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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

Aqui, é apresentado um protocolo no qual múltiplas ferramentas de bioinformática são combinadas para estudar as funções biológicas da TMEM200A no câncer. Além disso, também validamos experimentalmente as previsões de bioinformática.

Abstract

A proteína transmembrana, TMEM200A, é conhecida por estar associada a cânceres humanos e infiltração imunológica. Aqui, avaliamos a função da TMEM200A em cânceres comuns por meio de análise multiômica e usamos culturas de células gástricas in vitro para verificar os resultados. A expressão de TMEM200A em vários tipos de câncer humano foi avaliada usando os dados de RNA-seq do banco de dados UCSC Xena. A análise bioinformática revelou um papel potencial da TMEM200A como biomarcador diagnóstico e prognóstico.

Culturas de linhagens normais de células gástricas e cancerígenas foram cultivadas e TMEM200A foi derrubada. Os níveis de expressão de TMEM200A foram medidos usando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real e western blotting. Estudos in vitro de perda de função foram então utilizados para determinar o papel da TMEM200A no comportamento maligno e na formação tumoral de células de câncer gástrico (GC). Western blots foram utilizados para avaliar o efeito do knockdown na transição epitélio-mesenquimal (EMT) e na via de sinalização PI3K/AKT no GC. A análise bioinformática mostrou que TMEM200A foi expressa em níveis elevados no GC.

A proliferação de células GC foi inibida por knockdown TMEM200A , que também diminuiu as proteínas vimentina, N-caderina e Snai e inibiu a fosforilação de AKT. A via de sinalização PI3K/AKT também parece estar envolvida na regulação mediada por TMEM200A do desenvolvimento de GC. Os resultados aqui apresentados sugerem que TMEM200A regula o microambiente tumoral afetando a EMT. TMEM200A também podem afetar a EMT através da sinalização PI3K/AKT, influenciando o microambiente tumoral. Portanto, em pan-cânceres, especialmente GC, TMEM200A pode ser um potencial biomarcador e oncogene.

Introduction

O câncer tem emergido como um problema persistente de saúde pública que coloca em risco a saúde humana em todo o mundo1devido às suas altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, representando um pesado fardo financeiro e médico para a sociedade2. Avanços significativos na terapia do câncer foram alcançados nos últimos anos graças à descoberta de marcadores de câncer3, e os pesquisadores desenvolveram novos métodos diagnósticos e novas drogas para tratar o câncer. No entanto, alguns pacientes com câncer ainda apresentam prognóstico ruim devido a fatores como resistência aos medicamentos, efeitos colaterais dos fármacos e sensibilidade química4. Portanto, há uma necessidade urgente de identificação de novos biomarcadores para o rastreamento e tratamento de cânceres em estádio inicial5.

As proteínas de membrana são proteínas que podem se ligar e se integrar às células e membranas organelas6. Estas podem ser agrupadas em três categorias, dependendo da força de ligação à membrana e de sua localização: proteínas ancoradas a lipídios, proteínas íntegras e proteínas de membrana periférica 7,8. Uma proteína transmembrana (TMEM) é uma proteína de membrana integral que consiste em pelo menos um segmento transmembrana9, que passa total ou parcialmente através da membrana biológica.

Embora os mecanismos de ação das proteínas pertencentes à família TMEM não sejam bem compreendidos, sabe-se que essas proteínas estão envolvidas em vários tipos decâncer10. Várias proteínas TMEM estão associadas a fenótipos migratórios, proliferativos e invasivos, e sua expressão está frequentemente associada ao prognóstico do paciente11. Portanto, os membros da família TMEM tornaram-se alvo de pesquisa. Uma revisão abrangente dos relatos existentes sobre TMEM revelou que eles estão principalmente associados à sinalização inter e intracelular12, doenças relacionadas à imunidade e tumorigênese10. Muitos TMEMs também possuem funções fisiológicas importantes, por exemplo, canais iônicos na membrana plasmática, ativação de vias de transdução de sinal, bem como a mediação da quimiotaxia celular, adesão, apoptose e autofagia10. Portanto, levantamos a hipótese de que as proteínas TMEM podem ser importantes marcadores prognósticos na detecção e tratamento de tumores.

TMEM200A expressão é significativamente elevada no câncer gástrico (GC). A maior expressão do TMEM200A13, que possui oito exons e comprimento total de 77,536 kb no cromossomo 6q23.1, tem sido associada a um mau prognóstico de sobrevida global (SG) em casos de CG. No entanto, as alterações em sua expressão têm sido raramente relatadas em estudos oncológicos. Este artigo compara e analisa a utilidade do TMEM200A como alvo terapêutico e marcador diagnóstico tumoral em vários estudos de câncer usando diferentes conjuntos de dados disponíveis publicamente. Avaliamos a eficácia do TMEM200A como um biomarcador diagnóstico e prognóstico pan-câncer, bem como seus níveis de expressão em vários tipos de câncer humano usando dados de RNA-seq dos bancos de dados UCSC Xena e TCGA, bem como por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e western blotting.

O efeito dos níveis de expressão de TMEM200A sobre as taxas de mutação, processos regulatórios, diagnóstico e prognóstico tumoral, infiltração imune e imunoterapia foi investigado usando uma mistura de ferramentas computacionais e sites de conjunto de dados. Os bancos de dados CBioPortal e Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) foram usados para examinar mutações em TMEM200A. Os sites Sangerbox e TISIDB foram utilizados para entender como TMEM200A influencia a infiltração imunológica. A ferramenta on-line Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e o banco de dados CancerSEA foram usados para investigar a função do TMEM200A. Finalmente, para avaliar o impacto da TMEM200A sobre o comportamento maligno e a função de desenvolvimento tumoral das células GC, um experimento de perda de função foi conduzido em um ensaio in vitro . Adicionalmente, o western blotting foi realizado para avaliar como TMEM200A knockdown afetou a via de sinalização PI3K/AKT e a transição epitélio-mesenquimal (EMT) no GC.

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Protocol

1. O banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA)

NOTA: O banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) contém os dados de sequenciamento de genes em diferentes tecidos tumorais14. Dados de RNA-seq em TCGA para o estudo de TMEM200A transcritos por parte por milhão (TPM) foram extraídos do site UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) e transformados log2 para comparação das expressões entre amostras.

  1. Acesse a interface do site do UCSC Xena .
  2. Clique na guia Iniciar Xena .
  3. Clique na guia CONJUNTOS DE DADOS na parte superior da tela.
  4. Das 129 coortes e 1.571 conjuntos de dados nesta página, clique na guia para um total de 33 cânceres, como GDC TCGA Acute Myeloid Leukemia (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) e muito mais.
  5. No menu RNAseq de expressão gênica , selecione e clique na guia HTSeq - FPKM GDC Hub .
    NOTA: HTSeq - FPKM GDC Hub representa dados que foram corrigidos por consentimento.
  6. No menu de download , clique no link correspondente.
    NOTA: Pelo método acima, os dados de RNA-Seq foram baixados para 33 tipos diferentes de câncer.
  7. Descompacte o arquivo zip de dados RNA-seq para 33 tipos diferentes de câncer em um único arquivo na pasta desktop do computador.
  8. Unifique os arquivos txt descompactados na mesma pasta e coloque os scripts Perl nessa pasta.
  9. Abra o software Perl , copie e cole o caminho da pasta no software Perl onde o cursor do mouse está localizado, pressione a tecla Enter , digite o nome do código Perl e o nome do gene (TMEM200A) e, em seguida, pressione a tecla Enter para obter um novo arquivo txt (singleGeneExp.txt).
    NOTA: Este novo arquivo txt (singleGeneExp.txt) contém expressão gênica de TMEM200A em 33 cânceres em pacientes diferentes.
  10. Abra o código R (diffR) e copie e cole o caminho onde o arquivo singleGeneExp.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
  11. Abra o software R, execute o código R modificado (diffR) e desenhe a imagem através do pacote "ggpubr".

2. O banco de dados TIMER2.0

  1. Vá para a interface do site do banco de dados TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 16.
  2. Clique na guia Exploração do câncer.
  3. Digite o ID do gene (TMEM200A) na caixa de pesquisa e clique na guia Enviar para obter as imagens de expressão diferencial de TMEM200A em diferentes tipos de tumores.

3. Atlas de Proteínas Humanas (HPA)

  1. Vá para a interface web do Atlas de Proteína Humana (HPA) (www.proteinatlas.org) 17.
  2. Digite ID (TMEM200A) na caixa de pesquisa e clique no botão Pesquisar . Selecione o subatlas TISSUE.
  3. Passe o mouse sobre a página e role para baixo até encontrar a guia Visão geral da expressão de proteínas .
    NOTA: A seção Visão geral da expressão de proteínas mostra os níveis de expressão proteica de TMEM200A em 45 órgãos do corpo humano.

4. A matriz da plataforma de metilação de DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium

NOTA: O arranjo da plataforma de metilação de DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium foi usado para coletar dados sobre metilação. Foi possível avaliar os níveis TMEM200A de metilação do DNA utilizando o banco de dados SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. Acesse a interface do site SMART .
  2. Digite o ID do gene (TMEM200A) na caixa de pesquisa para obter a distribuição de TMEM200A nos cromossomos e o nível de metilação de TMEM200A em diferentes tipos de malignidades.
  3. Role a página para baixo até o clique para verificar o menu de metilação agregada CpG e clique no botão Plotar . Na parte inferior da página, localize e clique no botão Download Figur . Faça o download da figura.

