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Cancer Research

पैन-कैंसर बायोमार्कर के रूप में TMEM200A का मल्टीओमिक्स विश्लेषण

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

यहां, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जिसमें कैंसर में TMEM200A के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए कई जैव सूचना संबंधी उपकरण संयुक्त होते हैं। इसके अलावा, हम प्रयोगात्मक रूप से जैव सूचना विज्ञान भविष्यवाणियों को भी मान्य करते हैं।

Abstract

ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, TMEM200A, मानव कैंसर और प्रतिरक्षा घुसपैठ से जुड़ा हुआ माना जाता है। यहां, हमने मल्टीओमिक्स विश्लेषण द्वारा आम कैंसर में TMEM200A के कार्य का आकलन किया और परिणामों को सत्यापित करने के लिए गैस्ट्रिक कोशिकाओं के इन विट्रो सेल संस्कृतियों में उपयोग किया। कई मानव कैंसर प्रकारों में TMEM200A की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन यूसीएससी ज़ेना डेटाबेस से आरएनए-सीक्यू डेटा का उपयोग करके किया गया था। जैव सूचना संबंधी विश्लेषण ने नैदानिक और रोगनिरोधी बायोमार्कर के रूप में TMEM200A की संभावित भूमिका का खुलासा किया।

सामान्य गैस्ट्रिक और कैंसर सेल लाइनों की संस्कृतियों को उगाया गया और TMEM200A खटखटाया गया। TMEM200A के अभिव्यक्ति स्तर मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके मापा गया था। इन विट्रो लॉस-ऑफ-फंक्शन अध्ययनों का उपयोग तब गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कोशिकाओं के घातक व्यवहार और ट्यूमर गठन में TMEM200A की भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए किया गया था। पश्चिमी धब्बों का उपयोग जीसी में उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) और पीआई 3 के / एकेटी सिग्नलिंग मार्ग पर दस्तक के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया गया था। जैव सूचना संबंधी विश्लेषण से पता चला है कि TMEM200A जीसी में उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था।

जीसी कोशिकाओं के प्रसार को TMEM200A नॉकडाउन द्वारा बाधित किया गया था, जिसने विमेंटिन, एन-कैडरिन और स्नाई प्रोटीन को भी कम कर दिया और एकेटी फॉस्फोराइलेशन को रोक दिया। PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग भी GC विकास के TMEM200A-मध्यस्थता विनियमन में शामिल दिखाई दिया। यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि TMEM200A ईएमटी को प्रभावित करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को नियंत्रित करता है। TMEM200A PI3K/AKT सिग्नलिंग के माध्यम से EMT को भी प्रभावित कर सकता है, इस प्रकार ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को प्रभावित करता है। इसलिए, पैन-कैंसर में, विशेष रूप से जीसी, TMEM200A एक संभावित बायोमार्कर और ऑन्कोजीन हो सकता है।

Introduction

कैंसरदुनिया भर मेंअपनी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के कारण विश्व स्तर पर मानव स्वास्थ्य को खतरे में डालने वाले एक लगातार सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दे के रूप में उभरा है, जिससे समाज पर भारी वित्तीय और चिकित्सा बोझ पैदा हो रहाहै। कैंसर मार्करों3 की खोज के लिए हाल के वर्षों में कैंसर चिकित्सा में महत्वपूर्ण प्रगति हासिल की गई है, और शोधकर्ताओं ने कैंसर के इलाज के लिए उपन्यास नैदानिक विधियों और नई दवाओं का विकास किया है। हालांकि, कैंसर वाले कुछ रोगियों में अभी भी दवा प्रतिरोध, दवाओं के साइड इफेक्ट, और रासायनिक संवेदनशीलताजैसे कारकों के कारण खराब पूर्वानुमान हैं। इसलिए, प्रारंभिक चरण के कैंसर की स्क्रीनिंग और उपचार के लिए नए बायोमार्कर की पहचानकरने की तत्काल आवश्यकता है।

झिल्ली प्रोटीन है कि बाँध सकते हैं और कोशिकाओं और organelle झिल्ली 6 में एकीकृत कररहे हैं. ये झिल्ली और उनके स्थान के लिए बाध्यकारी की ताकत के आधार पर तीन श्रेणियों में बांटा जा सकता है: लिपिड-लंगर प्रोटीन, अभिन्न प्रोटीन, और परिधीय झिल्ली प्रोटीन 7,8. एक ट्रांसमेम्ब्रेन (टीएमईएम) प्रोटीन एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन है जिसमें कम से कम एक ट्रांसमेम्ब्रेन खंड9 होता है, जो जैविक झिल्ली के माध्यम से पूरी तरह या आंशिक रूप से गुजरता है।

हालांकि टीएमईएम परिवार से संबंधित प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र को अच्छी तरह से समझा नहीं जाता है, इन प्रोटीनों को कई प्रकार के कैंसर10 में शामिल होने के लिए जाना जाता है। कई टीएमईएम प्रोटीन प्रवासी, प्रोलिफेरेटिव और इनवेसिव फेनोटाइप से जुड़े होते हैं, और उनकी अभिव्यक्ति अक्सर रोगी के पूर्वानुमान11 से जुड़ी होती है। इसलिए, टीएमईएम परिवार के सदस्य अनुसंधान का लक्ष्य बन गए हैं। टीएमईएम पर मौजूदा रिपोर्टों की एक व्यापक समीक्षा से पता चला कि वे ज्यादातर अंतर- और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग12, प्रतिरक्षा संबंधी बीमारियों और ट्यूमरजेनेसिस10 से जुड़े हैं। कई टीएमईएम में महत्वपूर्ण शारीरिक कार्य भी होते हैं, उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली में आयन चैनल, सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों की सक्रियता, साथ ही सेल केमोटैक्सिस, आसंजन, एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी10 की मध्यस्थता। इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि टीएमईएम प्रोटीन ट्यूमर का पता लगाने और उपचार में महत्वपूर्ण रोगनिरोधी मार्कर हो सकते हैं।

गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) में TMEM200A अभिव्यक्ति काफी बढ़ जाती है। TMEM200A13 की उच्च अभिव्यक्ति, जिसमें गुणसूत्र 6q23.1 पर आठ एक्सॉन और 77.536 kb की पूरी लंबाई है, को GC के मामलों में समग्र अस्तित्व (OS) के लिए खराब पूर्वानुमान से जोड़ा गया है। फिर भी ऑन्कोलॉजी अध्ययनों में इसकी अभिव्यक्ति में परिवर्तन शायद ही कभी रिपोर्ट किए गए हैं। यह लेख विभिन्न सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटासेट का उपयोग करके विभिन्न कैंसर अध्ययनों में चिकित्सीय लक्ष्य और ट्यूमर डायग्नोस्टिक मार्कर के रूप में TMEM200A की उपयोगिता की तुलना और विश्लेषण करता है। हमने पैन-कैंसर डायग्नोस्टिक और रोगनिरोधी बायोमार्कर के रूप में TMEM200A की प्रभावशीलता का आकलन किया, साथ ही यूसीएससी ज़ेना और टीसीजीए डेटाबेस से आरएनए-सीक्यू डेटा का उपयोग करके विभिन्न मानव कैंसर प्रकारों में इसकी अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन किया, साथ ही साथ वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) और पश्चिमी सोख्ता।

उत्परिवर्तन दरों, नियामक प्रक्रियाओं, ट्यूमर निदान और रोग का निदान, प्रतिरक्षा घुसपैठ, और इम्यूनोथेरेपी पर TMEM200A अभिव्यक्ति के स्तर के प्रभाव की आगे कम्प्यूटेशनल टूल और डेटासेट वेबसाइटों के मिश्रण का उपयोग करके जांच की गई थी। CBioPortal और कैटलॉग ऑफ़ सोमैटिक म्यूटेशन इन कैंसर सेल्स (COSMIC) डेटाबेस का उपयोग TMEM200A में उत्परिवर्तन की जांच करने के लिए किया गया था। सेंगरबॉक्स और टीआईएसआईडीबी वेबसाइटों का उपयोग यह समझने के लिए किया गया था कि TMEM200A प्रतिरक्षा घुसपैठ को कैसे प्रभावित करता है। ट्यूमर इम्यून सिंगल सेल सेंटर (TISCH) ऑनलाइन टूल और CancerSEA डेटाबेस का उपयोग TMEM200A के कार्य की जांच के लिए किया गया था। अंत में, जीसी कोशिकाओं के घातक व्यवहार और ट्यूमर विकास समारोह पर TMEM200A के प्रभाव का आकलन करने के लिए, इन विट्रो परख में एक हानि-कार्य प्रयोग आयोजित किया गया था। इसके अतिरिक्त, पश्चिमी सोख्ता का आकलन करने TMEM200A लिए किया गया था कि कैसे नॉकडाउन ने PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग और GC में उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (EMT) को प्रभावित किया।

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Protocol

1. कैंसर जीनोम एटलस (TCGA) डेटाबेस

नोट: कैंसर जीनोम एटलस (TCGA) डेटाबेस विभिन्न ट्यूमर ऊतकों14 में जीन के अनुक्रमण डेटा शामिल हैं. टीसीजीए में आरएनए-सीक्यू डेटा प्रति भाग प्रति मिलियन (टीपीएम) प्रारूपों में TMEM200A प्रतिलेखों के अध्ययन के लिए यूसीएससी ज़ेना वेबसाइट15 (https://xenabrowser. नेट/डेटापेज/) से निकाला गया था और नमूनों के बीच अभिव्यक्तियों की तुलना करने के लिए लॉग 2 बदल दिया गया था।

  1. UCSC Xena वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
  2. लॉन्च Xena टैब पर क्लिक करें।
  3. स्क्रीन के शीर्ष पर डेटा सेट टैब पर क्लिक करें।
  4. इस पृष्ठ पर 129 समूहों और 1,571 डेटासेट से, कुल 33 कैंसर जैसे GDC TCGA Acute Myeloid Leukemia (LAML), GDC TCGA एड्रेनोकोर्टिकल कैंसर (ACC), GDC TCGA पित्त नली कैंसर (CHOL), और बहुत कुछ के लिए टैब पर क्लिक करें।
  5. जीन अभिव्यक्ति RNAseq मेनू से, HTSeq - FPKM GDC हब टैब पर चयन करें और क्लिक करें।
    नोट: HTSeq - FPKM GDC हब सहमति द्वारा ठीक किए गए डेटा का प्रतिनिधित्व करता है।
  6. डाउनलोड मेनू से, इसके संबंधित लिंक पर क्लिक करें।
    नोट: उपरोक्त विधि द्वारा, आरएनए-सेक डेटा 33 विभिन्न कैंसर प्रकारों के लिए डाउनलोड किए गए थे।
  7. कंप्यूटर के डेस्कटॉप फ़ोल्डर में एक फ़ाइल में 33 विभिन्न कैंसर प्रकारों के लिए आरएनए-सीक्यू डेटा के ज़िप संग्रह को अनपैक करें।
  8. एक ही फ़ोल्डर में unzipped txt फ़ाइलों को एकीकृत करें और इस फ़ोल्डर में पर्ल स्क्रिप्ट रखें।
  9. पर्ल सॉफ्टवेयर खोलें, पर्ल सॉफ्टवेयर में फ़ोल्डर के पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां माउस कर्सर स्थित है, एंटर कुंजी दबाएं, पर्ल कोड का नाम और जीन (TMEM200A) का नाम दर्ज करें, और फिर दबाएं दर्ज एक नई txt फ़ाइल (singleGeneExp.txt) प्राप्त करने के लिए कुंजी।
    नोट: इस नई txt फ़ाइल (singleGeneExp.txt) में विभिन्न रोगियों में 33 कैंसर में TMEM200A की जीन अभिव्यक्ति शामिल है।
  10. R कोड (diffR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां singleGeneExp.txt फ़ाइल उस लाइन पर स्थित है जहां सेटडब्ल्यूडी आर कोड में स्थित है।
  11. R सॉफ़्टवेयर खोलें, संशोधित R कोड (diffR) चलाएँ, और "ggpubr" पैकेज के माध्यम से चित्र बनाएं।

2. टाइमर 2.0 डेटाबेस

  1. TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) डेटाबेस 16 वेबसाइट इंटरफ़ेस पर जाएं।
  2. कैंसर एक्सप्लोरेशन टैब क्लिक करें।
  3. खोज बॉक्स में जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें और विभिन्न प्रकार के ट्यूमर में TMEM200A की अंतर अभिव्यक्ति छवियां प्राप्त करने के लिए सबमिट टैब पर क्लिक करें।

3. मानव प्रोटीन एटलस (एचपीए)

  1. मानव प्रोटीन एटलस (एचपीए) (www.proteinatlas.org) 17वेब इंटरफेस पर जाएं।
  2. खोज बॉक्स में आईडी (TMEM200A) टाइप करें और खोज बटन पर क्लिक करें। ऊतक उप-एटलस का चयन करें।
  3. पृष्ठ पर होवर करें और प्रोटीन अभिव्यक्ति अवलोकन टैब खोजने के लिए नीचे स्क्रॉल करें।
    नोट: प्रोटीन अभिव्यक्ति अवलोकन अनुभाग मानव शरीर में 45 अंगों में TMEM200A की प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाता है।

4. HumanMethylation450 Illumina Infinium डीएनए मेथिलिकरण मंच सरणी

नोट: HumanMethylation450 Illumina Infinium डीएनए मेथिलिकरण मंच सरणी मिथाइलेशन पर डेटा एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम स्मार्ट (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) डेटाबेस18 का उपयोग कर TMEM200A डीएनए मेथिलिकरण स्तर का आकलन कर सकता है.

  1. स्मार्ट वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
  2. गुणसूत्रों में TMEM200A का वितरण और विभिन्न प्रकार की विकृतियों में TMEM200A के मिथाइलेशन स्तर को प्राप्त करने के लिए खोज बॉक्स में जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें।
  3. पृष्ठ को नीचे स्क्रॉल करें सीपीजी-एकत्रित मिथाइलेशन मेनू की जांच करने के लिए क्लिक करें और प्लॉट बटन पर क्लिक करें। पृष्ठ के निचले भाग में, डाउनलोड चित्रा बटन ढूंढें और क्लिक करें। आंकड़ा डाउनलोड करें।

5. UALCAN डेटाबेस

  1. UALCAN वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
    नोट: विभिन्न विकृतियों में TMEM200A प्रमोटर मिथाइलेशन स्तरों के बॉक्स प्लॉट UALCAN डेटाबेस (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19के माध्यम से उत्पन्न किए गए थे
  2. पृष्ठ के शीर्ष पर, TCGA बटन पर क्लिक करें।
  3. स्क्रीन पर जीन आईडी इनपुट बॉक्स में TMEM200A दर्ज करें। टीसीजीए डेटासेट मेनू में, नीचे स्क्रॉल करें और पूछे जाने वाले कैंसर के प्रकार का चयन करें।
  4. एक्सप्लोर बटन पर क्लिक करने के बाद, इस ट्यूमर के मिथाइलेशन परिणाम प्राप्त करने के लिए विश्लेषण मेनू के लिए लिंक में इसके उपसमूह विश्लेषण मिथाइलेशन पर क्लिक करें।
    नोट: इस विधि से, हमने UALCAN डेटाबेस में 22 ट्यूमर के लिए मिथाइलेशन परिणाम प्राप्त किए।

6. कैंसर कोशिकाओं में दैहिक उत्परिवर्तन की सूची (कॉस्मिक) डेटाबेस

  1. कैंसर कोशिकाओं में दैहिक उत्परिवर्तन की सूची (कॉस्मिक) वेबसाइट इंटरफ़ेस पर जाएं।
    नोट: मानव जीनोम में कोडिंग म्यूटेशन, नॉनकोडिंग म्यूटेंट जीनोमिक पुनर्व्यवस्था, और फ्यूजन जीन पर डेटा कैंसर कोशिकाओं (कॉस्मिक) डेटाबेस 20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/) में दैहिक म्यूटेशन की सूची से उपलब्ध है, जिसका उपयोग विभिन्न TMEM200A उत्परिवर्तनों की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए भी किया जाता है।
  2. खोज बॉक्स में जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें और नई स्क्रीन पर जाने के लिए खोज बटन पर क्लिक करें।
  3. जीन मेनू में, उस लिंक का पता लगाएं और क्लिक करें जहां TMEM200A का जीन आईडी नाम दिखाई देता है।
  4. ट्यूमर में TMEM200A की उत्परिवर्तन स्थिति प्राप्त करने के लिए नए पृष्ठ पर उत्परिवर्तन distribut समूहीकरण कॉलम खोजें।

7. सीबीआईओपोर्टल

  1. CBioPortal वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
    नोट: कैंसर जीनोमिक्स डेटा cBioPortal (www.cioportal.org) डेटाबेस का उपयोग करके पाया, डाउनलोड, विश्लेषण और कल्पना किया जा सकता है। दैहिक उत्परिवर्तन, डीएनए कॉपी संख्या परिवर्तन (CNAs), mRNA और microRNA (miRNA) अभिव्यक्ति, डीएनए मेथिलिकरण, प्रोटीन बहुतायत, और फॉस्फोप्रोटीन बहुतायत केवल कुछ जीनोमिक डेटा प्रकार हैं जो cBioPortal21 द्वारा एकीकृत हैं। cBioPortal के साथ, अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला की जा सकती है; हालांकि, प्रमुख जोर उत्परिवर्तन और उनके दृश्य से संबंधित विभिन्न विश्लेषणों पर है।
  2. विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण अनुभाग के लिए अध्ययन का चयन करें के पैनकैंसर अध्ययन उपधारा से पूरे जीनोम डेटासेट के पैन-कैंसर विश्लेषण का चयन करें। फिर, जीन द्वारा क्वेरी बटन पर क्लिक करें।
  3. एंटर जीन के क्वेरी बॉक्स में लक्ष्य जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें। क्वेरी सबमिट करें बटन पर क्लिक करें.
  4. विभिन्न प्रकार के कैंसर में TMEM200A के उत्परिवर्तन प्राप्त करने के लिए पृष्ठ के शीर्ष पर कैंसर प्रकार विस्तृत बटन पर क्लिक करें।

8. सेंगरबॉक्स 3.0 टूल

  1. सेंगरबॉक्स 3.0 टूल इंटरफेस पर जाएं।
    नोट: सभी कैंसर में प्रतिरक्षा घुसपैठ कोशिकाओं, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों, इम्यूनोस्टिमुलेटरी कारकों और एमएचसी अणुओं (प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स) के साथ TMEM200A अभिव्यक्ति के सहसंबंध का विश्लेषण सेंगरबॉक्स 3.0 टूल22 (http://vip.sangerbox.com/) में पैन-कैंसर प्रतिरक्षा घुसपैठ डेटा का उपयोग करके CIBERSORT प्रतिरक्षा घुसपैठ द्वारा किया गया था।
  2. पृष्ठ के बाईं ओर टूलबार से, पैन-कैंसर विश्लेषण मेनू से इम्यूनोसेल्युलर विश्लेषण (CIBERSORT) टैब चुनें और क्लिक करें।
  3. एंटर जीन के क्वेरी बॉक्स में लक्ष्य जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें। सबमिट बटन पर क्लिक करें।

9. TISIDB डेटाबेस

  1. TISIDB वेबसाइट इंटरफ़ेस पर जाएँ।
    नोट: टीआईएसआईडीबी डेटाबेस23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) को विभिन्न कैंसर में प्रतिरक्षा घुसपैठ कोशिकाओं, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों, इम्यूनोस्टिमुलेटरी कारकों और एमएचसी अणुओं के साथ TMEM200A अभिव्यक्ति के सहसंबंध की जांच करने के लिए नियोजित किया गया था।
  2. Enter Genes के क्वेरी बॉक्स में लक्ष्य जीन प्रतीक (TMEM200A) दर्ज करें. सबमिट बटन पर क्लिक करें।
  3. पृष्ठ के शीर्ष पर लिम्फोसाइट्स, इम्युनोमोमोड्यूलेटर, केमोकाइन और उपप्रकार अनुभागों पर क्लिक करें। पृष्ठ के निचले भाग में प्रासंगिक चित्र डाउनलोड करें।

10. TIDE डेटाबेस

  1. TIDE वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
    नोट: TIDE डेटाबेस (http://tide.dfci.harvard.edu/) का उपयोग ट्यूमर प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी चिकित्सा की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए बायोमार्कर के रूप में TMEM200A की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था।
  2. खाता पंजीकृत करने और लॉग इन करने के लिए प्रारंभिक स्क्रीन पर ईमेल पता दर्ज करें।
  3. पृष्ठ के शीर्ष पर बायोमार्कर मूल्यांकन उपधारा ढूंढें और उस पर क्लिक करें।
  4. पृष्ठ के निचले भाग में Enter Genes के लिए क्वेरी बॉक्स में लक्ष्य जीन ID (TMEM200A) दर्ज करें. फिर, सबमिट बटन पर क्लिक करें।
  5. पृष्ठ में, विश्लेषण के परिणाम खोजने के लिए पृष्ठ को नीचे स्लाइड करने के लिए माउस खींचें।

11. CancerSEA डेटाबेस

  1. CancerSEA वेबसाइट इंटरफ़ेस पर जाएं।
    नोट: एकल-कोशिका अनुक्रमण डेटा का उपयोग करते हुए, TMEM200A अभिव्यक्ति और विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं की कार्यात्मक स्थिति के बीच संबंधों की जांच की गई। यह CancerSEA डेटाबेस24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/) का उपयोग करके किया गया था।
  2. पृष्ठ के शीर्ष पर, खोजें और खोज टैब पर क्लिक करें।
  3. एंटर जीन के क्वेरी बॉक्स में लक्ष्य जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें। सबमिट बटन पर क्लिक करें।

12. ट्यूमर प्रतिरक्षा एकल-कोशिका केंद्र (TISCH) नेटवर्क उपकरण

  1. ट्यूमर इम्यून सिंगल-सेल सेंटर (TISCH) नेटवर्क टूल वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
    नोट: TMEM200A और कैंसर कोशिकाओं की अभिव्यक्ति के स्तर के बीच संबंध भी ट्यूमर प्रतिरक्षा एकल कोशिका केंद्र (TISCH) नेटवर्क उपकरण25 का उपयोग करके दिखाया गया था.
  2. एंटर जीन के क्वेरी बॉक्स में लक्ष्य जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें। एक्सप्लोर बटन पर क्लिक करें।
  3. इस पृष्ठ पर कैंसर प्रकार मेनू में, सभी कैंसर डेटासेट का चयन करें और उस पर क्लिक करें। फिर, पृष्ठ को नीचे स्क्रॉल करें और क्लिक करें खोज बटन।

13. जीनमेनिया

  1. GeneMANIA वेबसाइट इंटरफ़ेस पर जाएं।
    नोट: TMEM200A और इसके कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक जीन के बीच संबंध जीन बहु संघ नेटवर्क वेबसाइट GeneMANIA (www.genemania.org)26 जीन जीन बातचीत (GGI) नेटवर्क के निर्माण के लिए एकीकरण रणनीति का उपयोग कर भविष्यवाणी की थी.
  2. पृष्ठ के शीर्ष बाईं ओर खोज बॉक्स में, जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें और खोज उपकरण पर क्लिक करें।
    नोट: GeneMANIA वेब टूल का उपयोग TMEM200A से जुड़े 20 जीन को खोजने के लिए किया गया था।

14. कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण

  1. txt फ़ाइल स्वरूप में संवर्धन के लिए विश्लेषण किया जा जीन के प्रतीक आईडी सहेजें.
  2. R कोड (symbolidR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां उपरोक्त txt फ़ाइल उस लाइन पर स्थित है जहां सेटडब्ल्यूडी आर कोड में स्थित है।
  3. R सॉफ्टवेअर उघडा आणि सुधारित R कोड (symbolidR) चालवा. इन जीनों के प्रतीक आईडी को "ऑर्ग" के माध्यम से एंट्रेज़आईडी में परिवर्तित करें। Hs.eg.db" पैकेज। id.txt फ़ाइल प्राप्त करें।
  4. R कोड (GOR आणि KEGGR) उघडा आणि त्या पाथ कॉपी आणि पेस्ट करा जेथे id.txt file त्यांच्या लाइनवर स्थित आहे जेथे सेटवड R कोडमध्ये अवस्थित आहे.
  5. R सॉफ्टवेअर उघडा आणि सुधारित R कोड (GOR आणि KEGGR) चालवा. इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, पैकेज "clusterProfiler," "org" द्वारा GO और KEGG संवर्धन के लिए इन जीनों का विश्लेषण करें। Hs.eg.db," और "एनरिचप्लॉट" और पैकेज "gglot2" का उपयोग करके संवर्धन परिणामों को प्लॉट करें।

15. जीन गतिविधि में अंतर का विश्लेषण

नोट: प्रत्येक कैंसर के नमूने में TMEM200A स्कोरिंग ssGSEA (एकल नमूना जीन सेट संवर्धन विश्लेषण)27का उपयोग कर गणना की गई थी, और विभिन्न कैंसर के लिए कैंसर और स्वस्थ ऊतकों में TMEM200A जीन गतिविधि के अंतर विश्लेषण किया गया था.

  1. चरण 1.7 में डाउनलोड किए गए 33 ट्यूमर प्रकारों के आरएनए-सीक्यू डेटा के आधार पर, सभी डाउनलोड की गई फ़ाइलों को अनज़िप करें और उन्हें एक एकीकृत फ़ोल्डर में रखें।
  2. merge.txt फ़ाइल को उपरोक्त फ़ोल्डर में रखें।
    नोट: बायोवॉल्फ (www.biowolf.cn) से merge.txt फ़ाइल में डेटा में कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) डेटाबेस में सभी ट्यूमर में सभी रोगियों के लिए जीन अभिव्यक्ति शामिल है।
  3. R कोड (ssGSEAR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां उपरोक्त फ़ोल्डर उस लाइन पर स्थित है जहां सेट आर कोड में स्थित है।
  4. वह रेखा लें जहां जीन नाम R कोड (ssGSEAR) में है और जीन आईडी (TMEM200A) दर्ज करें।
  5. R सफ्टवेयर खोल्नुहोस् र संशोधित R कोड (ssGSEAR) चाल्नुहोस्। जीन गतिविधि के लिए स्कोरिंग फ़ाइल प्राप्त करें: scores.txt।
    नोट: ssGSEA एल्गोरिथ्म के साथ, हम पहले merge.txt फ़ाइल में प्रदान किए गए डेटा के अनुसार जीन के बीच सहसंबंध गुणांक के आधार पर एक जीन सेट फ़ाइल का निर्माण करते हैं और फ़ाइल से लक्ष्य जीन (TMEM200A) के साथ उच्च सहसंबंध वाले जीन की पहचान करते हैं। फिर, उच्च सहसंबंध वाले जीन TMEM200A के सक्रिय जीन के रूप में एकीकृत होते हैं, और अंत में, हम प्रत्येक नमूने में सक्रिय जीन का स्कोरिंग प्राप्त करते हैं।
  6. R कोड (scoreDiffR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां scores.txt फ़ाइल उस लाइन पर स्थित है जहां सेटडब्ल्यूडी आर कोड में स्थित है।
  7. R सॉफ़्टवेयर खोलें, संशोधित R कोड (scoreDiffR) चलाएँ, और "plyr," "reshape2," और "ggpubr" पैकेज के माध्यम से चित्र बनाएं।

16. क्लिनिकोपैथोलॉजिकल सहसंबंध और उत्तरजीविता रोग का निदान विश्लेषण

  1. UCSC Xena वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
  2. Xena लॉन्च करें टैब पर क्लिक करें।
  3. स्क्रीन के शीर्ष पर डेटा सेट टैब पर क्लिक करें।
  4. पृष्ठ पर होवर करें और TCGA पैन-कैंसर (PANCAN) टैब खोजने के लिए नीचे स्क्रॉल करें।
  5. इस पृष्ठ पर 129 समूहों और 1,571 डेटासेट से, TCGA पैन-कैंसर (PANCAN) टैब पर क्लिक करें।
  6. फेनोटाइप मेनू से, क्यूरेटेड क्लिनिकल डेटा टैब पर चुनें और क्लिक करें।
  7. डाउनलोड मेनू से, इसके संबंधित लिंक पर क्लिक करें।
    नोट: उपरोक्त लिंक पर टीसीजीए डेटाबेस से 33 कैंसर के लिए नैदानिक डेटा डाउनलोड करें।
  8. डाउनलोड की गई नैदानिक डेटा फ़ाइल को अनज़िप करें और xls फ़ाइल स्वरूप में अनज़िप की गई फ़ाइल खोलें।
  9. फ़ाइल में आवश्यक नैदानिक डेटा (चरण, आयु, रोग चरण और रोगी स्थिति) को व्यवस्थित और बनाए रखें, शेष अनावश्यक नैदानिक डेटा को हटा दें, और पूरी फ़ाइल को नैदानिक नाम बदलने के बाद एक txt प्रारूप फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  10. चरण 1.9 में प्राप्त singleGeneExp.txt के आधार पर, इस फ़ाइल को व्यवस्थित clinical.txt फ़ाइल के रूप में एक ही फ़ोल्डर में रखें।
  11. डाउनलोड किए गए नैदानिक डेटा को अनज़िप करें और singleGeneExp.txt और clinical.txt फ़ाइलों को उसी फ़ोल्डर में रखें जिसमें अनज़िप की गई नैदानिक फ़ाइलें हैं।
  12. R कोड (क्लिनिकलDiffR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां उपरोक्त फ़ोल्डर उस लाइन पर स्थित है जहां सेटडब्ल्यूडी आर कोड में स्थित है।
  13. R सॉफ़्टवेयर खोलें, संशोधित R कोड (क्लिनिकलDiffR) चलाएँ, और "ggpubr" पैकेज का उपयोग करके चित्र बनाएं।
  14. UCSC Xena वेबसाइट इंटरफेस पर जाएं।
  15. Xena लॉन्च करें टैब पर क्लिक करें।
  16. स्क्रीन के शीर्ष पर डेटा सेट टैब पर क्लिक करें।
  17. इस पृष्ठ पर 129 समूहों और 1,571 डेटासेट से, कुल 33 कैंसर जैसे GDC TCGA Acute Myeloid Leukemia (LAML), GDC TCGA एड्रेनोकोर्टिकल कैंसर (ACC), GDC TCGA पित्त नली कैंसर (CHOL), और बहुत कुछ के लिए टैब पर क्लिक करें।
  18. फेनोटाइप मेनू से, चुनें और उत्तरजीविता डेटा टैब पर क्लिक करें।
  19. डाउनलोड मेनू से, इसके संबंधित लिंक पर क्लिक करें।
  20. कंप्यूटर के डेस्कटॉप फ़ोल्डर में एक ही फ़ाइल में 33 विभिन्न कैंसर प्रकारों के लिए उत्तरजीविता डेटा के ज़िप संग्रह को अनपैक करें।
  21. चरण 1.9 में प्राप्त singleGeneExp.txt फ़ाइल के रूप में एक ही फ़ोल्डर में अनज़िप किए गए उत्तरजीविता डेटा रखें।
  22. R कोड (preOSR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां उपरोक्त फ़ोल्डर उस लाइन पर स्थित है जहां सेट डब्ल्यू आर कोड में स्थित है।
  23. R सॉफ्टवेअर उघडा आणि मॉडिफाइड R कोड (preOSR) चालवा. पैन-कैंसर में TMEM200A के अस्तित्व के बारे में डेटा फ़ाइल प्राप्त करने के लिए "लिम्मा" पैकेज के माध्यम से गणना करें: expTime.txt।
  24. R कोड (OSR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां expTime.txt फ़ाइल उस लाइन पर स्थित है जहां सेटडब्ल्यूडी आर कोड में स्थित है।
  25. R सॉफ्टवेअर उघडा आणि सुधारित R कोड (OSR) चालवा. expTime.txt फ़ाइल में डेटा के आधार पर "उत्तरजीविता" और "सर्वमिनर" पैकेज का उपयोग करके KM विश्लेषण करें और पैन-कैंसर में TMEM200A के लिए उत्तरजीविता घटता को प्लॉट करें।

17. वन भूखंड निर्माण के साथ Univariate और बहुभिन्नरूपी कॉक्स प्रतिगमन विश्लेषण

  1. R कोड (COXR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां हमें 16.23 से expTime.txt फ़ाइल मिली है, उस लाइन पर स्थित है जहां सेटडब्ल्यूडी आर कोड में स्थित है।
  2. R सॉफ्टवेअर उघडा आणि सुधारित R कोड (COXR) चालवा. expTime.txt फ़ाइल में डेटा के आधार पर, विभिन्न कैंसर में TMEM200A के एक अभिन्नतावादी-वन भूखंड की साजिश रचने के लिए "उत्तरजीविता," "सर्वमिनर," और "फॉरेस्टप्लॉट" पैकेज का उपयोग करके अपरिवर्तनीय सीओएक्स प्रतिगमन विश्लेषण करें।
  3. चरण 16.23 से expTime.txt फ़ाइल डालें और चरण 16.10 से clinical.txt एक ही फ़ोल्डर में रखें।
  4. आर कोड (मल्टीकॉक्सआर) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां चरण 16.23 से expTime.txt फ़ाइल वाला फ़ोल्डर और चरण 16.10 से clinical.txt फ़ाइल उस लाइन पर स्थित है जहां सेटडब्ल्यूडी आर कोड में स्थित है।
  5. आर सॉफ्टवेयर खोलें और संशोधित आर कोड (मल्टीकॉक्सआर) चलाएं। expTime.txt और clinical.txt फाइलों में डेटा के आधार पर विभिन्न कैंसर में TMEM200A के बहुभिन्नरूपी वन भूखंड को प्लॉट करने के लिए "उत्तरजीविता" और "सर्वमिनर" पैकेज का उपयोग करके एक बहुभिन्नरूपी सीओएक्स प्रतिगमन विश्लेषण करें।

18. TMEM200A अभिव्यक्ति और नैदानिक विशेषताओं के आधार पर गैस्ट्रिक कैंसर का पूर्वानुमान मॉडल

  1. चरण 16.10 से clinical.txt फ़ाइल और चरण 16.23 से expTime.txt फ़ाइल को एक ही फ़ोल्डर में रखें।
  2. R कोड (NomoR) खोलें और उस पथ को कॉपी और पेस्ट करें जहां उपरोक्त txt फ़ाइल उस लाइन पर स्थित है जहां सेट आर कोड में स्थित है।
  3. R सॉफ्टवेअर उघडा आणि सुधारित R कोड (NomoR) चालवा. रोगी के अस्तित्व की भविष्यवाणी करने के लिए एक रोगनिरोधी मॉडल का निर्माण करने के लिए जीसी और नैदानिक डेटा में अभिव्यक्ति डेटा TMEM200A लिए सॉफ़्टवेयर पैकेज "उत्तरजीविता," "रेगप्लॉट," और "आरएमएस" का उपयोग करें।

19. सेल संस्कृति और TMEM200A के siRNA अभिकर्मक

नोट: मानव स्टैड एचजीसी -27 कोशिकाओं, एसजीसी -7901 कोशिकाओं, और मानव गैस्ट्रिक म्यूकोसल उपकला जीईएस -1 कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें), पुनर्जीवित, रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 पूर्ण माध्यम (10% नवजात भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन मिश्रण युक्त), और 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत सेल संस्कृति इनक्यूबेटर। संस्कृति का माध्यम हर 2-3 दिनों में बदल दिया गया था। अच्छी वृद्धि की स्थिति में कोशिकाओं को (2-3) × 105 कोशिकाओं के अनुसार छह-अच्छी प्लेटों में टीका लगाया गया था।

  1. सबसे पहले, तीन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब लें और प्रत्येक ट्यूब में 8 माइक्रोन ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक (सामग्री की टी सक्षम देखें) और 200 माइक्रोन बेसल माध्यम जोड़ें। फिर, क्रमशः प्रत्येक ट्यूब में SiRNA1, SiRNA2, और SiRNA3 के 4 माइक्रोग्राम जोड़ें।
    नोट: TMEM200A दस्तक के लिए, siRNA डिजाइन और ( सामग्री की तालिकादेखें) खरीदा गया था.
  2. तीन microcentrifuge ट्यूबों में अच्छी तरह से मिश्रण मिक्स और 6 अच्छी तरह से थाली के तीन कुओं में से प्रत्येक को जोड़ें. मिश्रण को समान रूप से वितरित करने के लिए 6-अच्छी प्लेट को धीरे से हिलाएं। तीन कुओं को लेबल करें जहां मिश्रण को SiRNA-1, SiRNA-2, और SiRNA-3 के रूप में जोड़ा गया था।
  3. जब कोशिकाओं को 4-6 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया है, तो 6-अच्छी तरह से प्लेट में तीन उप-कुओं में माध्यम के आधे हिस्से को बदलें।
    नोट: पूर्ण माध्यम के आधे हिस्से को प्रतिस्थापित करते समय, मूल पूर्ण माध्यम के आधे हिस्से को महाप्राण करें और ताजा पूर्ण माध्यम के आधे हिस्से से फिर से भरें।
  4. चौबीस से 48 घंटे बाद में, TMEM200A एसआईआरएनए-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को प्रयोगात्मक समूह और अट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के रूप में नकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में उपयोग करें। कोशिकाओं पर अभिकर्मक के प्रभाव का आकलन करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर, अनुभाग 20 देखें) करें।

20. मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

  1. प्रत्येक उपसमूह में सेल संस्कृति माध्यम त्यागें और धीरे फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  2. आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके कुल आरएनए को अलग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. आरएनए एकाग्रता का अनुमान लगाएं और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके आरएनए के 1 माइक्रोग्राम के साथ सीडीएनए को संश्लेषित करें।
  4. प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 माइक्रोन में सीडीएनए के 10 गुना कमजोर पड़ने पर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) करें, जिसमें जीएपीडीएच (मानकीकरण के लिए), TMEM200A ( सामग्री की तालिकादेखें), और क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के लिए मानव-विशिष्ट फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर शामिल हैं, रीयल-टाइम पीसीआर परख प्रणाली का उपयोग करना।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में करें।
  5. निम्नलिखित qPCR प्रतिक्रिया शर्तों का प्रयोग करें: आरंभीकरण, 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; विकृतीकरण, 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; एनीलिंग, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; और विस्तार, 10 एस के लिए 80 डिग्री सेल्सियस; विकृतीकरण, एनीलिंग और एक्सटेंशन 40X दोहराएं। 28 2-ΔΔCt तकनीक का उपयोग कर प्रत्येक जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति का निर्धारण.
  6. जैविक triplicates प्राप्त करने के लिए कम से कम तीन बार प्रयोगों दोहराएँ.

21. प्रासंगिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के पश्चिमी धब्बा का पता लगाना

  1. प्रत्येक उपसमूह में सेल संस्कृति माध्यम त्यागें और धीरे पीबीएस के 2 x 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  2. बर्फ पर कोशिकाओं वाले 6-अच्छी प्लेटों को ठंडा करें और प्रीकूल्ड रेडियो इम्यून वर्षा परख (आरआईपीए) लाइसिस बफर (150 एमएम एनएसीएल, 0.1% ट्राइटन एक्स-100, 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 0.1% एसडीएस, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, और हौसले से जोड़ा गया प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल) के 150 माइक्रोन जोड़ें। lysis 10 मिनट के लिए बर्फ पर आगे बढ़ने की अनुमति दें.
  3. एक प्लास्टिक सेल खुरचनी का उपयोग, पकवान से पालन कोशिकाओं को हटाने और नाजुक एक microcentrifuge ट्यूब है कि precooled किया गया है में सेल समाधान हस्तांतरण.
  4. सेल लाइसेट को 1.5 × 10 4ग्राम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला को एक नई 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन सामग्री निर्धारित करने के लिए बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करें।
  6. 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) जेल पर प्रत्येक नमूने से 30 ग्राम प्रोटीन लोड करें और 0.5 घंटे के लिए 80 वी पर चलाएं और उसके बाद 120 वी पर 1.5 घंटे चलाएं।
  7. जेल से प्रोटीन को 1-1.5 घंटे के लिए 300 एमए के वोल्टेज पर 45 माइक्रोन पॉलीविनाइलिडीन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें।
  8. PVDF झिल्ली को एक प्रकार के बरतन पर रखने और इसे 3 x 5 मिनट के लिए मिलाते हुए, प्रोटीन पक्ष (जेल पक्ष) के साथ उपयुक्त कंटेनर में Tween 20 (TBST, 20 मिमी Tris-HCl, पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, और 0.1% ट्वीन 20) के साथ Tris-बफर खारा जोड़ें।
  9. अवरुद्ध बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) में झिल्ली रखें और कमरे के तापमान पर 0.5 घंटे के लिए इसे सेते हैं.
  10. 3 x 10 मिनट के लिए टीबीएसटी के साथ झिल्ली धो लें।
  11. फॉस्फो-एकेटी (पी-एकेटी; 1:1,000), कुल एकेटी 1:1,000, ई-कैडरिन (ई-सीए; 1:1,000), एन-कैडरिन (एन-सीए; 1:1,000), विमेंटिन 1:1,000, घोंघा 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच; 1:1,000), रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  12. 3 x 10 मिनट के लिए झिल्ली धो लें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक खरगोश या माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 5,000) के साथ झिल्ली को सेते हैं।
  13. 30 एस के लिए ईसीएल सब्सट्रेट के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को इनक्यूबेट करें और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके सिग्नल का पता लगाएं।

22. सीसीके -8 परख

  1. बीज मानव STAD HGC-27 कोशिकाओं में अच्छी वृद्धि की स्थिति में 96 अच्छी तरह से प्लेटों.
  2. जब कोशिका घनत्व 60-70% तक पहुँच जाता है, तो कोशिकाओं को TMEM200A siRNA (चरण 19.3 के रूप में) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करें।
  3. 5 × 10 3/अच्छी तरह से (एक सेल काउंटर का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती) के एक सेल घनत्व पर 96 अच्छी तरह से प्लेटों में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं बीज, नेकां और TMEM200A siRNA समूहों (प्रत्येक समूह में तीन प्रतिकृति कुओं के साथ) में विभाजित, और 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन करते हैं.
  4. 0, 24, 48, 72 और 96 घंटे के बाद सीसीके -8 अभिकर्मक जोड़ें और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक बहुक्रियाशील एंजाइम लेबलर का उपयोग करके अवशोषण (450 एनएम) को मापें।

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Representative Results

विभिन्न कैंसर में TMEM200A की अभिव्यक्ति
जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, हमने पहले विभिन्न डेटाबेस के माध्यम से विभिन्न कैंसर में TMEM200A के अंतर अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण किया। TMEM200A अभिव्यक्ति को कोलेजनोकार्सिनोमा (CHOL), सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSC), रीनल क्लियर सेल कार्सिनोमा (KIRC), रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (LIHC), STAD, और थायरॉयड कार्सिनोमा (THCA) में केवल TCGA डेटा के आधार पर आसन्न सामान्य ऊतकों की तुलना में ऊंचा किया गया था। हालांकि TMEM200A, मूत्राशय यूरोपीथेलियल कार्सिनोमा (बीएलसीए), सर्वाइकल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और सर्वाइकल एडेनोकार्सिनोमा (सीईएससी), ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म (जीबीएम), किडनी क्रोमोफोब (केआईसीएच), फेफड़े के स्क्वैमस कार्सिनोमा (एलयूएससी), फियोक्रोमोसाइटोमा और पैरागैंग्लियोमा (पीसीपीजी), रेक्टल एडेनोकार्सिनोमा (रीड), और गर्भाशय कॉर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (यूसीईसी)(चित्रा 2ए)में अभिव्यक्ति में कमी आई है। TIMER2.0 डेटाबेस में, CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC और STAD में TMEM200A अभिव्यक्ति बढ़ गई। इसके अलावा, बीएलसीए, सीईएससी, जीबीएम, किच, एलयूएससी, पीसीपीजी, रीड, त्वचा त्वचीय मेलेनोमा (एसकेसीएम), और यूसीईसी(चित्रा 2बी)में TMEM200A अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई।

दो डेटाबेस के परिणामों की तुलना करके, हमने पाया कि TMEM200A की पैन-कैंसर अभिव्यक्ति प्रत्येक डेटाबेस में समान थी। हमने टीसीजीए डेटाबेस से कैंसर के साथ 33 रोगियों के नैदानिक अनुवर्ती डेटा और आरएनए अनुक्रमण डेटा प्राप्त किया, एसएसजीएसईए विश्लेषण का उपयोग करके प्रत्येक कैंसर के नमूने में स्कोरिंग TMEM200A गणना की, और फिर ट्यूमर में जीन गतिविधि TMEM200A गणना की और कई ट्यूमर में सामान्य ऊतक। हमने पाया कि TMEM200A जीबीएम, एचएनएससी, किडनी केआईआरसी, और टीएचसीए(चित्रा 2सी)में अत्यधिक व्यक्त किया गया था; इसलिए, प्रत्येक ट्यूमर ऊतक में TMEM200A की जीन गतिविधि को स्थान दिया गया था। यह पाया गया कि TMEM200A की जीन गतिविधि केआईआरसी में सबसे अधिक और यूवील मेलेनोमा (यूवीएम) (चित्रा 2डी) में सबसे कम थी। मानव ऊतकों में TMEM200A अभिव्यक्ति के स्तर के बाद के एचपीए डेटाबेस मूल्यांकन से पता चला है कि TMEM200A अभिव्यक्ति का स्तर अधिकांश सामान्य ऊतकों में कम था लेकिन अधिवृक्क प्रांतस्था, मलाशय, एंडोमेट्रियम, और चिकनी मांसपेशियों(चित्रा 2ई)में उच्च था।

सामान्य ऊतक सेल लाइनों में, ग्रैनुलोसा कोशिकाओं, द्विध्रुवी कोशिकाओं, कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं, एंडोमेट्रियल स्ट्रोमल कोशिकाओं और टी कोशिकाओं जैसी कुछ सेल लाइनों ने TMEM200A की उच्च अभिव्यक्ति दिखाई, जबकि TMEM200A अभिव्यक्ति अधिकांश अन्य सेल लाइनों(चित्रा 2एफ)में कम थी। हमने प्रोटीन स्तर पर TMEM200A की अभिव्यक्ति को देखने के लिए एचपीए डेटाबेस में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) डेटा की भी जांच की। धुंधला और तीव्रता के बारे में डेटा सामान्य ऊतकों (चित्रा 2G)के साथ तुलना में कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी), फेफड़ों के कैंसर (LUAD), यकृत कैंसर (LIHC), स्तन कैंसर (BRCA), और प्रोस्टेट कैंसर (PRAD) ऊतकों में TMEM200A के बहुत अधिक से अधिक स्पष्ट अभिव्यक्ति स्तर का पता चला. इन निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि TMEM200A विभिन्न कैंसर में व्यापक रूप से व्यक्त किया गया था और विभिन्न ट्यूमर में विभिन्न तंत्रों के माध्यम से कैंसर के विकास को प्रभावित किया था।

क्लिनिकोपैथोलॉजिकल संबंध और उत्तरजीविता रोग का निदान
33 मानव विकृतियों के लिए, हमने UCSC Xena डेटाबेस वेबसाइट से TCGA पैन-कैंसर (PanCan) कोहोर्ट में जानकारी और नैदानिक डेटा एकत्र किया और PanCan में TMEM200A अभिव्यक्ति और उम्र, पैथोलॉजिकल ग्रेड, क्लिनिकोपैथोलॉजिकल चरण और रोगी के अस्तित्व की स्थिति के बीच संबंध की जांच की। इस अध्ययन से पता चला कि, छह कैंसर में, TMEM200A की अभिव्यक्ति क्लिनिकोपैथोलॉजिकल चरण से जुड़ी थी, जिसमें बीएलसीए, आक्रामक स्तन कार्सिनोमा (बीआरसीए), एसोफेजियल कार्सिनोमा (ईएससीए), केआईआरपी, एसकेसीएम, और वृषण कार्सिनोमा (टीजीसीटी) (चित्रा 3ए)शामिल हैं। उम्र छह ट्यूमर के साथ सहसंबद्ध थी, जिसमें आक्रामक बीआरसीए, जीबीएम, तीव्र मायलोइड ल्यूकेमिया (एलएएमएल), एसकेसीएम, थाइमिक कार्सिनोमा (टीवाईएम), और एंडोमेट्रियल कैंसर (यूसीईसी)(चित्रा 3बी)शामिल थे। पैथोलॉजिकल ग्रेड छह ट्यूमर से जुड़ा था, जिसमें एसोफेजियल कार्सिनोमा (ईएससीए), एचएनएससी, केआईआरसी, मस्तिष्क के निम्न-ग्रेड ग्लियोमा (एलजीजी), अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा (पीएएडी), और एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (यूसीईसी)(चित्रा 3सी)शामिल थे। जीवित रहने की स्थिति एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा (एसीसी), बीएलसीए, केआईआरसी, पीसीपीजी, और यूवील मेलेनोमा (यूवीएम)(चित्रा 3डी)सहित पांच ट्यूमर से जुड़ी थी।

हमने ओएस, डीएसएस, पीएफआई और डीएफआई पर विभिन्न कैंसर के लिए अध्ययन किया, जिसमें TMEM200A अभिव्यक्ति और रोग का निदान के बीच संबंध के बारे में अधिक जानने के लिए एक औसत समूह सीमा के साथ एक तरफा कॉक्स प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग किया गया। ओएस विश्लेषण के परिणामों से पता चला कि, चार ट्यूमर के बीच, उच्च TMEM200A अभिव्यक्ति का चार ट्यूमर में ओएस रोग का निदान पर अधिक प्रभाव पड़ा, जिसमें एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा (एसीसी) (पी = 0.037), बीएलसीए (पी = 0.036), तीव्र मायलोइड ल्यूकेमिया (एलएएमएल) (पी = 0.011), और जीसी (एसटीएडी) (पी = 0.005)। इसके विपरीत, उच्च TMEM200A अभिव्यक्ति में केआईआरसी (पी < 0.001), केआईआरपी (पी = 0.020), मस्तिष्क के निम्न-ग्रेड ग्लियोमा (एलजीजी) (पी = 0.042), पीसीपीजी (पी = 0.002), और त्वचीय मेलेनोमा (एसकेसीएम) (पी = 0.043) (चित्रा 3ई, एफ) सहित पांच ट्यूमर में ओएस के लिए बेहतर पूर्वानुमान था। डीएसएस के लिए, उच्च TMEM200A अभिव्यक्ति में दो ट्यूमर प्रकारों में खराब रोग का निदान था, जिसमें एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा (एसीसी) (पी = 0.026) और बीएलसीए (पी = 0.015) शामिल थे। उच्च TMEM200A अभिव्यक्ति में केआईआरसी (पी < 0.001), केआईआरपी (पी = 0.001), मस्तिष्क के निम्न-ग्रेड ग्लियोमा (एलजीजी) (पी = 0.025), और पीसीपीजी (पी = 0.007) (चित्रा 3जी) सहित चार ट्यूमर प्रकारों में बेहतर पूर्वानुमान था। इसके अलावा, पीएफआई के लिए, उच्च TMEM200A अभिव्यक्ति में तीन ट्यूमर प्रकारों में खराब रोग का निदान था, जिसमें एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा (एसीसी) (पी = 0.007), बीएलसीए (पी = 0.040), और यूवील मेलेनोमा (यूवीएम) (पी = 0.020) शामिल हैं। उच्च TMEM200A अभिव्यक्ति में केआईआरसी (पी < 0.001) और मस्तिष्क के निम्न-ग्रेड ग्लियोमा (एलजीजी) (पी = 0.044) (चित्रा 3एच) सहित दो ट्यूमर प्रकारों में बेहतर रोग का निदान था। डीएफआई में, TMEM200A की उच्च अभिव्यक्ति में एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा (एसीसी) (पी = 0.044) (चित्रा 3I) में एक खराब रोग का निदान था।

इसके बाद, हमने मल्टी-कॉक्स प्रतिगमन विश्लेषण के लिए कई ट्यूमर (केआईआरसी और केआईआरपी) का चयन किया। परिणामों से पता चला कि TMEM200A अन्य नैदानिक कारकों (चित्रा 3 जे और के) की तुलना में कैंसर रोगियों की जीवित रहने की दर को व्यक्तिगत रूप से प्रभावित कर सकता है। इन परिणामों से पता चला कि TMEM200A कैंसर के रोगियों के अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए विभिन्न कैंसर में एक स्वतंत्र बायोप्रोग्नोस्टिक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण
एपिजेनेटिक परिवर्तनों में से एक जिसने अधिकतम ध्यान आकर्षित किया है वह डीएनए मेथिलिकरण29 है। यह सुझाव दिया गया है कि एपिजेनेटिक परिवर्तन का एक प्रकार, डीएनए मेथिलिकरण, ट्यूमर के विकास पर महत्वपूर्ण प्रभावपड़ता है 30. इसलिए, स्मार्ट डेटाबेस का उपयोग करके, हमने सामान्य और कैंसर के ऊतकों में TMEM200A के डीएनए मेथिलिकरण स्तर का मूल्यांकन किया। पीएएडी और पीआरएडी ऊतकों में सामान्य ऊतकों की तुलना में TMEM200A के डीएनए मेथिलिकरण का उच्च स्तर था। हालांकि, TMEM200A सामान्य ऊतकों(चित्रा 4ए)की तुलना में सीओएडी, केआईआरसी, केआईआरपी, एलआईएचसी, एलयूएससी, रीड, टीएचसीए और यूसीईसी में डीएनए मेथिलिकरण का स्तर कम था। TMEM200A के डीएनए मेथिलिकरण स्तर यूएएलकैन डेटाबेस (चित्रा 4बी) के आधार पर केआईआरपी, पीआरएडी, पीसीपीजी और टीवाईएचएम में टीसीजीए डेटाबेस में काफी अधिक थे, लेकिन बीएलसीए, बीआरसीए, चोल, सीओएडी, सीईएससी, ईएससीए, जीबीएम, एचएनएससी, केआईआरसी, एलआईएचसी, एलयूएडी, एलयूएससी, पीएएडी, रीड, टीजीसीटी, एसटीएडी, टीएचसीए और यूसीईसी में नहीं। एलयूएससी, पीएएडी, रीड, टीजीसीटी, एसटीएडी, टीएचसीए और यूसीईसी(चित्रा 4सी)में TMEM200A का मिथाइलेशन स्तर काफी कम हो गया। TMEM200A और डीएनए मेथिलिकरण और क्लिनिकोपैथोलॉजिकल कारकों के अभिव्यक्ति स्तर के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए, हमने फिर से स्मार्ट डेटाबेस का उपयोग किया और पाया कि बीएलसीए, एचएनएससी, एलयूएडी और एसटीएडी में TMEM200A का डीएनए मेथिलिकरण स्तर रोग चरण(चित्रा 4डी)के साथ बदल गया। नैदानिक कारक उपरोक्त ट्यूमर में TMEM200A के डीएनए मेथिलिकरण के स्तर को प्रभावित करते हैं।

जीन उत्परिवर्तन विश्लेषण
ट्यूमर के विकास के कारणों में से एक जीन उत्परिवर्तन31 का संचय है. इसलिए, दैहिक TMEM200A उत्परिवर्तन की आवृत्ति का विश्लेषण cBioPortal डेटाबेस का उपयोग करके पैन-कैंसर नैदानिक नमूनों में TMEM200A उत्परिवर्तन की आवृत्ति का आकलन करके किया गया था। TMEM200A कई कैंसर में उत्परिवर्तित होता है, जैसे कि फेफड़ों का कैंसर, गर्भाशय एंडोमेट्रियोइड कार्सिनोमा, मेलेनोमा, एसोफैगोगैस्ट्रिक कैंसर, हड्डी का कैंसर, गर्भाशय ग्रीवा का कैंसर, हेपेटोबिलरी कैंसर, परिपक्व बी-सेल लिंफोमा, बीआरसीए, एंडोमेट्रियल कैंसर, डिम्बग्रंथि के कैंसर, भ्रूण ट्यूमर, अग्नाशय का कैंसर, सिर और गर्दन का कैंसर, सीआरसी, ग्लियोमा, गैर-छोटे सेल फेफड़ों का कैंसर, नरम ऊतक सार्कोमा, और अज्ञात प्राथमिक का कैंसर(चित्र 5ए)चित्र 5ए(चित्र 5ए)). इसके अलावा, डीएनए परिवर्तन से प्रोटीन स्तर पर संरचनात्मक या अमीनो एसिड परिवर्तन हो सकते हैं। चित्रा 5 बी TMEM200A की 3 डी संरचना को दर्शाता है। cBioPortal डेटाबेस का उपयोग करते हुए, हमें TMEM200A के अमीनो एसिड में उत्परिवर्तन स्थल मिले; गलत उत्परिवर्तन उत्परिवर्तन का सबसे प्रचलित रूप था (चित्रा 5 सी)।

हमने उत्परिवर्तन साइटों की सटीकता को सत्यापित करने के लिए सेंगरबॉक्स 3.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया और पहले की तरह ही परिणाम प्राप्त किए। गलत उत्परिवर्तन TMEM200A में उत्परिवर्तन का सबसे लगातार रूप है और वे एसकेसीएम (चित्रा 5डी) में 7.8% के रूप में अक्सर हो सकते हैं। एक गलत उत्परिवर्तन एक उत्परिवर्तन है जिसमें एक अमीनो एसिड के लिए एक कोडन कोडिंग एक आधार प्रतिस्थापन से गुजरती है और दूसरे अमीनो एसिड के लिए कोडन कोडिंग बन जाती है, जिसके परिणामस्वरूप अमीनो एसिड प्रकार और पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के अनुक्रम में परिवर्तन होता है। गलत उत्परिवर्तन का परिणाम आमतौर पर यह होता है कि पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला अपने मूल कार्य को खो देती है। कई प्रोटीन असामान्यताएं गलत उत्परिवर्तन के कारण होती हैं, जो एक सामान्य प्रकार का ट्यूमर उत्परिवर्तन है। यह पाया गया है कि गलत उत्परिवर्तन प्रोटीन की स्थिरता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और उत्परिवर्तन की उपस्थिति प्रोटीन32 के बीच बाध्यकारी संबंध पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है, प्रोटीन और आसपास के सहसंबंधी मैक्रोमोलेक्यूल्स33 के बीच बातचीत को बदलना।

इस प्रकार, गलत उत्परिवर्तन सबसे अधिक संभावना विभिन्न कैंसर में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 200A के जैविक कार्य को प्रभावित करते हैं। जीन उत्परिवर्तन और कैंसर के रोगियों के नैदानिक अस्तित्व के पूर्वानुमान TMEM200A बीच संबंध की भी जांच की गई। TMEM200A-उत्परिवर्तित समूह की तुलना में ओएस की संभावना बढ़ गई, लेकिन रोग मुक्त समूह (चित्रा 5ई) में नहीं। जीन सहसंबंधों के अध्ययन से पता चला है कि TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244, और SLC18B1 जीन है कि TMEM200A (चित्रा 5F) के साथ सह-उत्परिवर्तित में से थे. हम जीसी में TMEM200A उत्परिवर्तन के बारे में अधिक जानने के लिए कॉस्मिक डेटाबेस के माध्यम से कई उत्परिवर्तन प्रकारों और एकल-न्यूक्लियोटाइड विविधताओं (एसएनवी) की पहचान करने में सक्षम थे। गलत प्रतिस्थापन की आवृत्ति उच्चतम (38.86%) (चित्रा 5 जी) थी, और एसएनवी डेटा से पता चला है कि एसटीएडी में सबसे आम एसएनवी जी>ए (31.73%) थे, इसके बाद सी>टी (26.35%) और जी>टी (11.73%) (चित्रा 5एच)।

कैंसर में TMEM200A का एकल-कोशिका विश्लेषण
हमने TISCH (ट्यूमर इम्यूनोलॉजी सिंगल सेल सेंटर) वेबसाइट का उपयोग करके विभिन्न एकल कोशिकाओं में TMEM200A अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण किया। TISCH ऑनलाइन टूल ने चित्र 6A में दिखाए गए हीट मैप में 65 डेटासेट और 28 सेल प्रकारों के लिए TMEM200A की अभिव्यक्ति प्रदर्शित की। निष्कर्षों से पता चला कि TMEM200A ज्यादातर सीडी 8+ टी कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट में व्यक्त किया गया था। GSE72056 डेटासेट, जिसमें मेटास्टैटिक त्वचीय मेलेनोमा (एसकेसीएम) वाले रोगियों की कोशिकाएं शामिल हैं, इस संबंध में उल्लेखनीय है। TMEM200A बी कोशिकाओं, सीडी 4 + टी लिम्फोसाइट्स, समाप्त सीडी 8 + टी कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, और एसकेसीएम माइक्रोएन्वायरनमेंट(चित्रा 6बी, सी)में अन्य सेल प्रकारों में व्यापक रूप से व्यक्त किया गया था। GSE146771 डेटासेट में, जिसमें सीआरसी के रोगियों की कोशिकाएं शामिल हैं, TMEM200A बी कोशिकाओं, सीडी 4 + टी लिम्फोसाइट्स, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, समाप्त सीडी 8 + टी कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स और सीआरसी माइक्रोएन्वायरमेंट (चित्रा 6 डी, ई) में अन्य सेल प्रकारों में व्यापक रूप से व्यक्त किया गया था। कैंसरएसईए डेटाबेस का उपयोग करके विशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं में TMEM200A की अभिव्यक्ति स्तर और कार्यात्मक स्थिति निर्धारित की गई थी(चित्र 6जी)। TMEM200A अभिव्यक्ति को ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एलयूएडी), क्रोनिक ग्रैनुलोसाइटिक ल्यूकेमिया (सीएमएल), सीआरसी, रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी), और यूवील मेलेनोमा (यूएम) सहित कैंसर की एक श्रृंखला में सेलुलर कार्यात्मक स्थिति के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध किया गया था। एंजियोजेनेसिस, एपोप्टोसिस, भेदभाव और सूजन सभी ट्यूमर कोशिकाओं के बहुमत में TMEM200A अभिव्यक्ति के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थे, जबकि डीएनए क्षति, डीएनए की मरम्मत, आक्रमण और चयापचय TMEM200A अभिव्यक्ति (चित्रा 6एफ) के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थे।

विभिन्न कैंसर में TMEM200A के कार्यात्मक और मार्ग संवर्धन विश्लेषण
हमने विभिन्न कैंसर(चित्रा 7ए)में TMEM200A के कार्य का पता लगाने के लिए जीजीआई नेटवर्क का उपयोग करके समान कार्यों के साथ TMEM200A और प्रोटीन के बीच लिंक की जांच की। जीनोमिक और प्रोटिओमिक जानकारी का विश्लेषण जीनमेनिया द्वारा लक्ष्य जीन की क्वेरी सूची का उपयोग करके किया जाता है। TMEM200A के समान काम करने वाले जीन का पता लगाकर, 40 प्रोटीन जो सीधे इस जीन के साथ बातचीत करते हैं, की खोज की गई थी। इन जीनों का सहसंबंध पीपीआई नेटवर्क(चित्रा 7बी)द्वारा दिखाया गया है। इसके बाद, TMEM200A से निकटता से संबंधित इन 20 जीनों के जीओ और केईजीजी संवर्धन विश्लेषण से पता चला कि इन आसन्न जीनों को ज्यादातर जीन साइलेंसिंग के आरएनए के नकारात्मक विनियमन में फंसाया गया था। केईजीजी विश्लेषण से पता चला कि TMEM200A रास्ते में प्रचुर मात्रा में था, जिसमें डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग और सेलुलर जीर्णता(चित्रा 7सी)शामिल थे। जीओ संवर्धन विश्लेषण से पता चला है कि, आणविक कार्य में, TMEM200A मुख्य रूप से कैल्शियम चैनलों और आरएनए (चित्रा 7डी) द्वारा जीन साइलेंसिंग के नकारात्मक विनियमन में प्रचुर मात्रा में था।

TMEM200A और प्रतिरक्षा घुसपैठ के बीच सहसंबंध विश्लेषण
हमने आगे TMEM200A और कैंसर प्रतिरक्षा के बीच संबंध को प्रदर्शित करने के लिए TMEM200A अभिव्यक्ति और प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के बीच संबंध की जांच की। हमने सेंगरबॉक्स 3.0 पैन-कैंसर डेटा का उपयोग करके CIBERSORT प्रतिरक्षा घुसपैठ विश्लेषण किया। परिणामों से पता चला कि पैन-कैंसर TMEM200A अभिव्यक्ति सीडी 8 + टी कोशिकाओं, सीडी 4 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, सहायक टी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, नियामक टी कोशिकाओं, मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, डेंड्राइटिक कोशिकाओं, ईोसिनोफिल, बेसोफिल और ग्रैनुलोसाइट्स (चित्रा 8ए)के साथ सहसंबद्ध थी। इसके बाद, हमने टीआईएसआईडीबी डेटाबेस का उपयोग करके TMEM200A अभिव्यक्ति और टीआईएल (ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स) के बीच संबंध को देखा, जो विभिन्न कैंसर प्रकारों (चित्रा 8बी) में TMEM200A अभिव्यक्ति और 28 टीआईएल बहुतायत के बीच घनिष्ठ संबंध दिखा रहा है। हमने मानव विकृतियों में TMEM200A अभिव्यक्ति और इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं के बीच सहसंबंध का आकलन करने के लिए टीआईएसआईडीबी डेटाबेस का उपयोग किया ताकि अधिक अच्छी तरह से जांच की जा सके कि इम्युनोमोड्यूलेटर और TMEM200A अभिव्यक्ति कैसे संबंधित थे। परिणामों से पता चला है कि TMEM200A अभिव्यक्ति का स्तर विभिन्न प्रकार के कैंसर(चित्रा 8सी)में इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों के साथ काफी सहसंबद्ध था। TMEM200A अभिव्यक्ति और कुछ इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों के बीच महत्वपूर्ण सहसंबंध वृषण कैंसर और यूएम(चित्रा 8डी-एफ)में पाए गए। हमने तब टीआईएसआईडीबी डेटाबेस(चित्रा 8जी,एच)का उपयोग करके इम्यूनोस्टिमुलेटरी कारकों और एमएचसी अणुओं के साथ TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध विश्लेषण किया। परिणामों से पता चला कि TMEM200A अभिव्यक्ति मूत्राशय, वृषण कार्सिनोमा, एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा, और यूएम(चित्रा 8आई-एल) के यूरोटेलियल कार्सिनोमा में चयनित इम्युनोस्टिममुलंट्स और एमएचसी अणुओं के साथ सहसंबद्ध थी। अगला कदम टीआईएसआईडीबी डेटाबेस में टीसीजीए पैनकैन कोहोर्ट में TMEM200A अभिव्यक्ति और प्रतिरक्षाविज्ञानी या आणविक उपप्रकारों के बीच संबंध की जांच करना था। हमने पाया कि नौ अलग-अलग कैंसर प्रकारों के प्रतिरक्षाविज्ञानी उपसमूह अलग-अलग TMEM200A व्यक्त किए गए, जिनमें बीएलसीए, यूवीएम, केआईआरसी, एलआईएचसी, एलयूएडी, एलयूएससी, पीआरएडी, टीजीसीटी और बीआरसीए(चित्रा 8एम)शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एचएनएससी, केआईआरपी, एलआईएचसी, पीसीपीजी, ओवी, और एलयूएससी सहित विविध आणविक उपसमूहों के साथ छह अलग-अलग कैंसर रूपों ने TMEM200A की चर अभिव्यक्ति प्रदर्शित की (चित्र 8एन)।

TMEM200A और इम्यूनोथेरेपी प्रतिक्रिया विश्लेषण
पीडी-1 / पीडी-एल 1 अवरोधकों की प्रभावशीलता टीएमबी के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध है, और ट्यूमर वाले कुछ रोगियों को इम्यूनोथेरेपी34 की प्रभावकारिता के लिए टीएमबी मार्करों का उपयोग करके कुछ हद तक भविष्यवाणी की जा सकती है। माइक्रोसेटेलाइट अस्थिरता (एमएसआई) दोषपूर्ण डीएनए बेमेल मरम्मत (एमएमआर) फ़ंक्शन का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला शब्द है जब माइक्रोसेटेलाइट प्रतिकृति गलतियों को तय नहीं किया जाता है और जमा होता है, माइक्रोसैटेलाइट्स35 की लंबाई या आधार संरचना को बदलता है। एमएसआई नैदानिक महत्व 36 का एक ट्यूमर मार्कर है. इस प्रकार हमने TMEM200A अभिव्यक्ति और टीएमबी या एमएसआई के बीच सहसंबंध की जांच करके इम्यूनोथेरेपी पर TMEM200A अभिव्यक्ति के प्रभाव का आकलन किया। निष्कर्षों ने THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP, और KIRC में TMEM200A अभिव्यक्ति और TMB के बीच पर्याप्त सकारात्मक सहसंबंध का प्रदर्शन किया, लेकिन TMEM200A अभिव्यक्ति UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM और BRCA(चित्रा 9A)के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थी। एमएसआई और TMEM200A अभिव्यक्ति टीजीसीटी में दृढ़ता से और अनुकूल रूप से जुड़ी हुई थी, जबकि TMEM200A अभिव्यक्ति यूसीईसी, एसटीएडी, एसकेसीएम, एलयूएससी, एलयूएडी, एचएनएससी, और सीएचओएल(चित्रा 9बी)में एमएसआई के साथ महत्वपूर्ण और नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थी। हमने आईसीबी की प्रभावशीलता की जांच करने के लिए बायोमार्कर के रूप में TMEM200A की क्षमता का भी आकलन किया। परिणामों से पता चला कि अकेले TMEM200A ने 25 आईसीबी उप-जनसंख्या में से 7 में 0.5 > एरिया अंडर कर्व (एयूसी) की सटीकता के साथ आईसीबी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी की थी। TMEM200A टी- और बी-सेल क्लोन की तुलना में अधिक भविष्य कहनेवाला मूल्य दिखाया, जिनमें से दोनों का मूल्य 5 था। हालांकि, TMEM200A के लिए मूल्य TIDE (11 ICB उप-जनसंख्या में AUC > 0.5), MSI स्कोर (11 ICB उप-जनसंख्या में AUC > 0.5), CD274 (15 ICB उप-जनसंख्या में AUC > 0.5), CD8 (17 ICB उप-जनसंख्या में AUC > 0.5), IFNG (16 ICB उप-जनसंख्या में AUC > 0.5), और Merck18 (17 ICB उपसमूहों में AUC > 0.5) (चित्र 9C). ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 और ICB_Hugo 2016_PD1 साथियों में खराब उत्तरजीविता पूर्वानुमान को उच्च TMEM200A अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध किया गया था। हालांकि, TMEM200A नॉकडाउन ने किर्नी 2018 T_PD1 और पैन 2018 ओटी 1 (चित्रा 9 डी) के औसत समूह में लिम्फोसाइट-मध्यस्थता ट्यूमर-हत्या शक्ति को बढ़ाया।

विभिन्न कैंसर में TMEM200A का जीएसईए संवर्धन विश्लेषण
हमने TMEM200A से संबंधित कैंसर विशेषताओं का पता लगाने के लिए 32 विकृतियों में TMEM200A उच्च-अभिव्यक्ति और TMEM200A कम-अभिव्यक्ति उपसमूहों के बीच डीईजी का उपयोग किया। हमने प्राथमिक इम्यूनोडेफिशिएंसी, आरआईजी (रेटिनोइक एसिड-इंड्यूसिबल जीन) -आई-जैसे रिसेप्टर सिग्नलिंग मार्ग, और पैन-कैंसर में TMEM200A अभिव्यक्ति के बीच एक पर्याप्त सहसंबंध की खोज की, विशेष रूप से बीएलसीए, सीओएडी, किच, जीबीएम, एलयूएससी, एलयूएडी, एमईएसओ, रीड, एसएआरसी, और एसकेसीएम (चित्रा 10)। वायरल साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन राइबोन्यूक्लिक एसिड का पता RIG-I-जैसे रिसेप्टर सिग्नलिंग मार्ग द्वारा लगाया जाता है। RIG-I-जैसे रिसेप्टर्स कुछ इंट्रासेल्युलर जंक्शन प्रोटीन को उलझाकर NF-kB सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करके शरीर में विभिन्न प्रकार के भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन को प्रभावित कर सकते हैं। नतीजतन, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 200A (TMEM200A) RIG-I-जैसे रिसेप्टर द्वारा इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की भर्ती में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। इन निष्कर्षों ने TMEM200A अभिव्यक्ति और प्रतिरक्षाविज्ञानी घुसपैठ के बीच एक मजबूत सहसंबंध निहित किया। इसके अतिरिक्त, जीएसईए संवर्धन विश्लेषण से पता चला है कि पैन-कैंसर TMEM200A अभिव्यक्ति को केमोकाइन सिग्नलिंग, सेल आसंजन, साइटोकिन रिसेप्टर कनेक्शन, सेल झिल्ली संवेदन मार्ग, और ऑटोफैगी नियंत्रण(चित्रा 10)के साथ सहसंबद्ध किया गया था। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन कैल्शियम जलाशयों से कोशिका में कैल्शियम आयनों के प्रवेश को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के अलावा ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को प्रभावित करने के लिए आसंजन अणुओं के रूप में कार्य कर सकते हैं। इसलिए, जीएसईए संवर्धन विश्लेषण से प्राप्त परिणाम कई शारीरिक प्रक्रियाओं में TMEM200A की भागीदारी के कारण हो सकते हैं, जिसमें सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों की सक्रियता, प्लाज्मा झिल्ली आयन चैनलों का गठन और सेल केमोटैक्सिस, आसंजन, एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी9 का विनियमन शामिल है।

हमने लिंक्डओमिक्स डेटाबेस से TMEM200A के साथ सकारात्मक और नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध शीर्ष 50 एसटीएडी जीन की पहचान की, जो एसटीएडी में गर्मी के नक्शे (चित्रा 11 ए, बी) के रूप में सह-व्यक्त किए गए थे। हमने शीर्ष 5 जीनों का सकारात्मक मूल्यांकन किया और जीसी(चित्रा 11सी)में TMEM200A से जुड़े शीर्ष 5 जीनों का नकारात्मक मूल्यांकन किया। हमारे परिणामों से पता चला है कि अभिव्यक्ति TMEM200A SPON1 (r = 0.51), CDH11 (r = 0.50), EPB41L2 (r = 0.49), LUM (r = 0.49), SAMD3 (r = 0.49), OVOL2 (r = -0.37), RASAL1 (r = -0.36), IRX5 (r = -0.35), SLC4A11 (r = -0.34), और SYTL1 (r = -0.33) सह-अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध था। हमने एसटीएडी में TMEM200A की भूमिका को और समझने के लिए थ्रेशोल्ड विज़ुअलाइज़ेशन परिणामों का विश्लेषण किया। स्क्रीनिंग के लिए निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग किया गया था: लॉग 2-फोल्ड चेंज (एफसी) > 2.0 और समायोजित पी वैल्यू 0.05। हमने 483 डीईजी पाए, जिनमें से 385 को अपग्रेड किया गया था और 98 को डाउनरेगुलेट किया गया था, और हमने उनमें से 100 को हीट मैप बनाने के लिए चुना था (चित्र 11डी)। फिर, स्क्रीनिंग मानदंडों को पूरा करने वाले डीईजी के लिए, हमने जीओ और केईजीजी संवर्धन विश्लेषण चलाए। जीओ संवर्धन विश्लेषण के परिणामों से पता चला है कि बीपी (जैविक प्रक्रिया) का संवर्धन मुख्य रूप से बाह्य मैट्रिक्स और संरचनात्मक ऊतक से जुड़ा था, सीसी (सेलुलर घटक) का संवर्धन मुख्य रूप से कोलेजन युक्त बाह्य मैट्रिक्स और तहखाने झिल्ली से जुड़ा था, और एमएफ (आणविक कार्य) मुख्य रूप से एक बाह्य मैट्रिक्स संरचना और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन बाध्यकारी (चित्रा 11ई और चित्रा 11 जी) में समृद्ध था). केईजीजी विश्लेषण के संवर्धन से पता चला है कि TMEM200A मुख्य रूप से बाह्य मैट्रिक्स रिसेप्टर इंटरैक्शन मार्ग, साइटोक्रोम पी 450, और रेनिन-एंजियोटेंसिन प्रणाली(चित्रा 11 एफ और चित्रा 11एच) में समृद्ध था।

TMEM200A-आधारित रोगनिरोधी मॉडल और पेट के कैंसर की नैदानिक विशेषताएं
हमने एसटीएडी के रोगियों के TMEM200A और नैदानिक डेटा के बीच संबंध की जांच की और इसलिए लॉजिस्टिक रिग्रेशन विश्लेषण द्वारा और TMEM200A अभिव्यक्ति स्तर(चित्रा 12ए)के आधार पर टीसीजीए-एसटीएडी कोहोर्ट में रोगियों की क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं का विश्लेषण किया। आयु, नैदानिक चरण, और TMEM200A अभिव्यक्ति सभी एसटीएडी के साथ रोगियों में ओएस के साथ काफी हद तक सहसंबद्ध थे, एक अपरिवर्तनीय कॉक्स प्रतिगमन विश्लेषण (चित्रा 12 बी) के अनुसार। बहुभिन्नरूपी कॉक्स प्रतिगमन विश्लेषण से पता चला है कि TMEM200A अभिव्यक्ति एसटीएडी (एचआर = 1.282, 95% सीआई = 1.066-1.541, पी = 0.008) (चित्रा 12सी) के रोगियों में ओएस के लिए एक स्टैंडअलोन भविष्य कहनेवाला कारक हो सकती है। हमने कई नैदानिक मापदंडों (चित्रा 12 डी) के संयोजन के साथ मानक कॉलम लाइन प्लॉट मॉडल का उपयोग करके एसटीएडी में 1, 3 और 5 वर्षों के बाद ओएस की भविष्यवाणी करने के लिए इन क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं की क्षमता की जांच की। 1 साल के अस्तित्व की संभावनाओं के लिए अंशांकन घटता स्तंभ लाइन साजिश की भविष्यवाणी की संभावनाओं (चित्रा 12E) के साथ अत्यधिक संगत थे.

एसटीएडी कोशिकाओं और सेल प्रसार वृद्धि में TMEM200A अपरेग्यूलेशन
TMEM200A से संबंधित साहित्य की समीक्षा करके, हमने पाया कि TMEM200A की उच्च अभिव्यक्ति ने एक खराब रोग का निदान 13 का संकेत दिया और जीसी प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट TMEM200A एक आसंजन अणु37 के रूप में कार्य करने से प्रभावित हो सकता है, इस प्रकार जीसी कोशिकाओं के आक्रमण और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देता है। हमने उपरोक्त अध्ययन के निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए एसटीएडी सेल लाइनों में प्रोटीन के स्तर और TMEM200A के एमआरएनए प्रतिलेख स्तरों की जांच की। जीसी सेल लाइन एचजीसी -27 नाटकीय रूप से प्रोटीन और एमआरएनए प्रतिलेख स्तर(चित्रा 13ए,बी)दोनों पर स्वस्थ गैस्ट्रिक म्यूकोसल उपकला सेल लाइन जीईएस-1 की तुलना में TMEM200A को अतिरंजित करता है, यह दर्शाता है कि TMEM200A एचजीसी -27 कोशिकाओं में अतिरंजित था। परिणामस्वरूप एचजीसी -27 कोशिकाओं का उपयोग करके निम्नलिखित परीक्षण किए गए थे। इस बीच, प्रयोगात्मक परिणामों की सटीकता साबित करने के लिए, हमने मानव जीसी कोशिकाओं एसजीसी -7901 और गैस्ट्रिक म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं जीईएस -1 में TMEM200A के अंतर एमआरएनए अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग किया, और परिणामों से पता चला कि TMEM200A एसजीसी -7901 कोशिकाओं(चित्रा 13बी)में अत्यधिक व्यक्त किया गया था। एसटीएडी (चित्रा 13 सी) में TMEM200A की संभावित भागीदारी की जांच करने के लिए एचजीसी -27 कोशिकाओं में TMEM200A खटखटाया गया था। डेटाबेस खनन परिणामों और TMEM200A के हमारे सहसंबंध विश्लेषण के आधार पर, यह पाया गया कि TMEM200A मुख्य रूप से बाह्य मैट्रिक्स रिसेप्टर इंटरैक्शन मार्ग में शामिल था, जो कैंसर प्रसार और आक्रमण से जुड़ा था। इस प्रकार हमने सीसीके -8 परख को नियोजित किया ताकि यह पता लगाया जा सके कि अभिव्यक्ति TMEM200A सेल विकास को कैसे प्रभावित करता है। सीसीके -8 परख से पता चला है कि TMEM200A नॉकडाउन समूहों (सी-आरएनए 2 और सी-आरएनए 3) ने एनसी समूह(चित्रा 13डी)की तुलना में सेल व्यवहार्यता में उल्लेखनीय गिरावट दिखाई। इन निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि एसटीएडी में TMEM200A को अपग्रेड किया गया था, और इसकी अभिव्यक्ति का स्तर जीसी कोशिकाओं के प्रसार को प्रभावित कर सकता है। चित्रा 11F में KEGG संवर्धन विश्लेषण के परिणामों के आधार पर, हमने पाया कि TMEM200A GC में PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग से जुड़ा था, और TMEM200A, सेल आसंजन कारक के रूप में, EMT को प्रभावित करके गैस्ट्रिक कार्सिनोजेनेसिस के तंत्र को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, हमने नॉकडाउन से पहले और बाद में EMT और PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग पर TMEM200A नॉकडाउन के प्रभावों को सत्यापित करने के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग किया। परिणामों से पता चला है कि नकारात्मक नियंत्रण समूह (एनसी) की तुलना में TMEM200A नॉकडाउन समूह (TMEM200A-एसआईआरएनए 2) में पी-एकेटी प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी आई थी, जबकि एन-कैडरिन, विमेंटिन और स्नाई प्रोटीन के स्तर भी कम हो गए थे और ई-कैडरिन प्रोटीन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी(चित्रा 13ई)। इन सभी परिणामों से पता चलता है कि TMEM200A PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से EMT को प्रभावित कर सकते हैं और इस प्रकार GC में भूमिका निभा सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: अध्ययन का कार्यप्रवाह। संक्षिप्ताक्षर: TCGA = कैंसर जीनोम एटलस डेटाबेस; TIMER2.0 = TIMER2.0 डेटाबेस; ओएस = समग्र उत्तरजीविता; पीएफएस = प्रगति-मुक्त उत्तरजीविता समय; DSS = रोग-विशिष्ट उत्तरजीविता; डीएफएस = रोग मुक्त उत्तरजीविता; TMB = ट्यूमर म्यूटेशनल बर्डन; MSI = माइक्रोसेटेलाइट अस्थिरता; पीपीआई = प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन; GGI = जीन-जीन इंटरैक्शन; KEGG = जीन और जीनोम का क्योटो विश्वकोश; GO = जीन ओन्टोलॉजी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न कैंसर में TMEM200A की अभिव्यक्ति का स्तर। (ए) विभिन्न मानव विकृतियों में टीसीजीए डेटासेट से TMEM200A की ऊपर या नीचे की अभिव्यक्ति। (बी)टाइमर 2.0 डेटाबेस का उपयोग करके ट्यूमर और सामान्य ऊतकों में TMEM200A अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण। (सी) टीसीजीए डेटासेट से विभिन्न मानव कैंसर में TMEM200A जीन गतिविधि का विभेदक विश्लेषण। (डी) एसएसजीएसईए स्कोरिंग के आधार पर विभिन्न मानव कैंसर में TMEM200A के जीन गतिविधि स्तरों की रैंकिंग। (ई) स्वस्थ ऊतकों में एचपीए डेटाबेस से अभिव्यक्ति के स्तर TMEM200A हैं। (एफ) सामान्य सेल लाइनों में एचपीए डेटाबेस की TMEM200A अभिव्यक्ति स्तर। (जी) एचपीए डेटाबेस से कैंसर में प्रोटीन अभिव्यक्ति TMEM200A के लिए आईएचसी परिणाम। संक्षिप्ताक्षर: TCGA = कैंसर जीनोम एटलस; ssGSEA = एकल नमूना जीन सेट संवर्धन विश्लेषण; एचपीए = मानव प्रोटीन एटलस; आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं और विभिन्न ट्यूमर के पूर्वानुमान के साथ TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध। (ए) प्रत्येक ट्यूमर में क्लिनिकोपैथोलॉजिकल स्टेजिंग के साथ टीसीजीए पैन-कैंसर (पैनकैन) कोहोर्ट में TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध यूसीएससी ज़ेना डेटाबेस का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। (बी) प्रत्येक ट्यूमर में रोगी की उम्र के साथ टीसीजीए पैनकैन कोहोर्ट में TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध। (सी) प्रत्येक ट्यूमर में ट्यूमर पैथोलॉजिकल ग्रेड के साथ टीसीजीए पैनकैन कोहोर्ट में TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध। (डी) प्रत्येक ट्यूमर में रोगियों के जीवित रहने की स्थिति के साथ टीसीजीए पैनकैन कोहोर्ट में TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध। (ई) कॉक्स प्रतिगमन मॉडल का उपयोग करके विभिन्न कैंसर में पैन-कैंसर समग्र अस्तित्व के साथ TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध विश्लेषण। (एफ) टीसीजीए पैनकैन कोहोर्ट में TMEM200A अभिव्यक्ति और पैन-कैंसर ओएस पूर्वानुमान के बीच संबंध। (जी) TMEM200A अभिव्यक्ति और रोग-विशिष्ट अस्तित्व के बीच सहसंबंध। (एच) टीसीजीए पैनकैन कोहोर्ट में TMEM200A अभिव्यक्ति और प्रगति-मुक्त अंतराल पूर्वानुमान के बीच संबंध। (I) TMEM200A अभिव्यक्ति और रोग मुक्त अंतराल के बीच सहसंबंध। (जे) केआईआरसी पर एक बहुक्रियात्मक सीओएक्स प्रतिगमन विश्लेषण किया गया था। (के) केआईआरपी पर एक बहुक्रियात्मक सीओएक्स प्रतिगमन विश्लेषण किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: TCGA = कैंसर जीनोम एटलस; केआईआरसी: किडनी रीनल क्लियर सेल कार्सिनोमा; KIRP: किडनी रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा; ओएस = समग्र अस्तित्व; DSS = रोग-विशिष्ट उत्तरजीविता; PFI = प्रगति-मुक्त अंतराल; DFI = रोग मुक्त अंतराल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न कैंसर में TMEM200A का डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण। (ए) स्मार्ट डेटाबेस के अनुसार, कई कैंसर प्रकारों में TMEM200A के प्रमोटर मिथाइलेशन स्तर की जांच की गई थी। (बी) सामान्य ऊतकों की तुलना में विभिन्न कैंसर प्रकारों में TMEM200A के उच्च प्रमोटर मिथाइलेशन स्तर की जांच यूएएलकैन डेटाबेस के अनुसार की गई थी। (सी) यूएएलकैन डेटाबेस का उपयोग करते हुए, यह निर्धारित किया गया था कि सामान्य ऊतकों में कई कैंसर प्रकारों में TMEM200A के प्रमोटर मिथाइलेशन स्तर कम थे। (घ) BLCA, HNSC, LUAD और STAD में TMEM200A का डीएनए मेथिलिकरण स्तर रोग चरण के साथ बदल गया। संक्षिप्ताक्षर: बीएलसीए = मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा; HNSC = सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा; LUAD = फेफड़े एडेनोकार्सिनोमा; STAD = पेट एडेनोकार्सिनोमा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न कैंसर में TMEM200A जीन उत्परिवर्तन। (ए) cBioPortal डेटाबेस का उपयोग करके विभिन्न कैंसर में TMEM200A जीन उत्परिवर्तन प्रकारों का विश्लेषण। (बी) TMEM200A की 3 डी प्रोटीन संरचना। बाध्यकारी क्षेत्र रंगीन भाग द्वारा इंगित किया जाता है, जबकि TMEM200A के अन्य वर्गों को ग्रे भाग द्वारा दिखाया जाता है। (सी) आइसोफॉर्म और TMEM200A दैहिक उत्परिवर्तन का वितरण। एक्स-अक्ष, अमीनो एसिड साइटें; वाई-अक्ष, TMEM200A उत्परिवर्तन की संख्या; हरे डॉट्स, गलत म्यूटेशन; और ग्रे डॉट्स, काटे गए उत्परिवर्तन। (डी) आइसोफॉर्म का सत्यापन और सेंगरबॉक्स 3.0 में डेटा का उपयोग करके TMEM200A दैहिक उत्परिवर्तन का वितरण। (ई) सभी टीसीजीए ट्यूमर के लिए, उत्परिवर्तन की स्थिति और रोगियों के समग्र अस्तित्व की भविष्यवाणी के बीच संबंध की जांच cBioPortal डेटाबेस का उपयोग करके की गई थी, जिसमें लाल वर्ग TMEM200A उत्परिवर्तन समूह और नीले वर्ग अपरिवर्तित समूह को इंगित करते हैं। (एफ) TMEM200A के साथ सह-उत्परिवर्तित जीन का विश्लेषण cBioPortal टूल का उपयोग करके किया गया था: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244, और SLC18B1। (जी) कॉस्मिक डेटाबेस का उपयोग करके जीसी में TMEM200A उत्परिवर्तन प्रकारों का विश्लेषण। (ज) कॉस्मिक डाटाबेस का उपयोग करते हुए जीसी में TMEM200A एसएनवी प्रकारों का विश्लेषण किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: TCGA = कैंसर जीनोम एटलस; ओएस = समग्र उत्तरजीविता; कॉस्मिक = कैंसर कोशिकाओं में दैहिक उत्परिवर्तन की सूची; जीसी = गैस्ट्रिक कैंसर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: विभिन्न कैंसर में TMEM200A अभिव्यक्ति का एकल-कोशिका सहसंबंध विश्लेषण। (ए) टीआईएससीएच वेबसाइट पर TMEM200A की अभिव्यक्ति का सारांश। (बी) मेटास्टैटिक त्वचीय मेलेनोमा GSE72056 डेटासेट में आठ अलग-अलग सेल प्रकारों का वितरण। (सी) GSE72056 डेटासेट से त्वचीय मेटास्टैटिक मेलेनोमा कोशिकाओं में TMEM200A की अभिव्यक्ति का स्तर। (डी) GSE146771 से कोलोरेक्टल कैंसर डेटासेट में 13 अलग-अलग सेल प्रकारों का वितरण। (ई) GSE146771 डेटासेट से कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर TMEM200A हैं। (एफ) कई ट्यूमर में एकल-कोशिका कार्यात्मक स्थिति के साथ TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध कैंसरएसईए डेटाबेस का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। (जी) टी-एसएनई मानचित्र जीबीएम, एलयूएडी, सीएमएल, सीआरसी, आरबी और यूएम सहित व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं में TMEM200A अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाते हैं। संक्षिप्ताक्षर: जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा; LUAD = फेफड़े का एडेनोकार्सिनोमा; सीएमएल = क्रोनिक ग्रैनुलोसाइटिक ल्यूकेमिया; सीआरसी = कोलोरेक्टल कैंसर; आरबी = रेटिनोब्लास्टोमा; यूएम = यूवील मेलेनोमा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: जीन स्तर पर TMEM200A के सह-अभिव्यक्ति नेटवर्क और कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण। (ए) TMEM200A और इसके सह-व्यक्त जीन का जीजीआई नेटवर्क। (B) PPI नेटवर्क। (सी, डी) TMEM200A और सह-व्यक्त जीन का विश्लेषण जीओ और केईजीजी मार्ग संवर्धन के लिए किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: पीपीआई = प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन; GGI = जीन-जीन इंटरैक्शन; KEGG = जीन और जीनोम का क्योटो विश्वकोश; GO = जीन ओन्टोलॉजी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: विभिन्न कैंसर प्रकारों में TMEM200A और प्रतिरक्षा कोशिकाओं, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों, इम्यूनोस्टिमुलेटरी पदार्थों और एमएचसी अणुओं की अभिव्यक्ति के बीच संबंध। (ए) सेंगरबॉक्स 3.0 हीट मैप TMEM200A अभिव्यक्ति और प्रतिरक्षा घुसपैठ कोशिकाओं के बीच संबंध का प्रदर्शन करता है। (बी) टीआईएसआईडीबी डेटाबेस में प्रतिरक्षा घुसपैठ कोशिकाओं और TMEM200A अभिव्यक्ति के बीच संबंध दिखाने वाला हीट मैप। (सी)टीआईएसडीबी डेटाबेस में इम्यूनोसप्रेसिव कोशिकाओं और TMEM200A अभिव्यक्ति के बीच संबंध दिखाने वाला हीट मैप। (डीएफ) वृषण कैंसर और यूवील मेलेनोमा में TMEM200A अभिव्यक्ति और कुछ इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों के बीच सहसंबंध। (जी) टीआईएसआईडीबी डेटाबेस में इम्यूनोस्टिमुलेटरी कारकों और TMEM200A अभिव्यक्ति के बीच संबंध दिखाने वाला हीट मैप। (एच)टीआईएसआईडीबी डेटाबेस में TMEM200A अभिव्यक्ति और एमएचसी अणुओं के बीच सहसंबंध का हीट मैप। (I-L) मूत्राशय के यूरोटेलियल कार्सिनोमा में TMEM200A अभिव्यक्ति और कुछ इम्यूनोस्टिमुलेटरी कारकों और एमएचसी अणुओं के बीच सहसंबंध, वृषण कार्सिनोमा, एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा और यूवील मेलेनोमा। (एम) पैन-कैंसर प्रतिरक्षा उपसमूहों और TMEM200A अभिव्यक्ति के बीच सहसंबंध। (एन) पैन-कैंसर आणविक उपसमूहों और TMEM200A अभिव्यक्ति के बीच सहसंबंध। संक्षिप्ताक्षर: MHC = प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: पैन्सीटोपेनिया में TMEM200A की इम्यूनोथेरेप्यूटिक प्रतिक्रिया का विश्लेषण। (ए) टीएमबी के साथ विभिन्न कैंसर में TMEM200A अभिव्यक्ति का सहसंबंध। (बी) पैन-कैंसर और TMEM200A अभिव्यक्ति में एमएसआई के बीच सहसंबंध। (सी) प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए बायोमार्कर के रूप में TMEM200A की क्षमता। (डी) आईसीबी उत्तरजीविता परिणाम के साथ TMEM200A के सहसंबंध का भारित माध्य और सीआरआईएसपीआर स्क्रीनिंग में लॉगरिदमिक फोल्ड परिवर्तन (लॉगएफसी) का उपयोग इसे रैंक करने के लिए किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: TMB = ट्यूमर उत्परिवर्ती बोझ; ICB = इम्यून चेकपॉइंट नाकाबंदी; CRISPR = क्लस्टर्ड रेगुलर इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: विभिन्न कैंसर में TMEM200A का जीएसईए संवर्धन विश्लेषण। शीर्ष पांच रास्ते जिनमें TMEM200A ने 32 कैंसर को विनियमित करने में एक प्रमुख कार्यात्मक भूमिका निभाई है, जीएसईए संवर्धन विश्लेषण द्वारा पहचान की गई थी। बायां पैनल ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ, और SARC में TMEM200A के लिए GSEA संवर्धन विश्लेषण के परिणाम दिखाता है। दायां पैनल SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS और UVM में TMEM200A के लिए GSEA संवर्धन विश्लेषण के परिणाम दिखाता है। संक्षिप्ताक्षर: जीएसईए = जीन सेट संवर्धन विश्लेषण; एसीसी = एड्रेनोकोर्टिकल कार्सिनोमा; बीएलसीए = मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा; BRCA = स्तन आक्रामक कार्सिनोमा; सीईएससी = सर्वाइकल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और एंडोकर्विकल एडेनोकार्सिनोमा; चोल = चोलैंगियोकार्सिनोमा; COAD = कोलन एडेनोकार्सिनोमा; ईएससीए = एसोफेजियल कार्सिनोमा; जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म; HNSC = सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा; KICH = किडनी क्रोमोफोब; KIRC = किडनी रीनल क्लियर सेल कार्सिनोमा; KIRP = किडनी रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा; LAML = तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया; LGG = ब्रेन लोअर ग्रेड ग्लियोमा; LIHC = लिवर हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा; LUAD = फेफड़े का एडेनोकार्सिनोमा; LUSC = फेफड़े के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा; मेसो = मेसोथेलियोमा; OV = डिम्बग्रंथि सीरस सिस्टेडेनोकार्सिनोमा; पीएएडी = अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा; पीसीपीजी = फियोक्रोमोसाइटोमा और पैरागैंग्लियोमा; PRAD = प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा; मलाशय एडेनोकार्सिनोमा पढ़ें; SARC = सारकोमा; SKCM = त्वचीय मेलेनोमा; STAD = पेट एडेनोकार्सिनोमा; TGCT =वृषण रोगाणु सेल ट्यूमर; THCA = थायराइड कार्सिनोमा; थाइम = थाइमोमा; UCEC = गर्भाशय कॉर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा; यूसीएस = गर्भाशय कार्सिनोसारकोमा; यूवीएम = यूवील मेलेनोमा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: एसटीएडी में TMEM200A। (ए) लिंक्डओमिक्स डेटाबेस द्वारा एसटीएडी में TMEM200A अभिव्यक्ति के साथ नकारात्मक सहसंबंध के साथ पाए गए शीर्ष 50 जीन। (बी) एसटीएडी में शीर्ष 50 जीन जो सकारात्मक रूप से TMEM200A से जुड़े थे। (सी) एसटीएडी में TMEM200A के शीर्ष पांच सकारात्मक और पांच नकारात्मक सहसंबद्ध जीन। (डी) एसटीएडी में डीईजी का हीट मैप। (ईएच) स्क्रीनिंग डीईजी का उपयोग करके समृद्ध जीओ और केईजीजी मार्गों की जांच। संक्षिप्ताक्षर: STAD = पेट एडेनोकार्सिनोमा; DEGs= जीन की विभेदक अभिव्यक्ति; KEGG = जीन और जीनोम का क्योटो विश्वकोश; GO = जीन ओन्टोलॉजी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: एसटीएडी और TMEM200A अभिव्यक्ति स्तर की नैदानिक विशेषताओं के बीच संबंध। (ए) लॉजिस्टिक रिग्रेशन का उपयोग करके TMEM200A अभिव्यक्ति के स्तर और एसटीएडी नैदानिक लक्षणों का विश्लेषण। (बी, सी) एकल और एकाधिक चर के लिए एसटीएडी वन भूखंडों का कॉक्स विश्लेषण। (डी) कॉलम लाइन सेक्स, पैथोलॉजिकल ग्रेड, आयु, रोग चरण और TMEM200A अभिव्यक्ति के आधार पर एसटीएडी वाले रोगियों में ओएस की भविष्यवाणी करने वाले प्लॉट करता है । (ई) कॉलम लाइन ग्राफ मॉडल के अंशांकन दिखा अंशांकन भूखंडों. संक्षिप्ताक्षर: STAD = पेट एडेनोकार्सिनोमा; ओएस = समग्र उत्तरजीविता। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्रा 13: TMEM200A अभिव्यक्ति एसटीएडी में विनियमित है और गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देता है। (ए) पश्चिमी सोख्ता द्वारा गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं एचजीसी -27 और गैस्ट्रिक म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं जीईएस -1 में TMEM200A अभिव्यक्ति का पता लगाना। (बी)जीसी कोशिकाओं एचजीसी -27 और एसजीसी -7901 में TMEM200A अभिव्यक्ति का पता लगाना, और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा गैस्ट्रिक म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं जीईएस -1। (सी) जीसी कोशिकाओं एचजीसी -27 में गैर-नॉकडाउन समूह की तुलना में TMEM200A नॉकडाउन समूह में TMEM200A की अभिव्यक्ति दक्षता बहुत कम हो गई थी, जैसा कि क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा प्रदर्शित किया गया था। (डी) TMEM200A नॉकडाउन ने सीसीके 8 परख द्वारा मापा गया जीसी कोशिकाओं के प्रसार को काफी बाधित किया। (ई) TMEM200A के दस्तक ने ईएमटी में संबंधित प्रोटीन को काफी बाधित किया और पीआई 3 के/एकेटी सिग्नलिंग मार्ग में एकेटी के फॉस्फोराइलेशन को प्रभावित किया। संक्षिप्त: जीसी = गैस्ट्रिक कैंसर; क्यूआरटी-पीसीआर: मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; EMT = उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण; AKT = प्रोटीन kinase B. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

TMEM200A टीएमईएम के एक परिवार से संबंधित है जो कैंसर कोशिकाओं के प्रसार के लिएआवश्यक है। विभिन्न विकृतियों में TMEM200A की परिवर्तनशील अभिव्यक्ति पर कम ध्यान दिया गया है, और पूरी तरह से पैन-कैंसर जांच की कमी है। हालांकि, सबूत जमा करना जारी है, यह दर्शाता है कि टीएमईएम ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन परिवार कई प्रोटीनों के साथ बातचीत के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं को घातक रखने में महत्वपूर्ण हो सकता है, उदाहरण के लिए, TMEM16A सीए1 + सक्रिय सीएल-चैनलों का सक्रियण रॉक1/मोसिन बीआरसीए मेटास्टेसिस39 को बढ़ावा देता है। इसलिए, वर्तमान कार्य में, हमारे विश्लेषण ने चिकित्सीय कैंसर लक्ष्य और ट्यूमर डायग्नोस्टिक मार्कर के रूप में TMEM200A की व्यवहार्यता की खोज पर ध्यान केंद्रित किया। विशेष रूप से, हमने UCSC Xena डेटाबेस से RNA-seq डेटा का उपयोग करके 33 घातक ट्यूमर में TMEM200A के अभिव्यक्ति स्तरों की जांच की, और TIMER2.0 डेटाबेस के परिणामों ने UCSC Xena डेटाबेस में विश्लेषण को सफलतापूर्वक मान्य किया।

इसके बाद, ट्यूमर इम्यून सिंगल सेल सेंटर (TISCH) वेब टूल और CancerSEA डेटाबेस का उपयोग विभिन्न प्रकार के मोनोसाइट्स में TMEM200A के अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। सेंगरबॉक्स और टीआईएसआईडीबी वेबसाइटों का उपयोग यह समझने में मदद करने के लिए किया गया था कि TMEM200A प्रतिरक्षा घुसपैठ को कैसे प्रभावित करता है। हमने सिग्नलिंग मार्गों की भी पहचान की जिसमें TMEM200A प्रत्येक कैंसर में जीएसईए संवर्धन विश्लेषण द्वारा प्रत्येक कैंसर में एक महत्वपूर्ण कार्य करता है ताकि प्रत्येक दुर्दमता में TMEM200A की प्रमुख कार्यात्मक भूमिकाओं को समझा जा सके।

TMEM200A जीसी के प्रतिरक्षा वातावरण को नियंत्रित करने और जीसी कोशिकाओं के आक्रामक प्रसार को बढ़ावा देने के लिए एक आसंजन अणु के रूप में कार्य कर सकता है। इसलिए, हमने टीसीजीए डेटाबेस के माध्यम से TMEM200A के अभिव्यक्ति स्तर से जुड़े 483 अलग-अलग व्यक्त जीन (डीईजी) की पहचान की और इन 483 डीईजी के जीओ और केईजीजी संवर्धन का विश्लेषण किया। संवर्धन परिणामों से पता चला है कि PI3K/AKT मार्ग कैंसर के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और PI3K/AKT मार्ग कैंसर के ड्राइविंग कारकों में से एक हो सकता है।

इसके अलावा, हमने TMEM200A अभिव्यक्ति और एसटीएडी सेल गतिविधि के बीच संबंध की पुष्टि करने के लिए कैंसर के विकास को चलाने में TMEM200A के महत्वपूर्ण कार्य के बारे में अधिक जानने के बाद सेलुलर और आणविक परीक्षण किए। जैसा कि अपेक्षित था, हमने पाया कि एसटीएडी कोशिकाओं में TMEM200A को कम करने से सेल प्रसार बहुत कम हो गया है, और कैंसर सेल लाइनों ने सामान्य सेल लाइनों की तुलना में काफी अधिक स्तर पर TMEM200A व्यक्त किया है। हाल के वर्षों में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन परिवार से संबंधित साहित्य को जोड़कर, हमने पाया कि ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, सेल आसंजन अणुओं37 के रूप में, ईएमटी में एक नियामक भूमिका है।

इसके अलावा, जीसी में TMEM200A से संबंधित जीनों के संवर्धन विश्लेषण के परिणामों के अनुसार, हमने पाया कि जीसी में PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग में TMEM200A नियामक भूमिका हो सकती है। पश्चिमी सोख्ता प्रयोगों से पता चला कि TMEM200A नॉकडाउन विमेंटिन, एन-कैडरिन और स्नाई प्रोटीन को कम कर सकता है और एकेटी फॉस्फोराइलेशन को रोक सकता है, यह सुझाव देता है कि TMEM200A ईएमटी को प्रभावित करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को नियंत्रित करता है, और यह कि पीआई 3 के / एकेटी सिग्नलिंग मार्ग जीसी विकास के TMEM200A-मध्यस्थता विनियमन में शामिल हो सकता है। हाल के वर्षों में, कुछ अध्ययनों में पाया गया है कि ईएमटी जीसी रोगियों में कीमोथेरेपी दवा प्रतिरोध का मुख्य कारण है। उपकला-मेसेनकाइमल प्लास्टिसिटी (ईएमपी) और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को कई प्रकार के कैंसर40 में प्रभावी उपचार के लिए सीमित कारकों के रूप में वर्णित किया गया है। ईएमटी की घटना जीसी कोशिकाओं उनके विशेषता गुणों को खो देते हैं और मेसेनकाइमल कोशिकाओं41 की विशेषताओं को दिखाने कर सकते हैं. यह सुविधा न केवल जीसी रोगियों की कीमोथेरेपी दवाओं के प्रति संवेदनशीलता को कम करती है, बल्कि जीसी कोशिकाओं की आक्रामक और प्रवासी क्षमता को भी बढ़ाती है, जिससे ट्यूमर मेटास्टेसिस होता है। इसलिए, ऊपर वर्णित कारणों के लिए, हमारा अध्ययन ईएमटी में प्रमुख नियामक बिंदुओं के अनुसंधान और विकास और ईएमटी को प्रभावित करने वाले TMEM200A की कार्रवाई के विशिष्ट तंत्र की खोज करके उपन्यास लक्षित चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास में सहायता करता है।

हाल के वर्षों में अनुसंधान के लिए जैव सूचना विज्ञान का उपयोग बढ़ा है, और इस अध्ययन के लिए, हमने कई इंटरनेट डेटाबेस से डेटा एक्सेस किया है. जैव सूचना विज्ञान में इन ऑनलाइन डेटाबेस के उपयोग ने कैंसर के अध्ययन को सुव्यवस्थित और तेज कर दिया है, और वे शोधकर्ताओं को उनके परिणामों को मान्य करने का एक किफायती साधन भी प्रदान करते हैं.

हालाँकि, जैव सूचना विज्ञान तकनीक में कुछ कमियां हैं। जब हम विश्लेषण के लिए इन डेटाबेस का उपयोग करते हैं, तो एक ही अध्ययन कई डेटाबेस में असंगत या यहां तक कि परस्पर विरोधी निष्कर्ष प्रदान कर सकता है क्योंकि कई ऑनलाइन डेटाबेस में कई डेटासेट से डेटा शामिल होता है। इसके अलावा, कई डेटाबेस बहुत लंबे समय तक अपडेट नहीं होते हैं, और कॉपीराइट कठिनाइयों के कारण, उनकी सामग्री को कभी भी बड़ा नहीं किया जा सकता है; इसलिए, शोधकर्ताओं को इन डेटाबेस से जो विश्लेषणात्मक निष्कर्ष मिलते हैं, वे हमेशा विवश होते हैं। इसलिए, इस शोध में, हमने इन बाधाओं को दूर करने और निष्कर्षों की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए सामूहिक रूप से परिणामों की जांच करने के लिए विभिन्न डेटाबेस को नियोजित किया। यह सुनिश्चित करने के लिए कि हमारे द्वारा प्राप्त निष्कर्षों में काफी बदलाव नहीं किया गया था, हमने विश्लेषण के लिए विभिन्न डेटाबेस का उपयोग करते समय प्रक्रिया को दोहराया। पश्चिमी धब्बा प्रयोगों के परिणामों ने हमारे जैव सूचना विज्ञान की भविष्यवाणी का समर्थन किया कि TMEM200A PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग को विनियमित करके GC में EMT को नियंत्रित कर सकते हैं, जो तब GC कोशिकाओं के प्रसार को प्रभावित करेगा। हमने संबंधित साहित्य के साथ संयोजन के रूप में जैव सूचना विज्ञान का उपयोग करके TMEM200A की कार्रवाई के तंत्र की भविष्यवाणी की।

संक्षेप में, यह काम दर्शाता है कि जैव सूचना विज्ञान उपकरण प्रयोगात्मक डिजाइन को महत्वपूर्ण रूप से कैसे सुविधाजनक बना सकते हैं और कई अन्य प्रकार के वैज्ञानिक अनुसंधान भविष्यवाणियों के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। भविष्य के कैंसर शोधकर्ताओं को जैव सूचना विज्ञान भविष्यवाणी के साथ प्रयोगात्मक सत्यापन के संयोजन के प्राथमिक प्रतिमान को अपनाने की संभावना है, और यह काम इस उद्देश्य के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में कार्य करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82160550) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

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References

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Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

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