Summary
여기에서는 암에서 TMEM200A 의 생물학적 기능을 연구하기 위해 여러 생물 정보학 도구를 결합한 프로토콜을 제시합니다. 또한 생물정보학 예측을 실험적으로 검증합니다.
Abstract
막관통 단백질인 TMEM200A는 인간의 암 및 면역 침윤과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 여기서는 멀티오믹스 분석을 통해 일반 암에서 TMEM200A 의 기능을 평가하고, 그 결과를 확인하기 위해 위세포의 시험관 내 세포 배양을 이용하였다. 여러 인간 암 유형에서 TMEM200A 의 발현은 UCSC Xena 데이터베이스의 RNA-seq 데이터를 사용하여 평가되었습니다. 생물정보학 분석은 진단 및 예후 바이오마커로서 TMEM200A 의 잠재적인 역할을 밝혀냈습니다.
정상 위 및 암 세포주의 배양액을 배양하고 TMEM200A 녹다운했습니다. TMEM200A 의 발현 수준은 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 측정되었습니다. 그런 다음 체외 기능 상실 연구를 사용하여 위암(GC) 세포의 악성 행동 및 종양 형성에서 TMEM200A 의 역할을 결정했습니다. 웨스턴 블롯은 GC의 상피-중간엽 전이(EMT) 및 PI3K/AKT 신호 전달 경로에 대한 녹다운의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 생물정보학 분석은 TMEM200A 가 GC에서 높은 수준으로 발현되었음을 보여주었습니다.
GC 세포의 증식은 TMEM200A 녹다운(knockdown)에 의해 억제되었으며, 이는 또한 비멘틴, N-cadherin 및 Snai 단백질을 감소시키고 AKT 인산화를 억제했습니다. PI3K/AKT 신호전달 경로는 GC 발달의 TMEM200A 매개 조절에도 관여하는 것으로 나타났다. 여기에 제시된 결과는 TMEM200A 가 EMT에 영향을 미쳐 종양 미세환경을 조절한다는 것을 시사합니다. TMEM200A 는 또한 PI3K/AKT 신호전달을 통해 EMT에 영향을 미쳐 종양 미세환경에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 범암, 특히 GC에서 TMEM200A 는 잠재적인 바이오마커 및 종양유전자가 될 수 있습니다.
Introduction
암은 전 세계적으로 높은 이환율과 사망률로 인해 전세계적으로 인간의 건강을 위협하는 지속적인 공중 보건 문제로 부상하고 있으며1 사회에 막대한 재정적, 의료적 부담을 주고 있다2. 암 표지자(cancer marker)3의 발견 덕분에 최근 몇 년 동안 암 치료의 상당한 발전이 이루어졌으며, 연구자들은 암 치료를 위한 새로운 진단 방법과 신약을 개발했습니다. 그러나 일부 암 환자는 약물 내성, 약물 부작용, 화학적 민감성 등의 요인으로 인해 예후가 좋지 않다4. 따라서 초기 암의 스크리닝과 치료를 위한 새로운 바이오마커 식별이 시급하다5.
막 단백질은 세포와 세포소기관막에 결합하고 통합할 수 있는 단백질이다6. 이들은 막에 대한 결합 강도와 그 위치에 따라 지질 고정 단백질, 통합 단백질 및 말초 막 단백질의 세 가지 범주로 그룹화 할 수 있습니다 7,8. 막관통(TMEM) 단백질은 적어도 하나의 막관통 세그먼트(9)로 구성되는 일체형 막 단백질로서, 생체막을 완전히 또는 부분적으로 통과한다.
TMEM 계열에 속하는 단백질의 작용 기전은 잘 알려져 있지 않지만, 이러한 단백질은 여러 유형의 암에 관여하는 것으로 알려져 있다10. 몇몇 TMEM 단백질은 이동성, 증식성 및 침습성 표현형과 연관되어 있으며, 이들의 발현은 종종 환자의 예후와 관련이 있다11. 따라서 TMEM 가족 구성원이 연구 대상이 되었습니다. TMEM에 대한 기존 보고를 종합적으로 검토한 결과, TMEM은 대부분 세포간 및 세포내 신호전달12, 면역 관련 질환 및 종양형성10과 관련이 있는 것으로 나타났다. 많은 TMEM은 또한 중요한 생리학적 기능, 예를 들어 원형질막의 이온 채널, 신호 전달 경로의 활성화, 세포 화학주성의 중재, 접착, 세포자멸사 및 자가포식10을 가지고 있습니다. 따라서 TMEM 단백질이 종양의 발견 및 치료에 중요한 예후 표지자가 될 수 있다는 가설을 세웠습니다.
TMEM200A 발현은 위암(GC)에서 현저히 증가합니다. 6q23.1 염색체에 8개의 엑손이 있고 전체 길이가 77.536kb인 TMEM200A13의 더 높은 발현은 GC의 경우 전체 생존(OS)에 대한 나쁜 예후와 관련이 있습니다. 그러나 종양학 연구에서 발현의 변화는 거의 보고되지 않았습니다. 이 기사에서는 공개적으로 사용 가능한 다양한 데이터 세트를 사용하여 다양한 암 연구에서 치료 표적 및 종양 진단 마커로서의 TMEM200A 의 유용성을 비교하고 분석합니다. 우리는 UCSC Xena 및 TCGA 데이터베이스의 RNA-seq 데이터와 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 다양한 인간 암 유형에서 발현 수준뿐만 아니라 범암 진단 및 예후 바이오마커로서의 TMEM200A 의 효과를 평가했습니다.
TMEM200A 발현 수준이 돌연변이 비율, 조절 과정, 종양 진단 및 예후, 면역 침윤 및 면역 요법에 미치는 영향은 계산 도구와 데이터 세트 웹 사이트를 혼합하여 추가로 조사되었습니다. CBioPortal 및 COSMIC(Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) 데이터베이스를 사용하여 TMEM200A의 돌연변이를 조사했습니다. Sangerbox와 TISIDB 웹사이트는 TMEM200A 면역 침윤에 어떤 영향을 미치는지 이해하기 위해 활용되었습니다. 종양 면역 단일 세포 센터(TISCH) 온라인 도구와 CancerSEA 데이터베이스를 사용하여 TMEM200A의 기능을 조사했습니다. 마지막으로, GC 세포의 악성 거동 및 종양 발달 기능에 대한 TMEM200A의 영향을 평가하기 위해 in vitro assay에서 기능 상실 실험을 수행했습니다. 또한 녹다운이 GC의 PI3K/AKT 신호 경로와 상피-중간엽 전이(EMT)에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위해 웨스턴 블로팅TMEM200A 수행했습니다.
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Protocol
1. 암 게놈 아틀라스(TCGA) 데이터베이스
참고: TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터베이스에는 서로 다른 종양 조직에 있는 유전자의 염기서열 분석 데이터가 포함되어있다 14. TPM(part per million) 형식당 TMEM200A 전사체 연구를 위한 TCGA의 RNA-seq 데이터는 UCSC Xena 웹사이트15 (https://xenabrowser. net/datapages/)에서 추출하고 샘플 간의 발현을 비교하기 위해 변환된 log2를 추출했습니다.
- UCSC Xena 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
- Launch Xena 탭을 클릭합니다.
- 화면 상단의 DATA SETS 탭을 클릭합니다.
- 이 페이지의 129개 코호트와 1,571개의 데이터 세트에서 탭을 클릭하면 GDC TCGA 급성 골수성 백혈병(LAML), GDC TCGA 부신피질암(ACC), GDC TCGA 담관암(CHOL) 등과 같은 총 33개의 암을 볼 수 있습니다.
- 유전자 발현 RNAseq 메뉴에서 HTSeq - FPKM GDC Hub 탭을 선택하고 클릭합니다.
참고: HTSeq - FPKM GDC Hub 는 동의에 의해 수정된 데이터를 나타냅니다. - 다운로드 메뉴에서 해당 링크를 클릭하십시오.
참고: 위의 방법으로 33개의 서로 다른 암 유형에 대한 RNA-Seq 데이터를 다운로드했습니다. - 33가지 암 유형에 대한 RNA-seq 데이터의 zip 아카이브를 컴퓨터의 바탕 화면 폴더에 있는 단일 파일로 압축을 풉니다.
- 압축을 푼 txt 파일을 동일한 폴더에 통합하고 Perl 스크립트를 이 폴더에 배치합니다.
- Perl 소프트웨어를 열고 폴더 경로를 복사하여 마우스 커서가 있는 Perl 소프트웨어에 붙여넣고 Enter 키를 누르고 Perl 코드 이름과 유전자 이름(TMEM200A)을 입력한 다음 Enter 키를 눌러 새 txt 파일(singleGeneExp.txt)을 가져옵니다.
참고: 이 새로운 txt 파일(singleGeneExp.txt)에는 다른 환자의 33개 암에서 TMEM200A 의 유전자 발현이 포함되어 있습니다. - R 코드(diffR)를 열고 singleGeneExp.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(diffR)를 실행하고 "ggpubr" 패키지를 통해 그림을 그립니다.
2. TIMER2.0 데이터베이스
- TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 데이터베이스 16 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
- Cancer Exploration(암 탐사) 탭을 클릭합니다.
- 검색 상자에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하고 제출 탭을 클릭하여 다양한 유형의 종양에서 TMEM200A 의 차등 발현 이미지를 가져옵니다.
3. 인간 단백질 아틀라스(HPA)
- Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) 17웹 인터페이스로 이동합니다.
- 검색 상자에 ID(TMEM200A)를 입력하고 검색 버튼을 클릭합니다. TISSUE 하위 아틀라스를 선택합니다.
- 페이지 위로 마우스를 가져가 아래로 스크롤하여 Protein Expression Overview(단백질 발현 개요 ) 탭을 찾습니다.
참고: 단백질 발현 개요 섹션은 인체의 45개 기관에서 TMEM200A 의 단백질 발현 수준을 보여줍니다.
4. HumanMethylation450 Illumina 인피늄 DNA 메틸화 플랫폼 배열
참고: HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA 메틸화 플랫폼 어레이를 사용하여 메틸화에 대한 데이터를 수집했습니다. SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) 데이터베이스18을 사용하여 TMEM200A DNA 메틸화 수준을 평가할 수 있다.
- SMART로 이동 web사이트 인터페이스.
- 검색 상자에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하여 염색체의 TMEM200A 분포와 다양한 유형의 악성 종양에서 TMEM200A의 메틸화 수준을 얻습니다.
- 페이지를 아래로 스크롤하여 Click to check CpG-aggregated methylation 메뉴로 이동하고 Plot 버튼을 클릭합니다. 페이지 하단에서 Figure 다운로드 버튼을 찾아 클릭합니다. 그림을 다운로드합니다.
5. UALCAN 데이터베이스
- UALCAN 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: 다양한 악성 종양에서 TMEM200A 프로모터 메틸화 수준의 상자 플롯은 UALCAN 데이터베이스(http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19를 통해 생성되었습니다 - 페이지 상단에서 TCGA 버튼을 클릭합니다.
- 화면의 Gene ID 입력 상자에 TMEM200A 입력합니다. TCGA 데이터셋 메뉴에서 아래로 스크롤하여 쿼리할 암 유형을 선택합니다.
- 탐색(Explore) 버튼을 클릭한 후 분석을 위한 링크(Links for analysis) 메뉴에서 하위 그룹 분석 메틸화(Methylation)를 클릭하면 이 종양의 메틸화 결과를 얻을 수 있습니다.
참고: 이 방법을 통해 UALCAN 데이터베이스에서 22개의 종양에 대한 메틸화 결과를 얻었습니다.
6. 암세포의 체세포 돌연변이 카탈로그(COSMIC) 데이터베이스
- Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) 웹사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: 인간 게놈의 코딩 돌연변이, 비코딩 돌연변이 게놈 재배열 및 융합 유전자에 대한 데이터는 다양한 암에서 다양한 TMEM200A 돌연변이의 빈도를 결정하는 데에도 사용되는 COSMIC(Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) 데이터베이스20(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)에서 사용할 수 있습니다. - 검색창에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하고 SEARCH 버튼을 클릭하면 새 화면으로 이동합니다.
- 유전자 메뉴에서 TMEM200A의 유전자 ID 이름이 나타나는 링크를 찾아 클릭합니다.
- 새 페이지에서 돌연변이 분포 그룹화 열을 찾아 종양 TMEM200A 의 돌연변이 상태를 가져옵니다.
7. CBio포털
- CBioPortal 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: 암 유전체학 데이터는 cBioPortal(www.cioportal.org) 데이터베이스를 사용하여 검색, 다운로드, 분석 및 시각화할 수 있습니다. 체세포 돌연변이, DNA 복제 수 변화(CNA), mRNA 및 microRNA(miRNA) 발현, DNA 메틸화, 단백질 풍부도 및 인단백질 풍부도는 cBioPortal21에 의해 통합된 게놈 데이터 유형 중 일부에 불과합니다. cBioPortal을 사용하면 광범위한 연구를 수행할 수 있습니다. 그러나 주요 강조점은 돌연변이 및 그 시각화와 관련된 다양한 분석입니다. - 시각화 및 분석을 위한 연구 선택 섹션의 PanCancer Studies 하위 섹션에서 전체 게놈의 Pan-cancer 분석 데이터 세트를 선택합니다. 그런 다음 Query By Gene 버튼을 클릭합니다.
- 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. Submit Query(쿼리 제출) 버튼을 클릭합니다.
- 페이지 상단의 Cancer Type Detailed 버튼을 클릭하면 다양한 유형의 암에서 TMEM200A 의 돌연변이를 얻을 수 있습니다.
8. Sangerbox 3.0 도구
- Sangerbox 3.0 도구 인터페이스로 이동합니다.
참고: 모든 암에서 면역 침윤 세포, 면역억제제, 면역자극 인자 및 MHC 분자(주요 조직적합성 복합체)와 TMEM200A 발현의 상관관계는 Sangerbox 3.0 도구22 (http://vip.sangerbox.com/)의 범암 면역 침윤 데이터를 사용하여 CIBERSORT 면역 침윤으로 분석되었습니다. - 페이지 왼쪽의 도구 모음에서 Pan-Cancer Analysis(범암 분석) 메뉴의 Immunocellular Analysis (CIBERSORT)(면역세포 분석(CIBERSORT)) 탭을 선택하고 클릭합니다.
- 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.
9. TISIDB 데이터베이스
- TISIDB 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: TISIDB 데이터베이스23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/)은 다양한 암에서 면역 침윤 세포, 면역억제제, 면역 자극 인자 및 MHC 분자와 TMEM200A 발현의 상관관계를 조사하기 위해 사용되었습니다. - Enter Genes의 질의란에 Target Gene Symbol(TMEM200A)을 입력합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.
- 페이지 상단의 Lymphocytes, Immunomodulators, Chemokines 및 Subtype 섹션을 클릭합니다. 페이지 하단에서 관련 이미지를 다운로드하십시오.
10. TIDE 데이터베이스
- TIDE 웹사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: TIDE 데이터베이스(http://tide.dfci.harvard.edu/)는 종양 면역 관문 차단 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 바이오마커로서 TMEM200A 의 잠재력을 평가하는 데 사용되었습니다. - 초기 화면에서 이메일 주소를 입력하여 계정을 등록하고 로그인합니다.
- 페이지 상단에서 Biomarker Evaluation 하위 섹션을 찾아 클릭합니다.
- 페이지 하단의 Enter Genes(유전자 입력)에 대한 쿼리 상자에 대상 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 그런 다음 제출 버튼을 클릭합니다.
- 페이지에서 마우스를 끌어 페이지를 아래로 밀어 분석 결과를 찾습니다.
11. CancerSEA 데이터베이스
- CancerSEA 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: 단일 세포 염기서열 분석 데이터를 사용하여 TMEM200A 발현과 다른 종양 세포의 기능적 상태 간의 관계를 조사했습니다. 이것은 CancerSEA 데이터베이스24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)를 사용하여 수행되었습니다. - 페이지 상단에서 검색 탭을 찾아 클릭합니다.
- 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.
12. 종양 면역 단세포 센터(TISCH) 네트워크 도구
- 종양 면역 단일 세포 센터(TISCH) 네트워크 도구 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: TMEM200A 와 암세포의 발현 수준 사이의 상관관계는 또한 종양 면역 단일세포 센터(TISCH) 네트워크 도구(25)를 사용하여 나타내었다. - 유전자 입력(Enter Genes)의 질의란에 타겟 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다. 탐색 버튼을 클릭합니다.
- 이 페이지의 암 유형 메뉴에서 모든 암 데이터 세트를 선택하고 클릭합니다. 그런 다음 페이지를 아래로 스크롤하고 검색 버튼을 클릭합니다.
13. 진매니아
- GeneMANIA 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
참고: TMEM200A와 기능적으로 관련된 유전자 사이의 상관관계는 유전자-유전자 상호작용(GGI) 네트워크 구축을 위한 유전자 다중 연관 네트워크 웹사이트 GeneMANIA (www.genemania.org)26에 대한 통합 전략을 사용하여 예측되었습니다. - 페이지 왼쪽 상단의 검색 상자에 유전자 ID(TMEM200A)를 입력하고 검색 도구를 클릭합니다.
참고: GeneMANIA 웹 도구를 사용하여 TMEM200A와 관련된 20개의 유전자를 찾았습니다.
14. 기능적 농축 분석
- 농축을 위해 분석할 유전자의 심볼 ID를 txt 파일 형식으로 저장합니다.
- R 코드(symbolidR)를 열고 위의 txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(symbolidR)를 실행합니다. 이러한 유전자의 심볼 ID를 "org. Hs.eg.db" 패키지. id.txt 파일을 가져옵니다.
- R 코드(GOR 및 KEGGR)를 열고 id.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(GOR 및 KEGGR)를 실행합니다. 이 프로토콜을 따르려면 "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db", "enrichplot"을 사용하고 "gglot2" 패키지를 사용하여 보강 결과를 플로팅합니다.
15. 유전자 활성의 차이 분석
참고: 각 암 검체의 TMEM200A 점수는 ssGSEA(single-sample gene set enrichment analysis)27를 사용하여 계산하였으며, 다양한 암에 대해 암성 및 건강한 조직에서의 TMEM200A 유전자 활성도의 차등 분석을 수행하였다.
- 1.7단계에서 다운로드한 33개 종양 유형의 RNA-seq 데이터를 기반으로 다운로드한 모든 파일의 압축을 풀고 통합 폴더에 넣습니다.
- 위의 폴더에 merge.txt 파일을 넣습니다.
참고: BioWolf(www.biowolf.cn)의 merge.txt 파일 데이터에는 TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터베이스의 모든 종양에 있는 모든 환자의 유전자 발현이 포함되어 있습니다. - R 코드(ssGSEAR)를 열고 위 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 코드(ssGSEAR)에서 geneName이 있는 줄을 선택하고 유전자 ID(TMEM200A)를 입력합니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(ssGSEAR)를 실행합니다. 유전자 활동에 대한 채점 파일 가져오기: scores.txt.
NOTE: ssGSEA 알고리즘을 사용하여 먼저 merge.txt 파일에 제공된 데이터에 따라 유전자 간 상관 계수를 기반으로 유전자 세트 파일을 구성하고 파일에서 대상 유전자(TMEM200A)와 상관 관계가 더 높은 유전자를 식별합니다. 그런 다음 상관 관계가 높은 유전자를 TMEM200A의 활성 유전자로 통합하고 마지막으로 각 샘플에서 활성 유전자의 점수를 얻습니다. - R 코드(scoreDiffR)를 열고 scores.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(scoreDiffR)를 실행하고 "plyr", "reshape2" 및 "ggpubr" 패키지를 통해 그림을 그립니다.
16. 임상병리학적 상관관계 및 생존예후 분석
- UCSC Xena 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
- Launch Xena(Xena 실행) 탭을 클릭합니다.
- 화면 상단의 DATA SETS 탭을 클릭합니다.
- 페이지 위로 마우스를 가져간 후 아래로 스크롤하여 TCGA Pan-Cancer(PANCAN) 탭을 찾습니다.
- 이 페이지의 129개 코호트와 1,571개 데이터 세트에서 TCGA Pan-Cancer (PANCAN) 탭을 클릭합니다.
- 표현형 메뉴에서 큐레이팅된 임상 데이터 탭을 선택하고 클릭합니다.
- 다운로드 메뉴에서 해당 링크를 클릭하십시오.
참고: 위 링크의 TCGA 데이터베이스에서 33개 암에 대한 임상 데이터를 다운로드하십시오. - 다운로드한 임상 데이터 파일의 압축을 풀고 압축을 푼 파일을 xls 파일 형식으로 엽니다.
- 필요한 임상 데이터(병기, 나이, 병기, 환자 상태)를 파일에 정리하여 보관하고, 불필요한 나머지 임상 데이터는 삭제하고, 파일 이름을 임상으로 변경한 후 전체 파일을 txt 형식의 파일로 저장합니다.
- 1.9단계에서 얻은 singleGeneExp.txt 기반으로 이 파일을 구성된 clinical.txt 파일과 동일한 폴더에 넣습니다.
- 다운로드한 임상 데이터의 압축을 풀고 singleGeneExp.txt 및 clinical.txt 파일을 압축을 푼 임상 파일과 동일한 폴더에 넣습니다.
- R 코드(clinicalDiffR)를 열고 위의 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고, 수정된 R 코드(clinicalDiffR)를 실행하고, "ggpubr" 패키지를 사용하여 그림을 그립니다.
- UCSC Xena 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다.
- Launch Xena(Xena 실행) 탭을 클릭합니다.
- 화면 상단의 DATA SETS 탭을 클릭합니다.
- 이 페이지의 129개 코호트와 1,571개의 데이터 세트에서 탭을 클릭하면 GDC TCGA 급성 골수성 백혈병(LAML), GDC TCGA 부신피질암(ACC), GDC TCGA 담관암(CHOL) 등과 같은 총 33개의 암을 볼 수 있습니다.
- 표현형 메뉴에서 생존 데이터 탭을 선택하고 클릭합니다.
- 다운로드 메뉴에서 해당 링크를 클릭하십시오.
- 33가지 암 유형에 대한 생존 데이터의 zip 아카이브를 컴퓨터의 바탕 화면 폴더에 있는 단일 파일로 압축을 풉니다.
- 압축을 푼 생존 데이터를 1.9단계에서 얻은 singleGeneExp.txt 파일과 동일한 폴더에 넣습니다.
- R 코드(preOSR)를 열고 위의 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(preOSR)를 실행합니다. "limma" 패키지를 통해 계산하여 범암에서 TMEM200A 의 생존에 대한 데이터 파일을 얻습니다 expTime.txt.
- R 코드(OSR)를 열고 expTime.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(OSR)를 실행합니다. expTime.txt 파일의 데이터를 기반으로 "survival" 및 "survminer" 패키지를 사용하여 KM 분석을 수행하고 범암 TMEM200A에 대한 생존 곡선을 플로팅합니다.
17. 산림 플롯 구성을 사용한 일변량 및 다변량 Cox 회귀 분석
- R 코드(COXR)를 열고 16.23에서 expTime.txt 파일을 가져온 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(COXR)를 실행합니다. expTime.txt 파일의 데이터를 기반으로 "survival", "survminer" 및 "forestplot" 패키지를 사용하여 일변량 COX 회귀 분석을 수행하여 다양한 암의 TMEM200A 에 대한 일변량 -숲 플롯을 플로팅합니다.
- 16.23단계의 expTime.txt 파일과 16.10단계의 clinical.txt 파일을 동일한 폴더에 넣습니다.
- R 코드(multicoxR)를 열고 16.23단계의 expTime.txt 파일과 16.10단계의 clinical.txt 파일이 포함된 폴더가 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(multicoxR)를 실행합니다. "survival" 및 "survminer" 패키지를 사용하여 다변량 COX 회귀 분석을 수행하여 expTime.txt 및 clinical.txt 파일의 데이터를 기반으로 다양한 암의 TMEM200A에 대한 다변량 포레스트 플롯을 플로팅합니다.
18. TMEM200A 발현 및 임상적 특징에 따른 위암의 예후 모델
- 16.10단계의 clinical.txt 파일과 16.23단계의 expTime.txt 파일을 같은 폴더에 넣습니다.
- R 코드(NomoR)를 열고 위의 txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd 가 있는 줄에 붙여넣습니다.
- R 소프트웨어를 열고 수정된 R 코드(NomoR)를 실행합니다. 소프트웨어 패키지 "survival", "regplot" 및 "rms"를 사용하여 GC의 TMEM200A 발현 데이터와 임상 데이터를 사용하여 환자 생존을 예측하기 위한 예후 모델을 구성할 수 있습니다.
19. TMEM200A의 세포 배양 및 siRNA transfection
참고: 인간 STAD HGC-27 세포, SGC-7901 세포 및 인간 위 점막 상피 GES-1 세포 를 상업적으로 수득하고( 재료 표 참조), 부활시키고, Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완전 배지(10% 신생아 태아 소 혈청 및 1% 페니실린 혼합물 포함)에서 접종하고, 37°C에서 5%CO2 에서 배양하였다 세포 배양 인큐베이터. 배양 배지는 2-3일마다 교체되었습니다. 양호한 성장 상태의 세포를 웰당 105 세포× (2-3)에 따라 6-웰 플레이트에 접종하였다.
- 먼저 3개의 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 8μL의 transfection 시약 (T able of Materials 참조)과 200μL의 기초 배지를 각 튜브에 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 각각 4μg의 SiRNA1, SiRNA2, SiRNA3 를 추가합니다.
참고: knockdown TMEM200A 위해 siRNA를 설계하고 구매했습니다( 재료 표 참조). - 혼합물을 3개의 마이크로 원심분리기 튜브에 완전히 혼합하고 6웰 플레이트의 3개 웰 각각에 추가합니다. 혼합물이 고르게 분포되도록 6웰 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 혼합물이 첨가된 3개의 웰을 SiRNA-1, SiRNA-2 및 SiRNA-3으로 라벨링합니다.
- 세포가 4-6시간 동안 배양되면 6웰 플레이트에 있는 3개의 서브 웰에 있는 배지의 절반을 교체합니다.
알림: 전체 배지의 절반을 교체할 때는 원래 전체 배지의 절반을 흡입하고 새 전체 배지의 절반으로 보충하십시오. - 24시간 내지 48시간 후, siRNA-transfection된 세포 TMEM200A 실험군으로, transfection되지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용합니다. 세포에 대한 transfection의 효과를 평가하기 위해 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR, 섹션 20 참조)을 수행합니다.
20. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응
- 각 하위 그룹의 세포 배양 배지를 버리고 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다.
- RNA 분리 키트를 사용하여 전체 RNA를 분리합니다( 재료 표 참조).
- 제조업체의 지침에 따라 cDNA Synthesis Kit를 사용하여 RNA 농도를 추정하고 1μg의 RNA로 cDNA를 합성합니다.
- Real-Time PCR Assay System을 사용하여 GAPDH(표준화용), TMEM200A(재료 표 참조) 및 qPCR Master Mix에 대한 인간 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하여 10μL의 반응 혼합물에서 cDNA의 10배 희석액에 대해 정량적 Real-Time PCR(qRT-PCR)을 수행합니다.
참고: 각 실험을 세 번 수행합니다. - 다음 qPCR 반응 조건 사용: 초기화, 3분 동안 95°C; 변성, 10초 동안 95°C; 어닐링, 30초 동안 60°C; 및 확장, 10초 동안 80°C; 변성, 어닐링 및 확장을 40배 반복합니다. 2-ΔΔCt 기법28을 사용하여 각 유전자의 상대적 발현을 결정한다.
- 생물학적 삼중을 얻기 위해 실험을 세 번 이상 반복하십시오.
21. 관련된 단백질 발현의 웨스턴 블롯 검출
- 각 하위 그룹의 세포 배양 배지를 버리고 2 x 1mL의 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.
- 얼음 위에서 세포가 들어있는 6-웰 플레이트를 냉각하고 150μL의 사전 냉각된 무선 면역 침전 분석(RIPA) 용해 완충액(150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.0 및 갓 첨가된 프로테아제 억제제 칵테일)을 추가합니다. 얼음 위에서 10분 동안 용해를 진행합니다.
- 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 부착 셀을 제거하고 셀 용액을 사전 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 섬세하게 옮깁니다.
- 세포 용해물을 1.5 × 4 °C에서 104 g 에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 새 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 단백질 함량을 측정하십시오.
- 각 샘플에서 30g의 단백질을 10% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔에 로드하고 80V에서 0.5시간 동안 실행한 다음 120V에서 1.5시간 동안 실행합니다.
- 겔에서 1-1.5시간 동안 300mA의 전압에서 45μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 옮깁니다.
- PVDF 멤브레인을 셰이커에 놓고 3 x 5분 동안 흔든 후 Tween 20(TBST, 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl 및 0.1% Tween 20)이 포함된 Tris-완충 식염수를 단백질 측(겔 측)이 위를 향하도록 하여 적절한 용기에 추가합니다.
- 멤브레인을 차단 완충액( 재료 표 참조)에 넣고 실온에서 0.5시간 동안 배양합니다.
- TBST로 멤브레인을 3 x 10분 동안 세척합니다.
- 인산염-AKT(p-AKT; 1:1,000), 총 AKT 1:1,000, E-cadherin(E-ca; 1:1,000), N-cadherin(N-ca; 1:1,000), Vimentin 1:1,000, 달팽 이 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH; 1:1,000)에 대한 1차 항체로 멤브레인을 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 멤브레인을 3 x 10분 동안 세척하고 토끼 또는 마우스 2차 항체(1:5,000)로 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다.
- PVDF 멤브레인을 ECL 기질로 30초 동안 배양하고 이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출합니다.
22. CCK-8 분석
- 인간 STAD HGC-27 세포를 양호한 성장 상태로 96웰 플레이트에 파종합니다.
- 세포 밀도가 60-70%에 도달하면 세포를 siRNA TMEM200A transfection합니다(단계 19.3에서와 같이).
- 형질주입된 세포를 세포 밀도 5 × 10 3/well(세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포 계수)의 96웰 플레이트에 시드하고, NC 및 TMEM200A siRNA 그룹 (각 그룹에 3개의 복제 웰 포함)으로 나누고, 37°C에서 배양합니다.
- 0, 24, 48, 72 및 96 시간 후에 CCK-8 시약을 추가하고 37 °C에서 2 시간 동안 배양합니다. 다기능 효소 라벨러를 사용하여 흡광도(450nm)를 측정합니다.
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Representative Results
다양한 암에서의 TMEM200A 발현
그림 1에서 볼 수 있듯이 먼저 다양한 데이터베이스를 통해 다양한 암에서 TMEM200A의 차등 발현 수준을 분석했습니다. 담관암(CHOL), 두경부 편평세포암(HNSC), 신투명세포암(KIRC), 신유두세포암(KIRP), 간세포암(LIHC), STAD, 갑상선암(THCA)에서 TMEM200A 발현이 인접 정상 조직과 비교하여 상승하였다. 그러나 방광 요로상피암(BLCA), 자궁경부 편평세포암 및 자궁경부 선암(CESC), 다형 교모세포종(GBM), 신장 염색체(KICH), 폐 편평 암종(LUSC), 갈색세포종 및 부신경절종(PCPG), 직장 선암(READ) 및 자궁 신체 자궁내막 암종(UCEC)에서는 TMEM200A 발현이 감소했습니다(그림 2A). TIMER2.0 데이터베이스에서 TMEM200A 표현식은 CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC 및 STAD에서 증가했습니다. 또한, BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, 피부 피부 흑색종(SKCM) 및 UCEC에서 TMEM200A 발현이 증가했습니다(그림 2B).
두 데이터베이스의 결과를 비교한 결과, TMEM200A 의 범암 발현이 각 데이터베이스에서 동일하다는 것을 발견했습니다. TCGA 데이터베이스에서 암 환자 33명의 임상 추적 데이터와 RNA 염기서열 분석 데이터를 확보하고, ssGSEA 분석을 통해 각 암 검체의 TMEM200A 점수를 계산한 후, 많은 종양의 종양과 정상 조직에서 TMEM200A 유전자 활성도를 계산했습니다. 우리는 TMEM200A 가 교모세포종, HNSC, 신장 KIRC 및 THCA에서 높게 발현된다는 것을 발견했습니다(그림 2C). 따라서, TMEM200A 의 유전자 활성은 각 종양 조직에서 순위가 매겨졌다. TMEM200A 의 유전자 활성은 KIRC에서 가장 높고 포도막 흑색종(UVM)에서 가장 낮은 것으로 나타났습니다(그림 2D). 인간 조직의 TMEM200A 발현 수준에 대한 후속 HPA 데이터베이스 평가는 대부분의 정상 조직에서는 TMEM200A 발현 수준이 낮았지만 부신 피질, 직장, 자궁 내막 및 평활근에서는 높았다는 것을 보여주었습니다(그림 2E).
정상 조직 세포주에서는 육아세포, 양극성 세포, 골격근 세포, 자궁내막 기질 세포 및 T 세포와 같은 일부 세포주에서 TMEM200A 발현이 높았던 반면, 대부분의 다른 세포주에서는 TMEM200A 발현이 낮았습니다(그림 2F). 또한 단백질 수준에서 TMEM200A 의 발현을 확인하기 위해 HPA 데이터베이스의 면역조직화학(IHC) 데이터를 조사했습니다. 염색 및 강도에 관한 데이터는 정상 조직에 비해 대장암(CRC), 폐암(LUAD), 간암(LIHC), 유방암(BRCA) 및 전립선암(PRAD) 조직에서 TMEM200A 의 발현 수준이 훨씬 더 크고 뚜렷하게 나타났습니다(그림 2G). 이러한 발견은 TMEM200A 다른 암에서 널리 발현되고 다른 종양에서 다른 메커니즘을 통해 암 발생에 영향을 미친다는 것을 시사했습니다.
임상병리학적 관계와 생존 예후
33건의 인간 악성 종양에 대해 UCSC Xena 데이터베이스 웹사이트에서 TCGA pan-cancer(PanCan) 코호트에 대한 정보 및 임상 데이터를 수집하고 PanCan의 TMEM200A 발현과 연령, 병리학적 등급, 임상병리학적 병기 및 환자 생존 상태 간의 상관관계를 조사했습니다. 이 연구는 BLCA, 침습성 유방암(BRCA), 식도암(ESCA), KIRP, SKCM 및 고환암(TGCT)을 포함한 6개의 암에서 TMEM200A 의 발현이 임상병리학적 단계와 관련이 있음을 밝혔습니다(그림 3A). 나이는 침습성 BRCA, 교모세포종, 급성 골수성 백혈병(LAML), SKCM, 흉선암(THYM) 및 자궁내막암(UCEC)을 포함한 6가지 종양과 상관관계가 있었습니다(그림 3B). 병리학적 등급은 식도암(ESCA), HNSC, KIRC, 저등급 뇌신경교종(LGG), 췌장 선암종(PAAD) 및 자궁내막암(UCEC)을 포함한 6개 종양과 관련이 있었습니다(그림 3C). 생존 상태는 부신피질암(ACC), BLCA, KIRC, PCPG 및 포도막 흑색종(UVM)을 포함한 5가지 종양과 관련이 있었습니다(그림 3D).
TMEM200A 발현과 예후 사이의 상관관계에 대해 자세히 알아보기 위해 중앙값 그룹 임계값을 사용한 일원 Cox 회귀 분석을 사용하여 OS, DSS, PFI 및 DFI에 대한 다양한 암에 대한 연구를 수행했습니다. OS 분석 결과, 부신피질암(ACC)(P=0.037), BLCA(P=0.036), 급성골수성백혈병(LAML)(P=0.011), GC(STAD)(P=0.005) 등 4개 종양에서 4개 종양 중 TMEM200A 발현이 높을수록 OS 예후에 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 반면, TMEM200A 발현이 높을수록 KIRC(P < 0.001), KIRP(P=0.020), 저등급 뇌신경교종(LGG)(P=0.042), PCPG(P=0.002), 피부 흑색종(SKCM)(P=0.043)을 포함한 5개 종양에서 OS의 예후가 더 좋았습니다(그림 3E,F). DSS의 경우, 부신피질암(ACC)(P=0.026)과 BLCA(P=0.015)를 포함한 두 가지 종양 유형에서 고TMEM200A 발현은 예후가 좋지 않았다. 고TMEM200A 발현은 KIRC(P < 0.001), KIRP(P=0.001), 저등급 뇌신경교종(LGG)(P=0.025), PCPG(P=0.007) 등 4가지 종양 유형에서 예후가 더 좋았다(그림 3G). 또한, PFI의 경우, 부신피질암(ACC)(P=0.007), BLCA(P=0.040), 포도막 흑색종(UVM)(P=0.020)을 포함한 3가지 종양 유형에서 TMEM200A 발현이 높을수록 예후가 좋지 않았다. TMEM200A 발현이 높을수록 뇌의 KIRC(P < 0.001)와 저등급 신경교종(LGG)(P=0.044)을 포함한 두 가지 종양 유형에서 예후가 더 좋았습니다(그림 3H). DFI에서 TMEM200A 발현이 높을수록 부신피질암(ACC)의 예후가 더 나빴다(P=0.044)(그림 3I).
그 후, multi-COX 회귀분석을 위해 여러 종양(KIRC 및 KIRP)을 선택하였다. 그 결과, TMEM200A 다른 임상적 요인에 비해 암 환자의 생존율에 개별적으로 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다(그림 3J 및 K). 이 결과는 TMEM200A 가 암 환자의 생존에 영향을 미치기 위해 다른 암에서 독립적인 생체 예후 마커로 사용될 수 있음을 보여주었습니다.
DNA 메틸화 분석
가장 주목을 받고 있는 후성유전학적 변화 중 하나는 DNA 메틸화(methylation)이다 29. 후성유전학적 변화의 한 유형인 DNA 메틸화가 종양 성장에 상당한 영향을 미친다는 것이 제안되었다30. 따라서 SMART 데이터베이스를 사용하여 정상 및 암 조직에서 TMEM200A 의 DNA 메틸화 수준을 평가했습니다. PAAD와 PRAD 조직은 정상 조직보다 TMEM200A 의 DNA 메틸화 수준이 더 높았다. 그러나 TMEM200A 정상 조직보다 COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA 및 UCEC에서 DNA 메틸화 수준이 낮았습니다(그림 4A). TMEM200A 의 DNA 메틸화 수준은 UALCAN 데이터베이스(그림 4B)를 기반으로 한 KIRP, PRAD, PCPG 및 THYM의 TCGA 데이터베이스에서 상당히 높았지만 BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA 및 UCEC에서는 그렇지 않았습니다. TMEM200A 의 메틸화 수준은 LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA 및 UCEC에서 현저히 감소했습니다(그림 4C). TMEM200A 의 발현 수준과 DNA 메틸화 및 임상병리학적 요인 간의 관계를 더욱 자세히 조사하기 위해 SMART 데이터베이스를 다시 활용한 결과 BLCA, HNSC, LUAD 및 STAD에서 TMEM200A 의 DNA 메틸화 수준이 병리학적 단계에 따라 변한다는 것을 발견했습니다(그림 4D). 임상적 요인은 위의 종양에서 TMEM200A 의 DNA 메틸화 수준에 영향을 미칩니다.
유전자 돌연변이 분석
종양이 생기는 이유 중 하나는 유전자 돌연변이의 축적이다31. 따라서 체세포 TMEM200A 돌연변이의 빈도는 cBioPortal 데이터베이스를 이용하여 범암 임상 검체에서 TMEM200A 돌연변이의 빈도를 추정하여 분석하였다. TMEM200A 는 폐암, 자궁내막암, 흑색종, 식도위암, 골암, 자궁경부암, 간담도암, 성숙 B세포 림프종, BRCA, 자궁내막암, 난소암, 배아종양, 췌장암, 두경부암, CRC, 신경교종, 비소세포폐암, 연조직육종, 미확인 원발성 암 등 많은 암에서 돌연변이가 일어난다(그림 5A). 또한 DNA 변형은 단백질 수준에서 구조적 또는 아미노산 변화를 유발할 수 있습니다. 그림 5B 는 TMEM200A의 3D 구조를 보여줍니다. cBioPortal 데이터베이스를 사용하여 TMEM200A의 아미노산에서 돌연변이 부위를 발견했습니다. 미센스 돌연변이(missense mutation)는 돌연변이 중 가장 흔한 형태였다(그림 5C).
돌연변이 부위의 정확성을 검증하기 위해 Sangerbox 3.0을 사용하여 데이터를 분석한 결과, 이전과 동일한 결과를 얻을 수 있었습니다. 미센스 돌연변이는 TMEM200A 에서 가장 빈번한 형태의 돌연변이이며 SKCM에서 7.8%까지 발생할 수 있습니다(그림 5D). 미센스 돌연변이(missense mutation)는 하나의 아미노산을 암호화하는 코돈이 염기 치환을 거쳐 다른 아미노산을 암호화하는 코돈이 되어 폴리펩티드 사슬의 아미노산 유형 및 서열에 변화를 초래하는 돌연변이이다. 미스센스 돌연변이의 결과는 일반적으로 폴리펩티드 사슬이 원래의 기능을 잃는 것입니다. 많은 단백질 이상은 흔한 유형의 종양 돌연변이인 미센스 돌연변이에 의해 발생합니다. 미센스 돌연변이는 단백질의 안정성에 중요한 역할을 하며, 돌연변이의 존재는 단백질(32) 사이의 결합 친화도에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 단백질과 주변의 상관 거대분자(33) 사이의 상호작용을 변화시킬 수 있다.
따라서, 미센스 돌연변이는 다른 암에서 막관통 단백질 200A의 생물학적 기능에 영향을 미칠 가능성이 가장 높다. TMEM200A 유전자 돌연변이와 암 환자의 임상적 생존 예후 사이의 상관관계도 조사되었습니다. OS의 가능성은 TMEM200A 돌연변이 그룹에 비해 증가했지만 질병이 없는 그룹에서는 증가하지 않았습니다(그림 5E). 유전자 상관 관계에 대한 연구는 TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 및 SLC18B1 가 TMEM200A 와 동시 돌연변이를 일으킨 유전자 중 하나임을 밝혔습니다(그림 5F). COSMIC 데이터베이스를 통해 여러 돌연변이 유형과 단일 뉴클레오티드 변이(SNV)를 식별하여 GC의 TMEM200A 돌연변이에 대해 자세히 알아볼 수 있었습니다. 미센스 치환의 빈도가 가장 높았고(그림 5G), SNV 데이터에 따르면 STAD에서 가장 흔한 SNV는 G>A(31.73%)였고, C>T(26.35%)와 G>T(11.73%)가 그 뒤를 이었습니다(그림 5H).
암의 TMEM200A 에 대한 단일 세포 분석
TISCH(Tumor Immunology Single Cell Center) 웹사이트를 사용하여 다양한 단일 세포의 TMEM200A 발현 수준을 분석했습니다. TISCH 온라인 도구는 그림 6A에 표시된 히트 맵에서 65개의 데이터 세트와 28개의 세포 유형에 대한 TMEM200A 발현을 표시했습니다. 그 결과, TMEM200A는 대부분 CD8+ T 세포와 섬유아세포에서 발현되는 것으로 나타났습니다. 전이성 피부 흑색종(SKCM) 환자의 세포를 포함하는 GSE72056 데이터 세트는 이와 관련하여 주목할 만합니다. TMEM200A는 SKCM 미세환경에서 B 세포, CD4+ T 림프구, 고갈된 CD8+ T 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 기타 세포 유형에서 광범위하게 많이 발현되었습니다(그림 6B, C). CRC 환자의 세포를 포함하는 GSE146771 데이터 세트에서 TMEM200A CRC 미세환경의 B 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 세포, 고갈된 CD8+ T 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 기타 세포 유형에서 광범위하게 많이 발현되었습니다(그림 6D,E). CancerSEA 데이터베이스를 사용하여 특정 종양 세포에서 TMEM200A의 발현 수준과 기능 상태를 측정했습니다(그림 6G). TMEM200A 발현은 교모세포종(GBM), 폐선암(LUAD), 만성 육아구성 백혈병(CML), CRC, 망막모세포종(RB) 및 포도막 흑색종(UM)을 포함한 다양한 암에서 세포 기능 상태와 밀접한 상관관계가 있었습니다. 혈관신생, 세포사멸, 분화 및 염증은 모두 대부분의 종양 세포에서 TMEM200A 발현과 양의 상관관계가 있는 반면, DNA 손상, DNA 복구, 침습 및 대사는 TMEM200A 발현과 음의 상관관계가 있었습니다(그림 6F).
다양한 암에서 TMEM200A의 기능 및 경로 농축 분석
GGI 네트워크를 사용하여 유사한 기능을 가진 TMEM200A 과 단백질 간의 연관성을 조사하여 다양한 암에서 TMEM200A 의 기능을 탐색했습니다(그림 7A). 게놈 및 단백질체 정보는 표적 유전자의 쿼리 목록을 사용하여 GeneMANIA에 의해 분석됩니다. TMEM200A와 유사하게 작동하는 유전자를 찾아냄으로써 이 유전자와 직접 상호작용하는 40개의 단백질을 발견했다. 이러한 유전자의 상관 관계는 PPI 네트워크에 의해 표시됩니다(그림 7B). 그 후, GO 와 KEGG는 TMEM200A와 밀접한 관련이 있는 이 20개의 유전자를 농축하여 분석한 결과, 이러한 인접 유전자들이 대부분 유전자 침묵에 대한 RNA의 음성 조절에 관여한다는 것을 밝혀냈다. KEGG 분석 결과, TMEM200A 는 Wnt 신호전달 경로와 세포 노화를 포함한 경로에 풍부함이 있는 것으로 나타났습니다(그림 7C). GO 농축 분석은 분자 기능에서 TMEM200A 가 주로 칼슘 채널에 풍부하고 RNA에 의한 유전자 침묵의 음성 조절을 보여주었습니다(그림 7D).
TMEM200A과 면역 침윤의 상관관계 분석
TMEM200A 발현과 면역 세포 침윤 사이의 상관 관계를 추가로 조사하여 TMEM200A과 암 면역의 상관 관계를 입증했습니다. Sangerbox 3.0 범암 데이터를 사용하여 CIBERSORT 면역 침윤 분석을 수행했습니다. 그 결과, 범암 TMEM200A 발현은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, B 세포, 보조 T 세포, 자연 살해 세포, 조절 T 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 호산구, 호염기구 및 과립구와 상관관계가 있음을 보여주었습니다(그림 8A). 그 후, TISIDB 데이터베이스를 사용하여 TMEM200A 발현과 TIL(종양 침윤 림프구) 사이의 상관관계를 살펴보았으며, 다양한 암 유형에서 TMEM200A 발현과 28 TIL 풍부도 사이의 밀접한 상관관계를 보여주었습니다(그림 8B). TISIDB 데이터베이스를 사용하여 인간 악성 종양에서 TMEM200A 발현과 면역억제제 간의 상관관계를 평가하여 면역조절제와 TMEM200A 발현이 어떻게 관련되어 있는지 보다 철저하게 조사했습니다. 그 결과, TMEM200A 발현 수준은 다양한 암에서 면역억제제와 유의한 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다(그림 8C). TMEM200A 발현과 특정 면역억제제 사이의 유의미한 상관관계는 고환암과 UM에서 발견되었습니다(그림 8D-F). 그런 다음 TISIDB 데이터베이스(그림 8G,H)를 사용하여 면역 자극 인자 및 MHC 분자와의 TMEM200A 발현의 상관 관계 분석을 수행했습니다. 그 결과, TMEM200A 발현은 방광의 요로상피암, 고환암, 부신피질암 및 UM에서 선택된 면역자극제 및 MHC 분자와 상관관계가 있음을 보여주었습니다(그림 8I-L). 다음 단계는 TISIDB 데이터베이스의 TCGA PanCan 코호트에서 TMEM200A 발현과 면역학적 또는 분자 아형 간의 상관관계를 조사하는 것이었습니다. BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT 및 BRCA를 포함한 9가지 암 유형의 면역학적 하위 그룹이 TMEM200A 다르게 발현되는 것을 발견했습니다(그림 8M). 또한 HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV 및 LUSC를 포함한 다양한 분자 하위 그룹을 가진 6가지 암 형태는 TMEM200A의 다양한 발현을 나타냈습니다(그림 8N).
TMEM200A 및 면역 요법 반응 분석
PD-1/PD-L1 억제제의 효과는 TMB와 높은 상관관계가 있으며, 일부 종양 환자는 면역요법의 효능을 위해 TMB 마커를 사용하여 어느 정도 예측할 수 있다34. 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI)은 현미부수체 복제 실수가 고정되지 않고 누적되어 현미부수체(35)의 길이 또는 염기 조성을 변화시킬 때 결함이 있는 DNA 불일치 복구(MMR) 기능을 설명하기 위해 사용되는 용어이다. MSI는 임상적으로 유의한 종양 표지자이다 36. 따라서 TMEM200A 발현과 TMB 또는 MSI 사이의 상관관계를 조사하여 면역요법에 대한 TMEM200A 발현의 영향을 평가했습니다. 연구 결과는 THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP 및 KERC에서 TMEM200A 발현과 TMB 사이에 상당한 양의 상관관계가 있음을 보여주었지만 TMEM200A 발현은 UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM 및 BRCA와 음의 상관관계를 보였습니다(그림 9A). MSI와 TMEM200A 발현은 TGCT에서 강력하고 유리하게 연결된 반면, TMEM200A 발현은 UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC 및 CHOL에서 MSI와 유의하고 음의 상관관계가 있었습니다(그림 9B). 또한 ICB의 효과를 조사하기 위한 바이오마커로서 TMEM200A 의 잠재력을 평가했습니다. 그 결과, TMEM200A 단독으로 ICB 반응을 예측한 정확도는 25개의 ICB 하위 집단 중 7개에서 AUC(Area Under Curve) > 0.5였습니다. TMEM200A T 세포 및 B 세포 클론보다 더 높은 예측 값을 보였으며, 둘 다 5의 값을 가졌습니다. 그러나 TMEM200A 값은 TIDE(11개 ICB 하위 집단에서 AUC > 0.5), MSI 점수(11개 ICB 하위 집단에서 AUC > 0.5), CD274(15개 ICB 하위 집단에서 AUC > 0.5), CD8(17개 ICB 하위 집단에서 AUC > 0.5), IFNG(16개 ICB 하위 집단에서 AUC > 0.5), Merck18(17개 ICB 하위 집단에서 AUC > 0.5)보다 낮았다(그림 9C). ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 및 ICB_Hugo 2016_PD1 코호트에서 생존 예후가 좋지 않은 것은 높은 TMEM200A 발현과 상관관계가 있었습니다. 그러나 녹다운TMEM200A Kearney 2018 T_PD1 및 Pan 2018 OT1의 평균 코호트에서 림프구 매개 종양 사멸 효능을 향상시켰습니다(그림 9D).
다양한 암의 TMEM200A 에 대한 GSEA 농축 분석
TMEM200A 관련 암 특성을 조사하기 위해 32개 악성종양에서 TMEM200A 고발현 하위그룹과 TMEM200A 저발현 하위그룹 사이의 DEG를 사용했다. 원발성 면역결핍, RIG(레티노산 유도 유전자)-I-유사 수용체 신호전달 경로, 특히 BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC 및 SKCM에서 TMEM200A 발현 사이에 상당한 상관관계가 있음을 발견했습니다(그림 10). 바이러스 세포질 단백질 리보핵산은 RIG-I 유사 수용체 신호 전달 경로에 의해 검출됩니다. RIG-I 유사 수용체는 특정 세포 내 접합 단백질에 관여하여 NF-kB 신호 전달 경로를 활성화함으로써 체내 다양한 염증성 사이토카인 생성에 영향을 미칠 수 있습니다. 그 결과, 막관통 단백질 200A(TMEM200A)는 RIG-I 유사 수용체에 의한 세포 내 단백질의 모집에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 이러한 발견은 TMEM200A 발현과 면역학적 침윤 사이에 강한 상관관계가 있음을 시사합니다. 또한 GSEA 농축 분석은 범암 TMEM200A 발현이 케모카인 신호전달, 세포 부착, 사이토카인 수용체 연결, 세포막 감지 경로 및 자가포식 제어와 상관관계가 있음을 보여주었습니다(그림 10). 막관통 단백질은 칼슘 저장고(36)로부터 칼슘 이온의 세포 내로의 진입을 제어하는데 중요한 역할을 하는 것 외에도 종양 미세환경에 영향을 미치는 접착 분자로서 기능할 수 있다. 따라서 GSEA 농축 분석에서 얻은 결과는 신호 전달 경로의 활성화, 원형질막 이온 채널의 형성, 세포 화학주성의 조절, 접착, 세포 사멸 및 자가포식9을 포함한 많은 생리학적 과정에 TMEM200A가 관여하기 때문일 수 있습니다.
STAD에서 동시 발현된 LinkedOmics 데이터베이스의 TMEM200A와 양성 및 음의 상관관계가 있는 상위 50개의 STAD 유전자를 히트 맵 형태로 식별했습니다(그림 11A,B). GC에서 상위 5개 유전자를 긍정적으로 평가하고 상위 5개 유전자를 TMEM200A와 부정적으로 연관시켰다(그림 11C). 그 결과, TMEM200A 발현은 SPON1 (r = 0.51), CDH11 (r = 0.50), EPB41L2 (r = 0.49), LUM (r = 0.49), SAMD3 (r = 0.49), OVOL2 (r = -0.37), RASAL1 (r = -0.36), IRX5 (r = -0.35), SLC4A11 (r = -0.34) 및 SYTL1 (r = -0.33) 동시 발현과 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. STAD에서 TMEM200A의 역할을 더 잘 이해하기 위해 임계값 시각화 결과를 분석했습니다. 스크리닝에는 log2-fold 변화(FC) > 2.0 및 조정된 P 값 0.05의 기준이 사용되었습니다. 483개의 DEG를 발견했는데, 그 중 385개는 상향 조절되고 98개는 하향 조절되었으며, 그 중 100개를 시각화하여 히트 맵을 생성했습니다(그림 11D). 그런 다음 스크리닝 기준을 충족하는 DEG에 대해 GO 및 KEGG 농축 분석을 실행했습니다. GO 농축 분석 결과, BP(Biological Process)의 농축은 주로 세포외 기질 및 구조 조직과 관련이 있었고, CC(Cellular Component)의 농축은 주로 콜라겐 함유 세포외 기질 및 기저막과 관련이 있었으며, MF(Molecular Function)는 주로 세포외 기질 구조 및 글리코사미노글리칸 결합과 관련이 있었다(그림 11E 및 그림 11G)). KEGG 분석의 농축은 TMEM200A가 주로 세포외 기질 수용체 상호작용 경로, 시토크롬 P450 및 레닌-안지오텐신 시스템에서 농축되었음을 보여주었습니다(그림 11F 및 그림 11H).
위암의 TMEM200A 기반 예후 모델 및 임상적 특징
STAD 환자의 임상 데이터와 TMEM200A 간의 상관관계를 조사하여 로지스틱 회귀 분석과 TMEM200A 발현 수준을 기반으로 TCGA-STAD 코호트 환자의 임상병리학적 특성을 분석했습니다(그림 12A). 연령, 임상 단계 및 TMEM200A 발현은 모두 일변량 Cox 회귀 분석에 따르면 STAD 환자의 OS와 실질적으로 상관 관계가 있었습니다(그림 12B). 다변량 Cox 회귀분석 결과, TMEM200A 발현은 STAD 환자에서 OS에 대한 독립형 예측 인자일 수 있음을 보여주었습니다(HR=1.282, 95% CI=1.066-1.541, P =0.008)(그림 12C). 우리는 여러 임상 매개변수와 함께 표준 열 선 플롯 모델을 사용하여 STAD에서 1년, 3년 및 5년 후 OS를 예측하기 위한 이러한 임상병리학적 특성의 잠재력을 조사했습니다(그림 12D). 1년 생존 확률에 대한 보정 곡선은 세로 선 그림 예측 확률과 매우 일치했습니다(그림 12E).
STAD 세포의 상향 조절 및 세포 증식 증진 TMEM200A
TMEM200A와 관련된 문헌을 검토함으로써, 우리는 TMEM200A의 높은 발현이 나쁜 예후를 나타내고13 GC 면역 미세환경이 접착 분자(37)로 작용하는 TMEM200A에 의해 영향을 받아 GC 세포의 침입 및 전이를 촉진할 수 있음을 발견했다. 앞서 언급한 연구의 결과를 확인하기 위해 STAD 세포주에서 TMEM200A의 단백질 수준과 mRNA 전사체 수준을 조사했습니다. GC 세포주 HGC-27은 단백질 및 mRNA 전사체 수준 모두에서 건강한 위 점막 상피 세포주 GES-1에 비해 TMEM200A 극적으로 과발현되었으며(그림 13A,B), 이는 HGC-27 세포에서 TMEM200A가 과발현되었음을 나타냅니다. 그 결과 HGC-27 세포를 사용하여 다음 테스트를 수행했습니다. 한편, 실험 결과의 정확성을 입증하기 위해 qRT-PCR을 사용하여 인간 GC 세포 SGC-7901과 위 점막 상피 세포 GES-1에서 TMEM200A의 차등 mRNA 발현을 비교한 결과, SGC-7901 세포에서 TMEM200A가 높게 발현되는 것을 보여주었습니다(그림 13B). TMEM200A HGC-27 세포에서 녹다운되어 STAD에 TMEM200A 관여할 가능성을 조사했습니다(그림 13C). 데이터베이스 마이닝 결과와 TMEM200A의 상관관계 분석을 바탕으로 TMEM200A는 주로 암 증식 및 침습과 관련된 세포외 기질 수용체 상호작용 경로에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 CCK-8 분석을 사용하여 TMEM200A 발현이 세포 성장에 어떤 영향을 미치는지 확인했습니다. CCK-8 분석은 TMEM200A knockdown 그룹(Si-RNA2 및 Si-RNA3)이 NC 그룹에 비해 세포 생존율이 현저히 감소했음을 보여주었습니다(그림 13D). 이러한 발견은 TMEM200A가 STAD에서 상향 조절되었으며 그 발현 수준이 GC 세포의 증식에 영향을 미칠 수 있음을 시사했습니다. 그림 11F의 KEGG 농축 분석 결과를 바탕으로 TMEM200A GC의 PI3K/AKT 신호전달 경로와 관련이 있으며, 세포 접착 인자인 TMEM200A가 EMT에 영향을 미쳐 위암 기전에 영향을 미칠 수 있음을 확인했습니다. 따라서 웨스턴 블로팅(western blotting)을 사용하여 TMEM200A 녹다운이 EMT와 녹다운 전후의 PI3K/AKT 신호 경로에 미치는 영향을 검증했습니다. 그 결과 TMEM200A knockdown 그룹(TMEM200A-SiRNA2)에서 음성 대조군(NC)에 비해 P-AKT 단백질 발현이 감소한 반면, N-cadherin, Vimentin 및 Snai 단백질의 수준도 감소하고 E-cadherin 단백질 발현이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 13E). 이러한 모든 결과는 TMEM200A가 PI3K/AKT 신호 경로를 통해 EMT에 영향을 미쳐 GC에서 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
그림 1: 연구의 작업 흐름. 약어: TCGA = 암 게놈 아틀라스 데이터베이스; TIMER2.0 = TIMER2.0 데이터베이스; OS = 전체 생존; PFS = 무진행 생존 시간; DSS = 질병별 생존율; DFS = 무질병 생존; TMB = 종양 돌연변이 부담; MSI = 현미부수체 불안정성; PPI = 단백질-단백질 상호 작용; GGI = 유전자-유전자 상호 작용; KEGG = 교토 유전자 및 게놈 백과사전; GO = 유전자 온톨로지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 암의 TMEM200A 발현 수준. (A) 다양한 인간 악성 종양에서 TCGA 데이터 세트의 TMEM200A 발현을 상향 또는 하향 조절합니다. (B) TIMER2.0 데이터베이스를 사용한 종양 및 정상 조직의 TMEM200A 발현 수준 분석. (C) TCGA 데이터 세트에서 다양한 인간 암의 TMEM200A 유전자 활성의 차등 분석. (D) ssGSEA 스코어링을 기반으로 한 다양한 인간 암의 TMEM200A 유전자 활성 수준 순위. (E) 건강한 조직의 HPA 데이터베이스에서 발현 수준을 TMEM200A . (F) 정상 세포주에서 HPA 데이터베이스의 TMEM200A 발현 수준. (G) HPA 데이터베이스의 암에서 TMEM200A 단백질 발현에 대한 IHC 결과. 약어: TCGA = 암 게놈 아틀라스; ssGSEA = 단일 샘플 유전자 세트 농축 분석; HPA = 인간 단백질 아틀라스; IHC = 면역조직화학(Immunohistochemistry). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TMEM200A 발현과 다른 종양의 임상병리학적 특성 및 예후의 상관관계. (A) TCGA pan-cancer(PanCan) 코호트에서 TMEM200A 발현과 각 종양의 임상병리학적 병기의 상관관계는 UCSC Xena 데이터베이스를 사용하여 분석되었습니다. (B) TCGA PANCAN 코호트에서 TMEM200A 발현과 각 종양의 환자 연령의 상관관계. (C) TCGA PANCAN 코호트에서의 TMEM200A 발현과 각 종양의 종양 병리학적 등급의 상관관계. (D) TCGA PanCan 코호트에서 TMEM200A 발현과 각 종양 환자의 생존 상태의 상관관계. (E) Cox 회귀 모델을 이용한 다양한 암의 범암 전체 생존율과 TMEM200A 발현의 상관관계 분석. (F) TCGA PanCan 코호트에서 TMEM200A 발현과 범암 OS 예후 사이의 상관관계. (G) TMEM200A 발현과 질병 특이적 생존 사이의 상관관계. (H) TCGA PanCan 코호트에서 TMEM200A 발현과 무진행 간격 예후 사이의 상관관계. (I) TMEM200A 발현과 무병 간격 사이의 상관관계. (J) KARC에 대해 다요인 COX 회귀분석을 수행하였다. (K) KERP에 대해 다요인 COX 회귀분석을 수행하였다. 약어: TCGA = 암 게놈 아틀라스; KIRC: 신장 신장 투명 세포 암종; KIRP: 신장 신장 유두세포 암종; OS = 전체 생존; DSS = 질병별 생존; PFI = 무진행 간격; DFI = 무질병 간격. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 다양한 암의 TMEM200A 에 대한 DNA 메틸화 분석. (A) TMEM200A 의 프로모터 메틸화 수준은 SMART 데이터베이스에 따라 여러 암 유형에서 조사되었습니다. (B) 정상 조직보다 다른 암 유형에서 더 높은 프로 모터 메틸화 수준의 TMEM200A가 UALCAN 데이터베이스에 따라 검사되었습니다. (C) UALCAN 데이터베이스를 사용하여 정상 조직은 여러 암 유형에서 프로모터 메틸화 수준이 TMEM200A 낮다는 것을 확인했습니다. (디) BLCA, HNSC, LUAD 및 STAD에서 TMEM200A 의 DNA 메틸화 수준은 병리학적 단계에 따라 변했습니다. 약어: BLCA=Bladder Urothelial Carcinoma; HNSC= 두경부 편평세포암; LUAD=폐 선암; STAD= 위 선암. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 서로 다른 암의 유전자 돌연변이 TMEM200A . (A) cBioPortal 데이터베이스를 이용한 다양한 암의 TMEM200A 유전자 돌연변이 유형 분석. (B) TMEM200A의 3D 단백질 구조. 바인딩 영역은 컬러 부분으로 표시되고 TMEM200A 의 다른 섹션은 회색 부분으로 표시됩니다. (C) TMEM200A 체세포 돌연변이의 동형과 분포. X축, 아미노산 부위; y축, TMEM200A 돌연변이 수; 녹색 점, 미센스 돌연변이; 그리고 회색 점, 잘린 돌연변이. (D) Sangerbox 3.0의 데이터를 사용한 TMEM200A 체 돌연변이의 동형 및 분포 검증. (E) 모든 TCGA 종양에 대해 돌연변이 상태와 환자의 전체 생존 예측 사이의 상관관계는 cBioPortal 데이터베이스를 사용하여 조사되었으며, 빨간색 사각형은 TMEM200A 돌연변이 그룹을 나타내고 파란색 사각형은 돌연변이가 없는 그룹을 나타냅니다. (F) TMEM200A 와 동시 돌연변이된 유전자는 cBioPortal 도구를 사용하여 분석되었습니다: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 및 SLC18B1. (G) COSMIC 데이터베이스를 이용한 GC의 TMEM200A 돌연변이 유형 분석. (H) GC에서 TMEM200A SNV 유형에 대한 분석은 COSMIC 데이터베이스를 사용하여 수행되었습니다. 약어: TCGA = 암 게놈 아틀라스; OS = 전체 생존; COSMIC = 암세포의 체세포 돌연변이 목록; GC = 위암. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 다양한 암의 TMEM200A 발현에 대한 단일 세포 상관 분석. (A) TISCH 웹사이트의 TMEM200A 발현 요약. (B) 전이성 피부 흑색종 GSE72056 데이터 세트에서 8가지 세포 유형의 분포. (C) GSE72056 데이터 세트의 피부 전이성 흑색종 세포의 TMEM200A 발현 수준. (D) GSE146771의 대장암 데이터 세트에서 13개의 서로 다른 세포 유형의 분포. (E) GSE146771 데이터 세트에서 대장암 세포의 TMEM200A 발현 수준. (F) 여러 종양에서 TMEM200A 발현과 단세포 기능 상태의 상관관계는 CancerSEA 데이터베이스를 사용하여 입증되었습니다. (G) GBM, LUAD, CML, CRC, RB 및 UM을 포함한 개별 종양 세포의 TMEM200A 발현 수준을 보여주는 T-SNE 맵. 약어: GBM = 교모세포종; LUAD = 폐 선암; CML = 만성 과립구성 백혈병; CRC = 대장암; RB = 망막모세포종; UM = 포도막 흑색종. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 유전자 수준에서 TMEM200A 의 동시 발현 네트워크 및 기능적 농축 분석. (A) TMEM200A 및 그 동시 발현 유전자의 GGI 네트워크. (B) PPI 네트워크. (씨,디) TMEM200A 및 동시 발현 유전자는 GO 및 KEGG 경로 농축을 위해 분석되었습니다. 약어: PPI = 단백질-단백질 상호 작용; GGI = 유전자-유전자 상호 작용; KEGG = 교토 유전자 및 게놈 백과사전; GO = 유전자 온톨로지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 다양한 암 유형에서 TMEM200A 및 면역 세포, 면역 억제제, 면역 자극 물질 및 MHC 분자의 발현 간의 상관관계. (A) TMEM200A 발현과 면역 침윤 세포 간의 상관관계를 보여주는 Sangerbox 3.0 히트 맵. (B) TISIDB 데이터베이스에서 면역 침윤 세포와 TMEM200A 발현 간의 상관 관계를 보여주는 히트 맵. (C) TISIDB 데이터베이스에서 면역억제 세포와 TMEM200A 발현 간의 상관관계를 보여주는 히트맵. (D-F) 고환암과 포도막 흑색종에서 TMEM200A 발현과 특정 면역억제제 사이의 상관관계. (G) TISIDB 데이터베이스에서 면역 자극 인자와 TMEM200A 발현 간의 상관 관계를 보여주는 히트 맵. (H) TISIDB 데이터베이스에서 TMEM200A 발현과 MHC 분자 간의 상관 관계에 대한 히트 맵. (일-엘) 방광의 요로상피암, 고환암, 부신피질암종 및 포도막 흑색종에서 TMEM200A 발현과 일부 면역자극 인자 및 MHC 분자 간의 상관관계. (M) 범암 면역 하위 그룹과 TMEM200A 발현 간의 상관관계. (N) 범암 분자 하위 그룹과 TMEM200A 발현 간의 상관 관계. 약어: MHC = Major histocompatibility complex. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 범혈구 감소증에서 TMEM200A 의 면역 치료 반응 분석. (A) TMB와 다른 암의 TMEM200A 발현의 상관관계. (B) 범암에서 MSI와 TMEM200A 발현의 상관관계. (씨) TMEM200A 면역관문 차단 반응을 예측하기 위한 바이오마커로서의 잠재력. (D) CRISPR 스크리닝에서 ICB 생존 결과 및 로그 폴드 변화(logFC)와 TMEM200A의 상관 관계의 가중 평균을 사용하여 순위를 매겼습니다. 약어: TMB = 종양 돌연변이 부담; ICB = 면역 관문 봉쇄; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(클러스터링된 규칙적인 간격 짧은 회문 반복). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 다양한 암의 TMEM200A 에 대한 GSEA 농축 분석. TMEM200A 가 32개의 암을 조절하는 데 중요한 기능적 역할을 한 상위 5개 경로가 GSEA 농축 분석에 의해 확인되었습니다. 왼쪽 패널은 ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ 및 SARC의 TMEM200A에 대한 GSEA 농축 분석 결과를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS 및 UVM의 TMEM200A에 대한 GSEA 농축 분석 결과를 보여줍니다. 약어: GSEA = 유전자 세트 농축 분석; ACC = 부신피질암; BLCA = 방광 요로상피암; BRCA = 유방 침습성 암종; CESC = 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁 경부 선암; CHOL =담관암; COAD = 결장 선암; ESCA = 식도암; GBM = 다형 교모세포종; HNSC = 두경부 편평 세포 암종; KICH = 신장 염색체; KIRC = 신장 신장 투명 세포 암종; KIRP = 신장 신장 유두 세포 암종; LAML = 급성 골수성 백혈병; LGG = 뇌 저등급 신경교종; LIHC = 간 간세포 암종; LUAD = 폐 선암; LUSC = 폐 편평 세포 암종; MESO = 중피종; OV = 난소 장액성 방광암; PAAD = 췌장 선암; PCPG = 갈색세포종 및 부신경절종; PRAD = 전립선 선암; 읽기 : 직장 선암; SARC=육종; SKCM = 피부 피부 흑색종; STAD = 위 선암; TGCT = 고환 생식 세포 종양; THCA = 갑상선암; THYM = 흉선종; UCEC = 자궁 신체 자궁내막암; UCS = 자궁 암육종; UVM = 포도막 흑색종. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: STAD의 TMEM200A. (A) LinkedOmics 데이터베이스에 의해 STAD의 TMEM200A 발현과 음의 상관 관계가 있는 상위 50개 유전자. (B) TMEM200A와 긍정적으로 연결된 STAD의 상위 50개 유전자. (C) STAD에서 TMEM200A의 상위 5개 유전자 및 5개 음의 상관 유전자. (D) STAD에서 DEG의 히트 맵. (E-H) 스크리닝된 DEG를 사용하여 강화된 GO 및 KEGG 경로 조사. 약어: STAD=위 선암; DEGs = 유전자의 차등 발현; KEGG = 교토 유전자 및 게놈 백과사전; GO = 유전자 온톨로지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: STAD의 임상적 특징과 TMEM200A 발현 수준 간의 상관관계. (A) 로지스틱 회귀를 이용한 TMEM200A 발현 수준 및 STAD 임상적 특성 분석. (나,씨) 단일 및 다중 변수에 대한 STAD 삼림 플롯의 Cox 분석. (D) 성별, 병리학적 등급, 연령, 병리학적 병기 및 TMEM200A 발현을 기반으로 STAD 환자의 OS 를 예측하는 세로 선 플롯. (E) 세로 막대 선 그래프 모델의 보정을 보여주는 보정 플롯. 약어: STAD= 위 선암; OS=전체 생존. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13: TMEM200A 발현은 STAD에서 상향 조절되어 위암 세포의 증식을 촉진합니다. (A) 웨스턴 블로팅에 의한 위암 세포 HGC-27 및 위 점막 상피 세포 GES-1의 TMEM200A 발현 검출. (B) qRT-PCR에 의한 GC 세포 HGC-27 및 SGC-7901 및 위 점막 상피 세포 GES-1의 TMEM200A 발현 검출. (C) qRT-PCR에 의해 입증된 바와 같이, TMEM200A 의 발현 효율은 GC 세포 HGC-27의 비knockdown 그룹에 비해 TMEM200A knockdown 그룹에서 크게 감소하였다. (D) TMEM200A knockdown은 CCK8 분석으로 측정한 GC 세포의 증식을 현저히 억제했습니다. (E) TMEM200A 의 녹다운은 EMT에서 관련 단백질을 현저히 억제하고 PI3K/AKT 신호 경로에서 AKT의 인산화에 영향을 미쳤습니다. 약어: GC = 위암; qRT-PCR: 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응; EMT=상피-중간엽 전이; AKT=단백질 키나아제 B. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
TMEM200A 암세포가 증식하는 데 필수적인 TMEM 계열에 속합니다38. 다양한 악성 종양에서 TMEM200A 의 다양한 발현은 주목을 덜 받았고 범암 조사에 대한 철저한 조사가 부족합니다. 그러나, TMEM 막관통 단백질군이 여러 단백질과의 상호작용을 통해 암세포를 악성으로 유지하는 데 중요할 수 있다는 증거가 계속 축적되고 있는데, 예를 들어, ROCK1/moesin에 의한 TMEM16A Ca2+-활성화된 Cl- 채널의 활성화는 BRCA 전이를 촉진한다39. 따라서 본 연구에서는 치료용 암 표적 및 종양 진단 마커로서 TMEM200A 의 타당성을 탐색하는 데 중점을 두었다. 특히, UCSC Xena 데이터베이스의 RNA-seq 데이터를 이용하여 33개의 악성종양에서 TMEM200A 의 발현량을 조사하였으며, TIMER2.0 데이터베이스의 결과는 UCSC Xena 데이터베이스의 분석을 성공적으로 검증하였다.
그 후, 종양 면역 단일 세포 센터(TISCH) 웹 도구와 CancerSEA 데이터베이스를 사용하여 다양한 유형의 단핵구에서 TMEM200A 의 발현 수준을 분석했습니다. Sangerbox 및 TISIDB 웹사이트는 TMEM200A 면역 침윤에 미치는 영향을 이해하는 데 사용되었습니다. 또한 GSEA 농축 분석을 통해 각 암에서 TMEM200A 가 중요한 기능을 하는 신호 전달 경로를 식별하여 각 악성종양에서 TMEM200A 의 주요 기능적 역할을 이해했습니다.
TMEM200A 는 GC의 면역 환경을 제어하고 GC 세포의 침습적 확산을 촉진하는 접착 분자로 작용할 수 있습니다. 따라서 TCGA 데이터베이스를 통해 TMEM200A 의 발현 수준과 관련된 483개의 차등 발현 유전자(DEG)를 확인하고 이 483개의 DEG의 GO 및 KEGG 농축을 분석했습니다. 농축 결과는 PI3K/AKT 경로가 암 발생에 중요한 역할을 하며 PI3K/AKT 경로가 암의 추진 요인 중 하나일 수 있음을 보여주었습니다.
또한, 암 발생을 촉진하는 TMEM200A 의 중요한 기능에 대해 더 많이 알게 된 후 세포 및 분자 테스트를 수행하여 TMEM200A 발현과 STAD 세포 활성 사이의 상관 관계를 확인했습니다. 예상했던 대로, 우리는 STAD 세포의 TMEM200A 하향 조절이 세포 증식을 크게 감소시켰고, 암 세포주가 정상 세포주보다 훨씬 더 높은 수준으로 TMEM200A 발현된다는 것을 발견했습니다. 최근 몇 년 동안 막관통 단백질군과 관련된 문헌을 종합하여 세포 접착 분자(37)로서 막관통 단백질이 EMT에서 조절 역할을 한다는 것을 발견했습니다.
또한, GC에서 TMEM200A 관련 유전자의 농축 분석 결과에 따르면, TMEM200A 가 GC의 PI3K/AKT 신호전달 경로에서 조절 역할을 할 수 있음을 발견했습니다. 웨스턴 블로팅 실험 TMEM200A 녹다운이 Vimentin, N-cadherin 및 Snai 단백질을 감소시키고 AKT 인산화를 억제할 수 있음을 밝혀냈으며, 이는 TMEM200A 가 EMT에 영향을 미쳐 종양 미세환경을 조절하고 PI3K/AKT 신호 경로가 GC 발달의 TMEM200A 매개 조절에 관여할 수 있음을 시사합니다. 최근 몇 년 동안 일부 연구에서는 EMT가 GC 환자에서 화학 요법 약물 내성의 주요 원인이라는 것을 발견했습니다. 상피-중간엽 가소성(epithelial-mesenchymal plasticity, EMP)과 종양 미세환경(tumor microenvironment)은 많은 암 유형에서 효과적인 치료를 위한 제한 요인으로 기술되어 왔다40. EMT의 발생은 GC 세포가 그들의 특징적인 특성을 잃게 할 수 있고, 중간엽 세포의 특성을 나타낼 수 있다41. 이러한 특징은 화학요법 약물에 대한 GC 환자의 민감도를 낮출 뿐만 아니라 GC 세포의 침습성 및 이동 능력을 향상시켜 종양 전이를 유도합니다. 따라서 위에서 언급한 이유로 본 연구는 EMT에 영향을 미치는 TMEM200A 의 특정 작용 메커니즘을 탐구함으로써 EMT의 주요 조절 포인트의 연구 및 개발과 새로운 표적 치료 접근법의 개발을 지원합니다.
최근 몇 년 동안 연구에 생물정보학의 사용이 증가했으며, 이 연구를 위해 여러 인터넷 데이터베이스의 데이터에 액세스했습니다. 생물 정보학에서 이러한 온라인 데이터베이스를 사용하면 암 연구가 간소화되고 속도가 빨라졌으며 연구자들에게 결과를 검증할 수 있는 저렴한 수단도 제공합니다.
그러나 생물정보학 기술에는 몇 가지 단점이 있습니다. 분석을 위해 이러한 데이터베이스를 활용하는 경우 많은 온라인 데이터베이스에 여러 데이터 세트의 데이터가 포함되어 있기 때문에 동일한 연구가 여러 데이터베이스에서 일관되지 않거나 충돌하는 결과를 제공할 수 있습니다. 또한 많은 데이터베이스가 오랫동안 업데이트되지 않으며 저작권 문제로 인해 내용을 확대할 수 없습니다. 따라서 연구원이 이러한 데이터베이스에서 얻는 분석 결과는 항상 제한적입니다. 따라서 이 연구에서는 이러한 제약을 극복하고 결과의 정확성을 보장하기 위해 다양한 데이터베이스를 사용하여 결과를 종합적으로 조사했습니다. 우리가 얻은 결과가 크게 변경되지 않았는지 확인하기 위해 분석을 위해 다른 데이터베이스를 사용할 때 절차를 반복했습니다. 웨스턴 블롯 실험의 결과는 TMEM200A 가 PI3K/AKT 신호 전달 경로를 조절하여 GC 세포의 증식에 영향을 미침으로써 GC의 EMT를 제어할 수 있다는 생물정보학 예측을 뒷받침했습니다. 생물정보학을 이용하여 TMEM200A 의 작용기전을 관련 문헌과 함께 예측하였다.
요약하면, 이 작업은 생물정보학 도구가 실험 설계를 크게 촉진하고 다른 많은 유형의 과학 연구 예측을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 미래의 암 연구자들은 실험적 검증과 생물정보학 예측을 결합하는 기본 패러다임을 채택할 가능성이 높으며, 이 연구는 이 목표를 위한 좋은 모델 역할을 합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82160550)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
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