5. A base de dados UALCAN

  1. Vá para a interface do site do UALCAN .
    NOTA: Box plots dos níveis de metilação do promotor TMEM200A em várias neoplasias malignas foram gerados através do banco de dados UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. Na parte superior da página, clique no botão TCGA .
  3. Digite TMEM200A na caixa de entrada Gene ID na tela. No menu do conjunto de dados TCGA , role para baixo e selecione o tipo de câncer a ser consultado.
  4. Depois de clicar no botão Explorar , clique em sua análise de subgrupo Metilação no menu Links para análise para obter os resultados de metilação deste tumor.
    NOTA: Por este método, obtivemos resultados de metilação para 22 tumores no banco de dados UALCAN .

6. Base de dados do Catálogo de Mutações Somáticas em Células Cancerosas (COSMIC)

  1. Acesse a interface do site do Catálogo de Mutações Somáticas em Células Cancerosas (COSMIC).
    NOTA: Dados sobre mutações codificantes, rearranjos genômicos mutantes não codificantes e genes de fusão no genoma humano estão disponíveis no banco de dados do Catálogo de Mutações Somáticas em Células Cancerosas (COSMIC)20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), que também é usado para determinar a frequência de várias mutações TMEM200A em vários tipos de câncer.
  2. Digite o ID do gene (TMEM200A) na caixa de pesquisa e clique no botão PESQUISAR para ir para uma nova tela.
  3. No menu Genes , localize e clique no link onde aparece o nome do ID do gene do TMEM200A .
  4. Encontre a coluna Agrupamento de distribuição de mutação na nova página para obter o status de mutação de TMEM200A no tumor.

7. CBioPortal

  1. Acesse a interface do site do CBioPortal .
    NOTA: Os dados genômicos do câncer podem ser encontrados, baixados, analisados e visualizados usando o banco de dados cBioPortal (www.cioportal.org). Mutações somáticas, alterações no número de cópias do DNA (CNAs), expressão de mRNA e microRNA (miRNA), metilação do DNA, abundância de proteínas e abundância de fosfoproteínas são apenas alguns dos tipos de dados genômicos integrados pelo cBioPortal21. Com o cBioPortal, uma ampla gama de estudos pode ser realizada; no entanto, a maior ênfase está em diferentes análises relacionadas às mutações e sua visualização.
  2. Selecione a análise Pan-câncer do conjunto de dados de genomas inteiros na subseção PanCancer Studies da seção Select Studies for Visualization & Analysis . Em seguida, clique no botão Consultar por gene .
  3. Digite o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar consulta .
  4. Clique no botão Tipo de Câncer Detalhado na parte superior da página para obter as mutações de TMEM200A em vários tipos de cânceres.

8. Ferramenta Sangerbox 3.0

  1. Vá para a interface da ferramenta Sangerbox 3.0 .
    NOTA: A correlação da expressão de TMEM200A com células imunes infiltrantes, agentes imunossupressores, fatores imunoestimulatórios e moléculas de MHC (complexo principal de histocompatibilidade) em todos os cânceres foi analisada por infiltração imune CIBERSORT usando os dados de infiltração imune pan-câncer na ferramenta Sangerbox 3.022 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. Na barra de ferramentas no lado esquerdo da página, selecione e clique na guia Análise Imunocelular (CIBERSORT) no menu Análise Pan-Câncer .
  3. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar .

9. Base de dados TISIDB

  1. Vá para a interface do site do TISIDB .
    NOTA: O banco de dados TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) foi empregado para examinar a correlação da expressão de TMEM200A com células imunes infiltrantes, agentes imunossupressores, fatores imunoestimulatórios e moléculas de MHC em vários tipos de câncer.
  2. Digite o Símbolo de Gene (TMEM200A) de destino na caixa de consulta de Inserir Genes. Clique no botão Enviar .
  3. Clique nas seções Linfócitos, Imunomoduladores, Quimiocinas e Subtipos na parte superior da página. Faça o download das imagens relevantes na parte inferior da página.

10. A base de dados TIDE

  1. Acesse a interface do site da TIDE .
    NOTA: O banco de dados TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) foi usado para avaliar o potencial do TMEM200A como um biomarcador para prever a resposta à terapia de bloqueio de checkpoint imune tumoral.
  2. Digite o endereço de e-mail na tela inicial para registrar a conta e fazer login.
  3. Encontre a subseção Avaliação de Biomarcadores na parte superior da página e clique nela.
  4. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta para Enter Genes na parte inferior da página. Em seguida, clique no botão Enviar .
  5. Na página, arraste o mouse para deslizar a página para baixo e encontrar os resultados da análise.

11. A base de dados CancerSEA

  1. Acesse a interface do site do CancerSea .
    NOTA: Usando dados de sequenciamento de célula única, as relações entre a expressão de TMEM200A e o estado funcional de diferentes células tumorais foram investigadas. Isso foi feito usando o banco de dados CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. Na parte superior da página, localize e clique na guia Pesquisar .
  3. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar .

12. A ferramenta de rede do centro imune unicelular do tumor (TISCH)

  1. Acesse a interface do site da ferramenta de rede TISCH .
    NOTA: A correlação entre os níveis de expressão de TMEM200A e células cancerosas também foi demonstrada usando a ferramenta de rede de centro imune único de célula tumoral (TISCH)25.
  2. Insira o ID do gene de destino (TMEM200A) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Explorar .
  3. No menu Tipo de câncer nesta página, selecione e clique no conjunto de dados Todos os cânceres . Em seguida, role a página para baixo e clique no botão Pesquisar .

13. GeneMANIA

  1. Acesse a interface do site do GeneMANIA .
    NOTA: A correlação entre TMEM200A e seus genes funcionalmente relevantes foi prevista usando a estratégia de integração para a rede de multi-associação gênica Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 para a construção de redes de interação gene-gene (GGI).
  2. Na caixa de pesquisa no canto superior esquerdo da página, digite o ID do gene (TMEM200A) e clique em Ferramentas de Pesquisa.
    NOTA: A ferramenta web GeneMANIA foi usada para encontrar 20 genes associados a TMEM200A.

14. Análise do enriquecimento funcional

  1. Salve os IDs de símbolos dos genes a serem analisados para enriquecimento no formato de arquivo txt.
  2. Abra o código R (symbolidR) e copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
  3. Abra o software R e execute o código R modificado (symbolidR). Converta os ids de símbolos desses genes em entrezIDs através da "org. Hs.eg.db" pacote. Obtenha o arquivo id.txt .
  4. Abra o código R (GOR e KEGGR) e copie e cole o caminho onde o arquivo id.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
  5. Abra o software R e execute o código R modificado (GOR e KEGGR). Para seguir este protocolo, analise esses genes para enriquecimento GO e KEGG pelos pacotes "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db," e "enrichplot" e plotar os resultados de enriquecimento usando o pacote "gglot2".

15. Análise das diferenças na atividade gênica

NOTA: TMEM200A pontuação em cada amostra de câncer foi calculada usando ssGSEA (análise de enriquecimento de conjunto gênico de amostra única)27, e a análise diferencial da atividade gênica de TMEM200A em tecidos cancerosos e saudáveis foi realizada para vários tipos de câncer.

  1. Com base nos dados de RNA-seq de 33 tipos de tumor baixados na etapa 1.7, descompacte todos os arquivos baixados e coloque-os em uma pasta unificada.
  2. Coloque o arquivo merge.txt na pasta acima.
    NOTA: Os dados em merge.txt arquivo de BioWolf (www.biowolf.cn) contém expressão gênica para todos os pacientes em todos os tumores no banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA).
  3. Abra o código R (ssGSEAR) e copie e cole o caminho onde a pasta acima está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
  4. Pegue a linha onde geneName está no código R (ssGSEAR) e digite o ID do gene (TMEM200A).
  5. Abra o software R e execute o código R modificado (ssGSEAR). Obtenha o arquivo de pontuação para a atividade do gene: scores.txt.
    NOTA: Com o algoritmo ssGSEA, primeiro construímos um arquivo de conjunto de genes com base nos coeficientes de correlação entre genes de acordo com os dados fornecidos no arquivo merge.txt e identificamos os genes com maior correlação com o gene alvo (TMEM200A) do arquivo. Em seguida, os genes com maior correlação são unificados como os genes ativos de TMEM200A e, finalmente, obtém-se a pontuação dos genes ativos em cada amostra.
  6. Abra o código R (scoreDiffR) e copie e cole o caminho onde o arquivo scores.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
  7. Abra o software R, execute o código R modificado (scoreDiffR) e desenhe a imagem através dos pacotes "plyr", "reshape2" e "ggpubr".

16. Correlação clínico-patológica e análise do prognóstico de sobrevida

  1. Acesse a interface do site do UCSC Xena .
  2. Clique na guia Iniciar Xena .
  3. Clique na guia CONJUNTOS DE DADOS na parte superior da tela.
  4. Passe o mouse sobre a página e role para baixo para encontrar a guia TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. Das 129 coortes e 1.571 conjuntos de dados nesta página, clique na guia TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. No menu do fenótipo , selecione e clique na guia Dados clínicos curados.
  7. No menu de download , clique no link correspondente.
    NOTA: Faça o download dos dados clínicos de 33 cânceres do banco de dados TCGA no link acima.
  8. Descompacte o arquivo de dados clínicos baixado e abra o arquivo descompactado no formato de arquivo xls.
  9. Organize e retenha os dados clínicos necessários (estágio, idade, estágio patológico e status do paciente) no arquivo, exclua os dados clínicos desnecessários restantes e salve o arquivo inteiro como um arquivo de formato txt depois de renomeá-lo como clínico.
  10. Com base na singleGeneExp.txt obtida na etapa 1.9, coloque esse arquivo na mesma pasta que o arquivo clinical.txt organizado.
  11. Descompacte os dados clínicos baixados e coloque os arquivos singleGeneExp.txt e clinical.txt na mesma pasta que os arquivos clínicos descompactados.
  12. Abra o código R (clinicalDiffR) e copie e cole o caminho onde a pasta acima está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
  13. Abra o software R, execute o código R modificado (clinicalDiffR) e desenhe a imagem usando o pacote "ggpubr".
  14. Acesse a interface do site do UCSC Xena .
  15. Clique na guia Iniciar Xena .
  16. Clique na guia CONJUNTOS DE DADOS na parte superior da tela.
  17. Das 129 coortes e 1.571 conjuntos de dados nesta página, clique na guia para um total de 33 cânceres, como GDC TCGA Acute Myeloid Leukemia (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) e muito mais.
  18. No menu do fenótipo , selecione e clique na guia Dados de sobrevivência.
  19. No menu de download , clique no link correspondente.
  20. Descompacte o arquivo zip de dados de sobrevivência para 33 tipos diferentes de câncer em um único arquivo na pasta da área de trabalho do computador.
  21. Coloque os dados de sobrevivência descompactados na mesma pasta que o arquivo singleGeneExp.txt obtido na etapa 1.9.
  22. Abra o código R (preOSR) e copie e cole o caminho onde a pasta acima está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
  23. Abra o software R e execute o código R modificado (preOSR). Calcule através do pacote "limma" para obter um arquivo de dados sobre a sobrevivência do TMEM200A em pan-câncer: expTime.txt.
  24. Abra o código R (OSR) e copie e cole o caminho onde o arquivo expTime.txt está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
  25. Abra o software R e execute o código R modificado (OSR). Realize uma análise de GC usando os pacotes "survival" e "survminer" com base nos dados no arquivo expTime.txt e plote as curvas de sobrevivência para TMEM200A em pan-câncer.

17. Análise univariada e multivariada de regressão de Cox com construção de forest plot

  1. Abra o código R (COXR) e copie e cole o caminho onde obtivemos o arquivo expTime.txt de 16.23 está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
  2. Abra o software R e execute o código R modificado (COXR). Com base nos dados do arquivo expTime.txt , execute análises de regressão COX univariada usando os pacotes "survival", "survminer" e "forestplot" para plotar um gráfico univariado de floresta de TMEM200A em diferentes cânceres.
  3. Coloque o arquivo expTime.txt da etapa 16.23 e clinical.txt da etapa 16.10 na mesma pasta.
  4. Abra o código R (multicoxR) e copie e cole o caminho onde a pasta que contém o arquivo expTime.txt da etapa 16.23 e clinical.txt arquivo da etapa 16.10 está localizada na linha onde setwd está localizado no código R.
  5. Abra o software R e execute o código R modificado (multicoxR). Execute uma análise de regressão COX multivariada usando os pacotes "survival" e "survminer" para plotar um gráfico multivariado de floresta de TMEM200A em diferentes cânceres com base nos dados nos arquivos expTime.txt e clinical.txt .

18. Modelo prognóstico do câncer gástrico baseado na expressão TMEM200A e características clínicas

  1. Coloque o arquivo clinical.txt da etapa 16.10 e o arquivo expTime.txt da etapa 16.23 na mesma pasta.
  2. Abra o código R (NomoR) e copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está localizado na linha onde setwd está localizado no código R.
  3. Abra o software R e execute o código R modificado (NomoR). Use os pacotes de software "survival", "regplot" e "rms" para dados de expressão TMEM200A em GC e dados clínicos para construir um modelo prognóstico para predizer a sobrevida do paciente.

19. Cultura celular e transfecção de siRNA de TMEM200A

NOTA: Células humanas STAD HGC-27, células SGC-7901 e células GES-1 epiteliais da mucosa gástrica humana foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais), revividas, inoculadas em meio completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (contendo 10% de soro fetal fetal bovino e 1% de mistura de penicilina) e cultivadas a 37 °C em um CO2 a 5% incubadora de cultura celular. O meio de cultura foi trocado a cada 2-3 dias. As células em boas condições de crescimento foram inoculadas em placas de seis poços de acordo com (2-3) ×10 5 células por poço.

  1. Primeiro, pegue três tubos de microcentrífuga e adicione 8 μL de reagente de transfecção (verT capaz de Materiais) e 200 μL de meio basal a cada tubo. Em seguida, adicione 4 μg de SiRNA1, SiRNA2 e SiRNA3 a cada tubo, respectivamente.
    NOTA: Para TMEM200A knockdown, o siRNA foi projetado e comprado (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Misture bem a mistura nos três tubos de microcentrífuga e adicione a cada um dos três poços da placa de 6 poços. Agite suavemente a placa de 6 poços para distribuir a mistura uniformemente. Rotular os três poços onde a mistura foi adicionada como SiRNA-1, SiRNA-2 e SiRNA-3.
  3. Quando as células tiverem sido incubadas por 4-6 h, substitua metade do meio nos três sub-poços na placa de 6 poços.
    OBS: Ao substituir metade do meio completo, aspirar metade do meio completo original e reabastecer com metade do meio completo fresco.
  4. Vinte e quatro a 48 h depois, utilizar TMEM200A células transfectadas com siRNA como grupo experimental e células não transfectadas como grupo controle negativo. Realizar uma reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR, ver secção 20) para avaliar o efeito da transfecção nas células.

20. Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real

  1. Descarte o meio de cultura celular em cada subgrupo e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  2. Isolar o RNA total usando um kit de isolamento de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Estimar a concentração de RNA e sintetizar cDNA com 1 μg de RNA usando um kit de síntese de cDNA, seguindo as instruções do fabricante.
  4. Realizar PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em diluições de 10 vezes de cDNA em 10 μL de mistura de reação, incluindo primers forward e reverse específicos para humanos para GAPDH (para padronização), TMEM200A (consulte a Tabela de Materiais) e qPCR Master Mix, usando o Real-Time PCR Assay System.
    NOTA: Realizar cada experimento em triplicata.
  5. Use as seguintes condições de reação qPCR: inicialização, 95 °C por 3 min; desnaturação, 95 °C por 10 s; recozimento, 60 °C por 30 s; e extensão, 80 °C por 10 s; Repita a desnaturação, recozimento e extensão 40x. Determinar a expressão relativa de cada gene utilizando a técnica 2-ΔΔCt 28.
  6. Repetir os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicatas biológicas.

21. Detecção de Western blot da expressão proteica relevante

  1. Descarte o meio de cultura celular em cada subgrupo e lave suavemente as células com 2 x 1 mL de PBS.
  2. Resfriar as placas de 6 poços contendo as células no gelo e adicionar 150 μL de tampão de lise pré-resfriado do ensaio de precipitação por rádio imune (RIPA) (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e coquetel inibidor de protease recém-adicionado). Deixe a lise prosseguir no gelo por 10 min.
  3. Utilizando um raspador de células de plástico, remova as células aderentes do prato e transfira delicadamente a solução celular para um tubo de microcentrífuga que foi pré-resfriado.
  4. Centrifugar o lisado celular durante 10 min a 1,5 × 104 g a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  5. Utilize um kit de ensaio de proteína BCA para determinar o teor de proteína de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Carregar 30 g de proteína de cada amostra em um gel de eletroforese em gel de poliacrilamida de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) e executar a 80 V por 0,5 h seguido de 1,5 h a 120 V.
  7. Transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de 45 μm a uma tensão de 300 mA por 1-1,5 h.
  8. Depois de colocar a membrana de PVDF em um agitador e agitá-la por 3 x 5 min, adicione solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST, Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM e Tween 20 0,1%) ao recipiente apropriado com o lado da proteína (lado do gel) voltado para cima.
  9. Coloque a membrana no tampão de bloqueio (ver Tabela de Materiais) e incube-a durante 0,5 h à temperatura ambiente.
  10. Lave a membrana com TBST por 3 x 10 min.
  11. Incubar a membrana com anticorpos primários contra fosfo-AKT (p-AKT; 1:1.000), AKT total 1:1.000, E-caderina (E-ca; 1:1.000), N-caderina (N-ca; 1:1.000), Vimentina 1:1.000, caracol 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1:1.000), durante a noite a 4 °C.
  12. Lave a membrana por 3 x 10 min e incube a membrana com um anticorpo secundário de coelho ou camundongo (1:5.000) por 1 h à temperatura ambiente.
  13. Incubar a membrana de PVDF com substrato ECL por 30 s e detectar o sinal usando um sistema de imagem.

22. Ensaio CCK-8

  1. Sementes humanas STAD HGC-27 em boas condições de crescimento em placas de 96 poços.
  2. Quando a densidade celular atingir 60-70%, transfectar as células com TMEM200A siRNA (como no passo 19.3).
  3. Semeando as células transfectadas em placas de 96 poços a uma densidade celular de 5 × 10 3/poço (contar células viáveis usando um contador de células), divididas em grupos NC e TMEM200A siRNA (com três poços replicados em cada grupo) e incubadas a 37 °C.
  4. Adicionar o reagente CCK-8 após 0, 24, 48, 72 e 96 h e incubar a 37 °C por 2 h. Medir a absorbância (450 nm) usando um rotulador enzimático multifuncional.

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Representative Results

Expressão de TMEM200A em vários tipos de câncer
Como ilustrado na Figura 1, primeiramente analisamos os níveis de expressão diferencial de TMEM200A em vários cânceres através de diferentes bancos de dados. TMEM200A expressão foi elevada no colangiocarcinoma (CHOL), carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSC), carcinoma de células claras renal (KIRC), carcinoma de células papilíferos renais (KIRP), carcinoma hepatocelular (LIHC), STAD e carcinoma de tireoide (THCA) em comparação com tecidos normais adjacentes apenas com base em dados de TCGA. Entretanto, TMEM200A expressão diminuiu no carcinoma uroepitelial de bexiga (BLCA), carcinoma de células escamosas cervicais e adenocarcinoma cervical (CESC), glioblastoma multiforme (GBM), cromófobo renal (KICH), carcinoma escamoso de pulmão (LUSC), feocromocitoma e paraganglioma (PCPG), adenocarcinoma retal (READ) e carcinoma endometrial de corpo uterino (UCEC) (Figura 2A). No banco de dados TIMER2.0, a expressão TMEM200A aumentou em CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC e STAD. Além disso, a expressão TMEM200A aumentou em BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, melanoma cutâneo cutâneo (SKCM) e UCEC (Figura 2B).

Comparando os resultados das duas bases de dados, verificou-se que a expressão pan-cancerígena de TMEM200A foi a mesma em cada base de dados. Obtivemos os dados de seguimento clínico e de sequenciamento de RNA de 33 pacientes com câncer do banco de dados de TCGA, calculamos TMEM200A pontuação em cada amostra de câncer usando a análise ssGSEA e, em seguida, calculamos TMEM200A atividade gênica em tecidos tumorais e normais em muitos tumores. Descobrimos que TMEM200A era altamente expressa em GBM, HNSC, KIRC renal e THCA (Figura 2C); Assim, a atividade gênica de TMEM200A foi classificada em cada tecido tumoral. Verificou-se que a atividade gênica do TMEM200A foi maior no KIRC e menor no melanoma uveal (UVM) (Figura 2D). A avaliação subsequente do banco de dados HPA dos níveis de expressão de TMEM200A em tecidos humanos mostrou que os níveis de expressão de TMEM200A eram baixos na maioria dos tecidos normais, mas altos no córtex adrenal, reto, endométrio e músculo liso (Figura 2E).

Em linhagens de tecidos normais, algumas linhagens celulares, como células da granulosa, células bipolares, células musculares esqueléticas, células do estroma endometrial e células T apresentaram alta expressão de TMEM200A, enquanto TMEM200A expressão foi baixa na maioria das outras linhagens celulares (Figura 2F). Também examinamos dados de imunohistoquímica (IHQ) no banco de dados HPA para observar a expressão de TMEM200A no nível de proteína. Os dados referentes à coloração e intensidade revelaram níveis de expressão muito maiores e mais pronunciados de TMEM200A nos tecidos de câncer colorretal (CCR), câncer de pulmão (LUAD), câncer de fígado (LIHC), câncer de mama (BRCA) e câncer de próstata (PRAD) em comparação com tecidos normais (Figura 2G). Esses achados sugeriram que TMEM200A foi amplamente expressa em diferentes cânceres e afetou o desenvolvimento de câncer através de diferentes mecanismos em diferentes tumores.

Relação clínico-patológica e prognóstico de sobrevida
Para 33 neoplasias humanas, coletamos informações e dados clínicos na coorte de pan-câncer de TCGA (PanCan) do site do banco de dados UCSC Xena e investigamos a correlação entre a expressão de TMEM200A em PanCan e idade, grau patológico, estágio clínico-patológico e status de sobrevida do paciente. Este estudo revelou que, em seis cânceres, a expressão de TMEM200A esteve associada ao estádio clínico-patológico, incluindo BLCA, carcinoma invasivo de mama (BRCA), carcinoma de esôfago (ESCA), KIRP, SKCM e carcinoma testicular (TGCT) (Figura 3A). A idade foi correlacionada com seis tumores, incluindo BRCA invasivo, GBM, leucemia mieloide aguda (LAML), SKCM, carcinoma tímico (THYM) e câncer endometrial (UCEC) (Figura 3B). O grau patológico foi associado a seis tumores, incluindo carcinoma de esôfago (ESCA), HNSC, KIRC, glioma cerebral de baixo grau (LGG), adenocarcinoma pancreático (PAAD) e carcinoma endometrial (UCEC) (Figura 3C). A sobrevida foi associada a cinco tumores, incluindo carcinoma adrenocortical (ACC), BLCA, KIRC, PCPG e melanoma uveal (UVM) (Figura 3D).

Conduzimos estudos para diferentes cânceres em OS, DSS, PFI e DFI usando análise de regressão de Cox one-way com um limiar de grupo mediano para aprender mais sobre a correlação entre a expressão de TMEM200A e o prognóstico. Os resultados da análise de EO revelaram que, entre os quatro tumores, a maior expressão de TMEM200A teve maior impacto no prognóstico da EO em quatro tumores, incluindo carcinoma adrenocortical (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), leucemia mieloide aguda (LAML) (P = 0,011) e GC (STAD) (P = 0,005). Em contraste, maior expressão de TMEM200A teve melhor prognóstico para EO em cinco tumores, incluindo KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), glioma cerebral de baixo grau (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) e melanoma cutâneo (SKCM) (P = 0,043) (Figura 3E,F). Para a ESD, a alta expressão TMEM200A teve mau prognóstico em dois tipos de tumores, incluindo carcinoma adrenocortical (ACC) (P = 0,026) e BLCA (P = 0,015). A alta expressão TMEM200A teve melhor prognóstico em quatro tipos tumorais, incluindo KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), glioma cerebral de baixo grau (LGG) (P = 0,025) e PCPG (P = 0,007) (Figura 3G). Além disso, para PFI, maior expressão TMEM200A teve um prognóstico ruim em três tipos de tumores, incluindo carcinoma adrenocortical (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) e melanoma uveal (UVM) (P = 0,020). A maior expressão TMEM200A teve melhor prognóstico em dois tipos de tumores, incluindo KIRC (P < 0,001) e glioma de baixo grau (LGG) (P = 0,044) do encéfalo (Figura 3H). No DFI, a maior expressão de TMEM200A teve pior prognóstico no carcinoma adrenocortical (ACC) (P = 0,044) (Figura 3I).

Posteriormente, selecionamos vários tumores (KIRC e KIRP) para análise de regressão multi-COX. Os resultados mostraram que TMEM200A podem afetar individualmente a taxa de sobrevida de pacientes com câncer em comparação com outros fatores clínicos (Figura 3J e K). Esses resultados mostraram que TMEM200A pode ser usado como um marcador bioprognóstico independente em diferentes cânceres para influenciar a sobrevida de pacientes com câncer.

Análise de metilação do DNA
Uma das alterações epigenéticas que tem recebido maior atenção é a metilação do DNA29. Tem sido sugerido que um tipo de alteração epigenética, a metilação do DNA, tem um impacto significativo no crescimento tumoral30. Assim, usando o banco de dados SMART, avaliamos os níveis de metilação do DNA de TMEM200A em tecidos normais e cancerosos. Os tecidos PAAD e PRAD apresentaram níveis mais elevados de metilação do DNA de TMEM200A do que os tecidos normais. No entanto, TMEM200A apresentaram níveis mais baixos de metilação do DNA em COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA e UCEC do que em tecidos normais (Figura 4A). Os níveis de metilação do DNA de TMEM200A foram substancialmente maiores no banco de dados TCGA em KIRP, PRAD, PCPG e THYM com base no banco de dados UALCAN (Figura 4B), mas não em BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA e UCEC. O nível de metilação de TMEM200A diminuiu significativamente em LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA e UCEC (Figura 4C). Para explorar ainda mais a relação entre o nível de expressão de TMEM200A e metilação do DNA e fatores clínico-patológicos, utilizamos novamente o banco de dados SMART e descobrimos que o nível de metilação do DNA de TMEM200A em BLCA, HNSC, LUAD e STAD mudou com o estágio patológico (Figura 4D). Fatores clínicos influenciam o nível de metilação do DNA de TMEM200A nos tumores acima.

Análise de mutações genéticas
Uma das razões para o desenvolvimento de tumores é o acúmulo de mutações gênicas31. Portanto, a frequência de mutações TMEM200A somáticas foi analisada estimando-se a frequência de mutações TMEM200A em amostras clínicas pan-cancerígenas usando o banco de dados cBioPortal. TMEM200A sofre mutação em muitos tipos de câncer, como câncer de pulmão, carcinoma endometrioide uterino, melanoma, câncer esofagogástrico, câncer ósseo, câncer cervical, câncer hepatobiliar, linfoma de células B maduras, BRCA, câncer de endométrio, câncer de ovário, tumor embrionário, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, CCR, glioma, câncer de pulmão de células não pequenas, sarcoma de tecidos moles e câncer primário desconhecido (Figura 5A). Além disso, alterações no DNA podem levar a alterações estruturais ou de aminoácidos no nível proteico. A Figura 5B mostra a estrutura 3D de TMEM200A. Usando o banco de dados cBioPortal, encontramos sítios de mutação nos aminoácidos de TMEM200A; mutações missense foram as mais prevalentes (Figura 5C).

Analisamos os dados usando Sangerbox 3.0 para verificar a acurácia dos sítios de mutação e obtivemos os mesmos resultados anteriores. As mutações missense são a forma mais frequente de mutações em TMEM200A e podem ocorrer até 7,8% em SKCM (Figura 5D). Uma mutação missense é uma mutação na qual um códon que codifica para um aminoácido sofre uma substituição de base e se torna um códon que codifica para outro aminoácido, resultando em uma mudança no tipo de aminoácido e na sequência da cadeia polipeptídica. O resultado da mutação missense é geralmente que a cadeia polipeptídica perde sua função original. Muitas anormalidades proteicas são causadas pela mutação missense, que é um tipo comum de mutação tumoral. Verificou-se que mutações missense desempenham um papel fundamental na estabilidade de proteínas, e a presença de mutações pode ter um efeito significativo na afinidade de ligação entre proteínas32, alterando as interações entre proteínas e as macromoléculas correlativas circundantes33.

Assim, mutações missense provavelmente afetam a função biológica da proteína transmembrana 200A em diferentes tipos de câncer. A correlação entre TMEM200A mutação genética e o prognóstico de sobrevida clínica de pacientes com câncer também foi examinada. A probabilidade de EO aumentou em comparação com a do grupo com mutação TMEM200A, mas não no grupo livre de doença (Figura 5E). O estudo das correlações gênicas revelou que TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2,ENPP3, TMEM244 e SLC18B1 estavam entre os genes que co-mutaram com TMEM200A (Figura 5F). Conseguimos identificar vários tipos de mutação e variações de nucleotídeo único (SNVs) através do banco de dados COSMIC para aprender mais sobre TMEM200A mutações em GC. A frequência de substituições sem sentido foi a maior (38,86%) (Figura 5G), e os dados de SNV mostraram que os SNVs mais comuns em STAD foram G>A (31,73%), seguidos por C>T (26,35%) e G>T (11,73%) (Figura 5H).

Análise unicelular de TMEM200A em câncer
Analisamos TMEM200A níveis de expressão em diferentes células isoladas usando o site TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center). A ferramenta on-line TISCH exibiu a expressão de TMEM200A para 65 conjuntos de dados e 28 tipos de células no mapa de calor mostrado na Figura 6A. Os resultados mostraram que TMEM200A foi expressa principalmente em células T CD8+ e fibroblastos. O conjunto de dados GSE72056, que inclui células de pacientes com melanoma cutâneo metastático (CMSK), é digno de nota a esse respeito. TMEM200A foi amplamente expressa em células B, linfócitos T CD4+, células T CD8+ depletadas, células endoteliais, fibroblastos e outros tipos celulares no microambiente SKCM (Figura 6B,C). No conjunto de dados GSE146771, que contém células de pacientes com CCR, TMEM200A foi amplamente expresso em células B, linfócitos T CD4+, células T CD8+, células T CD8+ depletadas, células endoteliais, fibroblastos e outros tipos celulares no microambiente do CCR (Figura 6D,E). Utilizando o banco de dados CancerSEA foram determinados os níveis de expressão e o estado funcional de TMEM200A em células tumorais específicas (Figura 6G). TMEM200A expressão foi fortemente correlacionada com o estado funcional celular em uma variedade de cânceres, incluindo glioblastoma (GBM), adenocarcinoma de pulmão (LUAD), leucemia granulocítica crônica (LMC), CCR, retinoblastoma (RB) e melanoma uveal (UMTT). Angiogênese, apoptose, diferenciação e inflamação correlacionaram-se positivamente com a expressão de TMEM200A na maioria das células tumorais, enquanto danos ao DNA, reparo do DNA, invasão e metabolismo correlacionaram-se negativamente com a expressão TMEM200A (Figura 6F).

Análise funcional e de enriquecimento de vias de TMEM200A em diversos cânceres
Examinamos a ligação entre TMEM200A e proteínas com funções semelhantes usando a rede GGI para explorar a função da TMEM200A em diferentes cânceres (Figura 7A). Informações genômicas e proteômicas são analisadas pelo GeneMANIA usando uma lista de consulta de genes-alvo. Ao localizar genes que operam de forma semelhante ao TMEM200A, foram descobertas as 40 proteínas que interagem diretamente com esse gene. A correlação desses genes é demonstrada pela rede PPI (Figura 7B). Posteriormente, análises de enriquecimento GO e KEGG desses 20 genes intimamente relacionados à TMEM200A revelaram que esses genes adjacentes estavam principalmente implicados na regulação negativa do RNA do silenciamento gênico. A análise de KEGG revelou que TMEM200A foi abundante em vias, incluindo a via de sinalização Wnt e senescência celular (Figura 7C). A análise do enriquecimento com GO mostrou que, em função molecular, TMEM200A foi principalmente abundante nos canais de cálcio e regulação negativa do silenciamento gênico por RNA (Figura 7D).

Análise de correlação entre TMEM200A e infiltração imunológica
Investigamos ainda a correlação entre a expressão de TMEM200A e a infiltração de células imunes para demonstrar a correlação entre TMEM200A e imunidade contra o câncer. Realizamos a análise de infiltração imune CIBERSORT usando os dados de pan-câncer do Sangerbox 3.0. Os resultados mostraram que a expressão de TMEM200A pan-câncer correlacionou-se com células T CD8+, células T CD4+, células B, células T auxiliares, células natural killer, células T reguladoras, monócitos, macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, basófilos e granulócitos (Figura 8A). Posteriormente, analisamos a correlação entre a expressão de TMEM200A e TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) usando o banco de dados TISIDB, mostrando uma estreita correlação entre a expressão de TMEM200A e a abundância de 28 TIL em diferentes tipos de câncer (Figura 8B). Usamos o banco de dados TISIDB para avaliar a correlação entre a expressão de TMEM200A e drogas imunossupressoras em neoplasias malignas humanas para investigar mais profundamente como os imunomoduladores e a expressão TMEM200A estavam relacionados. Os resultados mostraram que os níveis de expressão TMEM200A foram significativamente correlacionados com agentes imunossupressores em uma variedade de cânceres (Figura 8C). Correlações significativas entre a expressão TMEM200A e certos agentes imunossupressores foram encontradas no câncer de testículo e no UMTT (Figura 8D-F). Em seguida, realizamos uma análise de correlação da expressão de TMEM200A com fatores imunoestimulatórios e moléculas de MHC usando o banco de dados TISIDB (Figura 8G,H). Os resultados mostraram que a expressão TMEM200A foi correlacionada com imunoestimulantes selecionados e moléculas de MHC em carcinoma urotelial de bexiga, carcinoma testicular, carcinoma adrenocortical e UMT (Figura 8I-L). O próximo passo foi investigar a correlação entre a expressão TMEM200A e os subtipos imunológicos ou moleculares na coorte de TCGA PanCan no banco de dados TISIDB. Observamos que os subgrupos imunológicos de nove tipos distintos de câncer expressaram TMEM200A de forma diferente, incluindo BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT e BRCA (Figura 8M). Além disso, seis diferentes formas de câncer com diversos subgrupos moleculares, incluindo HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV e LUSC, apresentaram expressão variável de TMEM200A (Figura 8N).

Análise TMEM200A e resposta imunoterápica
A eficácia dos inibidores de PD-1/PD-L1 está altamente correlacionada com a TMB, e alguns pacientes com tumores podem ser de certa forma previstos usando marcadores de TMB para a eficácia daimunoterapia34. Instabilidade de microssatélites (MSI) é o termo usado para descrever a função de reparo de incompatibilidade de DNA (MMR) quando erros de replicação de microssatélites não são corrigidos e se acumulam, alterando o comprimento ou a composição de base dos microssatélites35. O MSI é um marcador tumoral de significado clínico36. Assim, avaliamos o impacto da expressão de TMEM200A na imunoterapia, investigando a correlação entre a expressão de TMEM200A e TMB ou MSI. Os achados demonstraram uma correlação positiva substancial entre a expressão de TMEM200A e TMB em THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP e KIRC, mas TMEM200A expressão foi negativamente correlacionada com UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM e BRCA (Figura 9A). A expressão de MSI e TMEM200A esteve forte e favoravelmente ligada no TGCT, enquanto a expressão de TMEM200A foi significativa e negativamente correlacionada com MSI em UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC e CHOL (Figura 9B). Também avaliamos o potencial do TMEM200A como biomarcador para examinar a eficácia do ICB. Os resultados mostraram que TMEM200A previu sozinha as respostas do ICB com uma precisão de Área sob a Curva (AUC) > 0,5 em 7 das 25 subpopulações do ICB. TMEM200A apresentaram maior valor preditivo do que os clones de células T e B, ambos com valor 5. No entanto, o valor para TMEM200A foi menor do que para TIDE (AUC > 0,5 em 11 subpopulações ICB), escore MSI (AUC > 0,5 em 11 subpopulações ICB), CD274 (AUC > 0,5 em 15 subpopulações ICB), CD8 (AUC > 0,5 em 17 subpopulações ICB), IFNG (AUC > 0,5 em 16 subpopulações ICB) e Merck18 (AUC > 0,5 em 17 subgrupos ICB) (Figura 9C). O mau prognóstico de sobrevida nas coortes ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 e ICB_Hugo 2016_PD1 correlacionou-se com a alta expressão TMEM200A . No entanto, TMEM200A knockdown aumentou a potência de morte tumoral mediada por linfócitos na coorte média de Kearney 2018 T_PD1 e Pan 2018 OT1 (Figura 9D).

Análise do enriquecimento de TMEM200A GSEA em diferentes cânceres
Usamos DEGs entre TMEM200A subgrupos de alta expressão e TMEM200A baixa expressão em 32 neoplasias malignas para explorar as características do câncer relacionadas à TMEM200A. Descobrimos uma correlação substancial entre a imunodeficiência primária, a via de sinalização do receptor RIG (Retinoic acid-inducible gene)-I-like e a expressão TMEM200A em pan-câncer, especialmente em BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC e SKCM (Figura 10). A proteína citoplasmática viral ácido ribonucleico é detectada pela via de sinalização do receptor RIG-I-like. Os receptores RIG-I-like podem influenciar a produção de uma variedade de citocinas inflamatórias no corpo, ativando a via de sinalização do NF-kB, envolvendo certas proteínas da junção intracelular. Como resultado, a proteína transmembrana 200A (TMEM200A) pode desempenhar um papel crucial no recrutamento de proteínas intracelulares pelo receptor RIG-I-like. Esses achados implicaram forte correlação entre expressão TMEM200A e infiltração imunológica. Além disso, a análise de enriquecimento com GSEA mostrou que a expressão de TMEM200A pan-câncer foi correlacionada com a sinalização de quimiocinas, adesão celular, conexões de receptores de citocinas, vias de detecção da membrana celular e controle da autofagia (Figura 10). As proteínas transmembrana podem funcionar como moléculas de adesão para afetar o microambiente tumoral, além de desempenhar um papel crítico no controle da entrada de íons cálcio na célula a partir de reservatórios de cálcio 36. Portanto, os resultados obtidos com a análise do enriquecimento com GSEA podem ser devidos ao envolvimento de TMEM200A em vários processos fisiológicos, incluindo ativação de vias de transdução de sinal, formação de canais iônicos de membrana plasmática e regulação da quimiotaxia celular, adesão, apoptose e autofagia9.

Identificamos os 50 principais genes STAD correlacionados positiva e negativamente com TMEM200A do banco de dados LinkedOmics, que foram co-expressos em STAD, na forma de mapas de calor (Figura 11A,B). Avaliamos positivamente os 5 principais genes e os 5 principais negativamente associados à TMEM200A no GC (Figura 11C). Nossos resultados mostraram que a expressão de TMEM200A se correlacionou com a coexpressão SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) e SYTL1 (r = -0,33). Analisamos os resultados da visualização do limiar para entender melhor o papel da TMEM200A no STAD. Os seguintes critérios foram utilizados para triagem: mudança log2 vezes (FC) > 2,0 e valor de P ajustado 0,05. Foram encontrados 483 DEGs, dos quais 385 eram upregulated e 98 downregulated, e escolhemos 100 deles para serem visualizados para criar um mapa de calor (Figura 11D). Em seguida, para os DEGs que satisfizeram os critérios de triagem, foram realizadas análises de enriquecimento GO e KEGG. Os resultados da análise de enriquecimento com GO mostraram que o enriquecimento do PB (Processo Biológico) foi associado principalmente com matriz extracelular e tecido estrutural, o enriquecimento de CC (Componente Celular) foi associado principalmente com matriz extracelular contendo colágeno e membrana basal, e MF (Função Molecular) foi enriquecido principalmente em estrutura de matriz extracelular e ligação de glicosaminoglicanos (Figura 11E e Figura 11G). O enriquecimento da análise de KEGG mostrou que TMEM200A foi enriquecido principalmente na via de interações do receptor da matriz extracelular, citocromo P450 e sistema renina-angiotensina (Figura 11F e Figura 11H).

Modelo prognóstico baseado em TMEM200A e características clínicas do câncer de estômago
Investigamos a correlação entre TMEM200A e os dados clínicos de pacientes com STAD e, portanto, analisamos as características clínico-patológicas dos pacientes da coorte TCGA-STAD por meio de análise de regressão logística e com base nos níveis de expressão TMEM200A (Figura 12A). Idade, estádio clínico e expressão TMEM200A foram substancialmente correlacionados com EO em pacientes com STAD, de acordo com uma análise de regressão de Cox univariada (Figura 12B). A análise de regressão multivariada de Cox mostrou que a expressão de TMEM200A pode ser um fator preditivo isolado para EO em pacientes com STAD (HR = 1,282, IC 95% = 1,066-1,541, P = 0,008) (Figura 12C). Examinamos o potencial dessas características clinicopatológicas para predizer EO após 1, 3 e 5 anos em STAD usando o modelo padrão de gráfico de linhas de coluna em conjunto com vários parâmetros clínicos (Figura 12D). As curvas de calibração para probabilidades de sobrevida em 1 ano foram altamente consistentes com as probabilidades preditas pelo gráfico de linhas em coluna (Figura 12E).

TMEM200A upregulation em células STAD e aumento da proliferação celular
Ao revisarmos a literatura relacionada à TMEM200A, descobrimos que a alta expressão de TMEM200A indica mau prognóstico 13 e que o microambiente imune do GC pode ser influenciado pela atuação TMEM200A como molécula de adesão37, promovendo a invasão e metástase das células GC. Examinamos os níveis de proteína e os níveis de transcrição de RNAm de TMEM200A em linhagens celulares STAD para confirmar os achados do estudo supracitado. A linhagem celular GC HGC-27 superexpressou dramaticamente TMEM200A em comparação com a linhagem celular epitelial da mucosa gástrica saudável GES-1 em ambos os níveis de proteína e transcrição de RNAm (Figura 13A,B), indicando que TMEM200A foi superexpressa em células HGC-27. Os testes a seguir foram realizados usando células HGC-27 como resultado. Enquanto isso, para comprovar a acurácia dos resultados experimentais, utilizamos qRT-PCR para comparar a expressão diferencial de RNAm de TMEM200A em células GC humanas SGC-7901 e células epiteliais da mucosa gástrica GES-1, e os resultados mostraram que TMEM200A foi altamente expressa em células SGC-7901 (Figura 13B). TMEM200A foi derrubado em células HGC-27 para examinar o possível envolvimento de TMEM200A em STAD (Figura 13C). Com base nos resultados da mineração de banco de dados e em nossa análise de correlação de TMEM200A, verificou-se que TMEM200A estava envolvido principalmente na via de interações de receptores da matriz extracelular, que estava associada à proliferação e invasão do câncer. Assim, empregamos ensaios de CCK-8 para verificar como a expressão TMEM200A afetou o crescimento celular. Os ensaios CCK-8 mostraram que TMEM200A grupos knockdown (Si-RNA2 e Si-RNA3) apresentaram uma queda notável na viabilidade celular em comparação com o grupo NC (Figura 13D). Esses achados sugeriram que TMEM200A foi regulada para cima no STAD, e seu nível de expressão poderia afetar a proliferação de células GC. Com base nos resultados da análise de enriquecimento de KEGG na Figura 11F, verificamos que TMEM200A foi associado com a via de sinalização PI3K/AKT no GC, e TMEM200A, como fator de adesão celular, pode influenciar o mecanismo de carcinogênese gástrica por afetar a EMT. Portanto, usamos o western blotting para verificar os efeitos de TMEM200A knockdown na EMT e na via de sinalização PI3K/AKT antes e após o knockdown. Os resultados mostraram que a expressão da proteína P-AKT estava diminuída no grupo knockdown TMEM200A (TMEM200A-SiRNA2) em comparação com o grupo controle negativo (NC), enquanto os níveis das proteínas N-caderina, Vimentina e Snai também estavam diminuídos e a expressão da proteína E-caderina estava aumentada (Figura 13E). Todos esses resultados sugerem que TMEM200A podem afetar a EMT através da via de sinalização PI3K/AKT e, portanto, desempenhar um papel no CG.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho do estudo. Abreviações: TCGA = The Cancer Genome Atlas database; TIMER2.0 = O banco de dados TIMER2.0; OS= Sobrevida Global; PFS = Tempo de Sobrevida Livre de Progressão; ESD = Sobrevida doença-específica; SLD = Sobrevida Livre de Doença; TMB = Carga Mutacional do Tumor; MSI = Instabilidade de microssatélites; PPI = Interação proteína-proteína; GGI = Interação gene-gene; KEGG = Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto; GO = Ontologia Gênica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Níveis de expressão de TMEM200A em diferentes cânceres. (A) Expressão regulada para cima ou para baixo de TMEM200A do conjunto de dados de TCGA em diferentes neoplasias humanas. (B) Análise dos níveis de expressão de TMEM200A em tecidos tumorais e normais utilizando o banco de dados TIMER2.0. (C) Análise diferencial da atividade TMEM200A gênica em vários cânceres humanos a partir do conjunto de dados TCGA. (D) Classificação dos níveis de atividade gênica de TMEM200A em vários cânceres humanos com base na pontuação ssGSEA. (E) TMEM200A níveis de expressão do banco de dados HPA em tecidos saudáveis. (F) Níveis de expressão TMEM200A do banco de dados HPA em linhagens celulares normais. (G) Resultados IHQ para expressão de proteínas TMEM200A em câncer a partir do banco de dados HPA. Abreviações: TCGA = Atlas do Genoma do Câncer; ssGSEA = Análise de Enriquecimento de Conjunto Gênico de Amostra Única; HPA = Atlas da Proteína Humana; IHQ = Imuno-histoquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Correlação da expressão TMEM200A com as características clínico-patológicas e prognóstico dos diferentes tumores. (A) A correlação da expressão de TMEM200A na coorte de pan-câncer de TCGA (PanCan) com o estadiamento clínico-patológico em cada tumor foi analisada usando o banco de dados UCSC Xena. (B) Correlação da expressão de TMEM200A na coorte TCGA PANCAN com a idade dos pacientes em cada tumor. (C) Correlação da expressão TMEM200A na coorte TCGA PANCAN com o grau patológico tumoral em cada tumor. (D) Correlação da expressão de TMEM200A na coorte de TCGA PanCan com o status de sobrevida dos pacientes em cada tumor. (E) Análise de correlação da expressão de TMEM200A com a sobrevida global do pan-câncer em vários cânceres usando o modelo de regressão de Cox. (F) Correlação entre a expressão de TMEM200A e o prognóstico de SO pan-câncer na coorte TCGA PanCan. (G) Correlação entre expressão TMEM200A e sobrevida doença-específica. (H) Correlação entre a expressão de TMEM200A e o prognóstico do intervalo livre de progressão na coorte de TCGA PanCan. (I) Correlação entre expressão TMEM200A e intervalo livre de doença. (J) Uma análise de regressão COX multifatorial foi realizada no KIRC. (K) Uma análise de regressão COX multifatorial foi realizada no KIRP. Abreviações: TCGA = Atlas do Genoma do Câncer; KIRC: Carcinoma renal de células claras; KIRP: Carcinoma de células papilíferos renais; OS = Sobrevida global; DSS = Sobrevida doença-específica; PFI = Intervalo livre de progressão; DFI = Intervalo livre de doença. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise da metilação do DNA de TMEM200A em diferentes cânceres. (A) Os níveis de metilação do promotor de TMEM200A foram examinados em vários tipos de câncer, de acordo com o banco de dados SMART. (B) Níveis mais elevados de metilação do promotor de TMEM200A em diferentes tipos de câncer do que em tecidos normais foram examinados de acordo com o banco de dados UALCAN. (C) Usando o banco de dados UALCAN, determinou-se que os tecidos normais tinham níveis mais baixos de metilação do promotor de TMEM200A em vários tipos de câncer. (D) O nível de metilação do DNA de TMEM200A em BLCA, HNSC, LUAD e STAD mudou com o estágio patológico. Abreviações: BLCA=carcinoma urotelial de bexiga; HNSC= Carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço; LUAD=Adenocarcinoma de pulmão; STAD= Adenocarcinoma de estômago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: TMEM200A mutações genéticas em diferentes tipos de câncer. (A) Análise de TMEM200A tipos de mutação gênica em diferentes cânceres utilizando o banco de dados cBioPortal. (B) Estrutura proteica 3D do TMEM200A. A área de ligação é indicada pela porção colorida, enquanto as outras seções do TMEM200A são mostradas pela porção cinza. (C) Isoformas e distribuição de mutações TMEM200A somáticas. eixo X, sítios de aminoácidos; eixo y, número de mutações TMEM200A ; pontos verdes, mutações missense; e pontos cinzentos, mutações truncadas. (D) Validação das isoformas e distribuição de mutações somáticas TMEM200A utilizando dados do Sangerbox 3.0. (E) Para todos os tumores de TCGA, a correlação entre o status da mutação e a predição de sobrevida global dos pacientes foi investigada usando o banco de dados cBioPortal, com quadrados vermelhos indicando o grupo de mutação TMEM200A e quadrados azuis indicando o grupo não mutado. (F) Genes co-mutados com TMEM200A foram analisados usando a ferramenta cBioPortal: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 e SLC18B1. (G) Análise dos tipos de mutação TMEM200A em GC utilizando o banco de dados COSMIC. (H) Uma análise de TMEM200A tipos de SNV no GC foi conduzida usando o banco de dados COSMIC. Abreviações: TCGA = Atlas do Genoma do Câncer; OS = Sobrevida Global; COSMIC = Catálogo de Mutações Somáticas em Células Cancerosas; GC = Câncer gástrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Análise de correlação unicelular da expressão de TMEM200A em diferentes cânceres. (A) Resumo da expressão de TMEM200A no sítio Web TISCH. (B) Distribuição de oito tipos celulares distintos no conjunto de dados de melanoma cutâneo metastático GSE72056 dados. (C) Níveis de expressão de TMEM200A em células de melanoma metastático cutâneo do conjunto de dados GSE72056. (D) Distribuição de 13 tipos celulares distintos no conjunto de dados de câncer colorretal de GSE146771. (E) TMEM200A níveis de expressão em células de câncer colorretal do conjunto de dados GSE146771. (F) A correlação da expressão de TMEM200A com o status funcional de uma única célula em tumores múltiplos foi demonstrada usando o banco de dados CancerSEA. (G) Mapas de T-SNE ilustrando os níveis de expressão de TMEM200A em células tumorais individuais, incluindo GBM, LUAD, CML, CRC, RB e UM. Abreviações: GBM = Glioblastoma; LUAD = Adenocarcinoma de pulmão; LMC = Leucemia granulocítica crônica; CCR = Câncer colorretal; RB = Retinoblastoma; UMTT = Melanoma uveal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Rede de co-expressão e análise de enriquecimento funcional de TMEM200A ao nível do gene. (A) Rede de TMEM200A GGI e seus genes co-expressos. (B) Rede PPI. (C,D) TMEM200A e os genes co-expressos foram analisados para enriquecimento das vias GO e KEGG. Abreviações: PPI = Interação proteína-proteína; GGI = Interação gene-gene; KEGG = Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto; GO = Ontologia Gênica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Correlação entre a expressão de células TMEM200A e imunes, agentes imunossupressores, substâncias imunoestimulatórias e moléculas de MHC em vários tipos de câncer. (A) Mapa de calor de Sangerbox 3.0 demonstrando a correlação entre a expressão de TMEM200A e células imunes infiltrantes. (B) Mapa de calor mostrando a correlação entre células imunes infiltrantes e expressão TMEM200A no banco de dados TISIDB. (C) Mapa de calor mostrando a correlação entre células imunossupressoras e expressão TMEM200A no banco de dados TISIDB. (D-F) Correlação entre expressão TMEM200A e certos agentes imunossupressores em câncer de testículo e melanoma uveal. (G) Mapa de calor mostrando a correlação entre fatores imunoestimulatórios e expressão TMEM200A na base de dados TISIDB. (H) Mapa de calor da correlação entre a expressão de TMEM200A e moléculas de MHC no banco de dados TISIDB. (I-L) Correlação entre a expressão TMEM200A e alguns fatores imunoestimulatórios e moléculas de MHC no carcinoma urotelial de bexiga, carcinoma testicular, carcinoma adrenocortical e melanoma uveal. (M) Correlação entre subgrupos imunes pan-câncer e expressão TMEM200A. (N) Correlação entre subgrupos moleculares pan-câncer e expressão TMEM200A. Abreviações: MHC = Complexo principal de histocompatibilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Análise da resposta imunoterápica de TMEM200A na pancitopenia. (A) Correlação da expressão de TMEM200A em diferentes cânceres com TMB. (B) Correlação entre MSI em pan-câncer e expressão TMEM200A . (C) TMEM200A potencial como um biomarcador para prever a resposta de bloqueio de checkpoint imune. (D) A média ponderada da correlação de TMEM200A com o resultado de sobrevida do ICB e a mudança logarítmica da dobra (logFC) no rastreamento do CRISPR foram usadas para classificá-lo. Abreviações: TMB = Carga mutacional tumoral; ICB = Bloqueio de Checkpoint Imune; CRISPR =Repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Análise do enriquecimento GSEA de TMEM200A em diferentes cânceres. As cinco principais vias nas quais TMEM200A desempenharam um papel funcional importante na regulação de 32 cânceres foram identificadas pela análise de enriquecimento GSEA. O painel esquerdo mostra os resultados da análise de enriquecimento GSEA para TMEM200A em ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ e SARC. O painel direito mostra os resultados da análise de enriquecimento GSEA para TMEM200A em SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS e UVM. Abreviações: GSEA =Gene Set Enrichment Analysis; CAC = carcinoma adrenocortical; BLCA = Carcinoma urotelial de bexiga; BRCA = Carcinoma invasivo da mama; CESC = Carcinoma epidermóide cervical e adenocarcinoma endocervical; CHOL = Colangiocarcinoma; COAD = Adenocarcinoma de cólon; ESCA = Carcinoma de esôfago; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço; KICH = Rim Cromófobo; KIRC = Carcinoma renal de células claras; KIRP = Carcinoma de células papilíferos renais; LAML = Leucemia Mielóide Aguda; LGG = Glioma Cerebral de Baixo Grau; LIHC = Carcinoma hepatocelular hepático; LUAD = Adenocarcinoma de pulmão; LUSC = Carcinoma de células escamosas de pulmão; MESO = Mesotelioma; OV = Cistoadenocarcinoma seroso ovariano; PAAD = Adenocarcinoma pancreático; PCPG = Feocromocitoma e Paraganglioma; PRAD = Adenocarcinoma de próstata; READ Adenocarcinoma de reto; SARC=Sarcoma; SKCM = Melanoma cutâneo cutâneo; STAD = Adenocarcinoma de estômago; TGCT = Tumores Testiculares de Células Germinativas; THCA = Carcinoma da tireoide; THYM = Timoma; UCEC = Carcinoma de Endométrio do Corpo Uterino; SCU = Carcinossarcoma Uterino; UVM = Melanoma Uveal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: TMEM200A no STAD. (A) Top 50 genes encontrados com correlação negativa com a expressão de TMEM200A em STAD pelo banco de dados LinkedOmics. (B) Top 50 genes em STAD que foram positivamente conectados a TMEM200A. (C) Os cinco principais genes de TMEM200A positivamente e cinco genes negativamente correlacionados no STAD. (D) Mapa de calor dos DEGs em STAD. (E-H) Investigação das vias GO e KEGG enriquecidas utilizando os DEGs triados. Abreviações: STAD=Adenocarcinoma de estômago; DEGs= Expressão diferencial de genes; KEGG = Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto; GO = Ontologia Gênica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12: Correlação entre as características clínicas do STAD e o nível de expressão TMEM200A . (A) Análise dos níveis de expressão TMEM200A e características clínicas de STAD por meio de regressão logística. (B,C) Análise de Cox de parcelas florestais STAD para variáveis únicas e múltiplas. (D) Gráficos de linhas em coluna predizendo EO em pacientes com STAD com base no sexo, grau patológico, idade, estágio patológico e expressão TMEM200A . (E) Gráficos de calibração mostrando a calibração do modelo do gráfico de linhas de coluna. Abreviações: STAD= Adenocarcinoma de estômago; OS=Sobrevida Global. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 13
Figura 13: TMEM200A expressão é upregulated em STAD e promove a proliferação de células de câncer gástrico. (A) Detecção da expressão de TMEM200A em células de câncer gástrico HGC-27 e células epiteliais da mucosa gástrica GES-1 por western blotting. (B) Detecção da expressão de TMEM200A nas células GC HGC-27 e SGC-7901 e nas células epiteliais da mucosa gástrica GES-1 por qRT-PCR. (C) A eficiência de expressão de TMEM200A foi bastante reduzida no grupo knockdown TMEM200A em comparação com o grupo não-knockdown em células GC HGC-27, como demonstrado por qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown inibiu significativamente a proliferação de células GC medida pelo ensaio CCK8. (E) O knockdown de TMEM200A inibiu significativamente as proteínas relacionadas na EMT e afetou a fosforilação de AKT na via de sinalização PI3K/AKT. Abreviação: GC = Câncer gástrico; qRT-PCR: Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; EMT=Transição Epitélio-Mesenquimal; AKT=Proteína quinase B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

TMEM200A pertence a uma família de TMEMs que é essencial para que as células cancerosas proliferem38. A expressão variável de TMEM200A em diferentes neoplasias malignas tem recebido menos atenção, e uma investigação completa do pan-câncer está faltando. No entanto, evidências continuam a se acumular, mostrando que a família de proteínas transmembrana TMEM pode ser importante na manutenção de células cancerosas malignas por meio de interações com várias proteínas, por exemplo, a ativação de canais Cl- ativados por TMEM16A Ca2+ por ROCK1/moesina promove metástase BRCA39. Portanto, no presente trabalho, nossas análises se concentraram em explorar a viabilidade da TMEM200A como alvo terapêutico do câncer e marcador diagnóstico tumoral. Em particular, investigamos os níveis de expressão de TMEM200A em 33 tumores malignos usando dados de RNA-seq do banco de dados UCSC Xena, e os resultados do banco de dados TIMER2.0 validaram com sucesso as análises no banco de dados UCSC Xena.

Posteriormente, a ferramenta web Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e o banco de dados CancerSEA foram utilizados para analisar os níveis de expressão de TMEM200A em diferentes tipos de monócitos. Os sites Sangerbox e TISIDB foram usados para ajudar a entender como TMEM200A afeta a infiltração imunológica. Também identificamos as vias de sinalização nas quais TMEM200A desempenha uma função-chave em cada câncer por meio da análise de enriquecimento GSEA para entender os principais papéis funcionais do TMEM200A em cada malignidade.

TMEM200A podem atuar como uma molécula de adesão para controlar o ambiente imunológico do GC e promover a disseminação invasiva de células GC. Portanto, identificamos 483 genes diferencialmente expressos (DEGs) associados ao nível de expressão de TMEM200A através do banco de dados TCGA e analisamos o enriquecimento GO e KEGG desses 483 DEGs. Os resultados do enriquecimento mostraram que a via PI3K/AKT desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do câncer, e a via PI3K/AKT pode ser um dos fatores determinantes do câncer.

Além disso, realizamos testes celulares e moleculares depois de aprender mais sobre a função crucial do TMEM200A em impulsionar o desenvolvimento de câncer para confirmar a correlação entre a expressão de TMEM200A e a atividade das células STAD. Como esperado, descobrimos que a TMEM200A downregulation em células STAD reduziu muito a proliferação celular, e que as linhagens de células cancerosas expressaram TMEM200A em níveis consideravelmente maiores do que as linhagens celulares normais. Ao vasculhar a literatura relacionada à família de proteínas transmembrana nos últimos anos, verificamos que as proteínas transmembrana, como moléculas de adesão celular37, têm um papel regulatório na EMT.

Além disso, de acordo com os resultados da análise de enriquecimento de genes relacionados à TMEM200A em GC, descobrimos que TMEM200A podem ter um papel regulatório na via de sinalização PI3K/AKT em GC. Experimentos de Western blotting revelaram que TMEM200A knockdown poderia reduzir as proteínas Vimentina, N-caderina e Snai e inibir a fosforilação de AKT, sugerindo que TMEM200A regula o microambiente tumoral afetando a EMT, e que a via de sinalização PI3K/AKT pode estar envolvida na regulação mediada por TMEM200A do desenvolvimento de GC. Nos últimos anos, alguns estudos constataram que a EMT é a principal causa de resistência aos quimioterápicos em pacientes com CG. A plasticidade epitélio-mesenquimal (EMP) e o microambiente tumoral têm sido descritos como fatores limitantes para o tratamento efetivo em muitos tipos decâncer40. A ocorrência de EMT pode fazer com que as células GC percam suas propriedades características e apresentem as características das célulasmesenquimais41. Essa característica não só reduz a sensibilidade dos pacientes com CG às drogas quimioterápicas, mas também aumenta a capacidade invasiva e migratória das células do CG, levando à metástase tumoral. Portanto, pelas razões mencionadas acima, nosso estudo auxilia a pesquisa e o desenvolvimento de pontos-chave regulatórios na EMT e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas direcionadas, explorando o mecanismo de ação específico de TMEM200A que afetam a EMT.

O uso da bioinformática para pesquisa tem aumentado nos últimos anos e, para este estudo, foram acessados dados de diversas bases de dados da internet. O uso desses bancos de dados on-line em bioinformática simplificou e acelerou o estudo do câncer, além de fornecer aos pesquisadores um meio acessível de validar seus resultados.

A técnica de bioinformática, no entanto, tem algumas desvantagens. Quando utilizamos essas bases de dados para análise, um mesmo estudo pode fornecer achados inconsistentes ou mesmo conflitantes em várias bases de dados, uma vez que muitas bases de dados on-line incluem dados de vários conjuntos de dados. Além disso, muitas bases de dados não são atualizadas por muito tempo e, devido a dificuldades de direitos autorais, seu conteúdo nunca pode ser ampliado; portanto, os achados analíticos que os pesquisadores obtêm dessas bases de dados são sempre restritos. Portanto, nesta pesquisa, empregamos diferentes bases de dados para examinar os resultados coletivamente para superar essas restrições e garantir a correção dos achados. Para garantir que os achados obtidos não fossem alterados consideravelmente, repetimos o procedimento ao utilizar diferentes bases de dados para análise. Os resultados dos experimentos de western blot apoiaram nossa previsão de bioinformática de que TMEM200A podem controlar a EMT em GC regulando a via de sinalização PI3K/AKT, o que afetaria a proliferação de células GC. Nós previmos o mecanismo de ação do TMEM200A usando bioinformática em conjunto com a literatura relacionada.

Em resumo, este trabalho demonstra como as ferramentas de bioinformática podem facilitar significativamente o planejamento experimental e ser usadas para fazer muitos outros tipos de previsões de pesquisa científica. Futuros pesquisadores de câncer provavelmente adotarão o paradigma primário de combinar validação experimental com predição de bioinformática, e este trabalho serve como um bom modelo para esse objetivo.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82160550).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

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References

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TMEM200A Análise Multiômica Biomarcador Pan-câncer Proteína Transmembrana Infiltração Imune Dados RNA-seq Biomarcador Diagnóstico Biomarcador Prognóstico Câncer Gástrico (GC) Culturas de Células In Vitro Knockdown Reação Quantitativa em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) Western Blotting Comportamento Maligno Formação de Tumores Transição Epitélio-mesenquimal (EMT) Via de Sinalização PI3K/AKT Inibição da Proliferação
Análise Multiômica de <em>TMEM200A</em> como Biomarcador Pan-Câncer
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Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

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