Multiomics-analyse van TMEM200A als een pan-kanker biomarker

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd waarin meerdere bio-informaticatools worden gecombineerd om de biologische functies van TMEM200A bij kanker te bestuderen. Daarnaast valideren we ook experimenteel de bioinformatica voorspellingen.

Abstract

Van het transmembraaneiwit, TMEM200A, is bekend dat het in verband wordt gebracht met menselijke kankers en immuuninfiltratie. Hier beoordeelden we de functie van TMEM200A bij veel voorkomende kankers door middel van multiomics-analyse en gebruikten we in vitro celculturen van maagcellen om de resultaten te verifiëren. De expressie van TMEM200A in verschillende soorten kanker bij de mens werd beoordeeld met behulp van de RNA-seq-gegevens uit de UCSC Xena-database. Bio-informatica-analyse onthulde een mogelijke rol van TMEM200A als diagnostische en prognostische biomarker.

Culturen van normale maag- en kankercellijnen werden gekweekt en TMEM200A werd neergehaald. De expressieniveaus van TMEM200A werden gemeten met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie en western blotting. In vitro onderzoeken naar functieverlies werden vervolgens gebruikt om de rol van TMEM200A in het kwaadaardige gedrag en de tumorvorming van maagkankercellen (GC) te bepalen. Westerse blots werden gebruikt om het effect van de knockdown op de epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) en de PI3K/AKT-signaleringsroute in GC te beoordelen. Bio-informatica-analyse toonde aan dat TMEM200A op hoge niveaus in GC tot expressie kwam.

De proliferatie van GC-cellen werd geremd door TMEM200A knockdown, die ook vimentine-, N-cadherine- en Snai-eiwitten verminderde en AKT-fosforylering remde. De PI3K/AKT-signaleringsroute bleek ook betrokken te zijn bij TMEM200A-gemedieerde regulatie van GC-ontwikkeling. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat TMEM200A de micro-omgeving van de tumor reguleert door de EMT te beïnvloeden. TMEM200A kan ook EMT beïnvloeden via PI3K/AKT-signalering, waardoor de micro-omgeving van de tumor wordt beïnvloed. Daarom kan TMEM200A bij pan-kankers, met name GC, een potentiële biomarker en oncogen zijn.

Introduction

Kanker is naar voren gekomen als een hardnekkig probleem voor de volksgezondheid dat wereldwijd de menselijke gezondheid in gevaar brengt¹vanwege de hoge morbiditeits- en sterftecijfers wereldwijd, wat een zware financiële en medische last vormt voor de samenleving². Er is de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van kankertherapie dankzij de ontdekking van kankermarkers³, en onderzoekers hebben nieuwe diagnostische methoden en nieuwe medicijnen ontwikkeld om kanker te behandelen. Sommige patiënten met kanker hebben echter nog steeds slechte prognoses vanwege factoren zoals medicatieresistentie, bijwerkingen van medicijnen en chemische gevoeligheid⁴. Daarom is er dringend behoefte aan het identificeren van nieuwe biomarkers voor het screenen en behandelen van kanker in een vroeg^stadium5.

Membraaneiwitten zijn eiwitten die kunnen binden en integreren in cellen en organelmembranen⁶. Deze kunnen worden gegroepeerd in drie categorieën, afhankelijk van de sterkte van de binding aan het membraan en hun locatie: lipide-verankerde eiwitten, integrale eiwitten en perifere membraaneiwitten ^7,8. Een transmembraan (TMEM) eiwit is een integraal membraaneiwit dat bestaat uit ten minste één transmembraansegment⁹, dat geheel of gedeeltelijk door het biologische membraan gaat.

Hoewel de werkingsmechanismen van eiwitten die tot de TMEM-familie behoren niet goed worden begrepen, is bekend dat deze eiwitten betrokken zijn bij verschillende soorten^kanker10. Verschillende TMEM-eiwitten worden geassocieerd met migrerende, proliferatieve en invasieve fenotypes, en hun expressie wordt vaak geassocieerd met de prognose van een patiënt¹¹. Daarom zijn TMEM-familieleden het doelwit van onderzoek geworden. Een uitgebreid overzicht van bestaande rapporten over TMEM onthulde dat ze meestal geassocieerd zijn met inter- en intracellulaire signalering¹², immuungerelateerde ziekten en tumorigenese¹⁰. Veel TMEM's bezitten ook belangrijke fysiologische functies, bijvoorbeeld ionkanalen in het plasmamembraan, activering van signaaltransductieroutes, evenals de bemiddeling van celchemotaxis, adhesie, apoptose en autofagie¹⁰. Daarom veronderstelden we dat TMEM-eiwitten belangrijke prognostische markers kunnen zijn bij de detectie en behandeling van tumoren.

TMEM200A expressie is significant verhoogd bij maagkanker (GC). Een hogere expressie van TMEM200A¹³, dat acht exonen heeft en een volledige lengte van 77,536 kb op chromosoom 6q23.1, is in verband gebracht met een slechte prognose voor algehele overleving (OS) in gevallen van GC. Toch zijn de veranderingen in de expressie ervan zelden gemeld in oncologische studies. Dit artikel vergelijkt en analyseert het nut van TMEM200A als therapeutisch doelwit en tumordiagnostische marker in verschillende kankeronderzoeken met behulp van verschillende openbaar beschikbare datasets. We beoordeelden de effectiviteit van TMEM200A als een diagnostische en prognostische biomarker voor pankanker, evenals de expressieniveaus ervan bij verschillende soorten kanker bij de mens met behulp van RNA-seq-gegevens uit de UCSC Xena- en TCGA-databases, evenals door real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qRT-PCR) en western blotting.

Het effect van TMEM200A expressieniveaus op mutatiesnelheden, regulerende processen, tumordiagnose en -prognose, immuuninfiltratie en immunotherapie werd verder onderzocht met behulp van een mix van computationele tools en datasetwebsites. CBioPortal en de Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC)-databases werden gebruikt om mutaties in TMEM200A te onderzoeken. De websites van Sangerbox en TISIDB werden gebruikt om te begrijpen hoe TMEM200A de immuuninfiltratie beïnvloedt. De online tool Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) en de CancerSEA-database werden gebruikt om de functie van TMEM200A te onderzoeken. Ten slotte, om de impact van TMEM200A op het kwaadaardige gedrag en de tumorontwikkelingsfunctie van GC-cellen te beoordelen, werd een experiment met functieverlies uitgevoerd in een in vitro test. Daarnaast werd western blotting uitgevoerd om te beoordelen hoe TMEM200A knockdown de PI3K/AKT-signaleringsroute en de epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) in GC beïnvloedde.

Protocol

1. De databank van de Cancer Genome Atlas (TCGA)

OPMERKING: De Cancer Genome Atlas (TCGA) -database bevat de sequentiegegevens van genen in verschillende tumorweefsels¹⁴. RNA-seq-gegevens in TCGA voor de studie van TMEM200A transcripten per deel per miljoen (TPM)-formaten werden geëxtraheerd uit de UCSC Xena-website ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) en log2 getransformeerd voor het vergelijken van de expressies tussen monsters.

1. Ga naar de interface van de UCSC Xena-website .
2. Klik op het tabblad Xena starten .
3. Klik op het tabblad DATASETS bovenaan het scherm.
4. Klik uit de 129 cohorten en 1,571 datasets op deze pagina op het tabblad voor in totaal 33 kankers zoals GDC TCGA acute myeloïde leukemie (LAML), GDC TCGA Adrenocorticale kanker (ACC), GDC TCGA Galwegkanker (CHOL) en meer.
5. Selecteer en klik in het menu Genexpressie RNAseq op het tabblad HTSeq - FPKM GDC Hub .
   OPMERKING: HTSeq - FPKM GDC Hub vertegenwoordigt gegevens die met toestemming zijn gecorrigeerd.
6. Klik in het downloadmenu op de bijbehorende link.
   OPMERKING: Met de bovenstaande methode werden RNA-Seq-gegevens gedownload voor 33 verschillende soorten kanker.
7. Pak het zip-archief met RNA-seq-gegevens voor 33 verschillende soorten kanker uit in één bestand in de bureaubladmap van de computer.
8. Verenig de uitgepakte txt-bestanden in dezelfde map en plaats de Perl-scripts in deze map.
9. Open de Perl-software , kopieer en plak het pad van de map in de Perl-software waar de muiscursor zich bevindt, druk op de Enter-toets , voer de naam van de Perl-code en de naam van het gen (TMEM200A) in en druk vervolgens op de Enter-toets om een nieuw txt-bestand(singleGeneExp.txt) te krijgen.
   OPMERKING: Dit nieuwe txt-bestand (singleGeneExp.txt) bevat genexpressie van TMEM200A bij 33 kankers bij verschillende patiënten.
10. Open de R-code (diffR) en kopieer en plak het pad waar het singleGeneExp.txt-bestand zich bevindt naar de regel waar setwd zich in de R-code bevindt.
11. Open de R-software, voer de gewijzigde R-code (diffR) uit en teken de afbeelding door het "ggpubr"-pakket.

2. De TIMER2.0 database

1. Ga naar de TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) database ¹⁶ website-interface.
2. Klik op het tabblad Kankeronderzoek.
3. Typ de gen-ID (TMEM200A) in het zoekvak en klik op het tabblad Verzenden om de differentiële expressiebeelden van TMEM200A in verschillende soorten tumoren te krijgen.

3. Menselijke eiwitatlas (HPA)

1. Ga naar de Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷webinterface.
2. Typ ID (TMEM200A) in het zoekvak en klik op de knop Zoeken . Selecteer TISSUE sub-atlas.
3. Beweeg de muisaanwijzer over de pagina en scrol omlaag om het tabblad Overzicht eiwitexpressie te vinden.
   OPMERKING: Het gedeelte Eiwitexpressieoverzicht toont de eiwitexpressieniveaus van TMEM200A in 45 organen in het menselijk lichaam.

4. De HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-methylatieplatformarray

OPMERKING: De HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-methylatieplatformarray werd gebruikt om gegevens over methylering te verzamelen. We zouden de TMEM200A DNA-methylatieniveaus kunnen beoordelen met behulp van de SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) database¹⁸.

1. Ga naar de interface van de SMART-website .
2. Voer de gen-ID (TMEM200A) in het zoekvak in om de verdeling van TMEM200A in chromosomen en het methylatieniveau van TMEM200A in verschillende soorten maligniteiten te verkrijgen.
3. Scroll naar beneden op de pagina naar het menu Klik om CpG-geaggregeerde methylering te controleren en klik op de knop Plot . Zoek en klik onderaan de pagina op de knop Figuur downloaden . Download de figuur.

5. De UALCAN-databank

1. Ga naar de interface van de UALCAN-website .
   OPMERKING: Boxplots van de methyleringsniveaus van de TMEM200A promotor bij verschillende maligniteiten werden gegenereerd via de UALCAN-database (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹
2. Klik bovenaan de pagina op de TCGA-knop .
3. Typ TMEM200A in het invoervak Gene ID op het scherm. Scroll in het TCGA-datasetmenu naar beneden en selecteer het type kanker dat moet worden opgevraagd.
4. Nadat u op de knop Verkennen hebt geklikt, klikt u op de subgroepanalyse Methylering in het menu Links voor analyse om de methylatieresultaten van deze tumor te krijgen.
   OPMERKING: Met deze methode hebben we methylatieresultaten verkregen voor 22 tumoren in de UALCAN-database .

6. De database van de catalogus van somatische mutaties in kankercellen (COSMIC)

1. Ga naar de website-interface van de Catalogus van Somatische Mutaties in Kankercellen (COSMIC ).
   OPMERKING: Gegevens over coderende mutaties, niet-coderende mutante genomische herschikkingen en fusiegenen in het menselijk genoom zijn beschikbaar in de Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) database²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), die ook wordt gebruikt om de frequentie van verschillende TMEM200A mutaties in verschillende kankers te bepalen.
2. Typ de gen-ID (TMEM200A) in het zoekvak en klik op de knop ZOEKEN om naar een nieuw scherm te gaan.
3. Zoek en klik in het menu Genen op de link waar de gen-ID-naam van de TMEM200A verschijnt.
4. Zoek de kolom Mutatiedistributgroepering op de nieuwe pagina om de mutatiestatus van TMEM200A in de tumor te krijgen.

7. CBio-portaal

1. Ga naar de interface van de CBioPortal-website .
   OPMERKING: Kankergenomics-gegevens kunnen worden gevonden, gedownload, geanalyseerd en gevisualiseerd met behulp van de cBioPortal (www.cioportal.org)-database. Somatische mutaties, veranderingen in het aantal DNA-kopieën (CNA's), expressie van mRNA en microRNA (miRNA), DNA-methylering, eiwitovervloed en fosforeiwitovervloed zijn slechts enkele van de genomische gegevenstypen die door cBioPortal²¹ worden geïntegreerd. Met cBioPortal kan een breed scala aan onderzoeken worden uitgevoerd; De nadruk ligt echter op verschillende analyses met betrekking tot mutaties en hun visualisatie.
2. Selecteer de Pan-kankeranalyse van het hele genoom , dataset in de subsectie PanCancer Studies van de sectie Select Studies for Visualization & Analysis . Klik vervolgens op de knop Query op gen .
3. Voer de doelgen-ID (TMEM200A) in het zoekvak van Genen invoeren in. Klik op de knop Query verzenden .
4. Klik op de knop Kankertype gedetailleerd bovenaan de pagina om de mutaties van TMEM200A in verschillende soorten kanker te krijgen.

8. Sangerbox 3.0-gereedschap

1. Ga naar de Sangerbox 3.0 tool interface.
   OPMERKING: De correlatie van TMEM200A expressie met immuuninfiltrerende cellen, immunosuppressiva, immunostimulerende factoren en MHC-moleculen (belangrijk histocompatibiliteitscomplex) in alle kankers werd geanalyseerd door CIBERSORT-immuuninfiltratie met behulp van de pan-kanker immuuninfiltratiegegevens in Sangerbox 3.0 tool²² (http://vip.sangerbox.com/).
2. Selecteer en klik in de werkbalk aan de linkerkant van de pagina op het tabblad Immunocellulaire analyse (CIBERSORT) in het menu Pan-kankeranalyse .
3. Voer de doelgen-ID (TMEM200A) in het zoekvak van Genen invoeren in. Klik op de knop Verzenden .

9. TISIDB-databank

1. Ga naar de interface van de TISIDB-website .
   OPMERKING: De TISIDB-database²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/) werd gebruikt om de correlatie van TMEM200A expressie met immuuninfiltrerende cellen, immunosuppressiva, immunostimulerende factoren en MHC-moleculen bij verschillende kankers te onderzoeken.
2. Voer het doelgensymbool (TMEM200A) in het zoekvak van Genen invoeren in. Klik op de knop Verzenden .
3. Klik op de secties Lymfocyten, Immunomodulatoren, Chemokines en Subtype bovenaan de pagina. Download de relevante afbeeldingen onderaan de pagina.

10. De TIDE-databank

1. Ga naar de interface van de TIDE-website .
   OPMERKING: De TIDE-database (http://tide.dfci.harvard.edu/) werd gebruikt om het potentieel van TMEM200A te evalueren als biomarker voor het voorspellen van de respons op obstructietherapie met een tumor-immuuncontrolepuntblokkade.
2. Voer het e-mailadres in op het beginscherm om het account te registreren en in te loggen.
3. Zoek de subsectie Biomarker Evaluatie bovenaan de pagina en klik erop.
4. Voer de doelgen-ID (TMEM200A) in het zoekvak voor Genen invoeren onder aan de pagina in. Klik vervolgens op de knop Verzenden .
5. Sleep de muis op de pagina om de pagina naar beneden te schuiven om de resultaten van de analyse te vinden.

11. De CancerSEA-databank

1. Ga naar de interface van de CancerSEA-website .
   OPMERKING: Met behulp van sequentiegegevens van één cel werden de relaties tussen TMEM200A expressie en de functionele toestand van verschillende tumorcellen onderzocht. Dit werd gedaan met behulp van de CancerSEA database²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
2. Zoek en klik bovenaan de pagina op het tabblad Zoeken .
3. Voer de doelgen-ID (TMEM200A) in het zoekvak van Genen invoeren in. Klik op de knop Verzenden .

12. De netwerktool van het tumor immuun eencellige centrum (TISCH)

1. Ga naar de website-interface van de tumor immune single-cell center (TISCH) netwerktool .
   OPMERKING: De correlatie tussen de expressieniveaus van TMEM200A en kankercellen werd ook aangetoond door gebruik te maken van de tumor immune single-cell center (TISCH) netwerktool²⁵.
2. Voer de doelgen-ID (TMEM200A) in het zoekvak van Genen invoeren in. Klik op de knop Verkennen .
3. Selecteer en klik in het menu Kankertype op deze pagina op de dataset Alle kankers . Scroll vervolgens naar beneden op de pagina en klik op de knop Zoeken .

13. GeneMANIA

1. Ga naar de interface van de GeneMANIA website.
   OPMERKING: De correlatie tussen TMEM200A en zijn functioneel relevante genen werd voorspeld met behulp van de integratiestrategie voor het gen-multiassociatienetwerk Website GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶ voor het construeren van gen-gen-interactie (GGI)- netwerken.
2. Voer in het zoekvak linksboven op de pagina de gen-ID (TMEM200A) in en klik op Zoekhulpmiddelen.
   OPMERKING: De GeneMANIA webtool werd gebruikt om 20 genen te vinden die geassocieerd zijn met TMEM200A.

14. Functionele verrijkingsanalyse

1. Sla de symbool-ID's van de te analyseren genen op voor verrijking in txt-bestandsformaat.
2. Open de R-code (symbolidR) en kopieer en plak het pad waar het bovenstaande txt-bestand zich bevindt naar de regel waar setwd zich in de R-code bevindt.
3. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (symbolidR) uit. Converteer de symbool-id's van deze genen naar entrezID's via de "org. Hs.eg.db" pakket. Download het id.txt bestand.
4. Open de R-code (GOR en KEGGR) en kopieer en plak het pad waar het id.txt-bestand zich bevindt naar de regel waar setwd zich bevindt in de R-code.
5. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (GOR en KEGGR) uit. Om dit protocol te volgen, analyseert u deze genen voor GO- en KEGG-verrijking door de pakketten "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" en "enrichplot" en plot de verrijkingsresultaten met behulp van het pakket "gglot2".

15. Analyse van de verschillen in genactiviteit

OPMERKING: TMEM200A score in elk kankermonster werd berekend met behulp van ssGSEA (single-sample gene set enrichment analysis)²⁷, en de differentiële analyse van TMEM200A genactiviteit in kankerachtige en gezonde weefsels werd uitgevoerd voor verschillende kankers.

1. Op basis van de RNA-seq-gegevens van 33 tumortypen die in stap 1.7 zijn gedownload, pakt u alle gedownloade bestanden uit en plaatst u ze in een uniforme map.
2. Plaats het merge.txt bestand in de bovenstaande map.
   OPMERKING: De gegevens in merge.txt bestand van BioWolf (www.biowolf.cn) bevatten genexpressie voor alle patiënten in alle tumoren in de database van The Cancer Genome Atlas (TCGA).
3. Open de R-code (ssGSEAR) en kopieer en plak het pad waar de bovenstaande map zich bevindt naar de regel waar setwd zich in de R-code bevindt.
4. Neem de regel waar geneName staat in de R-code (ssGSEAR) en voer de gen-ID (TMEM200A) in.
5. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (ssGSEAR) uit. Haal het scorebestand op voor genactiviteit: scores.txt.
   OPMERKING: Met het ssGSEA-algoritme construeren we eerst een genensetbestand op basis van de correlatiecoëfficiënten tussen genen volgens de gegevens in het merge.txt bestand en identificeren we de genen met een hogere correlatie met het doelgen (TMEM200A) uit het bestand. Vervolgens worden de genen met een hogere correlatie verenigd als de actieve genen van TMEM200A, en ten slotte krijgen we de score van actieve genen in elk monster.
6. Open de R-code (scoreDiffR) en kopieer en plak het pad waar het scores.txt-bestand zich bevindt naar de regel waar setwd zich bevindt in de R-code.
7. Open de R-software, voer de gewijzigde R-code (scoreDiffR) uit en teken de afbeelding door de pakketten "plyr", "reshape2" en "ggpubr".

16. Klinisch-pathologische correlatie en overlevingsprognose-analyse

1. Ga naar de interface van de UCSC Xena-website .
2. Klik op het tabblad Xena starten .
3. Klik op het tabblad DATASETS bovenaan het scherm.
4. Beweeg de muisaanwijzer over de pagina en scrol omlaag om het tabblad TCGA Pan-Cancer (PANCAN) te vinden.
5. Klik uit de 129 cohorten en 1.571 datasets op deze pagina op het tabblad TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
6. Selecteer en klik in het fenotypemenu op het tabblad Samengestelde klinische gegevens.
7. Klik in het downloadmenu op de bijbehorende link.
   OPMERKING: Download klinische gegevens voor 33 kankers uit de TCGA-database via de bovenstaande link.
8. Pak het gedownloade bestand met klinische gegevens uit en open het uitgepakte bestand in xls-bestandsindeling.
9. Organiseer en bewaar de benodigde klinische gegevens (stadium, leeftijd, pathologisch stadium en patiëntstatus) in het bestand, verwijder de resterende onnodige klinische gegevens en sla het hele bestand op als een bestand in txt-indeling nadat u het klinisch hebt hernoemd.
10. Op basis van de singleGeneExp.txt die in stap 1.9 zijn verkregen, plaatst u dit bestand in dezelfde map als het bestand met de georganiseerde clinical.txt .
11. Pak de gedownloade klinische gegevens uit en plaats de singleGeneExp.txt - en clinical.txt-bestanden in dezelfde map als de uitgepakte klinische bestanden.
12. Open de R-code (clinicalDiffR) en kopieer en plak het pad waar de bovenstaande map zich bevindt naar de regel waar setwd zich in de R-code bevindt.
13. Open de R-software, voer de gewijzigde R-code (clinicalDiffR) uit en teken de afbeelding met behulp van het "ggpubr"-pakket.
14. Ga naar de interface van de UCSC Xena-website .
15. Klik op het tabblad Xena starten .
16. Klik op het tabblad DATASETS bovenaan het scherm.
17. Klik uit de 129 cohorten en 1,571 datasets op deze pagina op het tabblad voor in totaal 33 kankers zoals GDC TCGA acute myeloïde leukemie (LAML), GDC TCGA Adrenocorticale kanker (ACC), GDC TCGA Galwegkanker (CHOL) en meer.
18. Selecteer en klik in het fenotypemenu op het tabblad overlevingsgegevens.
19. Klik in het downloadmenu op de bijbehorende link.
20. Pak het zip-archief met overlevingsgegevens voor 33 verschillende soorten kanker uit in één bestand in de bureaubladmap van de computer.
21. Plaats de uitgepakte overlevingsgegevens in dezelfde map als het singleGeneExp.txt bestand dat in stap 1.9 is verkregen.
22. Open de R-code (preOSR) en kopieer en plak het pad waar de bovenstaande map zich bevindt naar de regel waar setwd zich bevindt in de R-code.
23. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (preOSR) uit. Bereken via het "limma"-pakket om een gegevensbestand te krijgen over de overleving van de TMEM200A bij pan-kanker: expTime.txt.
24. Open de R-code (OSR) en kopieer en plak het pad waar het expTime.txt-bestand zich bevindt naar de regel waar setwd zich bevindt in de R-code.
25. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (OSR) uit. Voer een KM-analyse uit met behulp van de pakketten "overleving" en "survminer" op basis van de gegevens in het expTime.txt-bestand en plot de overlevingscurven voor TMEM200A bij pankanker.

17. Univariate en multivariate Cox-regressieanalyses met de aanleg van bospercelen

1. Open de R-code (COXR) en kopieer en plak het pad waar we het expTime.txt-bestand van 16.23 vandaan hebben, zich bevindt naar de regel waar setwd zich in de R-code bevindt.
2. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (COXR) uit. Voer op basis van de gegevens in het expTime.txt-bestand univariate COX-regressieanalyses uit met behulp van de pakketten "overleving", "survminer" en "forestplot" om een univariate bosplot van TMEM200A in verschillende kankers uit te zetten.
3. Zet het expTime.txt bestand uit stap 16.23 en clinical.txt uit stap 16.10 in dezelfde map.
4. Open de R-code (multicoxR) en kopieer en plak het pad waar de map met het expTime.txt-bestand uit stap 16.23 en clinical.txt bestand uit stap 16.10 zich bevindt naar de regel waar setwd zich bevindt in de R-code.
5. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (multicoxR) uit. Voer een multivariate COX-regressieanalyse uit met behulp van de pakketten "overleving" en "survminer" om een multivariate-bosplot van TMEM200A in verschillende kankers uit te zetten op basis van de gegevens in de expTime.txt - en clinical.txt-bestanden .

18. Prognostisch model van maagkanker op basis van TMEM200A expressie en klinische kenmerken

1. Zet het clinical.txt bestand uit stap 16.10 en het expTime.txt bestand uit stap 16.23 in dezelfde map.
2. Open de R-code (NomoR) en kopieer en plak het pad waar het bovenstaande txt-bestand zich bevindt naar de regel waar setwd zich in de R-code bevindt.
3. Open de R-software en voer de gewijzigde R-code (NomoR) uit. Gebruik de softwarepakketten "survival", "regplot" en "rms" voor TMEM200A expressiegegevens in GC en klinische gegevens om een prognostisch model te construeren om de overleving van de patiënt te voorspellen.

19. Celkweek en siRNA-transfectie van TMEM200A

OPMERKING: Menselijke STAD HGC-27-cellen, SGC-7901-cellen en menselijke maagslijmvliesepitheliale GES-1-cellen werden commercieel verkregen (zie de materiaaltabel), nieuw leven ingeblazen, geïnoculeerd in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 compleet medium (met 10% neonataal foetaal runderserum en 1% penicillinemengsel) en gekweekt bij 37 °C in een 5% CO₂ incubator voor celkweek. Het kweekmedium werd om de 2-3 dagen vervangen. De cellen in goede groeiconditie werden geënt in platen met zes putjes volgens (2-3) × 10⁵ cellen per putje.

1. Neem eerst drie microcentrifugebuisjes en voeg 8 μL transfectiereagens (ziede Materiaalmethode) en 200 μL basaal medium toe aan elk buisje. Voeg vervolgens respectievelijk 4 μg SiRNA1, SiRNA2 en SiRNA3 toe aan elke buis.
   OPMERKING: Voor TMEM200A knockdown is siRNA ontworpen en gekocht (zie de Tabel met materialen).
2. Meng het mengsel in de drie microcentrifugebuisjes grondig en voeg toe aan elk van de drie putjes van de plaat met 6 putjes. Schud de plaat met 6 putjes voorzichtig om het mengsel gelijkmatig te verdelen. Label de drie putjes waar het mengsel is toegevoegd als SiRNA-1, SiRNA-2 en SiRNA-3.
3. Wanneer de cellen 4-6 uur zijn geïncubeerd, vervangt u de helft van het medium in de drie subputjes in de plaat met 6 putjes.
   NOTITIE: Wanneer u de helft van het volledige medium vervangt, zuigt u de helft van het oorspronkelijke complete medium op en vult u deze aan met de helft van het verse complete medium.
4. Gebruik vierentwintig tot 48 uur later TMEM200A siRNA-getransfecteerde cellen als experimentele groep en niet-getransfecteerde cellen als negatieve controlegroep. Voer een kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR, zie rubriek 20) uit om het effect van transfectie op de cellen te beoordelen.

20. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie

1. Gooi het celkweekmedium in elke subgroep weg en was de cellen voorzichtig twee keer met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Isoleer totaal RNA met behulp van een RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel).
3. Schat de RNA-concentratie en synthetiseer cDNA met 1 μg RNA met behulp van een cDNA-synthesekit, volgens de instructies van de fabrikant.
4. Voer kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) uit op 10-voudige verdunningen van cDNA in 10 μL reactiemix, inclusief mensspecifieke voorwaartse en achterwaartse primers voor GAPDH (voor standaardisatie), TMEM200A (zie de materiaaltabel) en qPCR Master Mix, met behulp van het Real-Time PCR Assay System.
   OPMERKING: Voer elk experiment in drievoud uit.
5. Gebruik de volgende qPCR-reactiecondities: initialisatie, 95 °C gedurende 3 minuten; denaturatie, 95 °C gedurende 10 s; gloeien, 60 °C gedurende 30 s; en verlenging, 80 °C gedurende 10 s; Herhaal de denaturatie, het gloeien en de extensie 40x. Bepaal de relatieve expressie van elk gen met behulp van de ^{2-ΔΔCt-techniek 28}.
6. Herhaal de experimenten minstens drie keer om biologische drievoud te verkrijgen.

21. Western blot-detectie van relevante eiwitexpressie

1. Gooi het celkweekmedium in elke subgroep weg en was de cellen voorzichtig met 2 x 1 ml PBS.
2. Koel de platen met 6 putjes met de cellen op ijs en voeg 150 μL voorgekoelde radio-immuunprecipitatietest (RIPA) lysisbuffer toe (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 en vers toegevoegde proteaseremmercocktail). Laat de lysis 10 minuten op ijs inwerken.
3. Gebruik een plastic celschraper om de aanhangende cellen uit de schaal te verwijderen en de celoplossing voorzichtig over te brengen in een voorgekoelde microcentrifugebuis.
4. Centrifugeer het cellysaat gedurende 10 minuten bij 1,5 × 10⁴ g bij 4 °C. Breng het supernatans over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
5. Gebruik een BCA-eiwittestkit om het eiwitgehalte te bepalen volgens de instructies van de fabrikant.
6. Laad 30 g eiwit uit elk monster op een 10% natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gel en laat gedurende 0,5 uur op 80 V draaien, gevolgd door 1,5 uur bij 120 V.
7. Breng de eiwitten van de gel over naar een 45 μm polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan met een spanning van 300 mA gedurende 1-1,5 uur.
8. Nadat u het PVDF-membraan op een shaker hebt geplaatst en 3 x 5 minuten hebt geschud, voegt u Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl en 0.1% Tween 20) toe aan de juiste container met de eiwitzijde (gelzijde) naar boven gericht.
9. Plaats het membraan in de blokkeerbuffer (zie de materiaaltabel) en incubeer het gedurende 0,5 uur bij kamertemperatuur.
10. Was het membraan met TBST gedurende 3 x 10 min.
11. Incubeer het membraan met primaire antilichamen tegen fosfo-AKT (p-AKT; 1:1.000), totaal AKT 1:1.000, E-cadherine (E-ca; 1:1.000), N-cadherine (N-ca; 1:1.000), Vimentin 1:1.000, slak 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH; 1:1.000), 's nachts bij 4 °C.
12. Was het membraan gedurende 3 x 10 minuten en incubeer het membraan met een secundair antilichaam van konijn of muis (1:5.000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
13. Incubeer het PVDF-membraan met ECL-substraat gedurende 30 s en detecteer het signaal met behulp van een beeldvormingssysteem.

22. CCK-8-test

1. Zaad menselijke STAD HGC-27-cellen in goede groeiconditie in platen met 96 putjes.
2. Wanneer de celdichtheid 60-70% bereikt, transfecteert u de cellen met TMEM200A siRNA (zoals in stap 19.3).
3. Zaai de getransfecteerde cellen in platen met 96 putjes met een celdichtheid van 5 × 10 ³/putje (tel levensvatbare cellen met behulp van een celteller), verdeeld in NC - en TMEM200A siRNA-groepen (met drie duplicaatputjes in elke groep) en geïncubeerd bij 37 °C.
4. Voeg CCK-8-reagens toe na 0, 24, 48, 72 en 96 uur en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C. Meet de extinctie (450 nm) met behulp van een multifunctionele enzymetiketteermachine.

Representative Results

Expressie van TMEM200A bij verschillende vormen van kanker
Zoals geïllustreerd in figuur 1, analyseerden we eerst de differentiële expressieniveaus van TMEM200A bij verschillende kankers via verschillende databases. TMEM200A expressie was verhoogd bij cholangiocarcinoom (CHOL), plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de hals (HNSC), heldercellig niercarcinoom (KIRC), renale papillaire celcarcinoom (KIRP), hepatocellulair carcinoom (LIHC), STAD en schildkliercarcinoom (THCA) in vergelijking met aangrenzende normale weefsels uitsluitend op basis van TCGA-gegevens. De expressie van TMEM200A nam echter af bij blaasuepipitheliaal carcinoom (BLCA), cervicaal plaveiselcelcarcinoom en cervicaal adenocarcinoom (CESC), multiform glioblastoom (GBM), nierchromofoob (KICH), plaveiselcelcarcinoom van de longen (LUSC), feochromocytoom en paraganglioom (PCPG), rectaal adenocarcinoom (READ) en endometriumcarcinoom van het baarmoedercorpus (UCEC) (Figuur 2A). In de TIMER2.0-database nam TMEM200A expressie toe in CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC en STAD. Bovendien nam TMEM200A expressie toe in BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, huidhuidmelanoom (SKCM) en UCEC (Figuur 2B).

Door de resultaten van de twee databases te vergelijken, ontdekten we dat de pan-kankerexpressie van TMEM200A in elke database hetzelfde was. We verkregen de klinische follow-upgegevens en RNA-sequencinggegevens van 33 patiënten met kanker uit de TCGA-database, berekenden TMEM200A scores in elk kankermonster met behulp van ssGSEA-analyse en berekenden vervolgens TMEM200A genactiviteit in tumor en normale weefsels in veel tumoren. We ontdekten dat TMEM200A sterk tot expressie kwam in GBM, HNSC, nier-KIRC en THCA (Figuur 2C); Vandaar dat de genactiviteit van TMEM200A in elk tumorweefsel werd gerangschikt. Het bleek dat de genactiviteit van TMEM200A het hoogst was bij KIRC en het laagst bij oogmelanoom (UVM) (Figuur 2D). Daaropvolgende HPA-databasebeoordeling van TMEM200A expressieniveaus in menselijke weefsels toonde aan dat TMEM200A expressieniveaus laag waren in de meeste normale weefsels, maar hoog in de bijnierschors, het rectum, het endometrium en de gladde spieren (Figuur 2E).

In normale weefselcellijnen vertoonden enkele cellijnen zoals granulosacellen, bipolaire cellen, skeletspiercellen, endometriumstromale cellen en T-cellen een hoge expressie van TMEM200A, terwijl TMEM200A expressie laag was in de meeste andere cellijnen (Figuur 2F). We onderzochten ook immunohistochemie (IHC) gegevens in de HPA-database om te kijken naar de expressie van TMEM200A op eiwitniveau. De gegevens met betrekking tot kleuring en intensiteit onthulden veel grotere en meer uitgesproken expressieniveaus van TMEM200A in colorectale kanker (CRC), longkanker (LUAD), leverkanker (LIHC), borstkanker (BRCA) en prostaatkanker (PRAD) weefsels in vergelijking met normale weefsels (Figuur 2G). Deze bevindingen suggereerden dat TMEM200A op grote schaal tot expressie kwam in verschillende kankers en de ontwikkeling van kanker beïnvloedde via verschillende mechanismen in verschillende tumoren.

Klinisch-pathologische relatie en overlevingsprognose
Voor 33 menselijke maligniteiten verzamelden we informatie en klinische gegevens in het TCGA pan-kanker (PanCan) cohort van de UCSC Xena-databasewebsite en onderzochten we de correlatie tussen TMEM200A expressie in PanCan en leeftijd, pathologische graad, klinisch-pathologisch stadium en overlevingsstatus van de patiënt. Uit deze studie bleek dat bij zes kankers de expressie van TMEM200A geassocieerd was met het klinisch-pathologische stadium, waaronder BLCA, invasief borstcarcinoom (BRCA), slokdarmcarcinoom (ESCA), KIRP, SKCM en testiculaire carcinoom (TGCT) (Figuur 3A). Leeftijd was gecorreleerd met zes tumoren, waaronder invasieve BRCA, GBM, acute myeloïde leukemie (LAML), SKCM, thymuscarcinoom (THYM) en endometriumkanker (UCEC) (Figuur 3B). De pathologische graad was geassocieerd met zes tumoren, waaronder slokdarmcarcinoom (ESCA), HNSC, KIRC, laaggradig glioom van de hersenen (LGG), pancreasadenocarcinoom (PAAD) en endometriumcarcinoom (UCEC) (Figuur 3C). De overlevingsstatus was geassocieerd met vijf tumoren, waaronder bijnierschorscarcinoom (ACC), BLCA, KIRC, PCPG en oogmelanoom (UVM) (Figuur 3D).

We hebben studies uitgevoerd voor verschillende vormen van kanker op OS, DSS, PFI en DFI met behulp van eenrichtings-Cox-regressieanalyse met een mediane groepsdrempel om meer te weten te komen over de correlatie tussen TMEM200A expressie en prognose. De resultaten van de OS-analyse toonden aan dat, van de vier tumoren, een hogere TMEM200A expressie een grotere impact had op de OS-prognose bij vier tumoren, waaronder bijnierschorscarcinoom (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), acute myeloïde leukemie (LAML) (P = 0,011) en GC (STAD) (P = 0,005). Daarentegen had expressie van hogere TMEM200A een betere prognose voor OS in vijf tumoren, waaronder KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), laaggradig glioom van de hersenen (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) en huidmelanoom (SKCM) (P = 0,043) (Figuur 3E,F). Voor DSS had expressie van hoge TMEM200A een slechte prognose bij twee tumortypes, waaronder bijnierschorscarcinoom (ACC) (P = 0,026) en BLCA (P = 0,015). High TMEM200A-expressie had een betere prognose bij vier tumortypes, waaronder KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), laaggradig glioom van de hersenen (LGG) (P = 0,025) en PCPG (P = 0,007) (Figuur 3G). Bovendien had voor PFI een hogere TMEM200A expressie een slechte prognose bij drie tumortypes, waaronder bijnierschorscarcinoom (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) en oogmelanoom (UVM) (P = 0,020). Hogere TMEM200A expressie had een betere prognose in twee tumortypes, waaronder KIRC (P < 0,001) en laaggradig glioom (LGG) (P = 0,044) van de hersenen (Figuur 3H). In DFI had een hogere expressie van TMEM200A een slechtere prognose bij bijnierschorscarcinoom (ACC) (P = 0,044) (Figuur 3I).

Vervolgens selecteerden we verschillende tumoren (KIRC en KIRP) voor multi-COX-regressieanalyse. De resultaten toonden aan dat TMEM200A individueel de overlevingskans van kankerpatiënten konden beïnvloeden in vergelijking met andere klinische factoren (Figuur 3J en K). Deze resultaten toonden aan dat TMEM200A kan worden gebruikt als een onafhankelijke bioprognostische marker bij verschillende vormen van kanker om de overleving van patiënten met kanker te beïnvloeden.

DNA-methylatie-analyse
Een van de epigenetische veranderingen die de maximale aandacht heeft gekregen, is DNA-methylatie²⁹. Er is gesuggereerd dat één type epigenetische verandering, DNA-methylering, een significante invloed heeft op de tumorgroei³⁰. Daarom evalueerden we met behulp van de SMART-database de DNA-methylatieniveaus van TMEM200A in normale en kankerweefsels. PAAD- en PRAD-weefsels hadden hogere niveaus van DNA-methylering van TMEM200A dan normale weefsels. TMEM200A hadden echter lagere DNA-methylatieniveaus in COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA en UCEC dan in normale weefsels (Figuur 4A). De DNA-methylatieniveaus van TMEM200A waren aanzienlijk hoger in de TCGA-database in KIRP, PRAD, PCPG en THYM op basis van de UALCAN-database (figuur 4B), maar niet in BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA en UCEC. Het methylatieniveau van TMEM200A significant gedaald in LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA en UCEC (Figuur 4C). Om de relatie tussen het expressieniveau van TMEM200A en DNA-methylatie en klinisch-pathologische factoren nog verder te onderzoeken, gebruikten we opnieuw de SMART-database en ontdekten dat het DNA-methylatieniveau van TMEM200A in BLCA, HNSC, LUAD en STAD veranderde met het pathologische stadium (Figuur 4D). Klinische factoren beïnvloeden het niveau van DNA-methylatie van TMEM200A in de bovengenoemde tumoren.

Analyse van genmutaties
Een van de redenen voor de ontwikkeling van tumoren is de accumulatie van genmutaties³¹. Daarom werd de frequentie van somatische TMEM200A mutaties geanalyseerd door de frequentie van TMEM200A mutaties in klinische monsters van pan-kanker te schatten met behulp van de cBioPortal-database. TMEM200A is gemuteerd in veel vormen van kanker, zoals longkanker, baarmoeder-endometrioïde carcinoom, melanoom, slokdarmmaagkanker, botkanker, baarmoederhalskanker, hepatobiliaire kanker, volwassen B-cellymfoom, BRCA, endometriumkanker, eierstokkanker, embryonale tumor, alvleesklierkanker, hoofd-halskanker, CRC, glioom, niet-kleincellige longkanker, wekedelensarcoom en kanker van onbekende primaire (Figuur 5A). Bovendien kunnen DNA-veranderingen leiden tot structurele of aminozuurveranderingen op eiwitniveau. Figuur 5B toont de 3D-structuur van TMEM200A. Met behulp van de cBioPortal-database vonden we mutatieplaatsen in de aminozuren van TMEM200A; missense-mutaties waren de meest voorkomende vorm van mutaties (Figuur 5C).

We analyseerden de gegevens met behulp van Sangerbox 3.0 om de nauwkeurigheid van de mutatieplaatsen te verifiëren en bereikten dezelfde resultaten als eerder. Missense-mutaties zijn de meest voorkomende vorm van mutaties in TMEM200A en kunnen tot 7,8% voorkomen in SKCM (Figuur 5D). Een missense-mutatie is een mutatie waarbij een codon dat codeert voor een aminozuur een basensubstitutie ondergaat en een codon wordt dat codeert voor een ander aminozuur, wat resulteert in een verandering in het aminozuurtype en de volgorde van de polypeptideketen. Het resultaat van missense mutatie is meestal dat de polypeptideketen zijn oorspronkelijke functie verliest. Veel eiwitafwijkingen worden veroorzaakt door missense-mutatie, een veel voorkomend type tumormutatie. Het is gebleken dat missense-mutaties een sleutelrol spelen in de stabiliteit van eiwitten, en de aanwezigheid van mutaties kan een significant effect hebben op de bindingsaffiniteit tussen eiwitten³², waardoor de interacties tussen eiwitten en de omringende correlatieve macromoleculen veranderen³³.

Missense-mutaties beïnvloeden dus hoogstwaarschijnlijk de biologische functie van transmembraaneiwit 200A bij verschillende vormen van kanker. Ook de correlatie tussen TMEM200A genmutatie en de klinische overlevingsprognose van patiënten met kanker werd onderzocht. De kans op OS nam toe in vergelijking met die in de TMEM200A-gemuteerde groep, maar niet in de ziektevrije groep (Figuur 5E). Uit de studie van gencorrelaties bleek dat TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 en SLC18B1 tot de genen behoorden die co-muteerden met TMEM200A (Figuur 5F). We waren in staat om verschillende mutatietypes en single-nucleotide variaties (SNV's) te identificeren via de COSMIC-database om meer te weten te komen over TMEM200A mutaties in GC. De frequentie van missense-vervangingen was het hoogst (38,86%) (Figuur 5G), en SNV-gegevens toonden aan dat de meest voorkomende SNV's in STAD G>A (31,73%) waren, gevolgd door C>T (26,35%) en G>T (11,73%) (Figuur 5H).

Eencellige analyse van TMEM200A bij kanker
We analyseerden TMEM200A expressieniveaus in verschillende afzonderlijke cellen met behulp van de TISCH-website (Tumor Immunology Single Cell Center). De online tool van TISCH toonde de expressie van TMEM200A voor 65 datasets en 28 celtypen in de heatmap die wordt weergegeven in figuur 6A. De bevindingen toonden aan dat TMEM200A vooral tot expressie kwam in CD8⁺ T-cellen en fibroblasten. De GSE72056 dataset, die cellen bevat van patiënten met gemetastaseerd huidmelanoom (SKCM), is in dit opzicht opmerkelijk. TMEM200A kwam op grote schaal tot expressie in B-cellen, CD4⁺ T-lymfocyten, verarmde CD8⁺ T-cellen, endotheelcellen, fibroblasten en andere celtypen in de SKCM-micro-omgeving (Figuur 6B,C). In de GSE146771 dataset, die cellen bevat van patiënten met CRC, werd TMEM200A op grote schaal sterk tot expressie gebracht in B-cellen, CD4⁺ T-lymfocyten, CD8+ T-cellen, verarmde CD8⁺ T-cellen, endotheelcellen, fibroblasten en andere celtypen in de CRC-micro-omgeving (Figuur 6D,E). Met behulp van de CancerSEA-database werden de expressieniveaus en functionele status van TMEM200A in specifieke tumorcellen bepaald (Figuur 6G). TMEM200A expressie was sterk gecorreleerd met de cellulaire functionele toestand bij een reeks kankers, waaronder glioblastoom (GBM), longadenocarcinoom (LUAD), chronische granulocytische leukemie (CML), CRC, retinoblastoom (RB) en oogmelanoom (UM). Angiogenese, apoptose, differentiatie en ontsteking waren allemaal positief gecorreleerd met TMEM200A expressie in een meerderheid van de tumorcellen, terwijl DNA-schade, DNA-herstel, invasie en metabolisme negatief gecorreleerd waren met TMEM200A expressie (Figuur 6F).

Functionele en pathway enrichment analyse van TMEM200A bij verschillende kankers
We onderzochten het verband tussen TMEM200A en eiwitten met vergelijkbare functies met behulp van het GGI-netwerk om de functie van TMEM200A bij verschillende kankers te onderzoeken (Figuur 7A). Genomische en proteomische informatie wordt geanalyseerd door GeneMANIA met behulp van een querylijst van doelgenen. Door genen te lokaliseren die op dezelfde manier werken als TMEM200A, werden de 40 eiwitten ontdekt die direct met dit gen interageren. De correlatie van deze genen wordt weergegeven door het PPI-netwerk (Figuur 7B). Vervolgens bleek uit GO- en KEGG-verrijkingsanalyses van deze 20 genen die nauw verwant zijn aan TMEM200A dat deze aangrenzende genen meestal betrokken waren bij de negatieve regulatie van gen-uitschakeling door het RNA. Uit de analyse van KEGG bleek dat TMEM200A overvloedig aanwezig was in routes, waaronder de Wnt-signaleringsroute en cellulaire senescentie (Figuur 7C). GO-verrijkingsanalyse toonde aan dat TMEM200A in moleculaire functie voornamelijk overvloedig aanwezig was in de calciumkanalen en negatieve regulatie van gen-uitschakeling door RNA (Figuur 7D).

Correlatieanalyse tussen TMEM200A en immuuninfiltratie
We onderzochten verder de correlatie tussen TMEM200A expressie en infiltratie van immuuncellen om de correlatie tussen TMEM200A en immuniteit tegen kanker aan te tonen. We hebben een CIBERSORT-immuuninfiltratieanalyse uitgevoerd met behulp van de Sangerbox 3.0 pan-kankergegevens. De resultaten toonden aan dat de expressie van pankanker TMEM200A gecorreleerd was met CD8⁺ T-cellen, CD4⁺ T-cellen, B-cellen, helper-T-cellen, natural killer-cellen, regulerende T-cellen, monocyten, macrofagen, dendritische cellen, eosinofielen, basofielen en granulocyten (Figuur 8A). Vervolgens keken we naar de correlatie tussen TMEM200A expressie en TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) met behulp van de TISIDB-database, waarbij we een nauwe correlatie aantoonden tussen TMEM200A expressie en 28 TIL-abundantie in verschillende kankertypes (Figuur 8B). We gebruikten de TISIDB-database om de correlatie tussen TMEM200A expressie en immunosuppressiva bij menselijke maligniteiten te beoordelen om grondiger te onderzoeken hoe immunomodulatoren en TMEM200A expressie gerelateerd waren. De resultaten toonden aan dat TMEM200A expressieniveaus significant gecorreleerd waren met immunosuppressiva bij verschillende vormen van kanker (Figuur 8C). Significante correlaties tussen TMEM200A expressie en bepaalde immunosuppressiva werden gevonden bij teelbalkanker en UM (Figuur 8D-F). Vervolgens voerden we een correlatieanalyse uit van TMEM200A expressie met immunostimulerende factoren en MHC-moleculen met behulp van de TISIDB-database (Figuur 8G,H). De resultaten toonden aan dat TMEM200A expressie gecorreleerd was met geselecteerde immunostimulantia en MHC-moleculen bij urotheelcarcinoom van de blaas, testiculaire carcinoom, bijnierschorscarcinoom en UM (Figuur 8I-L). De volgende stap was het onderzoeken van de correlatie tussen TMEM200A expressie en immunologische of moleculaire subtypes in het TCGA PanCan-cohort in de TISIDB-database. We ontdekten dat de immunologische subgroepen van negen verschillende kankertypes TMEM200A anders tot expressie brachten, waaronder BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT en BRCA (Figuur 8M). Bovendien vertoonden zes verschillende kankervormen met diverse moleculaire subgroepen, waaronder HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV en LUSC, variabele expressie van TMEM200A (Figuur 8N).

TMEM200A en immunotherapie respons analyse
De effectiviteit van PD-1/PD-L1-remmers is sterk gecorreleerd met TMB, en sommige patiënten met tumoren kunnen enigszins worden voorspeld met behulp van TMB-markers voor de werkzaamheid van immunotherapie³⁴. Microsatellietinstabiliteit (MSI) is de term die wordt gebruikt om de defecte DNA-mismatch-reparatiefunctie (MMR) te beschrijven wanneer fouten in de replicatie van microsatellieten niet worden verholpen en zich ophopen, waardoor de lengte of basissamenstelling van microsatellieten verandert³⁵. MSI is een tumormarker van klinische betekenis ³⁶. We hebben dus de impact van TMEM200A expressie op immunotherapie beoordeeld door de correlatie tussen TMEM200A expressie en TMB of MSI te onderzoeken. De bevindingen toonden een substantiële positieve correlatie aan tussen TMEM200A expressie en TMB in THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP en KIRC, maar TMEM200A expressie was negatief gecorreleerd met UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM en BRCA (Figuur 9A). MSI en TMEM200A-expressie waren sterk en gunstig verbonden in TGCT, terwijl TMEM200A-expressie significant en negatief gecorreleerd was met MSI in UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC en CHOL (Figuur 9B). We beoordeelden ook het potentieel van TMEM200A als biomarker om de effectiviteit van ICB te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat TMEM200A alleen ICB-responsen voorspelde met een nauwkeurigheid van Area Under Curve (AUC) > 0,5 in 7 van de 25 ICB-subpopulaties. TMEM200A vertoonden een hogere voorspellende waarde dan T- en B-celklonen, die beide een waarde van 5 hadden. De waarde voor TMEM200A was echter lager dan die voor TIDE (AUC > 0,5 in 11 ICB-subpopulaties), MSI-score (AUC > 0,5 in 11 ICB-subpopulaties), CD274 (AUC > 0,5 in 15 ICB-subpopulaties), CD8 (AUC > 0,5 in 17 ICB-subpopulaties), IFNG (AUC > 0,5 in 16 ICB-subpopulaties) en Merck18 (AUC > 0,5 in 17 ICB-subgroepen) (Figuur 9C). Een slechte overlevingsprognose in de ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve-, ICB_Gide 2019_PD1- en ICB_Hugo 2016_PD1-cohorten was gecorreleerd met expressie van hoge TMEM200A . Echter, TMEM200A knockdown verbeterde lymfocyt-gemedieerde tumordodende potentie in het gemiddelde cohort van Kearney 2018 T_PD1 en Pan 2018 OT1 (Figuur 9D).

GSEA-verrijkingsanalyse van TMEM200A bij verschillende kankers
We gebruikten DEG's tussen TMEM200A subgroepen met hoge expressie en TMEM200A subgroepen met lage expressie in 32 maligniteiten om TMEM200A-gerelateerde kankerkenmerken te onderzoeken. We ontdekten een substantiële correlatie tussen primaire immunodeficiëntie, de RIG (Retinoïnezuur-induceerbaar gen)-I-achtige receptorsignaleringsroute en TMEM200A expressie in pankanker, vooral in BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC en SKCM (Figuur 10). Het virale cytoplasmatische eiwit ribonucleïnezuur wordt gedetecteerd door de RIG-I-achtige receptorsignaleringsroute. RIG-I-achtige receptoren kunnen de productie van een verscheidenheid aan inflammatoire cytokines in het lichaam beïnvloeden door de NF-kB-signaleringsroute te activeren door bepaalde intracellulaire junctie-eiwitten aan te spreken. Als gevolg hiervan kan het transmembraaneiwit 200A (TMEM200A) een cruciale rol spelen bij de rekrutering van intracellulaire eiwitten door de RIG-I-achtige receptor. Deze bevindingen impliceerden een sterke correlatie tussen TMEM200A expressie en immunologische infiltratie. Bovendien toonde GSEA-verrijkingsanalyse aan dat de expressie van pan-kanker TMEM200A gecorreleerd was met chemokinesignalering, celadhesie, cytokinereceptorverbindingen, celmembraandetectieroutes en autofagiecontrole (Figuur 10). Transmembraaneiwitten kunnen fungeren als adhesiemoleculen om de micro-omgeving van de tumor te beïnvloeden, naast het spelen van een cruciale rol bij het beheersen van de binnenkomst van calciumionen in de cel vanuit calciumreservoirs ^. Daarom kunnen de resultaten die zijn verkregen uit GSEA-verrijkingsanalyse te wijten zijn aan de betrokkenheid van TMEM200A bij vele fysiologische processen, waaronder activering van signaaltransductieroutes, vorming van plasmamembraanionkanalen en regulatie van celchemotaxis, adhesie, apoptose en autofagie⁹.

We identificeerden de top 50 STAD-genen, zowel positief als negatief, gecorreleerd met TMEM200A uit de LinkedOmics-database, die samen tot expressie werden gebracht in STAD, in de vorm van heatmaps (Figuur 11A,B). We evalueerden de top 5 genen positief en de top 5 genen negatief geassocieerd met TMEM200A in GC (Figuur 11C). Onze resultaten toonden aan dat TMEM200A expressie gecorreleerd was met SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) en SYTL1 (r = -0,33) co-expressie. We hebben de resultaten van de drempelvisualisatie geanalyseerd om de rol van TMEM200A in STAD beter te begrijpen. Voor de screening zijn de volgende criteria gehanteerd: log2-voudige verandering (FC) > 2,0 en aangepaste P-waarde 0,05. We vonden 483 DEG's, waarvan 385 opwaarts gereguleerd en 98 neerwaarts, en we kozen er 100 om te visualiseren om een heatmap te maken (Figuur 11D). Vervolgens hebben we voor de DEG's die aan de screeningscriteria voldeden, GO- en KEGG-verrijkingsanalyses uitgevoerd. De resultaten van de GO-verrijkingsanalyse toonden aan dat de verrijking van BP (biologisch proces) voornamelijk geassocieerd was met extracellulaire matrix en structureel weefsel, de verrijking van CC (cellulaire component) voornamelijk geassocieerd was met collageenbevattende extracellulaire matrix en basaalmembraan, en MF (moleculaire functie) voornamelijk werd verrijkt in een extracellulaire matrixstructuur en glycosaminoglycaanbinding (Figuur 11E en Figuur 11G). De verrijking van de KEGG-analyse toonde aan dat TMEM200A voornamelijk verrijkt was in de extracellulaire matrixreceptorinteractieroute, cytochroom P450 en het renine-angiotensinesysteem (Figuur 11F en Figuur 11H).

TMEM200A gebaseerd prognostisch model en klinische kenmerken van maagkanker
We onderzochten de correlatie tussen TMEM200A en de klinische gegevens van patiënten met STAD en analyseerden daarom de klinisch-pathologische kenmerken van patiënten in het TCGA-STAD-cohort door middel van logistische regressieanalyse en op basis van TMEM200A expressieniveaus (Figuur 12A). Leeftijd, klinisch stadium en TMEM200A expressie waren allemaal substantieel gecorreleerd met OS bij patiënten met STAD, volgens een univariate Cox-regressieanalyse (Figuur 12B). De multivariate Cox-regressieanalyse toonde aan dat TMEM200A expressie een op zichzelf staande voorspellende factor zou kunnen zijn voor OS bij patiënten met STAD (HR = 1.282, 95% BI = 1.066-1.541, P = 0.008) (Figuur 12C). We onderzochten het potentieel van deze klinisch-pathologische kenmerken om OS te voorspellen na 1, 3 en 5 jaar in STAD met behulp van het standaard kolomlijnplotmodel in combinatie met verschillende klinische parameters (Figuur 12D). De kalibratiecurven voor de overlevingskansen na 1 jaar waren zeer consistent met de voorspelde kansen op kolomlijndiagrammen (figuur 12E).

TMEM200A opregulatie in STAD-cellen en verbetering van de celproliferatie
Door de literatuur met betrekking tot TMEM200A te bekijken, ontdekten we dat de hoge expressie van TMEM200A duidde op een slechte prognose ¹³ en dat de GC-immuunmicro-omgeving kan worden beïnvloed door TMEM200A die als adhesiemolecuul^{werkt 37}, waardoor de invasie en metastase van GC-cellen wordt bevorderd. We onderzochten de eiwitniveaus en mRNA-transcriptniveaus van TMEM200A in STAD-cellijnen om de bevindingen van de bovengenoemde studie te bevestigen. De GC-cellijn HGC-27 bracht dramatisch TMEM200A tot overexpressie in vergelijking met de gezonde maagslijmvliesepitheelcellijn GES-1 op zowel eiwit- als mRNA-transcriptniveaus (Figuur 13A,B), wat aangeeft dat TMEM200A tot overexpressie werd gebracht in HGC-27-cellen. De volgende tests werden uitgevoerd met HGC-27-cellen als resultaat. Ondertussen, om de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten te bewijzen, gebruikten we qRT-PCR om de differentiële mRNA-expressie van TMEM200A in menselijke GC-cellen SGC-7901 en maagslijmvliesepitheelcellen GES-1 te vergelijken, en de resultaten toonden aan dat TMEM200A sterk tot expressie kwam in SGC-7901-cellen (Figuur 13B). TMEM200A werd uitgeschakeld in HGC-27-cellen om de mogelijke betrokkenheid van TMEM200A bij STAD te onderzoeken (Figuur 13C). Op basis van de resultaten van de databasemining en onze correlatieanalyse van TMEM200A, bleek dat TMEM200A voornamelijk betrokken was bij de interactieroute van extracellulaire matrixreceptoren, die in verband werd gebracht met proliferatie en invasie van kanker. Daarom gebruikten we CCK-8-assays om vast te stellen hoe TMEM200A expressie de celgroei beïnvloedde. De CCK-8-assays toonden aan dat TMEM200A knockdown-groepen (Si-RNA2 en Si-RNA3) een opmerkelijke daling van de levensvatbaarheid van de cellen vertoonden in vergelijking met de NC-groep (Figuur 13D). Deze bevindingen suggereerden dat TMEM200A werd opgereguleerd in STAD en dat het expressieniveau de proliferatie van GC-cellen zou kunnen beïnvloeden. Op basis van de resultaten van de KEGG-verrijkingsanalyse in figuur 11F ontdekten we dat TMEM200A geassocieerd was met de PI3K/AKT-signaleringsroute in GC, en TMEM200A, als celadhesiefactor, het mechanisme van maagcarcinogenese kan beïnvloeden door EMT te beïnvloeden. Daarom hebben we western blotting gebruikt om de effecten van TMEM200A knockdown op EMT en de PI3K/AKT-signaleringsroute voor en na knockdown te verifiëren. De resultaten toonden aan dat de expressie van het P-AKT-eiwit was afgenomen in de TMEM200A knockdown-groep (TMEM200A-SiRNA2) in vergelijking met de negatieve controlegroep (NC), terwijl de niveaus van N-cadherine-, Vimentin- en Snai-eiwitten ook waren verlaagd en de expressie van het E-cadherine-eiwit was verhoogd (Figuur 13E). Al deze resultaten suggereren dat TMEM200A EMT kunnen beïnvloeden via de PI3K/AKT-signaleringsroute en dus een rol kunnen spelen bij GC.

Figuur 1: De workflow van het onderzoek. Afkortingen: TCGA = The Cancer Genome Atlas database; TIMER2.0 = De TIMER2.0 database; OS= totale overleving; PFS = Progressievrije overlevingstijd; DSS = ziektespecifieke overleving; DFS = Ziektevrije Overleving; TMB = Tumor Mutatie Last; MSI = Microsatelliet instabiliteit; PPI = Eiwit-eiwit interactie; GGI = Gen-gen interactie; KEGG = Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen; GO = genontologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Expressieniveaus van TMEM200A bij verschillende kankers. (A) Op- of neerwaarts gereguleerde expressie van TMEM200A uit de TCGA-dataset bij verschillende menselijke maligniteiten. (B) Analyse van TMEM200A expressieniveaus in tumor en normale weefsels met behulp van de TIMER2.0-database. (C) Differentiële analyse van TMEM200A genactiviteit in verschillende menselijke kankers uit de TCGA-dataset. (D) Rangschikking van genactiviteitsniveaus van TMEM200A bij verschillende menselijke kankers op basis van ssGSEA-scores. (E) TMEM200A expressieniveaus uit de HPA-databank in gezonde weefsels. (F) De TMEM200A expressieniveaus van de HPA-database in normale cellijnen. (G) IHC-uitkomsten voor TMEM200A eiwitexpressie bij kanker uit de HPA-database. Afkortingen: TCGA = The Cancer Genome Atlas; ssGSEA = Verrijkingsanalyse van genensets met één monster; HPA = Human Protein Atlas; IHC = Immunohistochemie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Correlatie van TMEM200A expressie met klinisch-pathologische kenmerken en prognose van verschillende tumoren. (A) Correlatie van TMEM200A expressie in het TCGA pan-kanker (PanCan) cohort met klinisch-pathologische stadiëring in elke tumor werd geanalyseerd met behulp van de UCSC Xena-database. (B) Correlatie van TMEM200A expressie in het TCGA PANCAN-cohort met de leeftijd van de patiënt in elke tumor. (C) Correlatie van TMEM200A expressie in het TCGA PANCAN-cohort met tumorpathologische graad in elke tumor. (D) Correlatie van TMEM200A expressie in het TCGA PanCan-cohort met de overlevingsstatus van patiënten in elke tumor. (E) Correlatieanalyse van TMEM200A expressie met de algehele overleving van kanker bij verschillende vormen van kanker met behulp van het Cox-regressiemodel. (F) Correlatie tussen TMEM200A expressie en prognose van het besturingssysteem bij kanker in het TCGA PanCan-cohort. (G) Correlatie tussen TMEM200A expressie en ziektespecifieke overleving. (H) Correlatie tussen TMEM200A expressie en progressievrije intervalprognose in het TCGA PanCan-cohort. (I) Correlatie tussen TMEM200A expressie en ziektevrij interval. (J) Er werd een multifactoriële COX-regressieanalyse uitgevoerd op KIRC. (K) Er werd een multifactoriële COX-regressieanalyse uitgevoerd op KIRP. Afkortingen: TCGA = The Cancer Genome Atlas; KIRC: Niernieren heldercellig carcinoom; KIRP: nier nier papillair celcarcinoom; OS = Algehele overleving; DSS = Ziektespecifieke overleving; PFI = progressievrij interval; DFI = ziektevrij interval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: DNA-methylatieanalyse van TMEM200A bij verschillende kankers. (A) Promotormethylatieniveaus van TMEM200A werden onderzocht bij verschillende soorten kanker, volgens de SMART-database. (B) Hogere methylatieniveaus van TMEM200A van de promotor in verschillende soorten kanker dan in normale weefsels werden onderzocht in overeenstemming met de UALCAN-database. (C) Met behulp van de UALCAN-database werd vastgesteld dat normale weefsels lagere methylatieniveaus van TMEM200A promotor hadden bij verschillende soorten kanker. (D) Het DNA-methylatieniveau van TMEM200A in BLCA, HNSC, LUAD en STAD veranderde met het pathologische stadium. Afkortingen: BLCA = blaasurotheelcarcinoom; HNSC= hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom; LUAD = longadenocarcinoom; STAD= Maag adenocarcinoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: TMEM200A genmutaties in verschillende kankers. (A) Analyse van TMEM200A genmutatietypes in verschillende kankers met behulp van de cBioPortal-database. (B) 3D-eiwitstructuur van TMEM200A. Het bindingsgebied wordt aangegeven door het gekleurde gedeelte, terwijl de andere delen van TMEM200A worden aangegeven door het grijze gedeelte. (C) Isovormen en verdeling van TMEM200A somatische mutaties. X-as, aminozuurplaatsen; y-as, aantal TMEM200A mutaties; groene stippen, missense mutaties; en grijze stippen, afgeknotte mutaties. (D) Validatie van de isovormen en distributie van TMEM200A somatische mutaties met behulp van gegevens in Sangerbox 3.0. (E) Voor alle TCGA-tumoren werd de correlatie tussen de mutatiestatus en de voorspelling van de algehele overleving van patiënten onderzocht met behulp van de cBioPortal-database, waarbij rode vierkanten de TMEM200A mutatiegroep aangaven en blauwe vierkanten de niet-gemuteerde groep. (F) Genen die co-muteerden met TMEM200A werden geanalyseerd met behulp van de cBioPortal-tool: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 en SLC18B1. (G) Analyse van TMEM200A mutatietypes in GC met behulp van de COSMIC-database. (H) Een analyse van TMEM200A SNV-typen in GC werd uitgevoerd met behulp van de COSMIC-database. Afkortingen: TCGA = The Cancer Genome Atlas; OS = Totale overleving; COSMIC = catalogus van somatische mutaties in kankercellen; GC = Maagkanker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Single-cell correlatieanalyse van TMEM200A expressie in verschillende kankers. (A) Samenvatting van de expressie van TMEM200A op de TISCH-website. (B) Verdeling van acht verschillende celtypen in de dataset van het gemetastaseerde huidmelanoom GSE72056. (C) Expressieniveaus van TMEM200A in cutane gemetastaseerde melanoomcellen uit de GSE72056 dataset. (D) Distributie van 13 verschillende celtypen in de dataset van colorectale kanker uit GSE146771. (E) TMEM200A expressieniveaus in colorectale kankercellen uit de GSE146771 dataset. (F) Correlatie van TMEM200A expressie met eencellige functionele status in meerdere tumoren werd aangetoond met behulp van de CancerSEA-database. (G) T-SNE-kaarten die de niveaus van TMEM200A expressie in individuele tumorcellen illustreren, waaronder GBM, LUAD, CML, CRC, RB en UM. Afkortingen: GBM = Glioblastoom; LUAD = Longadenocarcinoom; CML = Chronische granulocytische leukemie; CRC = Colorectale kanker; RB = retinoblastoom; UM = Uveaal melanoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Co-expressienetwerk en functionele verrijkingsanalyse van TMEM200A op genniveau. (A) GGI-netwerk van TMEM200A en zijn co-expressie genen. (B) PPI-netwerk. (C,D) TMEM200A en de co-expressie genen werden geanalyseerd voor verrijking van de GO- en KEGG-route. Afkortingen: PPI = Eiwit-eiwit interactie; GGI = Gen-gen interactie; KEGG = Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen; GO = genontologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Correlatie tussen de expressie van TMEM200A- en immuuncellen, immunosuppressiva, immunostimulerende stoffen en MHC-moleculen bij verschillende soorten kanker. (A) Sangerbox 3.0 heatmap die de correlatie tussen TMEM200A expressie en immuuninfiltrerende cellen aantoont. (B) Heatmap met de correlatie tussen immuuninfiltrerende cellen en TMEM200A expressie in de TISIDB-database. (C) Heatmap met de correlatie tussen immunosuppressieve cellen en TMEM200A expressie in de TISIDB-database. (D-F) Correlatie tussen TMEM200A expressie en bepaalde immunosuppressiva bij teelbalkanker en oogmelanoom. (G) Heatmap met de correlatie tussen immunostimulerende factoren en TMEM200A expressie in de TISIDB-database. (H) Heatmap van de correlatie tussen TMEM200A expressie en MHC-moleculen in de TISIDB-database. (I-L) Correlatie tussen TMEM200A expressie en sommige immunostimulerende factoren en MHC-moleculen in het urotheelcarcinoom van de blaas, testiculaire carcinoom, bijnierschorscarcinoom en oogmelanoom. (M) Correlatie tussen pan-kanker immuunsubgroepen en TMEM200A expressie. (N) Correlatie tussen moleculaire subgroepen van pankanker en TMEM200A expressie. Afkortingen: MHC = Major histocompatibility complex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Analyse van de immunotherapeutische respons van TMEM200A bij pancytopenie. (A) Correlatie van TMEM200A expressie bij verschillende kankers met TMB. (B) Correlatie tussen MSI bij pan-kanker en TMEM200A expressie. (C) TMEM200A potentieel als biomarker voor het voorspellen van de blokkaderespons van het immuuncheckpoint. (D) Het gewogen gemiddelde van de correlatie van TMEM200A met het ICB-overlevingsresultaat en de logaritmische vouwverandering (logFC) in CRISPR-screening werden gebruikt om het te rangschikken. Afkortingen: TMB = Tumor mutational burden; ICB = Immuun Checkpoint Blokkade; CRISPR = geclusterde regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: GSEA-verrijkingsanalyse van TMEM200A bij verschillende kankers. De top vijf van routes waarin TMEM200A een belangrijke functionele rol speelde bij het reguleren van 32 kankers werden geïdentificeerd door GSEA-verrijkingsanalyse. Het linkerpaneel toont de resultaten van GSEA-verrijkingsanalyse voor TMEM200A in ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ en SARC. Het rechterpaneel toont de resultaten van GSEA-verrijkingsanalyse voor TMEM200A in SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS en UVM. Afkortingen: GSEA = Gene Set Enrichment Analysis; ACC = bijnierschorscarcinoom; BLCA = urotheelcarcinoom van de blaas; BRCA = Borstinvasief carcinoom; CESC = Cervicaal plaveiselcelcarcinoom en endocervicaal adenocarcinoom; CHOL = cholangiocarcinoom; COAD = Colon-adenocarcinoom; ESCA = Slokdarmcarcinoom; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom; KICH = Nier Chromofoob; KIRC = Niernieren heldercellig carcinoom; KIRP = Niernier-papillaircelcarcinoom; LAML = acute myeloïde leukemie; LGG = Brain Lower Grade Glioom; LIHC = leverhepatocellulair carcinoom; LUAD = Longadenocarcinoom; LUSC = plaveiselcelcarcinoom van de longen; MESO = Mesothelioom; OV = sereus cystadenocarcinoom van de eierstokken; PAAD = adenocarcinoom van de alvleesklier; PCPG = feochromocytoom en paraganglioom; PRAD = Prostaatadenocarcinoom; LEES: Rectum adenocarcinoom; SARC=Sarcoom; SKCM = huidmelanoom van de huid; STAD = Maagadenocarcinoom; TGCT = Testiculaire kiemceltumoren; THCA = Schildkliercarcinoom; THYM = Thymoom; UCEC = baarmoedercorpus endometriumcarcinoom; UCS = Baarmoedercarcinosarcoom; UVM = Uveal Melanoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: TMEM200A in STAD. (A) Top 50 genen gevonden met een negatieve correlatie met TMEM200A expressie in STAD door de LinkedOmics database. (B) Top 50 genen in STAD die positief verbonden waren met TMEM200A. (C) TMEM200A's top vijf positief en vijf negatief gecorreleerde genen in STAD. (D) Hittekaart van DEG's in STAD. (E-H) Onderzoek naar verrijkte GO- en KEGG-routes met behulp van de gescreende DEG's. Afkortingen: STAD=Maagadenocarcinoom; DEG's = Differentiële expressie van genen; KEGG = Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen; GO = genontologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Correlatie tussen de klinische kenmerken van STAD en TMEM200A expressieniveau. (A) Analyse van TMEM200A expressieniveaus en klinische STAD-kenmerken met behulp van logistische regressie. (B,C) Cox-analyse van STAD-bospercelen voor enkelvoudige en meervoudige variabelen. (D) Kolomlijndiagrammen die OS voorspellen bij patiënten met STAD op basis van geslacht, pathologische graad, leeftijd, pathologisch stadium en TMEM200A expressie. (E) Kalibratiegrafieken die de kalibratie van het kolomlijngrafiekmodel weergeven. Afkortingen: STAD= Maagadenocarcinoom; OS = Totale overleving. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13: TMEM200A expressie wordt opgereguleerd in STAD en bevordert de proliferatie van maagkankercellen. (A) Detectie van TMEM200A expressie in maagkankercellen HGC-27 en maagslijmvliesepitheelcellen GES-1 door western blotting. (B) Detectie van TMEM200A expressie in GC-cellen HGC-27 en SGC-7901 en maagslijmvliesepitheelcellen GES-1 door qRT-PCR. (C) De expressie-efficiëntie van TMEM200A was sterk verminderd in de TMEM200A knockdown-groep in vergelijking met de niet-knockdown-groep in GC-cellen HGC-27, zoals aangetoond door qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown remde de proliferatie van GC-cellen aanzienlijk, zoals gemeten met de CCK8-test. (E) De knockdown van TMEM200A remde de verwante eiwitten in EMT significant en beïnvloedde de fosforylering van AKT in de PI3K/AKT-signaleringsroute. Afkorting: GC = Maagkanker; qRT-PCR: Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie; EMT = epitheliale-mesenchymale overgang; AKT=Proteïnekinase B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

TMEM200A behoort tot een familie van TMEM's die essentieel is voor de proliferatie van kankercellen³⁸. De variabele expressie van TMEM200A bij verschillende maligniteiten heeft minder aandacht gekregen en een grondig pan-kankeronderzoek ontbreekt. Er blijft zich echter bewijs opstapelen, waaruit blijkt dat de TMEM-transmembraaneiwitfamilie belangrijk kan zijn bij het kwaadaardig houden van kankercellen door interacties met verschillende eiwitten, bijvoorbeeld activering van TMEM16A Ca²⁺-geactiveerde ^Cl-kanalen door ROCK1/moesin bevordert BRCA-metastase³⁹. Daarom waren onze analyses in het huidige werk gericht op het onderzoeken van de haalbaarheid van TMEM200A als therapeutisch kankerdoelwit en diagnostische marker voor tumoren. In het bijzonder onderzochten we de expressieniveaus van TMEM200A in 33 kwaadaardige tumoren met behulp van RNA-seq-gegevens uit de UCSC Xena-database, en de resultaten van de TIMER2.0-database valideerden met succes de analyses in de UCSC Xena-database.

Vervolgens werden de webtool Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) en de CancerSEA-database gebruikt om de expressieniveaus van TMEM200A in verschillende soorten monocyten te analyseren. De websites van Sangerbox en TISIDB werden gebruikt om te helpen begrijpen hoe TMEM200A de immuuninfiltratie beïnvloedt. We identificeerden ook de signaalroutes waarin TMEM200A een sleutelfunctie speelt bij elke kanker door middel van GSEA-verrijkingsanalyse om de belangrijkste functionele rollen van TMEM200A bij elke maligniteit te begrijpen.

TMEM200A kan fungeren als een adhesiemolecuul om de immuunomgeving van GC te beheersen en de invasieve verspreiding van GC-cellen te bevorderen. Daarom identificeerden we 483 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) geassocieerd met het expressieniveau van TMEM200A via de TCGA-database en analyseerden we de GO- en KEGG-verrijking van deze 483 DEG's. De verrijkingsresultaten toonden aan dat de PI3K/AKT-route een sleutelrol speelt bij de ontwikkeling van kanker, en de PI3K/AKT-route kan een van de drijvende factoren van kanker zijn.

Verder voerden we cellulaire en moleculaire tests uit nadat we meer te weten waren gekomen over de cruciale functie van TMEM200A bij het stimuleren van de ontwikkeling van kanker om de correlatie tussen TMEM200A expressie en STAD-celactiviteit te bevestigen. Zoals verwacht ontdekten we dat het downreguleren van TMEM200A in STAD-cellen de celproliferatie sterk verminderde, en dat kankercellijnen TMEM200A op aanzienlijk grotere niveaus tot expressie brachten dan normale cellijnen. Door de literatuur met betrekking tot de transmembraaneiwitfamilie van de afgelopen jaren te kammen, ontdekten we dat transmembraaneiwitten, als celadhesiemoleculen³⁷, een regulerende rol spelen bij EMT.

Verder, volgens de resultaten van de verrijkingsanalyse van TMEM200A-gerelateerde genen in GC, vonden we dat TMEM200A een regulerende rol kunnen spelen in de PI3K/AKT-signaleringsroute in GC. Western blotting-experimenten toonden aan dat TMEM200A knockdown Vimentin-, N-cadherine- en Snai-eiwitten zou kunnen verminderen en AKT-fosforylering zou kunnen remmen, wat suggereert dat TMEM200A de micro-omgeving van de tumor reguleert door de EMT te beïnvloeden, en dat de PI3K/AKT-signaleringsroute mogelijk betrokken is bij TMEM200A-gemedieerde regulatie van GC-ontwikkeling. In de afgelopen jaren hebben sommige onderzoeken aangetoond dat EMT de belangrijkste oorzaak is van resistentie tegen chemotherapie bij GC-patiënten. Epitheliale-mesenchymale plasticiteit (EMP) en tumormicro-omgeving zijn beschreven als beperkende factoren voor effectieve behandeling bij veel kankertypes⁴⁰. Het optreden van EMT kan ervoor zorgen dat GC-cellen hun karakteristieke eigenschappen verliezen en de kenmerken van mesenchymale cellen vertonen⁴¹. Deze functie vermindert niet alleen de gevoeligheid van GC-patiënten voor chemotherapeutische geneesmiddelen, maar verbetert ook het invasieve en migrerende vermogen van GC-cellen, wat leidt tot tumormetastase. Daarom, om de hierboven genoemde redenen, ondersteunt onze studie het onderzoek en de ontwikkeling van belangrijke regulerende punten in EMT en de ontwikkeling van nieuwe gerichte therapeutische benaderingen, door het specifieke werkingsmechanisme van TMEM200A EMT te onderzoeken.

Het gebruik van bio-informatica voor onderzoek is de afgelopen jaren toegenomen en voor dit onderzoek hebben we toegang gekregen tot gegevens uit verschillende internetdatabases. Het gebruik van deze online databases in de bio-informatica heeft de studie van kanker gestroomlijnd en versneld, en ze bieden onderzoekers ook een betaalbare manier om hun resultaten te valideren.

De bioinformaticatechniek heeft echter bepaalde nadelen. Wanneer we deze databases gebruiken voor analyse, kan hetzelfde onderzoek inconsistente of zelfs tegenstrijdige bevindingen opleveren in meerdere databases, aangezien veel online databases gegevens uit verschillende datasets bevatten. Bovendien worden veel databanken lange tijd niet bijgewerkt en kan de inhoud ervan nooit worden uitgebreid vanwege auteursrechtelijke problemen; Daarom zijn de analytische bevindingen die onderzoekers uit deze databases halen altijd beperkt. Daarom hebben we in dit onderzoek verschillende databases gebruikt om de resultaten gezamenlijk te onderzoeken om deze beperkingen te overwinnen en de juistheid van de bevindingen te garanderen. Om er zeker van te zijn dat de bevindingen die we verkregen niet aanzienlijk werden gewijzigd, herhaalden we de procedure bij het gebruik van verschillende databases voor analyse. De resultaten van western blot-experimenten ondersteunden onze bioinformatica-voorspelling dat TMEM200A de EMT in GC kunnen beheersen door de PI3K/AKT-signaleringsroute te reguleren, wat vervolgens de proliferatie van GC-cellen zou beïnvloeden. We voorspelden het werkingsmechanisme van TMEM200A met behulp van bio-informatica in combinatie met gerelateerde literatuur.

Samenvattend laat dit werk zien hoe bio-informaticatools het experimentele ontwerp aanzienlijk kunnen vergemakkelijken en kunnen worden gebruikt om vele andere soorten wetenschappelijke onderzoeksvoorspellingen te doen. Toekomstige kankeronderzoekers zullen waarschijnlijk het primaire paradigma aannemen van het combineren van experimentele validatie met bioinformatica-voorspelling, en dit werk dient als een goed model voor dit doel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold