Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

Summary

Qui viene presentato un protocollo in cui vengono combinati più strumenti bioinformatici per studiare le funzioni biologiche dei TMEM200A nel cancro. Inoltre, validiamo sperimentalmente le previsioni bioinformatiche.

Abstract

La proteina transmembrana, TMEM200A, è nota per essere associata ai tumori umani e all'infiltrazione immunitaria. Qui, abbiamo valutato la funzione di TMEM200A nei tumori comuni mediante analisi multiomica e abbiamo utilizzato colture cellulari in vitro di cellule gastriche per verificare i risultati. L'espressione di TMEM200A in diversi tipi di cancro umano è stata valutata utilizzando i dati RNA-seq del database Xena dell'UCSC. L'analisi bioinformatica ha rivelato un potenziale ruolo della TMEM200A come biomarcatore diagnostico e prognostico.

Sono state coltivate colture di normali linee cellulari gastriche e tumorali e TMEM200A è stato abbattuto. I livelli di espressione di TMEM200A sono stati misurati utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale e il western blotting. Sono stati quindi utilizzati studi in vitro sulla perdita di funzione per determinare il ruolo delle TMEM200A nel comportamento maligno e nella formazione tumorale delle cellule tumorali gastriche (GC). I Western blot sono stati utilizzati per valutare l'effetto del knockdown sulla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e sulla via di segnalazione PI3K/AKT nella GC. L'analisi bioinformatica ha mostrato che TMEM200A era espresso ad alti livelli nella GC.

La proliferazione delle cellule GC è stata inibita dal knockdown TMEM200A, che ha anche diminuito la vimentina, la N-caderina e le proteine Snai e ha inibito la fosforilazione di AKT. La via di segnalazione PI3K/AKT sembra anche essere coinvolta nella regolazione mediata da TMEM200A dello sviluppo dei GC. I risultati qui presentati suggeriscono che TMEM200A regola il microambiente tumorale influenzando l'EMT. TMEM200A può anche influenzare l'EMT attraverso la segnalazione PI3K/AKT, influenzando così il microambiente tumorale. Pertanto, nei pan-tumori, in particolare nei GC, TMEM200A può essere un potenziale biomarcatore e oncogene.

Introduction

Il cancro è emerso come un problema persistente di salute pubblica che mette in pericolo la salute umana a livello globale¹a causa dei suoi elevati tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo, ponendo un pesante onere finanziario e medico alla società². Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nella terapia del cancro grazie alla scoperta dei marcatori tumorali³ e i ricercatori hanno sviluppato nuovi metodi diagnostici e nuovi farmaci per il trattamento del cancro. Tuttavia, alcuni pazienti con cancro hanno ancora prognosi sfavorevoli a causa di fattori come la resistenza ai farmaci, gli effetti collaterali dei farmaci e la sensibilità chimica⁴. Pertanto, vi è un urgente bisogno di identificare nuovi biomarcatori per lo screening e il trattamento dei tumori in fase iniziale⁵.

Le proteine di membrana sono proteine che possono legarsi e integrarsi nelle cellule e nelle membrane degli organelli⁶. Queste possono essere raggruppate in tre categorie a seconda della forza di legame alla membrana e della loro posizione: proteine ancorate ai lipidi, proteine integrali e proteine di membrana periferica ^7,8. Una proteina transmembrana (TMEM) è una proteina di membrana integrale costituita da almeno un segmento^{transmembrana 9}, che passa completamente o parzialmente attraverso la membrana biologica.

Sebbene i meccanismi d'azione delle proteine appartenenti alla famiglia TMEM non siano ben compresi, è noto che queste proteine sono coinvolte in diversi tipi di tumori¹⁰. Diverse proteine TMEM sono associate a fenotipi migratori, proliferativi e invasivi e la loro espressione è spesso associata alla prognosi di un paziente¹¹. Pertanto, i membri della famiglia TMEM sono diventati l'obiettivo della ricerca. Una revisione completa dei rapporti esistenti su TMEM ha rivelato che sono per lo più associati alla segnalazione inter- e intracellulare¹², alle malattie immuno-correlate e alla tumorigenesi¹⁰. Molti TMEM possiedono anche importanti funzioni fisiologiche, ad esempio i canali ionici nella membrana plasmatica, l'attivazione delle vie di trasduzione del segnale, nonché la mediazione della chemiotassi cellulare, l'adesione, l'apoptosi e l'autofagia¹⁰. Pertanto, abbiamo ipotizzato che le proteine TMEM possano essere importanti marcatori prognostici nell'individuazione e nel trattamento dei tumori.

TMEM200A'espressione è significativamente elevata nel carcinoma gastrico (GC). Una maggiore espressione di TMEM200A¹³, che ha otto esoni e una lunghezza completa di 77,536 kb sul cromosoma 6q23.1, è stata collegata a una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza globale (OS) nei casi di GC. Tuttavia, i cambiamenti nella sua espressione sono stati raramente riportati negli studi oncologici. Questo articolo confronta e analizza l'utilità della TMEM200A come bersaglio terapeutico e marcatore diagnostico del tumore in vari studi sul cancro utilizzando diversi set di dati disponibili pubblicamente. È stata valutata l'efficacia di TMEM200A come biomarcatore diagnostico e prognostico pan-cancro, nonché i suoi livelli di espressione in vari tipi di cancro umano utilizzando i dati RNA-seq dei database UCSC Xena e TCGA, nonché mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e western blotting.

L'effetto dei livelli di espressione TMEM200A sui tassi di mutazione, sui processi regolatori, sulla diagnosi e sulla prognosi del tumore, sull'infiltrazione immunitaria e sull'immunoterapia è stato ulteriormente studiato utilizzando un mix di strumenti computazionali e siti Web di set di dati. CBioPortal e i database COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) sono stati utilizzati per esaminare le mutazioni in TMEM200A. I siti web Sangerbox e TISIDB sono stati utilizzati per capire come TMEM200A influenza l'infiltrazione immunitaria. Lo strumento online del Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e il database CancerSEA sono stati utilizzati per studiare la funzione di TMEM200A. Infine, per valutare l'impatto della TMEM200A sul comportamento maligno e sulla funzione di sviluppo tumorale delle cellule GC, è stato condotto un esperimento di perdita di funzione in un test in vitro . Inoltre, è stato eseguito il western blotting per valutare in che modo TMEM200A knockdown ha influenzato la via di segnalazione PI3K/AKT e la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nella GC.

Protocol

1. Il database dell'Atlante del Genoma del Cancro (TCGA)

NOTA: Il database Cancer Genome Atlas (TCGA) contiene i dati di sequenziamento dei geni in diversi tessuti tumorali¹⁴. I dati RNA-seq in TCGA per lo studio dei formati di trascritti TMEM200A per parte per milione (TPM) sono stati estratti dal sito web UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) e log2 trasformato per confrontare le espressioni tra i campioni.

1. Vai all'interfaccia del sito Web UCSC Xena .
2. Fare clic sulla scheda Avvia Xena .
3. Fare clic sulla scheda SET DI DATI nella parte superiore dello schermo.
4. Dalle 129 coorti e 1.571 set di dati in questa pagina, fai clic sulla scheda per un totale di 33 tumori come la leucemia mieloide acuta GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Cancro corticosurrenalico (ACC), GDC TCGA Cancro del dotto biliare (CHOL) e altri.
5. Dal menu RNAseq di espressione genica , selezionare e fare clic sulla scheda HTSeq - FPKM GDC Hub .
   NOTA: HTSeq - FPKM GDC Hub rappresenta i dati che sono stati corretti con il consenso.
6. Dal menu di download , fare clic sul collegamento corrispondente.
   NOTA: Con il metodo di cui sopra, sono stati scaricati i dati RNA-Seq per 33 diversi tipi di cancro.
7. Decomprimere l'archivio zip dei dati RNA-seq per 33 diversi tipi di cancro in un unico file nella cartella desktop del computer.
8. Unifica i file txt decompressi nella stessa cartella e posiziona gli script Perl in questa cartella.
9. Aprire il software Perl , copiare e incollare il percorso della cartella nel software Perl in cui si trova il cursore del mouse, premere il tasto Invio , inserire il nome del codice Perl e il nome del gene (TMEM200A), quindi premere il tasto Invio per ottenere un nuovo file txt (singleGeneExp.txt).
   NOTA: Questo nuovo file txt (singleGeneExp.txt) contiene l'espressione genica di TMEM200A in 33 tumori in diversi pazienti.
10. Aprire il codice R (diffR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file singleGeneExp.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
11. Aprire il software R, eseguire il codice R modificato (diffR) e disegnare l'immagine tramite il pacchetto "ggpubr".

2. Il database TIMER2.0

1. Vai all'interfaccia del sito Web del database TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) ¹⁶.
2. Fare clic sulla scheda Esplorazione del cancro.
3. Immettere l'ID del gene (TMEM200A) nella casella di ricerca e fare clic sulla scheda Invia per ottenere le immagini di espressione differenziale di TMEM200A in diversi tipi di tumori.

3. Atlante delle proteine umane (HPA)

1. Accedere all'interfaccia Web dell'Atlante delle proteine umane (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷.
2. Digita ID (TMEM200A) nella casella di ricerca e fai clic sul pulsante Cerca . Selezionare il sottoatlante TISSUE.
3. Passa il mouse sopra la pagina e scorri verso il basso per trovare la scheda Panoramica dell'espressione proteica .
   NOTA: La sezione Panoramica sull'espressione proteica mostra i livelli di espressione proteica di TMEM200A in 45 organi del corpo umano.

4. L'array della piattaforma di metilazione del DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium

NOTA: L'array della piattaforma di metilazione del DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium è stato utilizzato per raccogliere dati sulla metilazione. Abbiamo potuto valutare i TMEM200A livelli di metilazione del DNA utilizzando il database SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)¹⁸.

1. Vai all'interfaccia del sito Web SMART .
2. Inserisci l'ID del gene (TMEM200A) nella casella di ricerca per ottenere la distribuzione di TMEM200A nei cromosomi e il livello di metilazione di TMEM200A nei diversi tipi di neoplasie.
3. Scorrere la pagina verso il basso fino al menu Fare clic per controllare la metilazione aggregata CpG e fare clic sul pulsante Traccia . Nella parte inferiore della pagina, trova e fai clic sul pulsante Scarica figura . Scarica la figura.

5. La banca dati UALCAN

1. Vai all'interfaccia del sito web UALCAN .
   NOTA: I box plot dei livelli di metilazione del promotore TMEM200A in varie neoplasie sono stati generati attraverso il database UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹
2. Nella parte superiore della pagina, fai clic sul pulsante TCGA .
3. Immettere TMEM200A nella casella di input ID gene sullo schermo. Nel menu del set di dati TCGA , scorri verso il basso e seleziona il tipo di cancro da interrogare.
4. Dopo aver fatto clic sul pulsante Esplora , fare clic sull'analisi del sottogruppo Metilazione nel menu Collegamenti per l'analisi per ottenere i risultati della metilazione di questo tumore.
   NOTA: Con questo metodo, abbiamo ottenuto risultati di metilazione per 22 tumori nel database UALCAN .

6. Il database del Catalogo delle mutazioni somatiche nelle cellule tumorali (COSMIC)

1. Vai all'interfaccia del sito web del Catalogo delle mutazioni somatiche nelle cellule tumorali (COSMIC).
   NOTA: I dati sulle mutazioni codificanti, sui riarrangiamenti genomici mutanti non codificanti e sui geni di fusione nel genoma umano sono disponibili nel database ²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/) del Catalogo delle mutazioni somatiche nelle cellule tumorali (COSMIC), che viene utilizzato anche per determinare la frequenza di varie mutazioni TMEM200A in vari tumori.
2. Immettere l'ID del gene (TMEM200A) nella casella di ricerca e fare clic sul pulsante CERCA per passare a una nuova schermata.
3. Nel menu Geni, individuare e fare clic sul collegamento in cui viene visualizzato il nome dell'ID del gene del TMEM200A .
4. Trova la colonna Raggruppamento della distribuzione delle mutazioni nella nuova pagina per ottenere lo stato di mutazione di TMEM200A nel tumore.

7. CBioPortal

1. Vai all'interfaccia del sito web CBioPortal .
   NOTA: I dati genomici del cancro possono essere trovati, scaricati, analizzati e visualizzati utilizzando il database cBioPortal (www.cioportal.org). Le mutazioni somatiche, le variazioni del numero di copie del DNA (CNA), l'espressione di mRNA e microRNA (miRNA), la metilazione del DNA, l'abbondanza di proteine e l'abbondanza di fosfoproteine sono solo alcuni dei tipi di dati genomici integrati da cBioPortal²¹. Con cBioPortal è possibile effettuare un'ampia gamma di studi; Tuttavia, l'enfasi maggiore è posta su diverse analisi relative alle mutazioni e alla loro visualizzazione.
2. Selezionare il set di dati Pan-cancer analysis of whole genomes dalla sottosezione PanCancer Studies della sezione Select Studies for Visualization & Analysis . Quindi, fare clic sul pulsante Query By Gene .
3. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia query .
4. Fare clic sul pulsante Dettagliato del tipo di cancro nella parte superiore della pagina per ottenere le mutazioni di TMEM200A in vari tipi di cancro.

8. Strumento Sangerbox 3.0

1. Vai all'interfaccia dello strumento Sangerbox 3.0 .
   NOTA: La correlazione dell'espressione di TMEM200A con le cellule infiltranti immunitarie, gli agenti immunosoppressori, i fattori immunostimolatori e le molecole MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) in tutti i tumori è stata analizzata mediante l'infiltrazione immunitaria CIBERSORT utilizzando i dati di infiltrazione immunitaria pan-cancerogena nello strumento Sangerbox 3.0²² (http://vip.sangerbox.com/).
2. Dalla barra degli strumenti sul lato sinistro della pagina, selezionare e fare clic sulla scheda Analisi immunocellulare (CIBERSORT) dal menu Analisi pan-cancro .
3. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia .

9. Banca dati TISIDB

1. Vai all'interfaccia del sito web di TISIDB .
   NOTA: Il database TISIDB²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/) è stato utilizzato per esaminare la correlazione dell'espressione di TMEM200A con cellule infiltranti immunitarie, agenti immunosoppressori, fattori immunostimolatori e molecole MHC in vari tumori.
2. Immettere il simbolo del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia .
3. Fare clic sulle sezioni Linfociti, Immunomodulatori, Chemochine e Sottotipo nella parte superiore della pagina. Scarica le relative immagini in fondo alla pagina.

10. La banca dati TIDE

1. Vai all'interfaccia del sito web di TIDE .
   NOTA: Il database TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) è stato utilizzato per valutare il potenziale di TMEM200A come biomarcatore per predire la risposta alla terapia di blocco del checkpoint immunitario tumorale.
2. Inserisci l'indirizzo e-mail nella schermata iniziale per registrare l'account e accedere.
3. Trova la sottosezione Valutazione dei biomarcatori nella parte superiore della pagina e fai clic su di essa.
4. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query per Immettere i geni nella parte inferiore della pagina. Quindi, fai clic sul pulsante Invia .
5. Nella pagina, trascinare il mouse per far scorrere la pagina verso il basso e trovare i risultati dell'analisi.

11. La banca dati CancerSEA

1. Vai all'interfaccia del sito web di CancerSEA .
   NOTA: Utilizzando i dati di sequenziamento di singole cellule, sono state studiate le relazioni tra l'espressione di TMEM200A e lo stato funzionale di diverse cellule tumorali. Ciò è stato fatto utilizzando il database CancerSEA²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
2. Nella parte superiore della pagina, trova e fai clic sulla scheda Cerca .
3. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia .

12. Lo strumento di rete del centro a singola cellula immune al tumore (TISCH)

1. Vai all'interfaccia del sito Web dello strumento di rete TISCH (Tumor Immune Single-Cell Center).
   NOTA: La correlazione tra i livelli di espressione delle cellule TMEM200A e tumorali è stata dimostrata anche utilizzando lo strumento di rete TISCH (Tumor Immune Single-Cell Center)²⁵.
2. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fai clic sul pulsante Esplora .
3. Nel menu Tipo di cancro in questa pagina, selezionare e fare clic sul set di dati Tutti i tumori . Quindi, scorri la pagina verso il basso e fai clic sul pulsante Cerca .

13. GeneMANIA

1. Vai all'interfaccia del sito web di GeneMANIA .
   NOTA: La correlazione tra TMEM200A e i suoi geni funzionalmente rilevanti è stata prevista utilizzando la strategia di integrazione per la rete multi-associazione genica Website GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶ per la costruzione di reti di interazione gene-gene (GGI).
2. Nella casella di ricerca in alto a sinistra della pagina, inserisci l'ID del gene (TMEM200A) e fai clic su Strumenti di ricerca.
   NOTA: Lo strumento web GeneMANIA è stato utilizzato per trovare 20 geni associati a TMEM200A.

14. Analisi dell'arricchimento funzionale

1. Salvare gli ID dei simboli dei geni da analizzare per l'arricchimento in formato file txt.
2. Aprire il codice R (symbolidR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file txt precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
3. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (symbolidR). Converti gli ID simbolo di questi geni in entrezID tramite il comando "org. Hs.eg.db". Ottenere il file id.txt .
4. Apri il codice R (GOR e KEGGR) e copia e incolla il percorso in cui si trova il file id.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
5. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (GOR e KEGGR). Per seguire questo protocollo, analizza questi geni per l'arricchimento GO e KEGG da parte dei pacchetti "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" e "enrichplot" e tracciare i risultati dell'arricchimento usando il pacchetto "gglot2".

15. Analisi delle differenze nell'attività genica

NOTA: TMEM200A punteggio in ciascun campione di cancro è stato calcolato utilizzando ssGSEA (analisi di arricchimento del set genico a campione singolo)²⁷ e l'analisi differenziale dell'attività genica di TMEM200A nei tessuti cancerosi e sani è stata eseguita per vari tumori.

1. Sulla base dei dati RNA-seq di 33 tipi di tumore scaricati nel passaggio 1.7, decomprimere tutti i file scaricati e inserirli in una cartella unificata.
2. Posiziona il file merge.txt nella cartella precedente.
   NOTA: I dati in merge.txt file di BioWolf (www.biowolf.cn) contengono l'espressione genica per tutti i pazienti in tutti i tumori nel database The Cancer Genome Atlas (TCGA).
3. Aprire il codice R (ssGSEAR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova la cartella precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
4. Prendi la riga in cui geneName si trova nel codice R (ssGSEAR) e inserisci l'ID gene (TMEM200A).
5. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (ssGSEAR). Ottenere il file di punteggio per l'attività genica: scores.txt.
   NOTA: Con l'algoritmo ssGSEA, costruiamo prima un file di set di geni basato sui coefficienti di correlazione tra i geni in base ai dati forniti nel file merge.txt e identifichiamo i geni con una correlazione più alta con il gene bersaglio (TMEM200A) dal file. Quindi, i geni con una correlazione più alta vengono unificati come i geni attivi di TMEM200A e, infine, otteniamo il punteggio dei geni attivi in ciascun campione.
6. Aprire il codice R (scoreDiffR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file scores.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
7. Aprire il software R, eseguire il codice R modificato (scoreDiffR) e disegnare l'immagine tramite i pacchetti "plyr", "reshape2" e "ggpubr".

