = Tjocktarmsadenokarcinom; ESCA = Esofaguscancer; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = Skivepitelcancer i huvud och hals; KICH = Njurkromofob; KIRC = Njurnjurcancer med klara celler; KIRP = Papillärcellscancer i njurarna; LAML = Akut myeloisk leukemi; LGG = Hjärngliom; LIHC = leverleverlevercancer; LUAD = Lungadenokarcinom; LUSC = Lungskivepitelcancer; MESO = Mesoteliom; OV = Ovariellt seröst cystadenokarcinom; PAAD = Adenokarcinom i bukspottkörteln; PCPG = Feokromocytom och paragangliom; PRAD = Prostataadenokarcinom; LÄS Rektum adenokarcinom; SAR = Sarkom; SKCM = hudmelanom; STAD = Magsäckscancer; TGCT = testikeltumörer; THCA = Sköldkörtelcancer; THYM = Thymom; UCEC = livmoderkroppscancer i livmoderkroppen; UCS = Livmoderkarcinosarkom; UVM = Uvealt melanom. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 11
Figur 11: TMEM200A i STAD. (A) De 50 vanligaste generna som hittats med negativ korrelation med TMEM200A uttryck i STAD av LinkedOmics-databasen. (B) Topp 50 gener i STAD som var positivt kopplade till TMEM200A. (C) TMEM200A är topp fem positivt och fem negativt korrelerade gener i STAD. (D) Värmekarta över DEG i STAD. (E-H) Undersökning av berikade GO- och KEGG-vägar med hjälp av screenade DEG:er. Förkortningar: STAD=Magsäckscancer; DEGs= differentiellt uttryck av gener, KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GO = Gene Ontology. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 12
Figur 12: Korrelation mellan de kliniska tecknen på STAD och TMEM200A uttrycksnivå. (A) Analys av TMEM200A uttrycksnivåer och STAD-kliniska egenskaper med hjälp av logistisk regression. (B,C) Cox-analys av STAD-skogsytor för enstaka och multipla variabler. (D) Stapeldiagram som förutsäger totalöverlevnad hos patienter med STAD baserat på kön, patologisk grad, ålder, patologiskt stadium och TMEM200A uttryck. (E) Kalibreringsdiagram som visar kalibreringen av stapeldiagrammodellen. Förkortningar: STAD= Magsäckscancer; OS=Total överlevnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 13
Figur 13: TMEM200A uttrycket är uppreglerat i STAD och främjar proliferation av magcancerceller. (A) Påvisande av TMEM200A uttryck i magcancercellerna HGC-27 och magslemhinneepitelcellerna GES-1 genom western blotting. B) Påvisande av TMEM200A uttryck i GC-cellerna HGC-27 och SGC-7901 och magslemhinneepitelceller GES-1 med qRT-PCR. (C) Uttryckseffektiviteten för TMEM200A var kraftigt reducerad i gruppen med TMEM200A knockdown jämfört med gruppen med icke-knockdown i GC-cellerna HGC-27, vilket demonstrerades med qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown hämmade signifikant proliferationen av GC-celler mätt med CCK8-analys. (E) Knockdownen av TMEM200A signifikant hämmat de besläktade proteinerna i EMT och påverkat fosforyleringen av AKT i PI3K/AKT-signalvägen. Förkortning: GC = Magcancer; qRT-PCR: Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; EMT = Epitel-mesenkymal övergång; AKT=Proteinkinas B. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TMEM200A tillhör en familj av TMEM som är avgörande för att cancerceller ska kunna föröka sig38. Det varierande uttrycket av TMEM200A i olika maligniteter har fått mindre uppmärksamhet, och en grundlig pancancerutredning saknas. Bevisen fortsätter dock att ackumuleras som visar att TMEM-transmembranproteinfamiljen kan vara viktig för att hålla cancerceller maligna genom interaktioner med flera proteiner, till exempel främjar aktivering av TMEM16A Ca2+-aktiverade Cl-kanaler av ROCK1/moesin BRCA-metastasering39. I det aktuella arbetet fokuserade våra analyser därför på att undersöka genomförbarheten av TMEM200A som ett terapeutiskt cancermål och tumördiagnostisk markör. I synnerhet undersökte vi uttrycksnivåerna av TMEM200A i 33 maligna tumörer med hjälp av RNA-seq-data från UCSC Xena-databasen, och resultaten från TIMER2.0-databasen validerade framgångsrikt analyserna i UCSC Xena-databasen.

Därefter användes webbverktyget Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) och CancerSEA-databasen för att analysera uttrycksnivåerna av TMEM200A i olika typer av monocyter. Webbplatserna Sangerbox och TISIDB användes för att förstå hur TMEM200A påverkar immuninfiltrationen. Vi identifierade också de signalvägar där TMEM200A spelar en nyckelfunktion i varje cancer genom GSEA-anrikningsanalys för att förstå de viktigaste funktionella rollerna för TMEM200A i varje malignitet.

TMEM200A kan fungera som en vidhäftningsmolekyl för att kontrollera immunmiljön vid GC och främja invasiv spridning av GC-celler. Därför identifierade vi 483 differentiellt uttryckta gener (DEG) associerade med uttrycksnivån av TMEM200A genom TCGA-databasen och analyserade GO- och KEGG-anrikningen av dessa 483 DEG. Anrikningsresultaten visade att PI3K/AKT-signalvägen spelar en nyckelroll i cancerutvecklingen, och PI3K/AKT-signalvägen kan vara en av de drivande faktorerna för cancer.

Vidare utförde vi cellulära och molekylära tester efter att ha lärt oss mer om den avgörande funktionen av TMEM200A för att driva cancerutveckling för att bekräfta sambandet mellan TMEM200A uttryck och STAD-cellaktivitet. Som väntat upptäckte vi att nedreglering av TMEM200A i STAD-celler kraftigt minskade cellproliferationen, och att cancercellinjer uttryckte TMEM200A vid betydligt högre nivåer än normala cellinjer. Genom att finkamma litteraturen relaterad till den transmembrana proteinfamiljen under de senaste åren fann vi att transmembranproteiner, som celladhesionsmolekyler37, har en reglerande roll i EMT.

Vidare, enligt resultaten av anrikningsanalysen av TMEM200A-relaterade gener i GC, fann vi att TMEM200A kan ha en reglerande roll i PI3K/AKT-signalvägen i GC. Western blotting-experiment avslöjade att TMEM200A knockdown kunde minska Vimentin-, N-cadherin- och Snai-proteiner och hämma AKT-fosforylering, vilket tyder på att TMEM200A reglerar tumörens mikromiljö genom att påverka EMT, och att PI3K/AKT-signalvägen kan vara involverad i TMEM200A-medierad reglering av GC-utveckling. Under de senaste åren har vissa studier visat att EMT är den främsta orsaken till läkemedelsresistens vid kemoterapi hos GC-patienter. Epitel-mesenkymal plasticitet (EMP) och tumörmikromiljö har beskrivits som begränsande faktorer för effektiv behandling vid många cancertyper40. Förekomsten av EMT kan göra att GC-celler förlorar sina karakteristiska egenskaper och visa egenskaperna hos mesenkymala celler41. Denna funktion minskar inte bara GC-patienters känslighet för kemoterapeutiska läkemedel utan förbättrar också GC-cellernas invasiva och migrerande förmåga, vilket leder till tumörmetastaser. Därför, av de skäl som nämns ovan, hjälper vår studie forskningen och utvecklingen av viktiga regulatoriska punkter inom EMT och utvecklingen av nya riktade terapeutiska metoder, genom att utforska den specifika verkningsmekanismen för TMEM200A som påverkar EMT.

Användningen av bioinformatik för forskning har ökat de senaste åren, och för denna studie fick vi tillgång till data från flera internetdatabaser. Användningen av dessa onlinedatabaser inom bioinformatik har effektiviserat och påskyndat cancerstudierna, och de ger också forskare ett prisvärt sätt att validera sina resultat.

Bioinformatiktekniken har dock vissa nackdelar. När vi använder dessa databaser för analys kan samma studie ge inkonsekventa eller till och med motstridiga resultat i flera databaser eftersom många onlinedatabaser innehåller data från flera datamängder. Dessutom uppdateras många databaser inte på mycket lång tid, och på grund av upphovsrättsliga svårigheter kan deras innehåll aldrig utökas. Därför är de analytiska resultat som forskare får från dessa databaser alltid begränsade. Därför använde vi i denna forskning olika databaser för att undersöka resultaten kollektivt för att övervinna dessa begränsningar och säkerställa att resultaten är korrekta. För att vara säkra på att de resultat vi fick inte ändrades nämnvärt upprepade vi proceduren när vi använde olika databaser för analys. Resultaten av western blot-experiment stödde vår bioinformatiska förutsägelse att TMEM200A kan kontrollera EMT i GC genom att reglera PI3K/AKT-signalvägen, vilket sedan skulle påverka spridningen av GC-celler. Vi förutspådde verkningsmekanismen för TMEM200A med hjälp av bioinformatik i samband med relaterad litteratur.

Sammanfattningsvis visar detta arbete hur bioinformatiska verktyg avsevärt kan underlätta experimentell design och användas för att göra många andra typer av vetenskapliga forskningsförutsägelser. Framtida cancerforskare kommer sannolikt att anamma det primära paradigmet att kombinera experimentell validering med bioinformatisk förutsägelse, och detta arbete fungerar som en bra modell för detta mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82160550).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Tags

TMEM200A Multiomics-analys Pan-cancer biomarkör transmembranprotein immuninfiltration RNA-seq-data diagnostisk biomarkör prognostisk biomarkör magcancer (GC) in vitro cellkulturer knockdown kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qPCR) Western blotting malignt beteende tumörbildning epitel-mesenkymal övergång (EMT) PI3K/AKT-signalväg proliferationshämning
Multiomics-analys av <em>TMEM200A</em> som en pan-cancerbiomarkör
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter