Summary
Her presenteres en protokoll der flere bioinformatiske verktøy kombineres for å studere de biologiske funksjonene til TMEM200A i kreft. I tillegg validerer vi også eksperimentelt bioinformatikkprediksjonene.
Abstract
Det transmembrane proteinet, TMEM200A, er kjent for å være assosiert med humane kreftformer og immuninfiltrasjon. Her vurderte vi funksjonen til TMEM200A i vanlige kreftformer ved multiomics-analyse og brukt in vitro-cellekulturer av mageceller for å verifisere resultatene. Uttrykket av TMEM200A i flere humane krefttyper ble vurdert ved hjelp av RNA-seq-data fra UCSC Xena-databasen. Bioinformatisk analyse avslørte en potensiell rolle for TMEM200A som en diagnostisk og prognostisk biomarkør.
Kulturer av normale mage- og kreftcellelinjer ble dyrket og TMEM200A ble slått ned. Ekspresjonsnivåene av TMEM200A ble målt ved bruk av kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon og vestlig blotting. In vitro tap av funksjon studier ble deretter brukt til å bestemme rollene til TMEM200A i ondartet oppførsel og tumordannelse av magekreft (GC) celler. Western blots ble brukt til å vurdere effekten av knockdown på epithelial-mesenkymal overgang (EMT) og PI3K / AKT signalvei i GC. Bioinformatisk analyse viste at TMEM200A ble uttrykt i høye nivåer i GC.
Spredningen av GC-celler ble hemmet av TMEM200A knockdown, som også reduserte vimentin-, N-cadherin- og Snai-proteiner, og hemmet AKT-fosforylering. PI3K/AKT-signalveien syntes også å være involvert i TMEM200A-mediert regulering av GC-utvikling. Resultatene som presenteres her tyder på at TMEM200A regulerer tumormikromiljøet ved å påvirke EMT. TMEM200A kan også påvirke EMT gjennom PI3K/AKT-signalering, og dermed påvirke tumormikromiljøet. Derfor, i pan-kreft, spesielt GC, kan TMEM200A være en potensiell biomarkør og onkogen.
Introduction
Kreft har dukket opp som et vedvarende folkehelseproblem som truer menneskers helse globalt1på grunn av sin høye sykelighet og dødelighet over hele verden, og utgjør en tung økonomisk og medisinsk byrde for samfunnet2. Betydelige fremskritt innen kreftbehandling har blitt oppnådd de siste årene takket være oppdagelsen av kreftmarkører3, og forskere har utviklet nye diagnostiske metoder og nye medisiner for å behandle kreft. Noen pasienter med kreft har imidlertid fortsatt dårlige prognoser på grunn av faktorer som medisineringsresistens, bivirkninger av legemidler og kjemisk følsomhet4. Derfor er det et presserende behov for å identifisere nye biomarkører for screening og behandling av kreft i tidlig stadium5.
Membranproteiner er proteiner som kan binde seg og integreres i celler og organelle membraner6. Disse kan grupperes i tre kategorier avhengig av styrken av binding til membranen og deres plassering: lipidforankrede proteiner, integrerte proteiner og perifere membranproteiner 7,8. Et transmembranprotein (TMEM) er et integrert membranprotein som består av minst ett transmembransegment9, som passerer helt eller delvis gjennom den biologiske membranen.
Selv om virkningsmekanismene til proteiner som tilhører TMEM-familien ikke er godt forstått, er disse proteinene kjent for å være involvert i flere typer kreft10. Flere TMEM-proteiner er assosiert med migrerende, proliferative og invasive fenotyper, og deres uttrykk er ofte forbundet med pasientens prognose11. Derfor har TMEM-familiemedlemmer blitt målet for forskning. En omfattende gjennomgang av eksisterende rapporter om TMEM viste at de hovedsakelig er assosiert med inter- og intracellulær signalering12, immunrelaterte sykdommer og tumorigenese10. Mange TMEMer har også viktige fysiologiske funksjoner, for eksempel ionekanaler i plasmamembranen, aktivering av signaltransduksjonsveier, samt formidling av cellekjemotaksis, adhesjon, apoptose og autofagi10. Derfor antydet vi at TMEM-proteiner kan være viktige prognostiske markører i påvisning og behandling av svulster.
TMEM200A uttrykket er signifikant forhøyet i gastrisk kreft (GC). Høyere uttrykk av TMEM200A13, som har åtte eksoner og en full lengde på 77.536 kb på kromosom 6q23.1, har vært knyttet til en dårlig prognose for total overlevelse (OS) i tilfeller av GC. Likevel har endringene i uttrykket sjelden blitt rapportert i onkologiske studier. Denne artikkelen sammenligner og analyserer nytten av TMEM200A som terapeutisk mål og tumordiagnostisk markør i ulike kreftstudier ved hjelp av forskjellige offentlig tilgjengelige datasett. Vi vurderte effektiviteten av TMEM200A som en pan-kreftdiagnostisk og prognostisk biomarkør, samt dens ekspresjonsnivåer i forskjellige humane krefttyper ved hjelp av RNA-seq-data fra UCSC Xena- og TCGA-databasene, samt ved sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) og vestlig blotting.
Effekten av TMEM200A ekspresjonsnivåer på mutasjonshastigheter, regulatoriske prosesser, tumordiagnose og prognose, immuninfiltrasjon og immunterapi ble videre undersøkt ved hjelp av en blanding av beregningsverktøy og datasettnettsteder. CBioPortal og databasene Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) ble brukt til å undersøke mutasjoner i TMEM200A. Sangerbox og TISIDB nettsteder ble brukt til å forstå hvordan TMEM200A påvirker immuninfiltrasjon. Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) online verktøy og CancerSEA database ble brukt til å undersøke funksjonen til TMEM200A. Til slutt, for å vurdere virkningen av TMEM200A på den ondartede oppførselen og tumorutviklingsfunksjonen til GC-celler, ble det utført et funksjonstapseksperiment i en in vitro-analyse . I tillegg ble det utført western blotting for å vurdere hvordan TMEM200A knockdown påvirket PI3K/AKT-signalveien og epithelial-mesenkymalovergangen (EMT) i GC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Databasen Cancer Genome Atlas (TCGA)
MERK: Databasen Cancer Genome Atlas (TCGA) inneholder sekvenseringsdata for gener i forskjellige tumorvev14. RNA-seq-data i TCGA for studier av TMEM200A transkripsjoner per del per million (TPM) formater ble hentet fra UCSC Xenas nettsted15 (https://xenabrowser. net / datapages /) og log2 transformert for å sammenligne uttrykkene mellom prøver.
- Gå til UCSC Xenas nettstedgrensesnitt.
- Klikk på kategorien Start Xena .
- Klikk på DATASETT-fanen øverst på skjermen.
- Fra de 129 kohortene og 1,571-datasettene på denne siden, klikk på fanen for totalt 33 kreftformer som GDC TCGA akutt myeloid leukemi (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Galle Duct Cancer (CHOL) og mer.
- Fra genuttrykket RNAseq-menyen , velg og klikk på HTSeq - FPKM GDC Hub-fanen .
MERK: HTSeq - FPKM GDC Hub representerer data som er korrigert ved samtykke. - Fra nedlastingsmenyen klikker du på den tilhørende lenken.
MERK: Ved metoden ovenfor ble RNA-Seq-data lastet ned for 33 forskjellige krefttyper. - Pakk ut zip-arkivet med RNA-seq-data for 33 forskjellige krefttyper i en enkelt fil i skrivebordsmappen på datamaskinen.
- Samle de utpakkede txt-filene i samme mappe og plasser Perl-skriptene i denne mappen.
- Åpne Perl-programvaren , kopier og lim inn banen til mappen i Perl-programvaren der musepekeren er plassert, trykk Enter-tasten , skriv inn navnet på Perl-koden og navnet på genet (TMEM200A), og trykk deretter Enter-tasten for å få en ny txt-fil (singleGeneExp.txt).
MERK: Denne nye txt-filen (singleGeneExp.txt) inneholder genuttrykk av TMEM200A i 33 kreftformer hos forskjellige pasienter. - Åpne R-koden (diffR) og kopier og lim inn banen der den singleGeneExp.txt filen er plassert til linjen der setwd er plassert i R-koden.
- Åpne R-programvaren, kjør den modifiserte R-koden (diffR), og tegn bildet gjennom "ggpubr" -pakken.
2. TIMER2.0-databasen
- Gå til TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) database 16 nettstedgrensesnitt.
- Klikk kategorien Kreftutforskning.
- Skriv inn gen-ID (TMEM200A) i søkeboksen og klikk på Send-fanen for å få differensialuttrykksbilder av TMEM200A i forskjellige typer svulster.
3. Humant proteinatlas (HPA)
- Gå til nettgrensesnittet Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org ) 17.
- Skriv inn ID (TMEM200A) i søkeboksen , og klikk Søk-knappen . Velg TISSUE sub-atlas.
- Hold markøren over siden og bla ned for å finne fanen Oversikt over proteinuttrykk .
MERK: Protein Expression Overview delen viser proteinuttrykksnivåene av TMEM200A i 45 organer i menneskekroppen.
4. HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA metyleringsplattformarray
MERK: HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA metyleringsplattformarray ble brukt til å samle inn data om metylering. Vi kunne vurdere de TMEM200A DNA-metyleringsnivåene ved hjelp av SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) -databasen18.
- Gå til SMART-nettstedgrensesnittet.
- Skriv inn gen-ID (TMEM200A) i søkeboksen for å få fordelingen av TMEM200A i kromosomer og metyleringsnivået av TMEM200A i forskjellige typer maligniteter.
- Rull nedover siden til Klikk for å sjekke CpG-aggregert metyleringsmeny og klikk på Plott-knappen . Nederst på siden, finn og klikk på Last ned figur-knappen . Last ned figuren.
5. UALCAN-databasen
- Gå til UALCAN-nettstedets grensesnitt.
MERK: Boksplott av TMEM200A promotormetyleringsnivåer i forskjellige maligniteter ble generert gjennom UALCAN-databasen (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19 - Øverst på siden klikker du på TCGA-knappen .
- Skriv inn TMEM200A i Gene ID-inntastingsboksen på skjermen. I TCGA-datasettmenyen blar du ned og velger hvilken type kreft som skal spørres.
- Etter å ha klikket på Utforsk-knappen , klikk på undergruppeanalysen Metylering i menyen Lenker for analyse for å få metyleringsresultatene av denne svulsten.
MERK: Ved denne metoden oppnådde vi metyleringsresultater for 22 svulster i UALCAN-databasen .
6. Databasen Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC)
- Gå til Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) nettstedgrensesnitt.
MERK: Data om kodende mutasjoner, ikke-kodende mutante genomiske omorganiseringer og fusjonsgener i det humane genom er tilgjengelig fra databasen Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC)20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), som også brukes til å bestemme frekvensen av forskjellige TMEM200A mutasjoner i forskjellige kreftformer. - Skriv inn gen-ID (TMEM200A) i søkeboksen og klikk på SØK-knappen for å gå til en ny skjerm.
- I Genes-menyen , finn og klikk på lenken der gen-ID-navnet til TMEM200A vises.
- Finn kolonnen Mutation distribut grouping på den nye siden for å få mutasjonsstatusen til TMEM200A i svulsten.
7. CBioPortal
- Gå til CBioPortal-nettstedgrensesnittet .
MERK: Kreftgenomikkdata kan bli funnet, lastet ned, analysert og visualisert ved hjelp av cBioPortal (www.cioportal.org) databasen. Somatiske mutasjoner, DNA-kopinummerendringer (CNA), mRNA og mikroRNA (miRNA) -uttrykk, DNA-metylering, proteinoverflod og fosfoproteinoverflod er bare noen få av de genomiske datatypene som er integrert av cBioPortal21. Med cBioPortal kan et bredt spekter av studier utføres; Hovedvekten ligger imidlertid på ulike analyser knyttet til mutasjoner og deres visualisering. - Velg datasettet Pan-kreftanalyse av hele genomer fra PanCancer Studies-delen av delen Select Studies for Visualization & Analysis . Klikk deretter på Spørring etter gen-knappen .
- Skriv inn målgen-ID (TMEM200A) i spørringsboksen til Enter Genes. Klikk Send spørring-knappen .
- Klikk på Cancer Type Detailed-knappen øverst på siden for å få mutasjoner av TMEM200A i ulike typer kreftformer.
8. Sangerbox 3.0-verktøy
- Gå til Sangerbox 3.0-verktøygrensesnittet .
MERK: Korrelasjonen av TMEM200A ekspresjon med immuninfiltrerende celler, immunsuppressive midler, immunostimulerende faktorer og MHC-molekyler (hovedhistokompatibilitetskompleks) i alle kreftformer ble analysert ved CIBERSORT immuninfiltrasjon ved hjelp av immuninfiltrasjonsdata for immun mot kreft i Sangerbox 3.0 verktøy22 (http://vip.sangerbox.com/). - Fra verktøylinjen til venstre på siden velger du og klikker på fanen Immunocellular Analysis (CIBERSORT) fra menyen Pan-Cancer Analysis .
- Skriv inn målgen-ID (TMEM200A) i spørringsboksen til Enter Genes. Klikk på Send-knappen .
9. TISIDB database
- Gå til TISIDB-nettstedgrensesnittet .
MERK: TISIDB-databasen23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) ble brukt til å undersøke korrelasjonen av TMEM200A uttrykk med immuninfiltrerende celler, immunsuppressive midler, immunostimulerende faktorer og MHC-molekyler i forskjellige kreftformer. - Skriv inn målgensymbolet (TMEM200A) i spørringsboksen til Enter Genes. Klikk på Send-knappen .
- Klikk på seksjonene Lymfocytter, Immunmodulatorer, Kjemokiner og Subtype øverst på siden. Last ned de relevante bildene nederst på siden.
10. TIDE-databasen
- Gå til TIDE nettstedgrensesnitt.
MERK: TIDE-databasen (http://tide.dfci.harvard.edu/) ble brukt til å evaluere potensialet til TMEM200A som en biomarkør for å forutsi respons på tumorimmunkontrollpunktblokadebehandling. - Skriv inn e-postadressen på startskjermbildet for å registrere kontoen og logge på.
- Finn underavsnittet Biomarker Evaluation øverst på siden og klikk på den.
- Skriv inn målgen-ID (TMEM200A) i spørringsboksen for Angi gener nederst på siden. Klikk deretter på Send-knappen .
- Dra musen på siden for å skyve siden ned for å finne resultatene av analysen.
11. CancerSEA-databasen
- Gå til CancerSEAs nettstedgrensesnitt.
MERK: Ved hjelp av enkeltcellesekvenseringsdata ble forholdet mellom TMEM200A uttrykk og funksjonell tilstand av forskjellige tumorceller undersøkt. Dette ble gjort ved hjelp av CancerSEA database24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/). - Øverst på siden, finn og klikk på Søk-fanen.
- Skriv inn målgen-ID (TMEM200A) i spørringsboksen til Enter Genes. Klikk på Send-knappen .
12. Tumorimmun single-cell center (TISCH) nettverksverktøy
- Gå til nettverksgrensesnittet for tumorimmun enkeltcellesenter (TISCH) nettverksverktøy .
MERK: Korrelasjonen mellom ekspresjonsnivåene av TMEM200A og kreftceller ble også vist ved å bruke nettverksverktøyet tumorimmun single-cell center (TISCH)25. - Skriv inn målgen-ID (TMEM200A) i spørringsboksen til Enter Genes. Klikk på Utforsk-knappen .
- I Cancer type-menyen på denne siden velger du og klikker på datasettet All Cancers . Rull deretter nedover siden og klikk på Søk-knappen .
13. GeneMANIA
- Gå til grensesnittet til GeneMANIA nettstedet.
MERK: Korrelasjonen mellom TMEM200A og dets funksjonelt relevante gener ble spådd ved hjelp av integrasjonsstrategien for genmultiforeningsnettverket Nettstedet GeneMANIA (www.genemania.org) 26 for å konstruere gen-geninteraksjon (GGI) nettverk. - I søkeboksen øverst til venstre på siden skriver du inn gen-ID (TMEM200A) og klikker på Søkeverktøy.
MERK: Webverktøyet GeneMANIA ble brukt til å finne 20 gener assosiert med TMEM200A.
14. Analyse av funksjonell berikelse
- Lagre symbol-IDene til genene som skal analyseres for berikelse i txt-filformat.
- Åpne R-koden (symbolidR) og kopier og lim inn banen der den ovennevnte txt-filen er plassert til linjen der setwd ligger i R-koden.
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (symbolidR). Konverter symbol-ID-ene til disse genene til entrezID-er via "org. Hs.eg.db" pakke. Hent id.txt filen.
- Åpne R-koden (GOR og KEGGR) og kopier og lim inn banen der id.txt filen er plassert til linjen der setwd er plassert i R-koden.
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (GOR og KEGGR). For å følge denne protokollen, analyser disse genene for GO og KEGG-berikelse av pakkene "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db," og "berichplot" og plott berikelsesresultatene ved hjelp av pakken "gglot2".
15. Analyse av forskjellene i genaktivitet
MERK: TMEM200A skåring i hver kreftprøve ble beregnet ved hjelp av ssGSEA (single-sample gene set enrichment analysis)27, og differensialanalysen av TMEM200A genaktivitet i kreft og sunt vev ble utført for ulike kreftformer.
- Basert på RNA-seq-dataene for 33 tumortyper lastet ned i trinn 1.7, pakker du ut alle nedlastede filer og plasserer dem i en enhetlig mappe.
- Plasser merge.txt filen i mappen ovenfor.
MERK: Dataene i merge.txt filen fra BioWolf (www.biowolf.cn) inneholder genuttrykk for alle pasienter i alle svulster i databasen The Cancer Genome Atlas (TCGA). - Åpne R-koden (ssGSEAR) og kopier og lim inn banen der mappen ovenfor ligger til linjen der setwd ligger i R-koden.
- Ta linjen der geneName er i R-koden (ssGSEAR) og skriv inn gen-ID (TMEM200A).
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (ssGSEAR). Få scoringsfilen for genaktivitet: scores.txt.
MERK: Med ssGSEA-algoritmen konstruerer vi først en gensettfil basert på korrelasjonskoeffisientene mellom gener i henhold til dataene i merge.txt-filen og identifiserer genene med høyere korrelasjon med målgenet (TMEM200A) fra filen. Deretter blir genene med høyere korrelasjon samlet som de aktive genene til TMEM200A, og til slutt får vi skåringen av aktive gener i hver prøve. - Åpne R-koden (scoreDiffR) og kopier og lim inn banen der scores.txt filen er plassert til linjen der setwd er plassert i R-koden.
- Åpne R-programvaren, kjør den modifiserte R-koden (scoreDiffR), og tegn bildet gjennom pakkene "plyr", "reshape2" og "ggpubr".
16. Kliniskpatologisk korrelasjon og overlevelsesprognoseanalyse
- Gå til UCSC Xenas nettstedgrensesnitt.
- Klikk på Start Xena-fanen .
- Klikk på DATASETT-fanen øverst på skjermen.
- Hold markøren over siden og bla nedover for å finne TCGA Pan-Cancer (PANCAN)- fanen.
- Fra de 129 kohortene og 1 571 datasettene på denne siden klikker du på TCGA Pan-Cancer (PANCAN)- fanen.
- Fra fenotypemenyen velger du og klikker på fanen Kuraterte kliniske data.
- Fra nedlastingsmenyen klikker du på den tilhørende lenken.
MERK: Last ned kliniske data for 33 kreftformer fra TCGA-databasen på lenken ovenfor. - Pakk ut den nedlastede kliniske datafilen og åpne den utpakkede filen i xls-filformat.
- Organiser og behold de nødvendige kliniske dataene (stadium, alder, patologisk stadium og pasientstatus) i filen, slett de gjenværende unødvendige kliniske dataene, og lagre hele filen som en txt-formatfil etter å ha omdøpt den klinisk.
- Basert på singleGeneExp.txt oppnådd i trinn 1.9, legger du denne filen i samme mappe som den organiserte clinical.txt filen.
- Pakk ut de nedlastede kliniske dataene og plasser singleGeneExp.txt - og clinical.txt-filene i samme mappe som de utpakkede kliniske filene.
- Åpne R-koden (clinicalDiffR) og kopier og lim inn banen der mappen ovenfor er plassert til linjen der setwd ligger i R-koden.
- Åpne R-programvaren, kjør den modifiserte R-koden (clinicalDiffR), og tegn bildet ved hjelp av "ggpubr" -pakken.
- Gå til UCSC Xenas nettstedgrensesnitt.
- Klikk på Start Xena-fanen .
- Klikk på DATASETT-fanen øverst på skjermen.
- Fra de 129 kohortene og 1,571-datasettene på denne siden, klikk på fanen for totalt 33 kreftformer som GDC TCGA akutt myeloid leukemi (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Galle Duct Cancer (CHOL) og mer.
- Fra fenotypemenyen velger du og klikker på kategorien overlevelsesdata.
- Fra nedlastingsmenyen klikker du på den tilhørende lenken.
- Pakk ut zip-arkivet med overlevelsesdata for 33 forskjellige krefttyper i en enkelt fil i skrivebordsmappen på datamaskinen.
- Legg de utpakkede overlevelsesdataene i samme mappe som den singleGeneExp.txt filen du fikk i trinn 1.9.
- Åpne R-koden (preOSR) og kopier og lim inn banen der mappen ovenfor er plassert til linjen der setwd ligger i R-koden.
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (preOSR). Beregn gjennom "limma" -pakken for å få en datafil om overlevelsen av TMEM200A i pan-kreft: expTime.txt.
- Åpne R-koden (OSR) og kopier og lim inn banen der expTime.txt filen er plassert til linjen der setwd er plassert i R-koden.
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (OSR). Utfør en KM-analyse ved hjelp av "survival" og "survminer" -pakkene basert på dataene i expTime.txt-filen og plott overlevelseskurvene for TMEM200A i pan-kreft.
17. Univariate og multivariate Cox-regresjonsanalyser med skogplottkonstruksjon
- Åpne R-koden (COXR) og kopier og lim inn banen der vi fikk den expTime.txt filen fra 16.23 ligger til linjen der setwd ligger i R-koden.
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (COXR). Basert på dataene i expTime.txt-filen , utfør univariate COX-regresjonsanalyser ved hjelp av pakkene "survival", "survminer" og "forestplot" for å plotte en Univariate-skogplott av TMEM200A i forskjellige kreftformer.
- Legg expTime.txt filen fra trinn 16.23 og clinical.txt fra trinn 16.10 i samme mappe.
- Åpne R-koden (multicoxR) og kopier og lim inn banen der mappen som inneholder expTime.txt-filen fra trinn 16.23 og clinical.txt filen fra trinn 16.10 er plassert til linjen der setwd er plassert i R-koden.
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (multicoxR). Utfør en multivariat COX-regresjonsanalyse ved hjelp av "overlevelse" og "survminer" -pakkene for å plotte et multivariat skogplott av TMEM200A i forskjellige kreftformer basert på dataene i expTime.txt - og clinical.txt-filene .
18. Prognostisk modell av magekreft basert på TMEM200A uttrykk og kliniske egenskaper
- Legg clinical.txt filen fra trinn 16.10 og expTime.txt filen fra trinn 16.23 i samme mappe.
- Åpne R-koden (NomoR) og kopier og lim inn banen der txt-filen ovenfor ligger til linjen der setwd ligger i R-koden.
- Åpne R-programvaren og kjør den modifiserte R-koden (NomoR). Bruk programvarepakkene "survival", "regplot" og "rms" for TMEM200A uttrykksdata i GC og kliniske data for å konstruere en prognostisk modell for å forutsi pasientoverlevelse.
19. Cellekultur og siRNA-transfeksjon av TMEM200A
MERK: Humane STAD HGC-27-celler, SGC-7901-celler og humane gastrisk slimhinneepitelial GES-1-celler ble oppnådd kommersielt (se materialtabellen), gjenopplivet, inokulert i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 komplett medium (inneholdende 10% neonatal føtal bovint serum og 1% penicillinblanding), og dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2 cellekultur inkubator. Kulturmediet ble endret hver 2-3 dag. Cellene i god veksttilstand ble inokulert i seksbrønnsplater i henhold til (2-3) × 105 celler per brønn.
- Ta først tre mikrosentrifugerør og tilsett 8 μL transfeksjonsreagens (se Table of Materials) og 200 μL basalmedium til hvert rør. Deretter tilsettes 4 μg SiRNA1, SiRNA2 og SiRNA3 til hvert rør henholdsvis.
MERK: For TMEM200A knockdown ble siRNA designet og kjøpt (se materialfortegnelsen). - Bland blandingen i de tre mikrosentrifugerørene grundig og tilsett hver av de tre brønnene i 6-brønnsplaten. Rist forsiktig 6-brønnsplaten for å fordele blandingen jevnt. Merk de tre brønnene der blandingen ble tilsatt som SiRNA-1, SiRNA-2 og SiRNA-3.
- Når cellene har blitt inkubert i 4-6 timer, erstatt halvparten av mediet i de tre delbrønnene i 6-brønnsplaten.
MERK: Når du bytter ut halvparten av det komplette mediet, aspirerer halvparten av det opprinnelige komplette mediet og fyller på med halvparten av det friske komplette mediet. - Tjuefire til 48 timer senere, bruk TMEM200A siRNA-transfektede celler som eksperimentell gruppe og utransfekterte celler som den negative kontrollgruppen. Utfør kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR, se avsnitt 20) for å vurdere effekten av transfeksjon på cellene.
20. Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon
- Kast cellekulturmediet i hver undergruppe og vask cellene forsiktig to ganger med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
- Isoler totalt RNA ved hjelp av et RNA-isolasjonssett (se materialtabellen).
- Beregn RNA-konsentrasjonen og syntetiser cDNA med 1 μg RNA ved hjelp av et cDNA-syntesesett, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utfør kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR) på 10 ganger fortynninger av cDNA i 10 μL reaksjonsblanding, inkludert menneskespesifikke forover- og reversprimere for GAPDH (for standardisering), TMEM200A (se materialtabellen) og qPCR Master Mix, ved bruk av Real-Time PCR Assay System.
MERK: Utfør hvert eksperiment i tre eksemplarer. - Bruk følgende qPCR-reaksjonsbetingelser: initialisering, 95 °C i 3 minutter; denaturering, 95 ° C i 10 s; glødning, 60 °C i 30 s; og forlengelse, 80 °C i 10 s; Gjenta denaturering, glødning og forlengelse 40x. Bestem det relative uttrykket av hvert gen ved hjelp av 2-ΔΔCt-teknikken 28.
- Gjenta forsøkene minst tre ganger for å oppnå biologiske triplikater.
21. Western blot deteksjon av relevant proteinuttrykk
- Kast cellekulturmediet i hver undergruppe og vask forsiktig cellene med 2 x 1 ml PBS.
- Avkjøl 6-brønnsplatene som inneholder cellene på is og tilsett 150 μL forkjølt radioimmunutfellingsanalyse (RIPA) lysebuffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 og nylig tilsatt proteasehemmercocktail). La lysen fortsette på is i 10 min.
- Bruk en plastcelleskrape, fjern vedheftende celler fra parabolen og overfør celleløsningen forsiktig til et mikrosentrifugerør som er forkjølt.
- Sentrifuger cellelysatet i 10 minutter ved 1,5 × 104 g ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Bruk et BCA-proteinanalysesett for å bestemme proteininnholdet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Legg 30 g protein fra hver prøve på en 10% natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og kjør ved 80 V i 0,5 timer etterfulgt av 1,5 timer ved 120 V.
- Overfør proteinene fra gelen til en 45 μm polyvinylidendifluorid (PVDF) membran ved en spenning på 300 mA i 1-1,5 timer.
- Etter å ha plassert PVDF-membranen på en shaker og ristet den i 3 x 5 minutter, tilsett Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20) til riktig beholder med proteinsiden (gelsiden) vendt oppover.
- Plasser membranen i blokkeringsbufferen (se materialfortegnelsen) og inkuber den i 0,5 timer ved romtemperatur.
- Vask membranen med TBST i 3 x 10 min.
- Inkuber membranen med primære antistoffer mot fosfo-AKT (p-AKT; 1:1000), total AKT 1:1000, E-cadherin (E-ca; 1:1,000), N-cadherin (N-ca; 1:1,000), Vimentin 1:1,000, snegle 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH; 1:1,000), over natten ved 4 °C.
- Vask membranen i 3 x 10 min og inkuber membranen med et sekundært antistoff fra kanin eller mus (1:5 000) i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber PVDF-membranen med ECL-substrat i 30 sekunder og oppdag signalet ved hjelp av et bildesystem.
22. CCK-8-analyse
- Frø humane STAD HGC-27 celler i god veksttilstand i 96-brønnsplater.
- Når celletettheten når 60-70%, transfekter cellene med TMEM200A siRNA (som i trinn 19.3).
- Frø de transfekterte cellene til 96-brønnplater ved en celletetthet på 5 × 10 3/brønn (telle levedyktige celler ved hjelp av en celleteller), delt inn i NC - og TMEM200A siRNA-grupper (med tre replikerende brønner i hver gruppe), og inkubert ved 37 °C.
- Tilsett CCK-8-reagens etter 0, 24, 48, 72 og 96 timer og inkuber ved 37 °C i 2 timer. Mål absorbansen (450 nm) ved hjelp av en multifunksjonell enzymetikett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekspresjon av TMEM200A i ulike kreftformer
Som illustrert i figur 1 analyserte vi først differensialuttrykksnivåene av TMEM200A i ulike kreftformer gjennom ulike databaser. TMEM200A ekspresjon var forhøyet i kolangiokarsinom (CHOL), hode- og nakkeplateepitelkarsinom (HNSC), klarcellet nyrekarsinom (KIRC), nyrepapillærcellekarsinom (KIRP), hepatocellulært karsinom (LIHC), STAD og tyreoideakarsinom (THCA) sammenlignet med tilstøtende normalt vev utelukkende basert på TCGA-data. Imidlertid ble TMEM200A ekspresjon redusert i blære uroepitelial karsinom (BLCA), cervikal plateepitelkarsinom og cervikal adenokarsinom (CESC), glioblastoma multiforme (GBM), nyrekromofobe (KICH), lungeplateepitelkarsinom (LUSC), feokromocytom og paragangliom (PCPG), rektalt adenokarsinom (READ) og livmor corpus endometriekarsinom (UCEC) (figur 2A). I TIMER2.0-databasen økte uttrykket TMEM200A i CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC og STAD. Videre økte TMEM200A uttrykket i BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, hudkutant melanom (SKCM) og UCEC (figur 2B).
Ved å sammenligne resultatene fra de to databasene fant vi at pan-kreftuttrykket til TMEM200A var det samme i hver database. Vi innhentet kliniske oppfølgingsdata og RNA-sekvenseringsdata fra 33 pasienter med kreft fra TCGA-databasen, beregnet TMEM200A skåring i hver kreftprøve ved hjelp av ssGSEA-analyse, og beregnet deretter TMEM200A genaktivitet i tumor og normalt vev i mange svulster. Vi oppdaget at TMEM200A var sterkt uttrykt i GBM, HNSC, nyre KIRC og THCA (figur 2C); Derfor ble genaktiviteten til TMEM200A rangert i hvert tumorvev. Det ble funnet at genaktiviteten til TMEM200A var høyest i KIRC og lavest ved uvealt melanom (UVM) (figur 2D). Påfølgende HPA-databasevurdering av TMEM200A ekspresjonsnivåer i humant vev viste at TMEM200A ekspresjonsnivåene var lave i de fleste normale vev, men høye i binyrebarken, endetarmen, endometrium og glatt muskulatur (figur 2E).
I normale vevscellelinjer viste noen få cellelinjer som granulosaceller, bipolare celler, skjelettmuskelceller, endometriestromale celler og T-celler høyt uttrykk av TMEM200A, mens TMEM200A ekspresjon var lav i de fleste andre cellelinjer (figur 2F). Vi undersøkte også immunhistokjemi (IHC) data i HPA-databasen for å se på uttrykket av TMEM200A på proteinnivå. Dataene om farging og intensitet viste mye større og mer uttalte uttrykksnivåer av TMEM200A i kolorektal kreft (CRC), lungekreft (LUAD), leverkreft (LIHC), brystkreft (BRCA) og prostatakreft (PRAD) vev sammenlignet med normalt vev (figur 2G). Disse funnene antydet at TMEM200A var mye uttrykt i forskjellige kreftformer og påvirket kreftutvikling via forskjellige mekanismer i forskjellige svulster.
Kliniskpatologisk forhold og overlevelsesprognose
For 33 humane maligniteter samlet vi informasjon og kliniske data i TCGA pan-cancer (PanCan) kohorten fra UCSC Xena database nettsted og undersøkte sammenhengen mellom TMEM200A uttrykk i PanCan og alder, patologisk karakter, kliniskpatologisk stadium og pasientoverlevelsesstatus. Denne studien viste at i seks kreftformer var uttrykket av TMEM200A assosiert med det kliniskpatologiske stadiet, inkludert BLCA, invasivt brystkarsinom (BRCA), esophageal carcinoma (ESCA), KIRP, SKCM og testikkelkarsinom (TGCT) (figur 3A). Alder var korrelert med seks svulster, inkludert invasiv BRCA, GBM, akutt myelogen leukemi (LAML), SKCM, tymisk karsinom (THYM) og endometriekreft (UCEC) (figur 3B). Den patologiske karakteren var assosiert med seks svulster, inkludert esophageal carcinoma (ESCA), HNSC, KIRC, lavgradig gliom i hjernen (LGG), pankreatisk adenokarsinom (PAAD) og endometriekarsinom (UCEC) (figur 3C). Overlevelsesstatus var assosiert med fem svulster, inkludert binyrebarkkarsinom (ACC), BLCA, KIRC, PCPG og uvealt melanom (UVM) (figur 3D).
Vi gjennomførte studier for ulike kreftformer på OS, DSS, PFI og DFI ved hjelp av enveis Cox-regresjonsanalyse med mediangruppeterskel for å lære mer om sammenhengen mellom TMEM200A uttrykk og prognose. Resultatene fra OS-analysen viste at blant de fire svulstene hadde høyere TMEM200A-uttrykk større innvirkning på OS-prognosen ved fire svulster, inkludert binyrebarkkarsinom (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), akutt myelogen leukemi (LAML) (P = 0,011) og GC (STAD) (P = 0,005). Derimot hadde høyere TMEM200A uttrykk bedre prognose for OS i fem svulster, inkludert KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), lavgradig gliom i hjernen (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) og kutant melanom (SKCM) (P = 0,043) (figur 3E,F). For DSS hadde høyt TMEM200A uttrykk dårlig prognose ved to svulsttyper, inkludert binyrebarkkarsinom (ACC) (P = 0,026) og BLCA (P = 0,015). Høy TMEM200A ekspresjon hadde bedre prognose ved fire svulsttyper, inkludert KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), lavgradig gliom i hjernen (LGG) (P = 0,025) og PCPG (P = 0,007) (figur 3G). For PFI hadde i tillegg høyere TMEM200A uttrykk dårlig prognose ved tre svulsttyper, inkludert binyrebarkkarsinom (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) og uvealt melanom (UVM) (P = 0,020). Høyere TMEM200A uttrykk hadde bedre prognose ved to svulsttyper, inkludert KIRC (P < 0,001) og lavgradig gliom (LGG) (P = 0,044) i hjernen (figur 3H). Ved DFI hadde høyere uttrykk av TMEM200A dårligere prognose ved binyrebarkkarsinom (ACC) (P = 0,044) (figur 3I).
Deretter valgte vi ut flere svulster (KIRC og KIRP) for multi-COX-regresjonsanalyse. Resultatene viste at TMEM200A individuelt kunne påvirke overlevelsen til kreftpasienter sammenlignet med andre kliniske faktorer (figur 3J og K). Disse resultatene viste at TMEM200A kunne brukes som en uavhengig bioprognostisk markør i forskjellige kreftformer for å påvirke overlevelsen til pasienter med kreft.
DNA-metyleringsanalyse
En av de epigenetiske endringene som har fått maksimal oppmerksomhet er DNA-metylering29. Det har blitt foreslått at en type epigenetisk forandring, DNA-metylering, har en betydelig innvirkning på tumorvekst30. Derfor, ved hjelp av SMART-databasen, evaluerte vi DNA-metyleringsnivåene av TMEM200A i normalt og kreftvev. PAAD og PRAD vev hadde høyere nivåer av DNA-metylering av TMEM200A enn normalt vev. Imidlertid hadde TMEM200A lavere DNA-metyleringsnivåer i COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA og UCEC enn i normalt vev (figur 4A). DNA-metyleringsnivåene av TMEM200A var betydelig høyere i TCGA-databasen i KIRP, PRAD, PCPG og THYM basert på UALCAN-databasen (figur 4B), men ikke i BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA og UCEC. Metyleringsnivået på TMEM200A signifikant redusert i LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA og UCEC (figur 4C). For å undersøke forholdet mellom ekspresjonsnivået av TMEM200A og DNA-metylering og kliniskpatologiske faktorer ytterligere, benyttet vi igjen SMART-databasen og fant at DNA-metyleringsnivået på TMEM200A i BLCA, HNSC, LUAD og STAD endret seg med det patologiske stadiet (figur 4D). Kliniske faktorer påvirker nivået av DNA-metylering av TMEM200A i de ovennevnte svulstene.
Genmutasjonsanalyse
En av årsakene til utviklingen av svulster er akkumulering av genmutasjoner31. Derfor ble frekvensen av somatiske TMEM200A mutasjoner analysert ved å estimere frekvensen av TMEM200A mutasjoner i kliniske prøver av kreft i pan-kreft ved hjelp av cBioPortal-databasen. TMEM200A er mutert i mange kreftformer, som lungekreft, livmor endometrioid karsinom, melanom, esophagogastric cancer, bein kreft, livmorhalskreft, hepatobiliær kreft, moden B-celle lymfom, BRCA, livmorkreft, eggstokkreft, embryonal tumor, kreft i bukspyttkjertelen, hode og nakke kreft, CRC, gliom, ikke-småcellet lungekreft, bløtvevssarkom og kreft av ukjent primær (figur 5A). I tillegg kan DNA-endringer føre til strukturelle eller aminosyreendringer på proteinnivå. Figur 5B viser 3D-strukturen til TMEM200A. Ved hjelp av cBioPortal-databasen fant vi mutasjonssteder i aminosyrene i TMEM200A; missensemutasjoner var den hyppigst forekommende formen for mutasjoner (figur 5C).
Vi analyserte dataene ved hjelp av Sangerbox 3.0 for å verifisere nøyaktigheten av mutasjonsstedene og oppnådde de samme resultatene som tidligere. Missensemutasjoner er den hyppigste formen for mutasjoner i TMEM200A og de kan forekomme så ofte som 7,8 % i SKCM (figur 5D). En missense-mutasjon er en mutasjon der et kodon som koder for en aminosyre gjennomgår en basesubstitusjon og blir et kodon som koder for en annen aminosyre, noe som resulterer i en endring i aminosyretypen og sekvensen av polypeptidkjeden. Resultatet av missense-mutasjonen er vanligvis at polypeptidkjeden mister sin opprinnelige funksjon. Mange protein abnormiteter er forårsaket av missense mutasjon, som er en vanlig type tumormutasjon. Det har blitt funnet at missensemutasjoner spiller en nøkkelrolle i stabiliteten til proteiner, og tilstedeværelsen av mutasjoner kan ha en signifikant effekt på bindingsaffiniteten mellom proteiner32, og endre samspillet mellom proteiner og de omkringliggende korrelative makromolekylene33.
Dermed påvirker missensemutasjoner mest sannsynlig den biologiske funksjonen til transmembranprotein 200A i forskjellige kreftformer. Sammenhengen mellom TMEM200A genmutasjon og den kliniske overlevelsesprognosen hos pasienter med kreft ble også undersøkt. Sannsynligheten for OS økte sammenlignet med den i den TMEM200A-muterte gruppen, men ikke i den sykdomsfrie gruppen (figur 5E). Studien av genkorrelasjoner viste at TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 og SLC18B1 var blant genene som sammuterte med TMEM200A (figur 5F). Vi var i stand til å identifisere flere mutasjonstyper og enkeltnukleotidvariasjoner (SNV) gjennom COSMIC-databasen for å lære mer om TMEM200A mutasjoner i GC. Frekvensen av missense-substitusjoner var høyest (38,86 %) (figur 5G), og SNV-data viste at de vanligste SNVene i STAD var G>A (31,73 %), etterfulgt av C>T (26,35 %) og G>T (11,73 %) (figur 5H).
Enkeltcelleanalyse av TMEM200A ved kreft
Vi analyserte TMEM200A uttrykksnivåer i forskjellige enkeltceller ved hjelp av TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center) nettside. TISCH online-verktøyet viste uttrykket av TMEM200A for 65 datasett og 28 celletyper i varmekartet vist i figur 6A. Funnene viste at TMEM200A hovedsakelig ble uttrykt i CD8 + T-celler og fibroblaster. Det GSE72056 datasettet, som inkluderer celler fra pasienter med metastatisk kutant melanom (SKCM), er bemerkelsesverdig i denne forbindelse. TMEM200A ble i stor grad uttrykt i B-celler, CD4+ T-lymfocytter, utarmede CD8+ T-celler, endotelceller, fibroblaster og andre celletyper i SKCMs mikromiljø (figur 6B,C). I GSE146771-datasettet, som inneholder celler fra pasienter med CRC, ble TMEM200A mye sterkt uttrykt i B-celler, CD4 + T-lymfocytter, CD8 + T-celler, utarmede CD8 + T-celler, endotelceller, fibroblaster og andre celletyper i CRC-mikromiljøet (figur 6D, E). Ved å bruke CancerSEA-databasen ble ekspresjonsnivå og funksjonsstatus for TMEM200A i spesifikke tumorceller bestemt (figur 6G). TMEM200A uttrykket var sterkt korrelert med cellulær funksjonell tilstand i en rekke kreftformer, inkludert glioblastom (GBM), lungeadenokarsinom (LUAD), kronisk granulocytisk leukemi (CML), CRC, retinoblastom (RB) og uveal melanom (UM). Angiogenese, apoptose, differensiering og inflammasjon var alle positivt korrelert med TMEM200A uttrykk i et flertall av tumorceller, mens DNA-skade, DNA-reparasjon, invasjon og metabolisme var negativt korrelert med TMEM200A uttrykk (figur 6F).
Funksjonell og veiberikelsesanalyse av TMEM200A i ulike kreftformer
Vi undersøkte sammenhengen mellom TMEM200A og proteiner med lignende funksjoner ved hjelp av GGI-nettverket for å undersøke funksjonen til TMEM200A i forskjellige kreftformer (figur 7A). Genomisk og proteomisk informasjon analyseres av GeneMANIA ved hjelp av en spørringsliste over målgener. Ved å finne gener som fungerer på samme måte som TMEM200A, ble de 40 proteinene som direkte interagerer med dette genet oppdaget. Korrelasjonen av disse genene er vist av PPI-nettverket (figur 7B). Deretter avslørte GO- og KEGG-berikelsesanalyser av disse 20 genene nært beslektet med TMEM200A at disse tilstøtende genene hovedsakelig var involvert i RNAs negative regulering av genaktivering. KEGG-analyse viste at TMEM200A var rikelig med veier, inkludert Wnt-signalveien og cellulær senescens (figur 7C). GO-anrikningsanalyse viste at TMEM200A i molekylær funksjon hovedsakelig var rikelig i kalsiumkanalene og negativ regulering av genaktivering av RNA (figur 7D).
Korrelasjonsanalyse mellom TMEM200A og immuninfiltrasjon
Vi undersøkte videre sammenhengen mellom TMEM200A uttrykk og immuncelleinfiltrasjon for å demonstrere sammenhengen mellom TMEM200A og kreftimmunitet. Vi utførte CIBERSORT immuninfiltrasjonsanalyse ved hjelp av Sangerbox 3.0 pan-cancer data. Resultatene viste at pan-kreft TMEM200A uttrykk var korrelert med CD8 + T-celler, CD4 + T-celler, B-celler, hjelper-T-celler, naturlige drepeceller, regulatoriske T-celler, monocytter, makrofager, dendrittiske celler, eosinofiler, basofiler og granulocytter (figur 8A). Deretter så vi på sammenhengen mellom TMEM200A uttrykk og TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) ved hjelp av TISIDB-databasen, som viste en nær sammenheng mellom TMEM200A uttrykk og 28 TIL-tallrikhet i ulike krefttyper (figur 8B). Vi brukte TISIDB-databasen til å vurdere sammenhengen mellom TMEM200A ekspresjon og immundempende medikamenter i humane maligniteter for å undersøke grundigere hvordan immunmodulatorer og TMEM200A uttrykk var relatert. Resultatene viste at TMEM200A ekspresjonsnivåene var signifikant korrelert med immunsuppressive midler i en rekke kreftformer (figur 8C). Det ble funnet signifikante sammenhenger mellom TMEM200A uttrykk og visse immunsuppressive midler ved testikkelkreft og UM (figur 8D-F). Deretter utførte vi en korrelasjonsanalyse av TMEM200A uttrykk med immunstimulerende faktorer og MHC-molekyler ved hjelp av TISIDB-databasen (figur 8G,H). Resultatene viste at TMEM200A ekspresjon var korrelert med utvalgte immunstimulerende midler og MHC-molekyler i urotelialt karsinom i blæren, testikkelkarsinom, binyrebarkkarsinom og UM (figur 8I-L). Neste skritt var å undersøke sammenhengen mellom TMEM200A ekspresjon og immunologiske eller molekylære subtyper i TCGA PanCan-kohorten i TISIDB-databasen. Vi fant at de immunologiske undergruppene av ni forskjellige krefttyper uttrykte TMEM200A forskjellig, inkludert BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT og BRCA (figur 8M). I tillegg viste seks forskjellige kreftformer med forskjellige molekylære undergrupper, inkludert HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV og LUSC, variabelt uttrykk for TMEM200A (figur 8N).
TMEM200A og immunterapi responsanalyse
Effektiviteten av PD-1 / PD-L1-hemmere er sterkt korrelert med TMB, og noen pasienter med svulster kan forutsies noe ved hjelp av TMB-markører for effekten av immunterapi34. Microsatellite instability (MSI) er begrepet som brukes til å beskrive den defekte DNA mismatch repair (MMR) -funksjonen når mikrosatellittreplikasjonsfeil ikke er løst og akkumuleres, og endrer lengden eller basesammensetningen til mikrosatellitter35. MSI er en tumormarkør av klinisk betydning 36. Vi vurderte derfor effekten av TMEM200A uttrykk på immunterapi ved å undersøke sammenhengen mellom TMEM200A uttrykk og TMB eller MSI. Funnene viste en betydelig positiv korrelasjon mellom TMEM200A uttrykk og TMB i THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP og KIRC, men TMEM200A uttrykket var negativt korrelert med UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM og BRCA (figur 9A). MSI og TMEM200A uttrykk var sterkt og positivt forbundet i TGCT, mens TMEM200A uttrykk var signifikant og negativt korrelert med MSI i UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC og CHOL (figur 9B). Vi vurderte også potensialet for TMEM200A som biomarkør for å undersøke effekten av ICB. Resultatene viste at TMEM200A alene spådde ICB-responser med en nøyaktighet på areal under kurve (AUC) > 0,5 i 7 av 25 ICB-underpopulasjoner. TMEM200A viste høyere prediktiv verdi enn T- og B-cellekloner, som begge hadde en verdi på 5. Verdien for TMEM200A var imidlertid lavere enn for TIDE (AUC > 0,5 i 11 ICB-subpopulasjoner), MSI-score (AUC > 0,5 i 11 ICB-subpopulasjoner), CD274 (AUC > 0,5 i 15 ICB-subpopulasjoner), CD8 (AUC > 0,5 i 17 ICB-subpopulasjoner), IFNG (AUC > 0,5 i 16 ICB-underpopulasjoner) og Merck18 (AUC > 0,5 i 17 ICB-undergrupper) (figur 9C). Dårlig overlevelsesprognose i ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 og ICB_Hugo 2016_PD1 kohortene var korrelert med høy TMEM200A uttrykk. Imidlertid forbedret TMEM200A knockdown lymfocyttmediert tumordrepende styrke i gjennomsnittlig kohort av Kearney 2018 T_PD1 og Pan 2018 OT1 (figur 9D).
GSEA-berikelsesanalyse av TMEM200A i forskjellige kreftformer
Vi brukte DEGs mellom TMEM200A undergrupper med høyt uttrykk og TMEM200A lavt uttrykk i 32 maligniteter for å utforske TMEM200A-relaterte kreftkarakteristika. Vi oppdaget en betydelig korrelasjon mellom primær immunsvikt, RIG (Retinoic acid-inducible gene)-I-like receptor signaling pathway og TMEM200A ekspresjon i pan-cancer, spesielt i BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC og SKCM (figur 10). Det virale cytoplasmatiske proteinet ribonukleinsyre detekteres av den RIG-I-lignende reseptorsignalveien. RIG-I-lignende reseptorer kan påvirke produksjonen av en rekke inflammatoriske cytokiner i kroppen ved å aktivere NF-kB-signalveien ved å engasjere visse intracellulære koblingsproteiner. Som et resultat kan transmembranproteinet 200A (TMEM200A) spille en avgjørende rolle i rekrutteringen av intracellulære proteiner av den RIG-I-lignende reseptoren. Disse funnene antydet en sterk sammenheng mellom TMEM200A ekspresjon og immunologisk infiltrasjon. I tillegg viste GSEA-anrikningsanalyse at pan-cancer TMEM200A ekspresjon var korrelert med kjemokinsignalering, celleadhesjon, cytokinreseptorforbindelser, cellemembranens sensingveier og autofagikontroll (figur 10). Transmembranproteiner kan fungere som adhesjonsmolekyler for å påvirke tumormikromiljøet i tillegg til å spille en kritisk rolle i å kontrollere inngangen av kalsiumioner inn i cellen fra kalsiumreservoarer 36. Derfor kan resultatene oppnådd fra GSEA-anrikningsanalyse skyldes involvering av TMEM200A i mange fysiologiske prosesser, inkludert aktivering av signaltransduksjonsveier, dannelse av plasmamembranionkanaler og regulering av cellekjemotaksis, adhesjon, apoptose og autofagi9.
Vi identifiserte de 50 øverste STAD-genene både positivt og negativt korrelert med TMEM200A fra LinkedOmics-databasen, som ble uttrykt samtidig i STAD, i form av varmekart (figur 11A,B). Vi evaluerte de 5 øverste genene positivt og de 5 øverste genene negativt assosiert med TMEM200A i GC (figur 11C). Våre resultater viste at TMEM200A uttrykk var korrelert med SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) og SYTL1 (r = -0,33) co-uttrykk. Vi analyserte terskelvisualiseringsresultatene for å forstå rollen til TMEM200A i STAD. Følgende kriterier ble brukt for screening: log2-fold change (FC) > 2.0 og justert P-verdi 0.05. Vi fant 483 DEG, hvorav 385 var oppregulert og 98 ble nedregulert, og vi valgte 100 av dem som skulle visualiseres for å lage et varmekart (figur 11D). For DEG-ene som tilfredsstilte screeningkriteriene, kjørte vi GO- og KEGG-berikelsesanalyser. Resultatene av GO-anrikningsanalysen viste at anrikningen av BP (biologisk prosess) hovedsakelig var assosiert med ekstracellulær matrise og strukturelt vev, anrikningen av CC (cellulær komponent) var hovedsakelig assosiert med kollagenholdig ekstracellulær matrise og kjellermembran, og MF (molekylær funksjon) var hovedsakelig anriket i en ekstracellulær matriksstruktur og glykosaminoglykanbinding (figur 11E og figur 11G). Anrikningen av KEGG-analysen viste at TMEM200A hovedsakelig var anriket i den ekstracellulære matriksreseptorinteraksjonsveien, cytokrom P450 og renin-angiotensinsystemet (figur 11F og figur 11H).
TMEM200A-basert prognostisk modell og kliniske trekk ved magekreft
Vi undersøkte sammenhengen mellom TMEM200A og kliniske data fra pasienter med STAD og analyserte derfor kliniskpatologiske karakteristika hos pasienter i TCGA-STAD-kohorten ved logistisk regresjonsanalyse og basert på TMEM200A ekspresjonsnivåer (figur 12A). Alder, klinisk stadium og TMEM200A uttrykk var alle signifikant korrelert med OS hos pasienter med STAD, ifølge en univariat Cox-regresjonsanalyse (figur 12B). Den multivariate Cox-regresjonsanalysen viste at TMEM200A uttrykk kan være en frittstående prediktiv faktor for OS hos pasienter med STAD (HR = 1,282, 95 % KI = 1,066-1,541, P = 0,008) (figur 12C). Vi undersøkte potensialet til disse kliniskpatologiske karakteristika for å predikere OS etter 1, 3 og 5 år i STAD ved bruk av standard kolonnelinjeplottmodell sammen med flere kliniske parametere (figur 12D). Kalibreringskurvene for 1-års overlevelsessannsynligheter var svært konsistente med sannsynligheter for kolonnelinjeplott (figur 12E).
TMEM200A oppregulering i STAD-celler og celleproliferasjonsforbedring
Ved å gjennomgå litteraturen knyttet til TMEM200A, oppdaget vi at det høye uttrykket av TMEM200A indikerte en dårlig prognose 13 og GC-immunmikromiljøet kan påvirkes av TMEM200A som virker som et adhesjonsmolekyl37, og dermed fremme invasjonen og metastasen av GC-celler. Vi undersøkte proteinnivåene og mRNA-transkriptnivåene av TMEM200A i STAD-cellelinjer for å bekrefte funnene fra den nevnte studien. GC-cellelinjen HGC-27 overuttrykte dramatisk TMEM200A sammenlignet med den sunne mageslimhinneepitelcellelinjen GES-1 ved både protein- og mRNA-transkriptnivåene (figur 13A, B), noe som indikerer at TMEM200A ble overuttrykt i HGC-27-celler. Følgende tester ble utført ved bruk av HGC-27-celler som et resultat. I mellomtiden, for å bevise nøyaktigheten av de eksperimentelle resultatene, brukte vi qRT-PCR for å sammenligne differensial mRNA-ekspresjon av TMEM200A i humane GC-celler SGC-7901 og mageslimhinneepitelceller GES-1, og resultatene viste at TMEM200A ble sterkt uttrykt i SGC-7901-celler (figur 13B). TMEM200A ble slått ned i HGC-27-celler for å undersøke mulig involvering av TMEM200A i STAD (figur 13C). Basert på databaseutvinningsresultatene og vår korrelasjonsanalyse av TMEM200A, ble det funnet at TMEM200A hovedsakelig var involvert i den ekstracellulære matriksreseptorinteraksjonsveien, som var assosiert med kreftproliferasjon og invasjon. Vi benyttet derfor CCK-8-analyser for å finne ut hvordan TMEM200A ekspresjon påvirket celleveksten. CCK-8-analysene viste at TMEM200A knockdown-gruppene (Si-RNA2 og Si-RNA3) viste et merkbart fall i cellelevedyktighet sammenlignet med NC-gruppen (figur 13D). Disse funnene antydet at TMEM200A ble oppregulert i STAD, og ekspresjonsnivået kunne påvirke spredning av GC-celler. Basert på resultatene av KEGG-anrikningsanalyse i figur 11F, fant vi at TMEM200A var assosiert med PI3K/AKT-signalveien i GC, og TMEM200A, som en celleadhesjonsfaktor, kan påvirke mekanismen for gastrisk karsinogenese ved å påvirke EMT. Derfor brukte vi western blotting for å verifisere effekten av TMEM200A knockdown på EMT og PI3K/AKT-signalveien før og etter knockdown. Resultatene viste at P-AKT-proteinuttrykk ble redusert i TMEM200A knockdown-gruppen (TMEM200A-SiRNA2) sammenlignet med den negative kontrollgruppen (NC), mens nivåene av N-cadherin-, Vimentin- og Snai-proteiner også ble redusert og E-cadherinproteinuttrykk ble økt (figur 13E). Alle disse resultatene tyder på at TMEM200A kan påvirke EMT gjennom PI3K/AKT-signalveien og dermed spille en rolle i GC.
Figur 1 Studiens arbeidsflyt. Forkortelser: TCGA = The Cancer Genome Atlas database; TIMER2.0 = TIMER2.0-databasen; OS = total overlevelse; PFS = Progresjonsfri overlevelsestid; DSS = sykdomsspesifikk overlevelse; DFS = sykdomsfri overlevelse; TMB = tumormutasjonsbyrde; MSI = Mikrosatellitt ustabilitet; PPI = Protein-protein interaksjon; GGI = Gen-gen-interaksjon; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GO = genontologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekspresjonsnivåer av TMEM200A ved ulike kreftformer. (A) Opp- eller nedregulert uttrykk av TMEM200A fra TCGA-datasettet ved forskjellige humane maligniteter. (B) Analyse av TMEM200A uttrykksnivåer i tumor og normalt vev ved hjelp av TIMER2.0-databasen. (C) Differensiell analyse av TMEM200A genaktivitet i ulike humane kreftformer fra TCGA-datasettet. (D) Rangering av genaktivitetsnivåer av TMEM200A i ulike humane kreftformer basert på ssGSEA-skåring. (E) TMEM200A ekspresjonsnivåer fra HPA-databasen i friskt vev. (F) HPA-databasens TMEM200A uttrykksnivåer i normale cellelinjer. (G) IHC-utfall for TMEM200A proteinuttrykk i kreft fra HPA-databasen. Forkortelser: TCGA = The Cancer Genome Atlas; ssGSEA = enkeltprøve-gensettberikelsesanalyse; HPA = Humant proteinatlas; IHC = Immunhistokjemi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Korrelasjon av TMEM200A uttrykk med kliniskpatologiske karakteristika og prognose for ulike svulster. (A) Korrelasjon av TMEM200A uttrykk i TCGA pan-cancer (PanCan) kohorten med kliniskpatologisk staging i hver tumor ble analysert ved hjelp av UCSC Xena databasen. (B) Korrelasjon av TMEM200A uttrykk i TCGA PANCAN kohorten med pasientens alder i hver tumor. (C) Korrelasjon av TMEM200A uttrykk i TCGA PANCAN kohorten med tumor patologisk grad i hver tumor. (D) Korrelasjon av TMEM200A uttrykk i TCGA PanCan-kohorten med overlevelsesstatus for pasienter i hver tumor. (E) Korrelasjonsanalyse av TMEM200A uttrykk med total overlevelse av pan-cancer i ulike kreftformer ved bruk av Cox-regresjonsmodellen. (F) Korrelasjon mellom TMEM200A-uttrykk og prognose for OS-kreft i TCGA PanCan-kohorten. (G) Korrelasjon mellom TMEM200A uttrykk og sykdomsspesifikk overlevelse. (H) Korrelasjon mellom TMEM200A uttrykk og progresjonsfri intervallprognose i TCGA PanCan-kohorten. (I) Korrelasjon mellom TMEM200A uttrykk og sykdomsfritt intervall. (J) En multifaktoriell COX-regresjonsanalyse ble utført på KIRC. (K) En multifaktoriell COX-regresjonsanalyse ble utført på KIRP. Forkortelser: TCGA = The Cancer Genome Atlas; KIRC: Nyre nyre klarcellet karsinom; KIRP: Nyre nyre papillær cellekarsinom; OS = Total overlevelse; DSS = Sykdomsspesifikk overlevelse; PFI = Progresjonsfritt intervall; DFI = Sykdomsfritt intervall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: DNA-metyleringsanalyse av TMEM200A i forskjellige kreftformer. (A) Promotormetyleringsnivåer av TMEM200A ble undersøkt i flere krefttyper, ifølge SMART-databasen. (B) Høyere promotormetyleringsnivåer av TMEM200A i forskjellige krefttyper enn i normalt vev ble undersøkt i samsvar med UALCAN-databasen. (C) Ved hjelp av UALCAN-databasen ble det bestemt at normalt vev hadde lavere promotormetyleringsnivåer av TMEM200A i flere krefttyper. (D) DNA-metyleringsnivået av TMEM200A i BLCA, HNSC, LUAD og STAD endret seg med det patologiske stadiet. Forkortelser: BLCA = blære urotelialt karsinom; HNSC = hode og nakke plateepitelkarsinom; LUAD = Lungeadenokarsinom; STAD = Mageadenokarsinom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TMEM200A genmutasjoner i ulike kreftformer. (A) Analyse av TMEM200A genmutasjonstyper i forskjellige kreftformer ved hjelp av cBioPortal-databasen. (B) 3D-proteinstruktur av TMEM200A. Bindingsområdet indikeres av den fargede delen, mens de andre delene av TMEM200A vises med den grå delen. (C) Isoformer og distribusjon av TMEM200A somatiske mutasjoner. X-akse, aminosyre steder; y-akse, antall TMEM200A mutasjoner; grønne prikker, missense mutasjoner; og grå prikker, avkortede mutasjoner. (D) Validering av isoformene og fordeling av TMEM200A somatiske mutasjoner ved bruk av data i Sangerbox 3.0. (E) For alle TCGA-svulster ble korrelasjonen mellom mutasjonsstatus og pasientenes prediksjon av total overlevelse undersøkt ved hjelp av cBioPortal-databasen, med røde firkanter som indikerer TMEM200A mutasjonsgruppe og blå firkanter som indikerer den umuterte gruppen. (F) Gener co-mutert med TMEM200A ble analysert ved hjelp av cBioPortal-verktøyet: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 og SLC18B1. (G) Analyse av TMEM200A mutasjonstyper i GC ved bruk av COSMIC databasen. (H) En analyse av TMEM200A SNV-typer i GC ble utført ved hjelp av COSMIC-databasen. Forkortelser: TCGA = The Cancer Genome Atlas; OS = total overlevelse; COSMIC = katalog over somatiske mutasjoner i kreftceller; GC = Gastrisk kreft. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Enkeltcellekorrelasjonsanalyse av TMEM200A uttrykk ved ulike kreftformer. (A) Sammendrag av uttrykk for TMEM200A på TISCHs nettsted. (B) Fordeling av åtte distinkte celletyper i metastatisk kutant melanom GSE72056 datasett. (C) Ekspresjonsnivåer av TMEM200A i kutane metastatiske melanomceller fra GSE72056-datasettet. (D) Fordeling av 13 forskjellige celletyper i datasettet for kolorektal kreft fra GSE146771. (E) TMEM200A ekspresjonsnivåer i kolorektal kreftceller fra GSE146771-datasettet. (F) Korrelasjon av TMEM200A uttrykk med enkeltcellefunksjonell status i flere svulster ble demonstrert ved bruk av CancerSEA-databasen. (G) T-SNE-kart som illustrerer nivåene av TMEM200A uttrykk i individuelle tumorceller, inkludert GBM, LUAD, CML, CRC, RB og UM. Forkortelser: GBM = glioblastom; LUAD = Lungeadenokarsinom; KML = Kronisk granulocytisk leukemi; CRC = Kolorektal kreft; RB = retinoblastom; UM = Uveal melanom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Samuttrykksnettverk og funksjonell berikelsesanalyse av TMEM200A på gennivå. (A) GGI-nettverk av TMEM200A og dets samuttrykte gener. (B) PPI-nettverk. (C,D) TMEM200A og de samuttrykte genene ble analysert for GO og KEGG-baneberikelse. Forkortelser: PPI = Protein-protein interaksjon; GGI = Gen-gen-interaksjon; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GO = genontologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Korrelasjon mellom uttrykk av TMEM200A og immunceller, immundempende midler, immunstimulerende stoffer og MHC-molekyler i ulike krefttyper. (A) Sangerbox 3.0 varmekart som viser sammenhengen mellom TMEM200A uttrykk og immuninfiltrerende celler. (B) Varmekart som viser sammenhengen mellom immuninfiltrerende celler og TMEM200A uttrykk i TISIDB-databasen. (C) Varmekart som viser sammenhengen mellom immunsuppressive celler og TMEM200A uttrykk i TISIDB-databasen. (VG Nett) Korrelasjon mellom TMEM200A uttrykk og visse immundempende midler ved testikkelkreft og uvealt melanom. (G) Varmekart som viser sammenhengen mellom immunstimulerende faktorer og TMEM200A uttrykk i TISIDB-databasen. (H) Varmekart over korrelasjonen mellom TMEM200A ekspresjon og MHC-molekyler i TISIDB-databasen. (I-L) Korrelasjon mellom TMEM200A ekspresjon og noen immunostimulerende faktorer og MHC-molekyler i blærens uroteliale karsinom, testikkelkarsinom, binyrebarkkarsinom og uvealt melanom. (M) Korrelasjon mellom immunundergrupper mot kreft og TMEM200A uttrykk. (N) Korrelasjon mellom pan-kreft molekylære undergrupper og TMEM200A uttrykk. Forkortelser: MHC = Major histocompatibility complex. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Analyse av immunterapeutisk respons av TMEM200A ved pancytopeni. (A) Korrelasjon av TMEM200A uttrykk i forskjellige kreftformer med TMB. (B) Korrelasjon mellom MSI i pan-kreft og TMEM200A uttrykk. (C) TMEM200A potensial som biomarkør for å forutsi immunkontrollpunktblokaderespons. (D) Vektet gjennomsnitt av TMEM200A korrelasjon med ICB-overlevelsesresultat og logaritmisk foldeendring (logFC) i CRISPR-screening ble brukt til å rangere det. Forkortelser: TMB = Tumormutasjonsbyrde; ICB = Immunkontrollpunkt blokade; CRISPR = Grupperte regelmessige mellomliggende korte palindromiske repetisjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: GSEA-berikelsesanalyse av TMEM200A i forskjellige kreftformer. Topp fem veier der TMEM200A spilte en viktig funksjonell rolle i å regulere 32 kreftformer, ble identifisert ved GSEA-berikelsesanalyse. Det venstre panelet viser resultatene av GSEA-berikelsesanalyse for TMEM200A i ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ og SARC. Det høyre panelet viser resultatene av GSEA-anrikningsanalyse for TMEM200A i SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS og UVM. Forkortelser: GSEA = Gene Set Enrichment Analysis; ACC = Adrenokortikal karsinom; BLCA = blære urotelial karsinom; BRCA = Bryst invasivt karsinom; CESC = Cervikal plateepitelkarsinom og endocervikal adenokarsinom; CHOL = kolangiokarcinom; COAD = Kolon adenokarsinom; ESCA = Esophageal karsinom; GBM = Glioblastom multiforme; HNSC = hode og nakke plateepitelkarsinom; KICH = nyre kromofob; KIRC = Nyre nyre klarcellet karsinom; KIRP = Nyre nyre papillær cellekarsinom; LAML = Akutt myelogen leukemi; LGG = hjerne lavere grad gliom; LIHC = Lever hepatocellulært karsinom; LUAD = Lungeadenokarsinom; LUSC = Lungeplateepitelkarsinom; MESO = Mesothelioma; OV = Ovarie serøs cystadenokarsinom; PAAD = Bukspyttkjerteladenokarsinom; PCPG = feokromocytom og paragangliom; PRAD = Prostata adenokarsinom; LES Endetarm adenokarsinom; SARC = sarkom; SKCM = hudkutant melanom; STAD = Mageadenokarsinom; TGCT = testikulære kimcelletumorer; THCA = Skjoldbrusk karsinom; THYM = Thymoma; UCEC = livmor corpus endometrial karsinom; UCS = livmor karsinosarkom; UVM = Uveal melanom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: TMEM200A i STAD. (A) Topp 50 gener funnet med negativ korrelasjon med TMEM200A uttrykk i STAD av LinkedOmics-databasen. (B) Topp 50 gener i STAD som var positivt forbundet med TMEM200A. (C) TMEM200A er topp fem positivt og fem negativt korrelerte gener i STAD. (D) Varmekart over DEGs i STAD. (E-H) Undersøkelse av berikede GO- og KEGG-baner ved bruk av de screenede DEG-ene. Forkortelser: STAD=Mageadenokarsinom; DEGs= Differensielt uttrykk av gener; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GO = genontologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Korrelasjon mellom kliniske karakteristika ved STAD og TMEM200A ekspresjonsnivå. (A) Analyse av TMEM200A ekspresjonsnivåer og STAD kliniske trekk ved hjelp av logistisk regresjon. (B,C) Cox-analyse av STAD skogplott for enkle og flere variabler. (D) Kolonnelinjeplott som forutsier OS hos pasienter med STAD basert på kjønn, patologisk klasse, alder, patologisk stadium og TMEM200A uttrykk. (E) Kalibreringsdiagrammer som viser kalibreringen av kolonnelinjediagrammodellen. Forkortelser: STAD = Mageadenokarsinom; OS = Total overlevelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 13: TMEM200A ekspresjon er oppregulert i STAD og fremmer proliferasjon av magekreftceller. (A) Påvisning av TMEM200A uttrykk i magekreftceller HGC-27 og mageslimhinneepitelceller GES-1 ved vestlig blotting. (B) Påvisning av TMEM200A ekspresjon i GC-celler HGC-27 og SGC-7901, og mageslimhinneepitelceller GES-1 ved qRT-PCR. (C) Ekspresjonseffektiviteten til TMEM200A ble sterkt redusert i TMEM200A knockdown-gruppen sammenlignet med ikke-knockdown-gruppen i GC-celler HGC-27, som demonstrert av qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown hemmet signifikant spredning av GC-celler målt ved CCK8-analyse. (E) Nedslaget av TMEM200A hemmet signifikant de relaterte proteinene i EMT og påvirket fosforyleringen av AKT i PI3K/AKT-signalveien. Forkortelse: GC = Gastrisk kreft; qRT-PCR: Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon; EMT = epitel-mesenkymal overgang; AKT=Proteinkinase B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TMEM200A tilhører en familie av TMEMs som er avgjørende for at kreftceller skal spre seg38. Det variable uttrykket av TMEM200A ved ulike maligniteter har fått mindre oppmerksomhet, og grundig pan-cancer utredning mangler. Imidlertid fortsetter bevis å akkumulere, noe som viser at TMEM-transmembranproteinfamilien kan være viktig for å holde kreftceller ondartede gjennom interaksjoner med flere proteiner, for eksempel aktivering av TMEM16A Ca2+-aktiverte Cl-kanaler av ROCK1 / moesin fremmer BRCA-metastase39. Derfor, i det nåværende arbeidet, fokuserte våre analyser på å utforske muligheten for TMEM200A som terapeutisk kreftmål og tumordiagnostisk markør. Spesielt undersøkte vi ekspresjonsnivåene av TMEM200A i 33 ondartede svulster ved hjelp av RNA-seq-data fra UCSC Xena-databasen, og resultatene fra TIMER2.0-databasen validerte analysene i UCSC Xena-databasen.
Deretter ble nettverktøyet Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) og CancerSEA-databasen brukt til å analysere uttrykksnivåene av TMEM200A i forskjellige typer monocytter. Sangerbox og TISIDB nettsteder ble brukt til å forstå hvordan TMEM200A påvirker immuninfiltrasjon. Vi identifiserte også signalveiene der TMEM200A spiller en nøkkelfunksjon i hver kreft ved GSEA-berikelsesanalyse for å forstå de viktigste funksjonelle rollene til TMEM200A i hver malignitet.
TMEM200A kan fungere som et adhesjonsmolekyl for å kontrollere immunmiljøet til GC og fremme invasiv spredning av GC-celler. Derfor identifiserte vi 483 differensielt uttrykte gener (DEG) assosiert med ekspresjonsnivået av TMEM200A gjennom TCGA-databasen og analyserte GO og KEGG-anrikningen av disse 483 DEGene. Berikelsesresultatene viste at PI3K/AKT-banen spiller en nøkkelrolle i kreftutviklingen, og PI3K/AKT-banen kan være en av de drivende faktorene for kreft.
Videre utførte vi cellulære og molekylære tester etter å ha lært mer om den avgjørende funksjonen til TMEM200A i å drive kreftutvikling for å bekrefte sammenhengen mellom TMEM200A uttrykk og STAD-celleaktivitet. Som forventet oppdaget vi at nedregulering av TMEM200A i STAD-celler reduserte celleproliferasjonen kraftig, og at kreftcellelinjer uttrykte TMEM200A på betydelig større nivåer enn normale cellelinjer. Ved å kaste litteraturen relatert til transmembranproteinfamilien de siste årene, fant vi at transmembranproteiner, som celleadhesjonsmolekyler37, har en regulerende rolle i EMT.
Videre, ifølge resultatene av anrikningsanalysen av TMEM200A-relaterte gener i GC, fant vi at TMEM200A kan ha en regulerende rolle i PI3K / AKT-signalveien i GC. Vestlige blottingseksperimenter viste at TMEM200A knockdown kunne redusere Vimentin-, N-cadherin- og Snai-proteiner og hemme AKT-fosforylering, noe som tyder på at TMEM200A regulerer tumormikromiljøet ved å påvirke EMT, og at PI3K / AKT-signalveien kan være involvert i TMEM200A-mediert regulering av GC-utvikling. I de senere år har noen studier funnet at EMT er hovedårsaken til kjemoterapi medikamentresistens hos GC-pasienter. Epitel-mesenkymal plastisitet (EMP) og tumormikromiljø er beskrevet som begrensende faktorer for effektiv behandling i mange krefttyper40. Forekomsten av EMT kan få GC-celler til å miste sine karakteristiske egenskaper og vise egenskapene til mesenkymale celler41. Denne funksjonen reduserer ikke bare følsomheten til GC-pasienter for kjemoterapeutiske legemidler, men forbedrer også GC-cellenes invasive og migrerende evne, noe som fører til tumormetastase. Derfor, av årsakene nevnt ovenfor, hjelper vår studie forskning og utvikling av viktige regulatoriske punkter i EMT og utviklingen av nye målrettede terapeutiske tilnærminger ved å utforske den spesifikke virkningsmekanismen til TMEM200A som påvirker EMT.
Bruken av bioinformatikk til forskning har økt de siste årene, og til denne studien fikk vi tilgang til data fra flere internettdatabaser. Bruken av disse elektroniske databasene i bioinformatikk har strømlinjeformet og fremskyndet studiet av kreft, og de gir også forskere et rimelig middel til å validere resultatene sine.
Bioinformatikkteknikken har imidlertid visse ulemper. Når vi bruker disse databasene for analyse, kan den samme studien gi inkonsekvente eller til og med motstridende funn i flere databaser, siden mange online databaser inneholder data fra flere datasett. Videre blir mange databaser ikke oppdatert i svært lang tid, og på grunn av opphavsrettsproblemer kan innholdet aldri forstørres; Derfor er de analytiske funnene som forskere får fra disse databasene alltid begrenset. Derfor, i denne undersøkelsen, benyttet vi forskjellige databaser for å undersøke resultatene samlet for å overvinne disse begrensningene og sikre korrektheten av funnene. For å være sikre på at funnene vi innhentet ikke ble vesentlig endret, gjentok vi prosedyren ved bruk av ulike databaser for analyse. Resultatene av western blot-eksperimenter støttet vår bioinformatikkprediksjon om at TMEM200A kan kontrollere EMT i GC ved å regulere PI3K / AKT-signalveien, som deretter ville påvirke spredning av GC-celler. Vi forutså virkningsmekanismen til TMEM200A ved hjelp av bioinformatikk i forbindelse med relatert litteratur.
Oppsummert demonstrerer dette arbeidet hvordan bioinformatikkverktøy kan legge til rette for eksperimentell design og brukes til å gjøre mange andre typer vitenskapelige forskningsforutsigelser. Fremtidige kreftforskere vil sannsynligvis vedta det primære paradigmet for å kombinere eksperimentell validering med bioinformatikkprediksjon, og dette arbeidet fungerer som en god modell for dette målet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82160550).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
- Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
- Harbeck, N., Gnant, M.
- Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
- Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
- Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
- Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
- Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
- Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
- Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
- Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
- Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
- Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
- Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
- Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
- Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
- Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
- Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
- Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
- Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
- Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
- Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
- Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
- Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
- Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
- Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
- Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
- Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
- Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
- Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K.
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S.
- Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
- Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
- Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
- Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
- Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
- Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
- Stemmler, M. P.
- Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
- De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
- Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).