16. Correlazione clinicopatologica e analisi della prognosi di sopravvivenza

1. Vai all'interfaccia del sito Web UCSC Xena .
2. Fare clic sulla scheda Avvia Xena .
3. Fare clic sulla scheda SET DI DATI nella parte superiore dello schermo.
4. Passa il mouse sopra la pagina e scorri verso il basso per trovare la scheda TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
5. Dalle 129 coorti e dai 1.571 set di dati in questa pagina, fare clic sulla scheda TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
6. Dal menu fenotipo , selezionare e fare clic sulla scheda Dati clinici curati.
7. Dal menu di download , fare clic sul collegamento corrispondente.
   NOTA: Scarica i dati clinici per 33 tumori dal database TCGA al link sopra.
8. Decomprimere il file di dati clinici scaricato e aprire il file decompresso in formato file xls.
9. Organizzare e conservare i dati clinici necessari (stadio, età, stadio patologico e stato del paziente) nel file, eliminare i dati clinici rimanenti non necessari e salvare l'intero file come file in formato txt dopo averlo rinominato clinico.
10. In base alle singleGeneExp.txt ottenute nel passaggio 1.9, inserire questo file nella stessa cartella del file clinical.txt organizzato.
11. Decomprimere i dati clinici scaricati e posizionare i file singleGeneExp.txt e clinical.txt nella stessa cartella dei file clinici decompressi.
12. Aprire il codice R (clinicalDiffR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova la cartella precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
13. Aprire il software R, eseguire il codice R modificato (clinicalDiffR) e disegnare l'immagine usando il pacchetto "ggpubr".
14. Vai all'interfaccia del sito Web UCSC Xena .
15. Fare clic sulla scheda Avvia Xena .
16. Fare clic sulla scheda SET DI DATI nella parte superiore dello schermo.
17. Dalle 129 coorti e 1.571 set di dati in questa pagina, fai clic sulla scheda per un totale di 33 tumori come la leucemia mieloide acuta GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Cancro corticosurrenalico (ACC), GDC TCGA Cancro del dotto biliare (CHOL) e altri.
18. Dal menu fenotipo , selezionare e fare clic sulla scheda dei dati di sopravvivenza.
19. Dal menu di download , fare clic sul collegamento corrispondente.
20. Decomprimere l'archivio zip dei dati di sopravvivenza per 33 diversi tipi di cancro in un unico file nella cartella desktop del computer.
21. Inserire i dati di sopravvivenza decompressi nella stessa cartella del file singleGeneExp.txt ottenuto nel passaggio 1.9.
22. Apri il codice R (preOSR) e copia e incolla il percorso in cui si trova la cartella precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
23. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (preOSR). Calcola attraverso il pacchetto "limma" per ottenere un file di dati sulla sopravvivenza del TMEM200A nel pan-cancro: expTime.txt.
24. Aprire il codice R (OSR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file expTime.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
25. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (OSR). Eseguire un'analisi KM utilizzando i pacchetti "survival" e "survminer" in base ai dati nel file expTime.txt e tracciare le curve di sopravvivenza per TMEM200A nel pan-cancro.

17. Analisi di regressione di Cox univariata e multivariata con costruzione di parcelle forestali

1. Aprire il codice R (COXR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file expTime.txt dalla versione 16.23 alla riga in cui si trova setwd nel codice R.
2. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (COXR). Sulla base dei dati nel file expTime.txt , eseguire analisi di regressione COX univariate utilizzando i pacchetti "survival", "survminer" e "forestplot" per tracciare un grafico univariato -forest di TMEM200A in diversi tumori.
3. Inserire il file expTime.txt del passaggio 16.23 e clinical.txt del passaggio 16.10 nella stessa cartella.
4. Aprire il codice R (multicoxR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova la cartella contenente il file expTime.txt del passaggio 16.23 e clinical.txt file del passaggio 16.10 nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
5. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (multicoxR). Eseguire un'analisi di regressione COX multivariata utilizzando i pacchetti "survival" e "survminer" per tracciare un grafico multivariato della foresta di TMEM200A in diversi tumori in base ai dati nei file expTime.txt e clinical.txt .

18. Modello prognostico del carcinoma gastrico basato sull'espressione TMEM200A e sulle caratteristiche cliniche

1. Inserire il file clinical.txt del passaggio 16.10 e il file expTime.txt del passaggio 16.23 nella stessa cartella.
2. Apri il codice R (NomoR) e copia e incolla il percorso in cui si trova il file txt precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
3. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (NomoR). Utilizzare i pacchetti software "survival", "regplot" e "rms" per i dati di espressione TMEM200A nei GC e nei dati clinici per costruire un modello prognostico per prevedere la sopravvivenza del paziente.

19. Coltura cellulare e trasfezione di siRNA di TMEM200A

NOTA: Le cellule umane STAD HGC-27, le cellule SGC-7901 e le cellule GES-1 epiteliali della mucosa gastrica umana sono state ottenute commercialmente (vedere la tabella dei materiali), rianimate, inoculate nel terreno completo 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contenente il 10% di siero fetale neonatale bovino e l'1% di miscela di penicillina) e coltivate a 37 °C in un 5% di CO₂ incubatore per colture cellulari. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni 2-3 giorni. Le cellule in buone condizioni di crescita sono state inoculate in piastre da sei pozzetti secondo (2-3) × 10^{5 cellule} per pozzetto.

1. Innanzitutto, prelevare tre provette per microcentrifuga e aggiungere 8 μL di reagente di trasfezione (vedere la Table dei materiali) e 200 μL di terreno basale a ciascuna provetta. Quindi, aggiungere 4 μg di SiRNA1, SiRNA2 e SiRNA3 rispettivamente a ciascuna provetta.
   NOTA: Per TMEM200A knockdown, il siRNA è stato progettato e acquistato (vedere la tabella dei materiali).
2. Mescolare accuratamente la miscela nelle tre provette per microcentrifuga e aggiungerla a ciascuno dei tre pozzetti della piastra a 6 pozzetti. Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti per distribuire uniformemente la miscela. Etichettare i tre pozzetti in cui è stata aggiunta la miscela come SiRNA-1, SiRNA-2 e SiRNA-3.
3. Quando le cellule sono state incubate per 4-6 ore, sostituire metà del terreno nei tre sottopozzetti nella piastra a 6 pozzetti.
   NOTA: Quando si sostituisce metà del terreno completo, aspirare metà del terreno completo originale e rabboccare con metà del terreno completo fresco.
4. Da 24 a 48 ore dopo, utilizzare TMEM200A cellule trasfettate con siRNA come gruppo sperimentale e cellule non trasfettate come gruppo di controllo negativo. Eseguire la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR, vedere paragrafo 20) per valutare l'effetto della trasfezione sulle cellule.

20. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale

1. Scartare il terreno di coltura cellulare in ciascun sottogruppo e lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento dell'RNA (vedere la tabella dei materiali).
3. Stimare la concentrazione di RNA e sintetizzare il cDNA con 1 μg di RNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA, seguendo le istruzioni del produttore.
4. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) su diluizioni di 10 volte di cDNA in 10 μL di miscela di reazione, inclusi primer diretti e inversi specifici per l'uomo per GAPDH (per la standardizzazione), TMEM200A (vedere la tabella dei materiali) e qPCR Master Mix, utilizzando il sistema di analisi PCR in tempo reale.
   NOTA: Eseguire ogni esperimento in triplice copia.
5. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione qPCR: inizializzazione, 95 °C per 3 min; denaturazione, 95 °C per 10 s; ricottura, 60 °C per 30 s; ed estensione, 80 °C per 10 s; Ripetere la denaturazione, la ricottura e l'estensione 40 volte. Determinare l'espressione relativa di ciascun gene utilizzando la tecnica ^{2-ΔΔCt 28}.
6. Ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici.

21. Rilevamento Western blot dell'espressione proteica rilevante

1. Scartare il terreno di coltura cellulare in ciascun sottogruppo e lavare delicatamente le cellule con 2 x 1 mL di PBS.
2. Raffreddare le piastre a 6 pozzetti contenenti le cellule sul ghiaccio e aggiungere 150 μL di tampone di lisi RIPA (test di precipitazione radioimmunitaria) preraffreddato (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e cocktail di inibitori della proteasi appena aggiunti). Lasciare che la lisi proceda sul ghiaccio per 10 minuti.
3. Utilizzando un raschietto per cellule di plastica, rimuovere le cellule aderenti dal piatto e trasferire delicatamente la soluzione cellulare in una provetta per microcentrifuga preraffreddata.
4. Centrifugare il lisato cellulare per 10 minuti a 1,5 × 10⁴ g a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
5. Utilizzare un kit di analisi delle proteine BCA per determinare il contenuto proteico secondo le istruzioni del produttore.
6. Caricare 30 g di proteine da ciascun campione su un gel di elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecilsolfato al 10% (SDS-PAGE) e far funzionare a 80 V per 0,5 ore, seguite da 1,5 ore a 120 V.
7. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF) da 45 μm a una tensione di 300 mA per 1-1,5 ore.
8. Dopo aver posizionato la membrana in PVDF su uno shaker e averla agitata per 3 x 5 minuti, aggiungere soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) nel contenitore appropriato con il lato proteico (lato gel) rivolto verso l'alto.
9. Posizionare la membrana nel tampone bloccante (vedere la tabella dei materiali) e incubarla per 0,5 ore a temperatura ambiente.
10. Lavare la membrana con TBST per 3 x 10 min.
11. Incubare la membrana con anticorpi primari contro fosfo-AKT (p-AKT; 1:1.000), AKT totale 1:1.000, E-caderina (E-ca; 1:1.000), N-caderina (N-ca; 1:1.000), Vimentina 1:1.000, lumaca 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1:1.000), per una notte a 4 °C.
12. Lavare la membrana per 3 x 10 minuti e incubarla con un anticorpo secondario di coniglio o topo (1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente.
13. Incubare la membrana in PVDF con substrato ECL per 30 secondi e rilevare il segnale utilizzando un sistema di imaging.

22. Saggio CCK-8

1. Seminare cellule umane STAD HGC-27 in buone condizioni di crescita in piastre a 96 pozzetti.
2. Quando la densità cellulare raggiunge il 60-70%, trasfettare le cellule con TMEM200A siRNA (come nel passaggio 19.3).
3. Seminare le cellule trasfettate in piastre da 96 pozzetti con una densità cellulare di 5 × 10 ³/pozzetto (contare le cellule vitali utilizzando un contatore di cellule), divise in gruppi NC e TMEM200A siRNA (con tre pozzetti replicati in ciascun gruppo) e incubate a 37 °C.
4. Aggiungere il reagente CCK-8 dopo 0, 24, 48, 72 e 96 ore e incubare a 37 °C per 2 ore. Misurare l'assorbanza (450 nm) utilizzando un etichettatore enzimatico multifunzionale.

Representative Results

Espressione di TMEM200A in vari tumori
Come illustrato nella Figura 1, abbiamo prima analizzato i livelli di espressione differenziale di TMEM200A in vari tumori attraverso diversi database. TMEM200A'espressione è risultata elevata nel colangiocarcinoma (CHOL), nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSC), nel carcinoma renale a cellule chiare (KIRC), nel carcinoma a cellule papillari renali (KIRP), nel carcinoma epatocellulare (LIHC), nello STAD e nel carcinoma tiroideo (THCA) rispetto ai tessuti normali adiacenti esclusivamente sulla base dei dati TCGA. Tuttavia, l'espressione di TMEM200A è diminuita nel carcinoma uroepiteliale della vescica (BLCA), nel carcinoma a cellule squamose cervicali e nell'adenocarcinoma cervicale (CESC), nel glioblastoma multiforme (GBM), nel cromofobo renale (KICH), nel carcinoma squamoso polmonare (LUSC), nel feocromocitoma e paraganglioma (PCPG), nell'adenocarcinoma rettale (READ) e nel carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC) (Figura 2A). Nel database TIMER2.0, l'espressione di TMEM200A è aumentata in CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC e STAD. Inoltre, l'espressione di TMEM200A è aumentata in BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, melanoma cutaneo (SKCM) e UCEC (Figura 2B).

Confrontando i risultati dei due database, abbiamo scoperto che l'espressione pan-cancerogena di TMEM200A era la stessa in ciascun database. Abbiamo ottenuto i dati di follow-up clinico e i dati di sequenziamento dell'RNA di 33 pazienti con cancro dal database TCGA, abbiamo calcolato il punteggio TMEM200A in ciascun campione di cancro utilizzando l'analisi ssGSEA, quindi abbiamo calcolato TMEM200A l'attività genica nel tumore e nei tessuti normali in molti tumori. Abbiamo scoperto che TMEM200A era altamente espresso in GBM, HNSC, KIRC renale e THCA (Figura 2C); Quindi, l'attività genica di TMEM200A è stata classificata in ciascun tessuto tumorale. È stato riscontrato che l'attività genica di TMEM200A era la più alta nel KIRC e la più bassa nel melanoma uveale (UVM) (Figura 2D). La successiva valutazione del database HPA dei livelli di espressione di TMEM200A nei tessuti umani ha mostrato che i livelli di espressione di TMEM200A erano bassi nella maggior parte dei tessuti normali, ma elevati nella corteccia surrenale, nel retto, nell'endometrio e nella muscolatura liscia (Figura 2E).

Nelle linee cellulari tissutali normali, alcune linee cellulari come le cellule della granulosa, le cellule bipolari, le cellule muscolari scheletriche, le cellule stromali endometriali e le cellule T hanno mostrato un'elevata espressione di TMEM200A, mentre TMEM200A espressione era bassa nella maggior parte delle altre linee cellulari (Figura 2F). Abbiamo anche esaminato i dati di immunoistochimica (IHC) nel database HPA per esaminare l'espressione di TMEM200A a livello proteico. I dati relativi alla colorazione e all'intensità hanno rivelato livelli di espressione molto maggiori e più pronunciati di TMEM200A nei tessuti del cancro del colon-retto (CRC), del polmone (LUAD), del fegato (LIHC), del cancro al seno (BRCA) e del cancro alla prostata (PRAD) rispetto ai tessuti normali (Figura 2G). Questi risultati hanno suggerito che TMEM200A era ampiamente espresso in diversi tipi di cancro e influenzava lo sviluppo del cancro attraverso meccanismi diversi in diversi tumori.

Relazione clinicopatologica e prognosi di sopravvivenza
Per 33 neoplasie maligne umane, sono state raccolte informazioni e dati clinici nella coorte pan-cancerogena TCGA (PanCan) dal sito web del database UCSC Xena e ha studiato la correlazione tra l'espressione di TMEM200A in PanCan e l'età, il grado patologico, lo stadio clinicopatologico e lo stato di sopravvivenza del paziente. Questo studio ha rivelato che, in sei tumori, l'espressione di TMEM200A era associata allo stadio clinicopatologico, tra cui BLCA, carcinoma mammario invasivo (BRCA), carcinoma esofageo (ESCA), KIRP, SKCM e carcinoma testicolare (TGCT) (Figura 3A). L'età è stata correlata a sei tumori, tra cui BRCA invasivo, GBM, leucemia mieloide acuta (LAML), SKCM, carcinoma timico (THYM) e cancro dell'endometrio (UCEC) (Figura 3B). Il grado patologico è stato associato a sei tumori, tra cui il carcinoma esofageo (ESCA), HNSC, KIRC, glioma cerebrale di basso grado (LGG), adenocarcinoma pancreatico (PAAD) e carcinoma endometriale (UCEC) (Figura 3C). Lo stato di sopravvivenza è stato associato a cinque tumori, tra cui il carcinoma corticosurrenalico (ACC), BLCA, KIRC, PCPG e il melanoma uveale (UVM) (Figura 3D).

Sono stati condotti studi per diversi tumori su OS, DSS, PFI e DFI utilizzando l'analisi di regressione di Cox unidirezionale con una soglia di gruppo mediana per saperne di più sulla correlazione tra espressione TMEM200A e prognosi. I risultati dell'analisi della OS hanno rivelato che, tra i quattro tumori, una maggiore espressione di TMEM200A ha avuto un impatto maggiore sulla prognosi della OS in quattro tumori, tra cui il carcinoma corticosurrenalico (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), leucemia mieloide acuta (LAML) (P = 0,011) e GC (STAD) (P = 0,005). Al contrario, una maggiore espressione di TMEM200A ha avuto una prognosi migliore per la OS in cinque tumori, tra cui KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), glioma cerebrale di basso grado (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) e melanoma cutaneo (SKCM) (P = 0,043) (Figura 3E,F). Per il DSS, un'elevata espressione di TMEM200A ha avuto una prognosi sfavorevole in due tipi di tumore, tra cui il carcinoma corticosurrenalico (ACC) (P = 0,026) e il BLCA (P = 0,015). L'alta espressione di TMEM200A ha avuto una prognosi migliore in quattro tipi di tumore, tra cui KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), glioma cerebrale di basso grado (LGG) (P = 0,025) e PCPG (P = 0,007) (Figura 3G). Inoltre, per PFI, una maggiore espressione di TMEM200A ha avuto una prognosi sfavorevole in tre tipi di tumore, tra cui il carcinoma corticosurrenalico (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) e il melanoma uveale (UVM) (P = 0,020). Una maggiore espressione TMEM200A ha avuto una prognosi migliore in due tipi di tumore, tra cui KIRC (P < 0,001) e glioma di basso grado (LGG) (P = 0,044) del cervello (Figura 3H). Nella DFI, una maggiore espressione di TMEM200A aveva una prognosi peggiore nel carcinoma corticosurrenalico (ACC) (P = 0,044) (Figura 3I).

Successivamente, abbiamo selezionato diversi tumori (KIRC e KIRP) per l'analisi di regressione multi-COX. I risultati hanno mostrato che TMEM200A potrebbe influenzare individualmente il tasso di sopravvivenza dei pazienti oncologici rispetto ad altri fattori clinici (Figura 3J e K). Questi risultati hanno mostrato che TMEM200A potrebbe essere utilizzato come marcatore bioprognostico indipendente in diversi tumori per influenzare la sopravvivenza dei pazienti con cancro.

Analisi di metilazione del DNA
Una delle alterazioni epigenetiche che ha ricevuto la massima attenzione è la metilazione^{del DNA 29}. È stato suggerito che un tipo di cambiamento epigenetico, la metilazione del DNA, abbia un impatto significativo sulla crescita del tumore³⁰. Quindi, utilizzando il database SMART, abbiamo valutato i livelli di metilazione del DNA di TMEM200A nei tessuti normali e cancerosi. I tessuti PAAD e PRAD avevano livelli più elevati di metilazione del DNA di TMEM200A rispetto ai tessuti normali. Tuttavia, TMEM200A avevano livelli di metilazione del DNA più bassi in COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA e UCEC rispetto ai tessuti normali (Figura 4A). I livelli di metilazione del DNA di TMEM200A erano sostanzialmente più alti nel database TCGA in KIRP, PRAD, PCPG e THYM in base al database UALCAN (Figura 4B) ma non in BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA e UCEC. Il livello di metilazione di TMEM200A diminuito significativamente in LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA e UCEC (Figura 4C). Per esplorare ulteriormente la relazione tra il livello di espressione di TMEM200A e la metilazione del DNA e i fattori clinicopatologici, abbiamo nuovamente utilizzato il database SMART e abbiamo scoperto che il livello di metilazione del DNA di TMEM200A in BLCA, HNSC, LUAD e STAD cambiava con lo stadio patologico (Figura 4D). I fattori clinici influenzano il livello di metilazione del DNA di TMEM200A nei tumori di cui sopra.

Analisi delle mutazioni geniche
Una delle ragioni dello sviluppo dei tumori è l'accumulo di mutazioni genetiche³¹. Pertanto, la frequenza delle mutazioni somatiche TMEM200A è stata analizzata stimando la frequenza delle mutazioni TMEM200A in campioni clinici pan-cancerogeni utilizzando il database cBioPortal. TMEM200A è mutato in molti tumori, come il cancro del polmone, il carcinoma endometrioide uterino, il melanoma, il cancro dell'esofagogastrico, il cancro delle ossa, il cancro cervicale, il cancro epatobiliare, il linfoma a cellule B maturo, il BRCA, il cancro dell'endometrio, il cancro ovarico, il tumore embrionale, il cancro del pancreas, il cancro della testa e del collo, il CRC, il glioma, il carcinoma polmonare non a piccole cellule, il sarcoma dei tessuti molli e il cancro di origine sconosciuta (Figura 5A). Inoltre, le alterazioni del DNA possono portare a cambiamenti strutturali o aminoacidici a livello proteico. La Figura 5B mostra la struttura 3D di TMEM200A. Utilizzando il database cBioPortal, abbiamo trovato siti di mutazione negli amminoacidi di TMEM200A; le mutazioni missenso erano la forma più diffusa di mutazioni (Figura 5C).

Abbiamo analizzato i dati utilizzando Sangerbox 3.0 per verificare l'accuratezza dei siti di mutazione e abbiamo ottenuto gli stessi risultati di prima. Le mutazioni missenso sono la forma più frequente di mutazioni in TMEM200A e possono verificarsi fino al 7,8% nella SKCM (Figura 5D). Una mutazione missenso è una mutazione in cui un codone che codifica per un amminoacido subisce una sostituzione di base e diventa un codone che codifica per un altro amminoacido, con conseguente cambiamento nel tipo di amminoacido e nella sequenza della catena polipeptidica. Il risultato della mutazione missenso è di solito che la catena polipeptidica perde la sua funzione originale. Molte anomalie proteiche sono causate da una mutazione missenso, che è un tipo comune di mutazione tumorale. È stato scoperto che le mutazioni missenso svolgono un ruolo chiave nella stabilità delle proteine e la presenza di mutazioni può avere un effetto significativo sull'affinità di legame tra le proteine³², alterando le interazioni tra le proteine e le macromolecole correlative^{circostanti 33}.

Pertanto, le mutazioni missenso molto probabilmente influenzano la funzione biologica della proteina transmembrana 200A in diversi tumori. È stata inoltre esaminata la correlazione tra TMEM200A mutazione genica e la prognosi clinica di sopravvivenza dei pazienti affetti da cancro. La probabilità di OS è aumentata rispetto a quella del gruppo TMEM200A-mutato, ma non nel gruppo libero da malattia (Figura 5E). Lo studio delle correlazioni geniche ha rivelato che TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 e SLC18B1 erano tra i geni che co-mutavano con TMEM200A (Figura 5F). Siamo stati in grado di identificare diversi tipi di mutazioni e variazioni a singolo nucleotide (SNV) attraverso il database COSMIC per saperne di più sulle mutazioni TMEM200A in GC. La frequenza delle sostituzioni missenso è stata la più alta (38,86%) (Figura 5G) e i dati SNV hanno mostrato che gli SNV più comuni nella STAD erano G>A (31,73%), seguiti da C>T (26,35%) e G>T (11,73%) (Figura 5H).

Analisi a singola cellula di TMEM200A nel cancro
Abbiamo analizzato i livelli di espressione TMEM200A in diverse singole cellule utilizzando il sito web TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center). Lo strumento online TISCH ha mostrato l'espressione di TMEM200A per 65 set di dati e 28 tipi di cellule nella mappa termica mostrata nella Figura 6A. I risultati hanno mostrato che TMEM200A era principalmente espresso nelle cellule T CD8⁺ e nei fibroblasti. Il set di dati GSE72056, che include cellule di pazienti con melanoma cutaneo metastatico (SKCM), è degno di nota a questo proposito. TMEM200A era ampiamente espresso nelle cellule B, nei linfociti T CD4⁺, nelle cellule T CD8⁺ impoverite, nelle cellule endoteliali, nei fibroblasti e in altri tipi di cellule nel microambiente SKCM (Figura 6B,C). Nel set di dati GSE146771, che contiene cellule di pazienti con CRC, TMEM200A è stato ampiamente espresso nelle cellule B, nei linfociti T CD4⁺, nelle cellule T CD8+, nelle cellule T CD8⁺ impoverite, nelle cellule endoteliali, nei fibroblasti e in altri tipi di cellule nel microambiente CRC (Figura 6D,E). Utilizzando il database CancerSEA, sono stati determinati i livelli di espressione e lo stato funzionale di TMEM200A in specifiche cellule tumorali (Figura 6G). TMEM200A'espressione è risultata fortemente correlata con lo stato funzionale cellulare in una serie di tumori, tra cui il glioblastoma (GBM), l'adenocarcinoma polmonare (LUAD), la leucemia granulocitica cronica (LMC), il CRC, il retinoblastoma (RB) e il melanoma uveale (UM). L'angiogenesi, l'apoptosi, la differenziazione e l'infiammazione sono state tutte correlate positivamente con l'espressione di TMEM200A nella maggior parte delle cellule tumorali, mentre il danno al DNA, la riparazione, l'invasione e il metabolismo del DNA sono stati correlati negativamente con l'espressione di TMEM200A (Figura 6F).

Analisi dell'arricchimento funzionale e del pathway di TMEM200A in vari tumori
Abbiamo esaminato il legame tra TMEM200A e proteine con funzioni simili utilizzando la rete GGI per esplorare la funzione di TMEM200A in diversi tumori (Figura 7A). Le informazioni genomiche e proteomiche vengono analizzate da GeneMANIA utilizzando una lista di query di geni bersaglio. Individuando geni che funzionano in modo simile a TMEM200A, sono state scoperte le 40 proteine che interagiscono direttamente con questo gene. La correlazione di questi geni è dimostrata dalla rete PPI (Figura 7B). Successivamente, le analisi di arricchimento GO e KEGG di questi 20 geni strettamente correlati a TMEM200A hanno rivelato che questi geni adiacenti erano per lo più implicati nella regolazione negativa del silenziamento genico da parte dell'RNA. L'analisi di KEGG ha rivelato che TMEM200A era abbondante nelle vie, tra cui la via di segnalazione Wnt e la senescenza cellulare (Figura 7C). L'analisi dell'arricchimento della OB ha mostrato che, nella funzione molecolare, TMEM200A era principalmente abbondante nei canali del calcio e nella regolazione negativa del silenziamento genico da parte dell'RNA (Figura 7D).

Analisi di correlazione tra TMEM200A e infiltrazione immunitaria
Abbiamo ulteriormente studiato la correlazione tra l'espressione TMEM200A e l'infiltrazione delle cellule immunitarie per dimostrare la correlazione tra TMEM200A e immunità al cancro. Abbiamo condotto l'analisi dell'infiltrazione immunitaria CIBERSORT utilizzando i dati pan-tumorali di Sangerbox 3.0. I risultati hanno mostrato che l'espressione di TMEM200A pan-tumorali era correlata con le cellule T CD8⁺, le cellule T CD4⁺, le cellule B, le cellule T helper, le cellule natural killer, le cellule T regolatorie, i monociti, i macrofagi, le cellule dendritiche, gli eosinofili, i basofili e i granulociti (Figura 8A). Successivamente, abbiamo esaminato la correlazione tra l'espressione di TMEM200A e i TIL (linfociti infiltranti il tumore) utilizzando il database TISIDB, mostrando una stretta correlazione tra l'espressione di TMEM200A e l'abbondanza di 28 TIL in diversi tipi di cancro (Figura 8B). Abbiamo utilizzato il database TISIDB per valutare la correlazione tra l'espressione di TMEM200A e i farmaci immunosoppressori nelle neoplasie umane per indagare più a fondo come gli immunomodulatori e l'espressione di TMEM200A fossero correlati. I risultati hanno mostrato che i livelli di espressione di TMEM200A erano significativamente correlati con gli agenti immunosoppressori in una varietà di tumori (Figura 8C). Correlazioni significative tra l'espressione di TMEM200A e alcuni agenti immunosoppressori sono state trovate nel cancro ai testicoli e nell'UM (Figura 8D-F). Abbiamo quindi eseguito un'analisi di correlazione dell'espressione di TMEM200A con fattori immunostimolatori e molecole MHC utilizzando il database TISIDB (Figura 8G,H). I risultati hanno mostrato che l'espressione di TMEM200A era correlata con immunostimolanti selezionati e molecole MHC nel carcinoma uroteliale della vescica, nel carcinoma testicolare, nel carcinoma corticosurrenalico e nell'UM (Figura 8I-L). Il passo successivo è stato quello di studiare la correlazione tra l'espressione di TMEM200A e i sottotipi immunologici o molecolari nella coorte TCGA PanCan nel database TISIDB. Abbiamo scoperto che i sottogruppi immunologici di nove distinti tipi di cancro si esprimevano TMEM200A in modo diverso, tra cui BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT e BRCA (Figura 8M). Inoltre, sei diverse forme tumorali con diversi sottogruppi molecolari, tra cui HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV e LUSC, hanno mostrato un'espressione variabile di TMEM200A (Figura 8N).

TMEM200A e analisi della risposta all'immunoterapia
L'efficacia degli inibitori di PD-1/PD-L1 è altamente correlata con il TMB e alcuni pazienti con tumori possono essere in qualche modo previsti utilizzando i marcatori TMB per l'efficacia dell'immunoterapia³⁴. L'instabilità dei microsatelliti (MSI) è il termine usato per descrivere la funzione di riparazione del mismatch del DNA difettoso (MMR) quando gli errori di replicazione dei microsatelliti non vengono corretti e si accumulano, modificando la lunghezza o la composizione di base dei microsatelliti³⁵. L'MSI è un marcatore tumorale di importanza clinica ³⁶. Abbiamo quindi valutato l'impatto dell'espressione di TMEM200A sull'immunoterapia studiando la correlazione tra l'espressione di TMEM200A e TMB o MSI. I risultati hanno dimostrato una sostanziale correlazione positiva tra l'espressione di TMEM200A e TMB in THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP e KIRC, ma TMEM200A espressione è risultata negativamente correlata con UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM e BRCA (Figura 9A). L'espressione di MSI e TMEM200A era fortemente e favorevolmente collegata nel TGCT, mentre TMEM200A espressione era significativamente e negativamente correlata con l'MSI in UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC e CHOL (Figura 9B). Abbiamo anche valutato il potenziale di TMEM200A come biomarcatore per esaminare l'efficacia dell'ICB. I risultati hanno mostrato che TMEM200A da solo prediceva le risposte degli ICB con un'accuratezza dell'Area Under Curve (AUC) > 0,5 in 7 delle 25 sottopopolazioni di ICB. TMEM200A mostrato un valore predittivo più elevato rispetto ai cloni di cellule T e B, entrambi con un valore di 5. Tuttavia, il valore di TMEM200A era inferiore a quello di TIDE (AUC > 0,5 in 11 sottopopolazioni ICB), punteggio MSI (AUC > 0,5 in 11 sottopopolazioni ICB), CD274 (AUC > 0,5 in 15 sottopopolazioni ICB), CD8 (AUC > 0,5 in 17 sottopopolazioni ICB), IFNG (AUC > 0,5 in 16 sottopopolazioni ICB) e Merck18 (AUC > 0,5 in 17 sottogruppi ICB) (Figura 9C). La prognosi di sopravvivenza infausta nelle coorti ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 e ICB_Hugo 2016_PD1 è stata correlata con un'elevata espressione TMEM200A. Tuttavia, TMEM200A knockdown ha migliorato la potenza di uccisione del tumore mediata dai linfociti nella coorte media di Kearney 2018 T_PD1 e Pan 2018 OT1 (Figura 9D).

Analisi di arricchimento GSEA di TMEM200A in diversi tumori
Abbiamo utilizzato i DEG tra TMEM200A sottogruppi ad alta espressione e TMEM200A sottogruppi a bassa espressione in 32 neoplasie maligne per esplorare le caratteristiche del cancro correlate al TMEM200A. Abbiamo scoperto una correlazione sostanziale tra l'immunodeficienza primaria, la via di segnalazione del recettore RIG (gene inducibile dall'acido retinoico)-I-like e l'espressione TMEM200A nel pan-cancro, in particolare in BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC e SKCM (Figura 10). L'acido ribonucleico della proteina citoplasmatica virale viene rilevato dalla via di segnalazione del recettore simile a RIG-I. I recettori simili a RIG-I possono influenzare la produzione di una varietà di citochine infiammatorie nel corpo attivando la via di segnalazione NF-kB coinvolgendo alcune proteine della giunzione intracellulare. Di conseguenza, la proteina transmembrana 200A (TMEM200A) può svolgere un ruolo cruciale nel reclutamento di proteine intracellulari da parte del recettore RIG-I-like. Questi risultati implicano una forte correlazione tra l'espressione TMEM200A e l'infiltrazione immunologica. Inoltre, l'analisi dell'arricchimento GSEA ha mostrato che l'espressione di TMEM200A pan-tumorali era correlata con la segnalazione delle chemochine, l'adesione cellulare, le connessioni dei recettori delle citochine, le vie di rilevamento della membrana cellulare e il controllo dell'autofagia (Figura 10). Le proteine transmembrana possono funzionare come molecole di adesione per influenzare il microambiente tumorale, oltre a svolgere un ruolo fondamentale nel controllo dell'ingresso di ioni calcio nella cellula dai serbatoi di calcio ³⁶. Pertanto, i risultati ottenuti dall'analisi dell'arricchimento GSEA possono essere dovuti al coinvolgimento di TMEM200A in molti processi fisiologici, tra cui l'attivazione delle vie di trasduzione del segnale, la formazione di canali ionici della membrana plasmatica e la regolazione della chemiotassi, dell'adesione, dell'apoptosi e dell'autofagia^{cellulare 9}.

Abbiamo identificato i primi 50 geni STAD sia positivamente che negativamente correlati con TMEM200A dal database LinkedOmics, che sono stati co-espressi in STAD, sotto forma di mappe termiche (Figura 11A,B). Sono stati valutati i primi 5 geni positivamente e i primi 5 geni associati negativamente a TMEM200A in GC (Figura 11C). I nostri risultati hanno mostrato che l'espressione di TMEM200A era correlata con la co-espressione di SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) e SYTL1 (r = -0,33). Abbiamo analizzato i risultati della visualizzazione delle soglie per comprendere meglio il ruolo dei TMEM200A nella STAD. Per lo screening sono stati utilizzati i seguenti criteri: variazione log2 volte (FC) > 2,0 e valore P aggiustato 0,05. Abbiamo trovato 483 DEG, di cui 385 sovraregolati e 98 sottoregolati, e ne abbiamo scelti 100 da visualizzare per creare una mappa di calore (Figura 11D). Quindi, per i DEG che soddisfacevano i criteri di screening, abbiamo eseguito analisi di arricchimento GO e KEGG. I risultati dell'analisi dell'arricchimento di OB hanno mostrato che l'arricchimento di BP (processo biologico) era principalmente associato alla matrice extracellulare e al tessuto strutturale, l'arricchimento di CC (componente cellulare) era principalmente associato alla matrice extracellulare contenente collagene e alla membrana basale e MF (funzione molecolare) era principalmente arricchito in una struttura di matrice extracellulare e legame con i glicosaminoglicani (Figura 11E e Figura 11G). L'arricchimento dell'analisi KEGG ha mostrato che TMEM200A è stato arricchito principalmente nella via di interazione del recettore della matrice extracellulare, nel citocromo P450 e nel sistema renina-angiotensina (Figura 11F e Figura 11H).

Modello prognostico basato su TMEM200A e caratteristiche cliniche del carcinoma dello stomaco
Abbiamo studiato la correlazione tra TMEM200A e i dati clinici dei pazienti con STAD e quindi analizzato le caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti nella coorte TCGA-STAD mediante analisi di regressione logistica e sulla base dei livelli di espressione TMEM200A (Figura 12A). L'età, lo stadio clinico e l'espressione TMEM200A erano tutti sostanzialmente correlati con la sopravvivenza globale nei pazienti con STAD, secondo un'analisi di regressione di Cox univariata (Figura 12B). L'analisi di regressione multivariata di Cox ha mostrato che l'espressione di TMEM200A potrebbe essere un fattore predittivo autonomo per la OS nei pazienti con STAD (HR = 1,282, IC 95% = 1,066-1,541, P = 0,008) (Figura 12C). Abbiamo esaminato il potenziale di queste caratteristiche clinicopatologiche per predire la sopravvivenza globale dopo 1, 3 e 5 anni in STAD utilizzando il modello standard di grafico a colonne in combinazione con diversi parametri clinici (Figura 12D). Le curve di calibrazione per le probabilità di sopravvivenza a 1 anno erano altamente coerenti con le probabilità previste dal grafico a colonna (Figura 12E).

TMEM200A upregulation nelle cellule STAD e miglioramento della proliferazione cellulare
Esaminando la letteratura relativa alla TMEM200A, abbiamo scoperto che l'elevata espressione di TMEM200A indicava una prognosi sfavorevole ¹³ e il microambiente immunitario GC potrebbe essere influenzato dal TMEM200A che agisce come molecola di adesione³⁷, promuovendo così l'invasione e la metastasi delle cellule GC. Abbiamo esaminato i livelli proteici e i livelli di trascrizione dell'mRNA di TMEM200A nelle linee cellulari STAD per confermare i risultati dello studio di cui sopra. La linea cellulare GC HGC-27 ha drammaticamente sovraespresso TMEM200A rispetto alla linea cellulare epiteliale sana della mucosa gastrica GES-1 sia a livello di trascritto proteico che di mRNA (Figura 13A, B), indicando che TMEM200A era sovraespresso nelle cellule HGC-27. Di conseguenza, sono stati condotti i seguenti test utilizzando celle HGC-27. Nel frattempo, per dimostrare l'accuratezza dei risultati sperimentali, abbiamo utilizzato la qRT-PCR per confrontare l'espressione differenziale dell'mRNA di TMEM200A nelle cellule GC umane SGC-7901 e nelle cellule epiteliali della mucosa gastrica GES-1 e i risultati hanno mostrato che TMEM200A era altamente espresso nelle cellule SGC-7901 (Figura 13B). TMEM200A è stato abbattuto in cellule HGC-27 per esaminare il possibile coinvolgimento di TMEM200A nella STAD (Figura 13C). Sulla base dei risultati dell'estrazione del database e della nostra analisi di correlazione di TMEM200A, è stato scoperto che TMEM200A era principalmente coinvolto nella via di interazione dei recettori della matrice extracellulare, che era associata alla proliferazione e all'invasione del cancro. Abbiamo quindi utilizzato saggi CCK-8 per accertare come l'espressione TMEM200A influenzasse la crescita cellulare. I saggi CCK-8 hanno mostrato che TMEM200A gruppi knockdown (Si-RNA2 e Si-RNA3) hanno mostrato un notevole calo della vitalità cellulare rispetto al gruppo NC (Figura 13D). Questi risultati hanno suggerito che TMEM200A era sovraregolato nella STAD e il suo livello di espressione potrebbe influenzare la proliferazione delle cellule GC. Sulla base dei risultati dell'analisi dell'arricchimento di KEGG nella Figura 11F, abbiamo scoperto che TMEM200A era associato alla via di segnalazione PI3K/AKT nella GC e TMEM200A, come fattore di adesione cellulare, può influenzare il meccanismo della carcinogenesi gastrica influenzando l'EMT. Pertanto, abbiamo utilizzato il western blotting per verificare gli effetti del knockdown di TMEM200A sull'EMT e sulla via di segnalazione PI3K/AKT prima e dopo il knockdown. I risultati hanno mostrato che l'espressione della proteina P-AKT era diminuita nel gruppo knockdown TMEM200A (TMEM200A-SiRNA2) rispetto al gruppo di controllo negativo (NC), mentre anche i livelli di N-caderina, Vimentina e proteine Snai erano diminuiti e l'espressione della proteina E-caderina era aumentata (Figura 13E). Tutti questi risultati suggeriscono che TMEM200A possono influenzare l'EMT attraverso la via di segnalazione PI3K/AKT e quindi svolgere un ruolo nella GC.

Figura 1: Il flusso di lavoro dello studio. Abbreviazioni: TCGA = The Cancer Genome Atlas database; TIMER2.0 = Il database TIMER2.0; OS= sopravvivenza globale; PFS = Tempo di sopravvivenza libera da progressione; DSS = Sopravvivenza specifica per malattia; DFS = Sopravvivenza libera da malattia; TMB = carico mutazionale del tumore; MSI = Instabilità dei microsatelliti; PPI = Interazione proteina-proteina; GGI = Interazione gene-gene; KEGG = Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto; GO = Ontologia genica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Livelli di espressione di TMEM200A in diversi tipi di cancro. (A) Aumento o riduzione dell'espressione di TMEM200A dal set di dati TCGA in diverse neoplasie umane. (B) Analisi dei livelli di espressione di TMEM200A in tessuti tumorali e normali utilizzando il database TIMER2.0. (C) Analisi differenziale dell'attività genica di TMEM200A in vari tumori umani dal set di dati TCGA. (D) Classificazione dei livelli di attività genica di TMEM200A in vari tumori umani in base al punteggio ssGSEA. (E) TMEM200A livelli di espressione dal database HPA nei tessuti sani. (F) Livelli di espressione TMEM200A del database HPA in linee cellulari normali. (G) Esiti IHC per l'espressione della proteina TMEM200A nel cancro dal database HPA. Abbreviazioni: TCGA = Atlante del Genoma del Cancro; ssGSEA = Analisi dell'arricchimento del set genico a campione singolo; HPA = Atlante delle Proteine Umane; IHC = Immunoistochimica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Correlazione dell'espressione di TMEM200A con le caratteristiche clinicopatologiche e la prognosi dei diversi tumori. (A) La correlazione dell'espressione di TMEM200A nella coorte pan-cancerogena TCGA (PanCan) con la stadiazione clinicopatologica in ciascun tumore è stata analizzata utilizzando il database UCSC Xena. (B) Correlazione dell'espressione di TMEM200A nella coorte TCGA PANCAN con l'età del paziente in ciascun tumore. (C) Correlazione dell'espressione di TMEM200A nella coorte TCGA PANCAN con il grado patologico del tumore in ciascun tumore. (D) Correlazione dell'espressione di TMEM200A nella coorte TCGA PanCan con lo stato di sopravvivenza dei pazienti in ciascun tumore. (E) Analisi di correlazione dell'espressione di TMEM200A con la sopravvivenza globale pan-cancerosa in vari tumori utilizzando il modello di regressione di Cox. (F) Correlazione tra l'espressione TMEM200A e la prognosi della OS pan-tumorale nella coorte TCGA PanCan. (G) Correlazione tra espressione TMEM200A e sopravvivenza malattia-specifica. (H) Correlazione tra l'espressione TMEM200A e la prognosi dell'intervallo libero da progressione nella coorte TCGA PanCan. (I) Correlazione tra espressione TMEM200A e intervallo libero da malattia. (J) È stata eseguita un'analisi di regressione COX multifattoriale su KIRC. (K) È stata eseguita un'analisi di regressione COX multifattoriale su KIRP. Abbreviazioni: TCGA = Atlante del Genoma del Cancro; KIRC: Carcinoma renale a cellule chiare renale; KIRP: Carcinoma a cellule papillari renali renali; OS = Sopravvivenza globale; DSS = Sopravvivenza specifica per malattia; PFI = Intervallo libero da progressione; DFI = Intervallo libero da malattia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi della metilazione del DNA di TMEM200A in diversi tipi di cancro. (A) I livelli di metilazione del promotore di TMEM200A sono stati esaminati in diversi tipi di cancro, secondo il database SMART. (B) Sono stati esaminati livelli più elevati di metilazione del promotore di TMEM200A in diversi tipi di cancro rispetto ai tessuti normali in conformità con la banca dati UALCAN. (C) Utilizzando il database UALCAN, è stato determinato che i tessuti normali avevano livelli di metilazione del promotore più bassi di TMEM200A in diversi tipi di cancro. (D) Il livello di metilazione del DNA di TMEM200A in BLCA, HNSC, LUAD e STAD è cambiato con lo stadio patologico. Abbreviazioni: BLCA = carcinoma uroteliale della vescica; HNSC= Carcinoma a cellule squamose della testa e del collo; LUAD=Adenocarcinoma polmonare; STAD= Adenocarcinoma dello stomaco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: TMEM200A mutazioni genetiche in diversi tipi di cancro. (A) Analisi di TMEM200A tipi di mutazione genica in diversi tumori utilizzando il database cBioPortal. (B) Struttura proteica 3D di TMEM200A. L'area di rilegatura è indicata dalla parte colorata, mentre le altre sezioni di TMEM200A sono indicate dalla parte grigia. (C) Isoforme e distribuzione delle mutazioni somatiche TMEM200A . asse X, siti amminoacidici; asse delle ordinate, numero di mutazioni TMEM200A ; puntini verdi, mutazioni missenso; e puntini grigi, mutazioni troncate. (D) Validazione delle isoforme e distribuzione delle mutazioni somatiche TMEM200A utilizzando i dati di Sangerbox 3.0. (E) Per tutti i tumori TCGA, la correlazione tra lo stato di mutazione e la previsione di sopravvivenza globale dei pazienti è stata studiata utilizzando il database cBioPortal, con quadrati rossi che indicano il gruppo di mutazione TMEM200A e quadrati blu che indicano il gruppo non mutato. (F) I geni co-mutati con TMEM200A sono stati analizzati utilizzando lo strumento cBioPortal: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 e SLC18B1. (G) Analisi di TMEM200A tipi di mutazione in GC utilizzando il database COSMIC. (H) È stata condotta un'analisi dei tipi TMEM200A di SNV in GC utilizzando il database COSMIC. Abbreviazioni: TCGA = Atlante del Genoma del Cancro; OS = Sopravvivenza Globale; COSMIC = Catalogo delle mutazioni somatiche nelle cellule tumorali; GC = Cancro gastrico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi di correlazione a singola cellula dell'espressione di TMEM200A in diversi tumori. (A) Sintesi dell'espressione di TMEM200A sul sito web del TISCH. (B) Distribuzione di otto tipi di cellule distinte nel set di dati GSE72056 sul melanoma cutaneo metastatico. (C) Livelli di espressione di TMEM200A nelle cellule di melanoma metastatico cutaneo dal set di dati GSE72056. (D) Distribuzione di 13 tipi di cellule distinte nel set di dati sul cancro del colon-retto da GSE146771. (E) TMEM200A livelli di espressione nelle cellule tumorali del colon-retto dal set di dati GSE146771. (F) La correlazione dell'espressione di TMEM200A con lo stato funzionale di una singola cellula in più tumori è stata dimostrata utilizzando il database CancerSEA. (G) Mappe T-SNE che illustrano i livelli di espressione di TMEM200A nelle singole cellule tumorali, tra cui GBM, LUAD, CML, CRC, RB e UM. Abbreviazioni: GBM = Glioblastoma; LUAD = Adenocarcinoma polmonare; LMC = leucemia granulocitica cronica; CRC = Cancro del colon-retto; RB = Retinoblastoma; UM = Melanoma uveale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Rete di co-espressione e analisi dell'arricchimento funzionale di TMEM200A a livello genico. (A) Rete GGI di TMEM200A e suoi geni co-espressi. (B) Rete PPI. (C,D) TMEM200A e i geni co-espressi sono stati analizzati per l'arricchimento del pathway di GO e KEGG. Abbreviazioni: PPI = Interazione proteina-proteina; GGI = Interazione gene-gene; KEGG = Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto; GO = Ontologia genica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Correlazione tra l'espressione di cellule TMEM200A e immunitarie, agenti immunosoppressori, sostanze immunostimolanti e molecole MHC in vari tipi di cancro. (A) Mappa termica Sangerbox 3.0 che dimostra la correlazione tra l'espressione TMEM200A e le cellule immunoinfiltranti. (B) Mappa di calore che mostra la correlazione tra le cellule infiltranti immunitarie e l'espressione TMEM200A nel database TISIDB. (C) Mappa di calore che mostra la correlazione tra cellule immunosoppressive ed espressione TMEM200A nel database TISIDB. (D-F) Correlazione tra l'espressione TMEM200A e alcuni agenti immunosoppressori nel cancro testicolare e nel melanoma uveale. (G) Mappa di calore che mostra la correlazione tra fattori immunostimolatori ed espressione TMEM200A nel database TISIDB. (H) Mappa termica della correlazione tra espressione di TMEM200A e molecole MHC nel database TISIDB. (I-L) Correlazione tra l'espressione di TMEM200A e alcuni fattori immunostimolatori e molecole MHC nel carcinoma uroteliale della vescica, carcinoma testicolare, carcinoma corticosurrenalico e melanoma uveale. (M) Correlazione tra sottogruppi immunitari pan-cancerogeni ed espressione TMEM200A. (N) Correlazione tra sottogruppi molecolari pan-cancerogeni ed espressione TMEM200A. Abbreviazioni: MHC = Complesso maggiore di istocompatibilità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Analisi della risposta immunoterapeutica di TMEM200A nella pancitopenia. (A) Correlazione dell'espressione di TMEM200A in diversi tumori con TMB. (B) Correlazione tra MSI nel pan-cancro ed espressione TMEM200A . (C) TMEM200A potenziale come biomarcatore per predire la risposta al blocco del checkpoint immunitario. (D) Per classificarlo è stata utilizzata la media ponderata della correlazione di TMEM200A con il risultato di sopravvivenza dell'ICB e il cambiamento di piega logaritmica (logFC) nello screening CRISPR. Abbreviazioni: TMB = Carico mutazionale del tumore; ICB = Blocco del checkpoint immunitario; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Analisi dell'arricchimento GSEA di TMEM200A in diversi tumori. I primi cinque percorsi in cui TMEM200A svolto un ruolo funzionale importante nella regolazione di 32 tumori sono stati identificati dall'analisi di arricchimento GSEA. Il pannello di sinistra mostra i risultati dell'analisi dell'arricchimento GSEA per TMEM200A in ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ e SARC. Il pannello di destra mostra i risultati dell'analisi dell'arricchimento GSEA per TMEM200A in SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS e UVM. Abbreviazioni: GSEA = Gene Set Enrichment Analysis; ACC = carcinoma corticosurrenalico; BLCA = Carcinoma Uroteliale della vescica; BRCA = Carcinoma invasivo della mammella; CESC = Carcinoma a cellule squamose cervicale e adenocarcinoma endocervicale; CHOL = Colangiocarcinoma; COAD = adenocarcinoma del colon; ESCA = Carcinoma esofageo; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = Carcinoma a cellule squamose della testa e del collo; KICH = rene cromofobo; KIRC = Carcinoma renale a cellule chiare; KIRP = Carcinoma a cellule papillari renali renali; LAML = Leucemia Mieloide Acuta; LGG = glioma cerebrale di grado inferiore; LIHC = Carcinoma epatocellulare del fegato; LUAD = Adenocarcinoma polmonare; LUSC = Carcinoma polmonare a cellule squamose; MESO = Mesotelioma; OV = cistoadenocarcinoma sieroso ovarico; PAAD = adenocarcinoma pancreatico; PCPG = Feocromocitoma e Paraganglioma; PRAD = adenocarcinoma prostatico; LEGGI: Adenocarcinoma del retto; SARC=Sarcoma; SKCM = melanoma cutaneo cutaneo; STAD = adenocarcinoma dello stomaco; TGCT = Tumori a cellule germinali testicolari; THCA = Carcinoma della tiroide; THYM = Timoma; UCEC = Carcinoma endometriale del corpo uterino; UCS = Carcinosarcoma uterino; UVM = Melanoma uveale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: TMEM200A in STAD. (A) I primi 50 geni trovati con una correlazione negativa con l'espressione di TMEM200A in STAD dal database LinkedOmics. (B) I primi 50 geni in STAD che erano collegati positivamente a TMEM200A. (C) I primi cinque geni di TMEM200A correlati positivamente e cinque negativamente in STAD. (D) Mappa termica dei DEG in STAD. (E-H) Studio delle vie GO e KEGG arricchite utilizzando i DEG sottoposti a screening. Abbreviazioni: STAD=Adenocarcinoma dello stomaco; DEGs= Espressione differenziale dei geni; KEGG = Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto; GO = Ontologia genica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Correlazione tra le caratteristiche cliniche di STAD e il livello di espressione di TMEM200A . (A) Analisi dei livelli di espressione di TMEM200A e dei caratteri clinici di STAD utilizzando la regressione logistica. (B,C) Analisi di Cox di appezzamenti forestali STAD per variabili singole e multiple. (D) Grafici a linee di colonna che predicono la sopravvivenza globale nei pazienti con STAD in base al sesso, al grado patologico, all'età, allo stadio patologico e all'espressione TMEM200A . (E) Grafici di calibrazione che mostrano la calibrazione del modello di grafico a colonne a linee. Abbreviazioni: STAD= adenocarcinoma dello stomaco; OS=Sopravvivenza globale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 13: L'espressione di TMEM200A è sovraregolata in STAD e promuove la proliferazione delle cellule tumorali gastriche. (A) Rilevamento dell'espressione di TMEM200A nelle cellule di carcinoma gastrico HGC-27 e nelle cellule epiteliali della mucosa gastrica GES-1 mediante western blotting. (B) Rilevamento dell'espressione di TMEM200A nelle cellule GC HGC-27 e SGC-7901 e nelle cellule epiteliali della mucosa gastrica GES-1 mediante qRT-PCR. (C) L'efficienza di espressione di TMEM200A è stata notevolmente ridotta nel gruppo knockdown TMEM200A rispetto al gruppo non-knockdown nelle cellule GC HGC-27, come dimostrato dalla qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule GC misurata mediante test CCK8. (E) Il knockdown di TMEM200A ha inibito significativamente le proteine correlate nell'EMT e ha influenzato la fosforilazione di AKT nella via di segnalazione PI3K/AKT. Abbreviazione: GC = Cancro gastrico; qRT-PCR: Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale; EMT=transizione epiteliale-mesenchimale; AKT=Protein chinasi B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

TMEM200A appartiene a una famiglia di TMEM che è essenziale per la proliferazione delle cellule tumorali³⁸. L'espressione variabile di TMEM200A in diverse neoplasie maligne ha ricevuto meno attenzione e manca un'indagine approfondita sul pan-cancro. Tuttavia, le prove continuano ad accumularsi, dimostrando che la famiglia di proteine transmembrana TMEM può essere importante nel mantenere le cellule tumorali maligne attraverso interazioni con diverse proteine, ad esempio, l'attivazione dei canali Cl^- attivati da TMEM16A Ca²⁺ da parte di ROCK1/moesina promuove la metastasi BRCA³⁹. Pertanto, nel presente lavoro, le nostre analisi si sono concentrate sull'esplorazione della fattibilità di TMEM200A come bersaglio terapeutico del cancro e marcatore diagnostico del tumore. In particolare, abbiamo studiato i livelli di espressione di TMEM200A in 33 tumori maligni utilizzando i dati RNA-seq del database UCSC Xena e i risultati del database TIMER2.0 hanno convalidato con successo le analisi nel database UCSC Xena.

Successivamente, lo strumento web Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e il database CancerSEA sono stati utilizzati per analizzare i livelli di espressione di TMEM200A in diversi tipi di monociti. I siti web Sangerbox e TISIDB sono stati utilizzati per aiutare a capire come TMEM200A influisce sull'infiltrazione immunitaria. Abbiamo anche identificato le vie di segnalazione in cui TMEM200A svolge una funzione chiave in ciascun tumore mediante l'analisi di arricchimento GSEA per comprendere i principali ruoli funzionali di TMEM200A in ciascun tumore maligno.

TMEM200A può agire come molecola di adesione per controllare l'ambiente immunitario dei GC e promuovere la diffusione invasiva delle cellule GC. Pertanto, abbiamo identificato 483 geni differenzialmente espressi (DEG) associati al livello di espressione di TMEM200A attraverso il database TCGA e analizzato l'arricchimento di GO e KEGG di questi 483 DEG. I risultati dell'arricchimento hanno mostrato che la via PI3K/AKT svolge un ruolo chiave nello sviluppo del cancro e la via PI3K/AKT può essere uno dei fattori trainanti del cancro.

Inoltre, abbiamo effettuato test cellulari e molecolari dopo aver appreso di più sulla funzione cruciale di TMEM200A nel guidare lo sviluppo del cancro per confermare la correlazione tra l'espressione di TMEM200A e l'attività delle cellule STAD. Come previsto, abbiamo scoperto che la sottoregolazione TMEM200A nelle cellule STAD riduceva notevolmente la proliferazione cellulare e che le linee cellulari tumorali esprimevano TMEM200A a livelli considerevolmente maggiori rispetto alle linee cellulari normali. Analizzando la letteratura relativa alla famiglia delle proteine transmembrana negli ultimi anni, abbiamo scoperto che le proteine transmembrana, come molecole di adesione cellulare³⁷, hanno un ruolo regolatorio nell'EMT.

Inoltre, secondo i risultati dell'analisi di arricchimento dei geni correlati al TMEM200A nella GC, abbiamo scoperto che TMEM200A può avere un ruolo regolatorio nella via di segnalazione PI3K/AKT nella GC. Gli esperimenti di Western blotting hanno rivelato che TMEM200A knockdown potrebbe ridurre le proteine Vimentina, N-caderina e Snai e inibire la fosforilazione di AKT, suggerendo che TMEM200A regola il microambiente tumorale influenzando l'EMT e che la via di segnalazione PI3K/AKT può essere coinvolta nella regolazione mediata da TMEM200A dello sviluppo di GC. Negli ultimi anni, alcuni studi hanno scoperto che l'EMT è la principale causa di resistenza ai farmaci chemioterapici nei pazienti con GC. La plasticità epitelio-mesenchimale (EMP) e il microambiente tumorale sono stati descritti come fattori limitanti per un trattamento efficace in molti tipi di cancro⁴⁰. L'insorgenza di EMT può far perdere alle cellule GC le loro proprietà caratteristiche e mostrare le caratteristiche delle cellule mesenchimali⁴¹. Questa caratteristica non solo riduce la sensibilità dei pazienti GC ai farmaci chemioterapici, ma migliora anche la capacità invasiva e migratoria delle cellule GC, portando a metastasi tumorali. Pertanto, per le ragioni sopra menzionate, il nostro studio aiuta la ricerca e lo sviluppo di punti regolatori chiave nell'EMT e lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici mirati, esplorando lo specifico meccanismo d'azione delle TMEM200A che influenzano l'EMT.

L'uso della bioinformatica per la ricerca è aumentato negli ultimi anni e per questo studio abbiamo avuto accesso ai dati di diversi database Internet. L'uso di questi database online in bioinformatica ha semplificato e accelerato lo studio del cancro e fornisce anche ai ricercatori un mezzo conveniente per convalidare i loro risultati.

La tecnica bioinformatica, tuttavia, presenta alcuni inconvenienti. Quando utilizziamo questi database per l'analisi, lo stesso studio può fornire risultati incoerenti o addirittura contrastanti in più database poiché molti database online includono dati provenienti da diversi set di dati. Inoltre, molte banche dati non vengono aggiornate per molto tempo e, a causa di problemi di copyright, il loro contenuto non può mai essere ampliato; Pertanto, i risultati analitici che i ricercatori ottengono da questi database sono sempre vincolati. Pertanto, in questa ricerca, abbiamo utilizzato diversi database per esaminare i risultati collettivamente per superare questi vincoli e garantire la correttezza dei risultati. Per essere sicuri che i risultati acquisiti non venissero alterati in modo considerevole, abbiamo ripetuto la procedura quando abbiamo utilizzato diversi database per l'analisi. I risultati degli esperimenti di western blot hanno supportato la nostra previsione bioinformatica secondo cui TMEM200A può controllare l'EMT in GC regolando la via di segnalazione PI3K/AKT, che influenzerebbe quindi la proliferazione delle cellule GC. Abbiamo previsto il meccanismo d'azione di TMEM200A utilizzando la bioinformatica in combinazione con la letteratura correlata.

In sintesi, questo lavoro dimostra come gli strumenti bioinformatici possano facilitare in modo significativo la progettazione sperimentale ed essere utilizzati per fare molti altri tipi di previsioni di ricerca scientifica. È probabile che i futuri ricercatori sul cancro adottino il paradigma primario di combinare la convalida sperimentale con la previsione bioinformatica, e questo lavoro funge da buon modello per questo obiettivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold