Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale
Summary
Qui viene presentato un protocollo in cui vengono combinati più strumenti bioinformatici per studiare le funzioni biologiche dei TMEM200A nel cancro. Inoltre, validiamo sperimentalmente le previsioni bioinformatiche.
Abstract
La proteina transmembrana, TMEM200A, è nota per essere associata ai tumori umani e all’infiltrazione immunitaria. Qui, abbiamo valutato la funzione di TMEM200A nei tumori comuni mediante analisi multiomica e abbiamo utilizzato colture cellulari in vitro di cellule gastriche per verificare i risultati. L’espressione di TMEM200A in diversi tipi di cancro umano è stata valutata utilizzando i dati RNA-seq del database Xena dell’UCSC. L’analisi bioinformatica ha rivelato un potenziale ruolo della TMEM200A come biomarcatore diagnostico e prognostico.
Sono state coltivate colture di normali linee cellulari gastriche e tumorali e TMEM200A è stato abbattuto. I livelli di espressione di TMEM200A sono stati misurati utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale e il western blotting. Sono stati quindi utilizzati studi in vitro sulla perdita di funzione per determinare il ruolo delle TMEM200A nel comportamento maligno e nella formazione tumorale delle cellule tumorali gastriche (GC). I Western blot sono stati utilizzati per valutare l’effetto del knockdown sulla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e sulla via di segnalazione PI3K/AKT nella GC. L’analisi bioinformatica ha mostrato che TMEM200A era espresso ad alti livelli nella GC.
La proliferazione delle cellule GC è stata inibita dal knockdown TMEM200A, che ha anche diminuito la vimentina, la N-caderina e le proteine Snai e ha inibito la fosforilazione di AKT. La via di segnalazione PI3K/AKT sembra anche essere coinvolta nella regolazione mediata da TMEM200A dello sviluppo dei GC. I risultati qui presentati suggeriscono che TMEM200A regola il microambiente tumorale influenzando l’EMT. TMEM200A può anche influenzare l’EMT attraverso la segnalazione PI3K/AKT, influenzando così il microambiente tumorale. Pertanto, nei pan-tumori, in particolare nei GC, TMEM200A può essere un potenziale biomarcatore e oncogene.
Introduction
Il cancro è emerso come un problema persistente di salute pubblica che mette in pericolo la salute umana a livello globale1a causa dei suoi elevati tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo, ponendo un pesante onere finanziario e medico alla società2. Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nella terapia del cancro grazie alla scoperta dei marcatori tumorali3 e i ricercatori hanno sviluppato nuovi metodi diagnostici e nuovi farmaci per il trattamento del cancro. Tuttavia, alcuni pazienti con cancro hanno ancora prognosi sfavorevoli a causa di fattori come la resistenza ai farmaci, gli effetti collaterali dei farmaci e la sensibilità chimica4. Pertanto, vi è un urgente bisogno di identificare nuovi biomarcatori per lo screening e il trattamento dei tumori in fase iniziale5.
Le proteine di membrana sono proteine che possono legarsi e integrarsi nelle cellule e nelle membrane degli organelli6. Queste possono essere raggruppate in tre categorie a seconda della forza di legame alla membrana e della loro posizione: proteine ancorate ai lipidi, proteine integrali e proteine di membrana periferica 7,8. Una proteina transmembrana (TMEM) è una proteina di membrana integrale costituita da almeno un segmentotransmembrana 9, che passa completamente o parzialmente attraverso la membrana biologica.
Sebbene i meccanismi d’azione delle proteine appartenenti alla famiglia TMEM non siano ben compresi, è noto che queste proteine sono coinvolte in diversi tipi di tumori10. Diverse proteine TMEM sono associate a fenotipi migratori, proliferativi e invasivi e la loro espressione è spesso associata alla prognosi di un paziente11. Pertanto, i membri della famiglia TMEM sono diventati l’obiettivo della ricerca. Una revisione completa dei rapporti esistenti su TMEM ha rivelato che sono per lo più associati alla segnalazione inter- e intracellulare12, alle malattie immuno-correlate e alla tumorigenesi10. Molti TMEM possiedono anche importanti funzioni fisiologiche, ad esempio i canali ionici nella membrana plasmatica, l’attivazione delle vie di trasduzione del segnale, nonché la mediazione della chemiotassi cellulare, l’adesione, l’apoptosi e l’autofagia10. Pertanto, abbiamo ipotizzato che le proteine TMEM possano essere importanti marcatori prognostici nell’individuazione e nel trattamento dei tumori.
TMEM200A’espressione è significativamente elevata nel carcinoma gastrico (GC). Una maggiore espressione di TMEM200A13, che ha otto esoni e una lunghezza completa di 77,536 kb sul cromosoma 6q23.1, è stata collegata a una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza globale (OS) nei casi di GC. Tuttavia, i cambiamenti nella sua espressione sono stati raramente riportati negli studi oncologici. Questo articolo confronta e analizza l’utilità della TMEM200A come bersaglio terapeutico e marcatore diagnostico del tumore in vari studi sul cancro utilizzando diversi set di dati disponibili pubblicamente. È stata valutata l’efficacia di TMEM200A come biomarcatore diagnostico e prognostico pan-cancro, nonché i suoi livelli di espressione in vari tipi di cancro umano utilizzando i dati RNA-seq dei database UCSC Xena e TCGA, nonché mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e western blotting.
L’effetto dei livelli di espressione TMEM200A sui tassi di mutazione, sui processi regolatori, sulla diagnosi e sulla prognosi del tumore, sull’infiltrazione immunitaria e sull’immunoterapia è stato ulteriormente studiato utilizzando un mix di strumenti computazionali e siti Web di set di dati. CBioPortal e i database COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) sono stati utilizzati per esaminare le mutazioni in TMEM200A. I siti web Sangerbox e TISIDB sono stati utilizzati per capire come TMEM200A influenza l’infiltrazione immunitaria. Lo strumento online del Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e il database CancerSEA sono stati utilizzati per studiare la funzione di TMEM200A. Infine, per valutare l’impatto della TMEM200A sul comportamento maligno e sulla funzione di sviluppo tumorale delle cellule GC, è stato condotto un esperimento di perdita di funzione in un test in vitro . Inoltre, è stato eseguito il western blotting per valutare in che modo TMEM200A knockdown ha influenzato la via di segnalazione PI3K/AKT e la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nella GC.
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A appartiene a una famiglia di TMEM che è essenziale per la proliferazione delle cellule tumorali38. L’espressione variabile di TMEM200A in diverse neoplasie maligne ha ricevuto meno attenzione e manca un’indagine approfondita sul pan-cancro. Tuttavia, le prove continuano ad accumularsi, dimostrando che la famiglia di proteine transmembrana TMEM può essere importante nel mantenere le cellule tumorali maligne attraverso interazioni con diverse proteine, ad esempio, l’atti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82160550).
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
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