Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Мультиомный анализ TMEM200A как панракового биомаркера

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

Здесь представлен протокол, в котором объединены несколько биоинформатических инструментов для изучения биологических функций TMEM200A при раке. Кроме того, мы также экспериментально проверяем предсказания биоинформатики.

Abstract

Известно, что трансмембранный белок, TMEM200A, связан с раком человека и иммунной инфильтрацией. Здесь мы оценили функцию TMEM200A при распространенных раковых опухолях с помощью мультиомного анализа и использовали клеточные культуры клеток желудка in vitro для проверки результатов. Экспрессию TMEM200A при нескольких типах рака человека оценивали с использованием данных РНК-секвенирования из базы данных UCSC Xena. Биоинформатический анализ выявил потенциальную роль TMEM200A как диагностического и прогностического биомаркера.

Культивировались культуры нормальных желудочных и раковых клеточных линий , и TMEM200A сбивали. Уровни экспрессии TMEM200A измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и вестерн-блоттинга. Затем исследования потери функции in vitro были использованы для определения роли TMEM200A в злокачественном поведении и опухолевом образовании клеток рака желудка (ГК). Вестерн-блоттинг использовали для оценки влияния нокдауна на эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и сигнальный путь PI3K/AKT при ГК. Биоинформатический анализ показал, что TMEM200A экспрессируется на высоких уровнях в ГХ.

Пролиферация GC-клеток ингибировалась нокдауном TMEM200A, который также снижал количество белков виментина, N-кадгерина и Snai и ингибировал фосфорилирование AKT. Сигнальный путь PI3K/AKT также, по-видимому, участвует в TMEM200A-опосредованной регуляции развития ГК. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что TMEM200A регулирует микроокружение опухоли, воздействуя на ЭМП. TMEM200A также может влиять на ЭМП через передачу сигналов PI3K/AKT, тем самым влияя на микроокружение опухоли. Таким образом, при панраковых опухолях, особенно при ГК, TMEM200A может быть потенциальным биомаркером и онкогеном.

Introduction

Рак превратился в постоянную проблему общественного здравоохранения, угрожающую здоровью человека во всеммире1из-за высокого уровня заболеваемости и смертности во всем мире, что создает тяжелое финансовое и медицинское бремядля общества2. Значительные успехи в терапии рака были достигнуты в последние годы благодаря открытию раковыхмаркеров, и исследователи разработали новые методы диагностики и новые лекарства для лечения рака. Тем не менее, некоторые пациенты с раком по-прежнему имеют плохие прогнозы из-за таких факторов, как лекарственная устойчивость, побочные эффекты лекарств и чувствительность к химическимвеществам. В связи с этим существует острая необходимость в выявлении новых биомаркеров для скрининга и лечения рака на ранних стадиях5.

Мембранные белки - это белки, которые могут связываться и интегрироваться в клетки и мембраны органелл6. Они могут быть сгруппированы в три категории в зависимости от силы связывания с мембраной и их расположения: липидно-якорные белки, интегральные белки и периферические мембранные белки 7,8. Трансмембранный белок (ТМЕМ) представляет собой интегральный мембранный белок, состоящий по меньшей мере из одного трансмембранного сегмента9, который полностью или частично проходит через биологическую мембрану.

Хотя механизмы действия белков, принадлежащих к семейству TMEM, недостаточно изучены, известно, что эти белки участвуют в развитии нескольких типоврака. Некоторые белки ТМЕМ ассоциированы с мигрирующими, пролиферативными и инвазивными фенотипами, и их экспрессия часто связана с прогнозом пациента11. Таким образом, члены семейства ТМЕМ стали объектом исследования. Всесторонний обзор существующих сообщений о ТМЕМ показал, что они в основном связаны с меж- и внутриклеточной сигнализацией12, иммунозависимыми заболеваниями и опухолегенезом10. Многие ТЭМ также обладают важными физиологическими функциями, например, ионными каналами в плазматической мембране, активацией путей передачи сигнала, а также посредничеством клеточного хемотаксиса, адгезии, апоптоза и аутофагии10. Таким образом, мы предположили, что белки ТМЕМ могут быть важными прогностическими маркерами в выявлении и лечении опухолей.

TMEM200A экспрессия значительно повышена при раке желудка (ГК). Более высокая экспрессия TMEM200A13, которая имеет восемь экзонов и полную длину 77,536 kb на хромосоме 6q23.1, была связана с плохим прогнозом общей выживаемости (ОВ) в случаях ГК. Тем не менее, об изменениях в его экспрессии редко сообщалось в онкологических исследованиях. В данной статье сравнивается и анализируется полезность TMEM200A в качестве терапевтической мишени и опухолевого диагностического маркера в различных онкологических исследованиях с использованием различных общедоступных наборов данных. Мы оценивали эффективность TMEM200A как панракового диагностического и прогностического биомаркера, а также уровни его экспрессии при различных типах рака человека с использованием данных РНК-секвенирования из баз данных UCSC Xena и TCGA, а также количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) и вестерн-блоттинга.

Влияние уровней экспрессии TMEM200A на частоту мутаций, регуляторные процессы, диагностику и прогноз опухолей, иммунную инфильтрацию и иммунотерапию было дополнительно изучено с использованием комбинации вычислительных инструментов и веб-сайтов наборов данных. Для изучения мутаций в TMEM200A использовались базы данных CBioPortal и Каталог соматических мутаций в раковых клетках (COSMIC). Для понимания того , как TMEM200A влияет на иммунную инфильтрацию, были использованы веб-сайты Sangerbox и TISIDB. Для исследования функции TMEM200A был использован онлайн-инструмент Центра опухолевого иммунитета (TISCH) и база данных CancerSEA. Наконец, для оценки влияния TMEM200A на злокачественное поведение и функцию развития опухоли ГК-клеток был проведен эксперимент по потере функции в анализе in vitro . Кроме того, был проведен вестерн-блоттинг для оценки влияния нокдауна TMEM200A сигнальный путь PI3K/AKT и эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) при ГК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. База данных «Атлас генома рака» (TCGA)

ПРИМЕЧАНИЕ: База данных Атласа генома рака (TCGA) содержит данные секвенирования генов в различных опухолевых тканях14. Данные РНК-секвенирования в TCGA для изучения форматов TMEM200A transcripts per part per million (TPM) были извлечены с веб-сайта UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) и преобразованы log2 для сравнения экспрессий между образцами.

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта UCSC Xena .
  2. Перейдите на вкладку «Запустить Xena ».
  3. Нажмите на вкладку НАБОРЫ ДАННЫХ в верхней части экрана.
  4. Из 129 когорт и 1 571 наборов данных на этой странице нажмите на вкладку, чтобы увидеть в общей сложности 33 вида рака, таких как острый миелоидный лейкоз GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Рак коры надпочечников (ACC), GDC TCGA Рак желчных протоков (CHOL) и другие.
  5. В меню RNAseq экспрессии генов выберите и щелкните вкладку HTSeq - FPKM GDC Hub .
    ПРИМЕЧАНИЕ: HTSeq - FPKM GDC Hub представляет данные, которые были исправлены по согласию.
  6. В меню загрузки нажмите на соответствующую ссылку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью вышеуказанного метода были загружены данные RNA-Seq для 33 различных типов рака.
  7. Распакуйте zip-архив данных РНК-секвенирования для 33 различных типов рака в один файл в папке рабочего стола компьютера.
  8. Объедините распакованные txt-файлы в одну папку и поместите в нее Perl-скрипты.
  9. Откройте программу Perl, скопируйте и вставьте путь к папке в программу Perl, в которой находится курсор мыши, нажмите клавишу Enter, введите имя кода Perl и имя гена (TMEM200A), а затем нажмите клавишу Enter, чтобы получить новый файл (singleGeneExp.txt).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот новый txt-файл (singleGeneExp.txt) содержит экспрессию генов TMEM200A в 33 видах рака у разных пациентов.
  10. Откройте код R (diffR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл singleGeneExp.txt , в строку, где находится setwd в коде R.
  11. Откройте программу R, запустите модифицированный код R (diffR) и нарисуйте картинку с помощью пакета ggpubr.

2. База данных TIMER2.0

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) database 16 .
  2. Перейдите на вкладку Исследование рака.
  3. Введите идентификатор гена (TMEM200A) в поле поиска и перейдите на вкладку Отправить , чтобы получить изображения дифференциальной экспрессии TMEM200A в различных типах опухолей.

3. Атлас белков человека (HPA)

  1. Перейдите в веб-интерфейс Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) 17.
  2. Введите ID (TMEM200A) в поле поиска и нажмите кнопку Поиск . Выберите вложенный атлас TISSUE.
  3. Наведите курсор на страницу и прокрутите вниз, чтобы найти вкладку «Обзор экспрессии белка ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе «Обзор экспрессии белка » показаны уровни экспрессии белка TMEM200A в 45 органах человеческого тела.

4. Массив платформ метилирования ДНК HumanMethylation450 Illumina Infinium

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных о метилировании ДНК использовалась матрица платформы метилирования ДНК HumanMethylation450 Illumina Infinium . Мы могли бы оценить TMEM200A уровни метилирования ДНК с помощью базы данных SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. Перейдите в интерфейс сайта SMART .
  2. Введите идентификатор гена (TMEM200A) в поле поиска , чтобы получить распределение TMEM200A в хромосомах и уровень метилирования TMEM200A при различных типах злокачественных новообразований.
  3. Прокрутите страницу вниз до меню Нажмите, чтобы проверить метилирование, агрегированное CpG, и нажмите кнопку График . В нижней части страницы найдите и нажмите кнопку «Загрузить рисунок ». Скачать рисунок.

5. База данных УАЛКАН

  1. Перейдите в интерфейс сайта UALCAN .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ящичковые диаграммы уровней метилирования промоторов TMEM200A при различных злокачественных новообразованиях были построены с помощью базы данных UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. В верхней части страницы нажмите на кнопку TCGA .
  3. Введите TMEM200A в поле ввода Gene ID на экране. В меню набора данных TCGA прокрутите вниз и выберите тип рака, который нужно запросить.
  4. После нажатия кнопки «Исследовать » нажмите на ее подгруппу анализа «Метилирование» в меню «Ссылки для анализа », чтобы получить результаты метилирования этой опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого метода мы получили результаты метилирования для 22 опухолей в базе данных UALCAN .

6. База данных «Каталог соматических мутаций в раковых клетках» (COSMIC)

  1. Перейти на сайт Каталога соматических мутаций в раковых клетках (COSMIC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные о кодирующих мутациях, некодирующих мутантных геномных перестройках и слияниях генов в геноме человека доступны из базы данных Каталога соматических мутаций в раковых клетках (COSMIC)20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), которая также используется для определения частоты различных мутаций TMEM200A при различных видах рака.
  2. Введите идентификатор гена (TMEM200A) в поле поиска и нажмите кнопку ПОИСК, чтобы перейти на новый экран.
  3. В меню «Гены » найдите и щелкните ссылку, по которой отображается имя идентификатора гена TMEM200A .
  4. Найдите столбец Группировка распределения мутаций на новой странице, чтобы получить статус мутации TMEM200A в опухоли.

7. CBioPortal

  1. Перейдите в интерфейс сайта CBioPortal .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные геномики рака могут быть найдены, загружены, проанализированы и визуализированы с помощью базы данных cBioPortal (www.cioportal.org). Соматические мутации, изменения числа копий ДНК (CNA), экспрессия мРНК и микроРНК (miRNA), метилирование ДНК, обилие белка и содержание фосфопротеинов — это лишь некоторые из типов геномных данных, которые интегрированы в cBioPortal21. С помощью cBioPortal можно проводить широкий спектр исследований; Тем не менее, основной акцент делается на различных анализах, связанных с мутациями и их визуализацией.
  2. Выберите набор данных « Панраковый анализ целых геномов » в подразделе « Исследования панрака » раздела «Выбор исследований для визуализации и анализа ». Затем нажмите кнопку Query By Gene .
  3. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Отправить запрос .
  4. Нажмите на кнопку «Сведения о типе рака » в верхней части страницы, чтобы получить мутации TMEM200A при различных типах рака.

8. Инструмент Sangerbox 3.0

  1. Перейдите в интерфейс инструмента Sangerbox 3.0 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция экспрессии TMEM200A с иммунными инфильтрирующими клетками, иммунодепрессантами, иммуностимулирующими факторами и молекулами MHC (главный комплекс гистосовместимости) при всех видах рака была проанализирована методом иммунной инфильтрации CIBERSORT с использованием данных панраковой иммунной инфильтрации в Sangerbox 3.0 инструмент22 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. На панели инструментов в левой части страницы выберите и щелкните вкладку «Иммуноклеточный анализ (CIBERSORT)» в меню «Панраковый анализ ».
  3. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Отправить .

9. База данных TISIDB

  1. Перейдите в интерфейс сайта TISIDB .
    ПРИМЕЧАНИЕ: База данных TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) была использована для изучения корреляции экспрессии TMEM200A с иммунными инфильтрирующими клетками, иммунодепрессантами, иммуностимулирующими факторами и молекулами MHC при различных видах рака.
  2. Введите целевой символ гена (TMEM200A) в поле запроса команды Введите гены. Нажмите кнопку Отправить .
  3. Нажмите на разделы «Лимфоциты», «Иммуномодуляторы», «Химиконы» и « Подтипы » в верхней части страницы. Загрузите соответствующие изображения внизу страницы.

10. База данных TIDE

  1. Перейдите в интерфейс сайта TIDE .
    ПРИМЕЧАНИЕ: База данных TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) была использована для оценки потенциала TMEM200A в качестве биомаркера для прогнозирования ответа на терапию блокадой иммунных контрольных точек опухолевого иммунитета.
  2. Введите адрес электронной почты на первом экране, чтобы зарегистрировать учетную запись и войти в систему.
  3. Найдите подраздел «Оценка биомаркеров » в верхней части страницы и нажмите на него.
  4. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены в нижней части страницы. Затем нажмите кнопку «Отправить ».
  5. На странице перетащите мышь, чтобы сдвинуть страницу вниз, чтобы найти результаты анализа.

11. База данных CancerSEA

  1. Перейдите в интерфейс сайта CancerSEA .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя данные секвенирования отдельных клеток, были исследованы взаимосвязи между экспрессией TMEM200A и функциональным состоянием различных опухолевых клеток. Это было сделано с помощью базы данных CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. В верхней части страницы найдите и нажмите на вкладку «Поиск ».
  3. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Отправить .

12. Сетевой инструмент «Одноклеточный центр опухолевого иммунитета» (TISCH)

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта сетевого инструмента Центра иммунного иммунитета опухолей (TISCH).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция между уровнями экспрессии TMEM200A и раковых клеток также была показана с помощью сетевого инструмента сети опухолевого иммунного одноклеточного центра (TISCH)25.
  2. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Исследовать .
  3. В меню Тип рака на этой странице выберите и щелкните набор данных All Cancers. Затем прокрутите страницу вниз и нажмите кнопку «Поиск».

13. Геномания

  1. Перейдите в интерфейс сайта GeneMANIA .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция между TMEM200A и его функционально значимыми генами была предсказана с использованием стратегии интеграции генной мультиассоциативной сети Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 для построения сетей ген-ген-генного взаимодействия (GGI).
  2. В поле поиска в левом верхнем углу страницы введите идентификатор гена (TMEM200A) и нажмите Инструменты поиска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-инструмент GeneMANIA был использован для поиска 20 генов, связанных с TMEM200A.

14. Анализ функционального обогащения

  1. Сохраните идентификаторы символов анализируемых генов для обогащения в формате txt.
  2. Откройте код R (symbolidR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится приведенный выше txt-файл, в строку, где находится setwd в коде R.
  3. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (symbolidR). Преобразуйте идентификаторы символов этих генов в entrezID с помощью команды "org. Hs.eg.db». Получите файл id.txt .
  4. Откройте код R (GOR и KEGGR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл id.txt , в строку, где находится setwd в коде R.
  5. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (GOR и KEGGR). Чтобы следовать этому протоколу, проанализируйте эти гены на предмет обогащения GO и KEGG пакетами "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" и "enrichplot" и построить график результатов обогащения с помощью пакета "gglot2".

15. Анализ различий в активности генов

ПРИМЕЧАНИЕ: TMEM200A баллов в каждом образце рака рассчитывали с помощью ssGSEA (анализ обогащения набора генов с одним выборкой)27, а для различных видов рака был проведен дифференциальный анализ активности TMEM200A генов в раковых и здоровых тканях.

  1. На основе данных РНК-секвенирования 33 типов опухолей, загруженных на шаге 1.7, распакуйте все загруженные файлы и поместите их в единую папку.
  2. Поместите merge.txt файл в указанную выше папку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные merge.txt файле BioWolf (www.biowolf.cn) содержат экспрессию генов для всех пациентов во всех опухолях в базе данных The Cancer Genome Atlas (TCGA).
  3. Откройте код R (ssGSEAR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится указанная выше папка, в строку, где находится setwd в коде R.
  4. Возьмите строку, где geneName находится в коде R (ssGSEAR) и введите идентификатор гена (TMEM200A).
  5. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (ssGSEAR). Получите файл оценки активности генов: scores.txt.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью алгоритма ssGSEA мы сначала создаем файл набора генов на основе коэффициентов корреляции между генами в соответствии с данными, представленными в файле merge.txt , и идентифицируем гены с более высокой корреляцией с целевым геном (TMEM200A) из файла. Затем гены с более высокой корреляцией объединяются как активные гены TMEM200A, и, наконец, мы получаем оценку активных генов в каждой выборке.
  6. Откройте код R (scoreDiffR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл scores.txt, в строку, где находится setwd в коде R.
  7. Откройте программное обеспечение R, запустите модифицированный код R (scoreDiffR) и нарисуйте изображение с помощью пакетов "plyr", "reshape2" и "ggpubr".

16. Клинико-патологическая корреляция и анализ прогноза выживаемости

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта UCSC Xena .
  2. Перейдите на вкладку Запустить Xena .
  3. Нажмите на вкладку НАБОРЫ ДАННЫХ в верхней части экрана.
  4. Наведите курсор на страницу и прокрутите вниз, чтобы найти вкладку TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. Из 129 когорт и 1 571 наборов данных на этой странице перейдите на вкладку TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. В меню фенотипа выберите и щелкните вкладку Курируемые клинические данные.
  7. В меню загрузки нажмите на соответствующую ссылку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите клинические данные по 33 видам рака из базы данных TCGA по ссылке выше.
  8. Распакуйте загруженный файл клинических данных и откройте его в формате xls.
  9. Систематизируйте и сохраняйте необходимые клинические данные (стадия, возраст, патологическая стадия и состояние пациента) в файле, удаляйте оставшиеся ненужные клинические данные и сохраняйте весь файл в формате txt после переименования его в клинический.
  10. Основываясь на singleGeneExp.txt , полученных на шаге 1.9, поместите этот файл в ту же папку, что и организованный файл clinical.txt .
  11. Распакуйте загруженные клинические данные и поместите файлы singleGeneExp.txt и clinical.txt в ту же папку, что и разархивированные клинические файлы.
  12. Откройте код R (clinicalDiffR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится указанная выше папка, в строку, где находится setwd в коде R.
  13. Откройте программу R, запустите модифицированный код R (clinicalDiffR) и нарисуйте картинку с помощью пакета ggpubr.
  14. Перейдите в интерфейс веб-сайта UCSC Xena .
  15. Перейдите на вкладку Запустить Xena .
  16. Нажмите на вкладку НАБОРЫ ДАННЫХ в верхней части экрана.
  17. Из 129 когорт и 1 571 наборов данных на этой странице нажмите на вкладку, чтобы увидеть в общей сложности 33 вида рака, таких как острый миелоидный лейкоз GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Рак коры надпочечников (ACC), GDC TCGA Рак желчных протоков (CHOL) и другие.
  18. В меню фенотипа выберите и нажмите на вкладку данных о выживаемости.
  19. В меню загрузки нажмите на соответствующую ссылку.
  20. Распакуйте zip-архив данных о выживаемости для 33 различных видов рака в один файл в папке рабочего стола компьютера.
  21. Поместите распакованные данные о выживании в ту же папку, что и singleGeneExp.txt файл, полученный на шаге 1.9.
  22. Откройте код R (preOSR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится указанная выше папка, в строку, где находится setwd в коде R.
  23. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (preOSR). Вычислите через пакет «лимма», чтобы получить файл данных о выживаемости TMEM200A при панраке: expTime.txt.
  24. Откройте код R (OSR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл expTime.txt , в строку, где находится setwd в коде R.
  25. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (OSR). Выполните анализ КМ с использованием пакетов «survival» и «survminer» на основе данных в файле expTime.txt и постройте кривые выживаемости для TMEM200A при панраке.

17. Одномерный и многомерный регрессионный анализ Кокса при строительстве лесных участков

  1. Открываем R-код (COXR) и копируем и вставляем путь, по которому мы получили expTime.txt находится файл из 16.23 , в строку, где находится setwd в R-коде.
  2. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (COXR). Основываясь на данных в файле expTime.txt , выполните одномерный регрессионный анализ ЦОГ с использованием пакетов «survival», «survminer» и «forestplot», чтобы построить одномерный лесной график TMEM200A при различных видах рака.
  3. Поместите expTime.txt файл из шага 16.23 и clinical.txt из шага 16.10 в одну папку.
  4. Откройте код R (multicoxR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится папка, содержащая файл expTime.txt из шага 16.23 и файл clinical.txt из шага 16.10, в строку, где находится setwd в коде R.
  5. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (multicoxR). Выполните многомерный регрессионный анализ COX с использованием пакетов "survival" и "survminer", чтобы построить многомерный лесной график TMEM200A при различных видах рака на основе данных в файлах expTime.txt и clinical.txt .

18. Прогностическая модель рака желудка на основе экспрессии TMEM200A и клинических особенностей

  1. Поместите clinical.txt файл из шага 16.10 и expTime.txt файл из шага 16.23 в одну папку.
  2. Откройте код R (NomoR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится приведенный выше файл txt, в строку, где находится setwd в коде R.
  3. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (NomoR). Используйте программные пакеты "survival", "regplot" и "rms" для TMEM200A экспрессии данных в ГК и клинических данных для построения прогностической модели для прогнозирования выживаемости пациентов.

19. Клеточная культура и трансфекция миРНК TMEM200A

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HGC-27 STAD человека, клетки SGC-7901 и эпителиальные клетки слизистой оболочки желудка человека GES-1 были получены коммерчески (см. таблицу материалов), реанимированы, инокулированы в полную среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (содержащую 10% сыворотки новорожденного плода крупного рогатого скота и 1% смеси пенициллина) и культивированы при 37 °C в 5%CO2 инкубатор клеточных культур. Питательную среду меняли каждые 2-3 дня. Клетки в хорошем состоянии роста высевали в шестилуночные планшеты по (2-3) × 105 клеток на лунку.

  1. Сначала возьмите три микроцентрифужные пробирки и добавьте в каждую пробирку 8 мкл реагента для трансфекции (см. раздел«Материалы») и 200 мкл базальной среды. Затем добавьте 4 мкг SiRNA1, SiRNA2 и SiRNA3 в каждую пробирку соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для TMEM200A нокдауна была разработана и закуплена миРНК (см. Таблицу материалов).
  2. Тщательно перемешайте смесь в трех пробирках микроцентрифуги и добавьте в каждую из трех лунок 6-луночной пластины. Осторожно встряхните 6-луночную пластину, чтобы равномерно распределить смесь. Обозначьте три лунки, в которые была добавлена смесь , как SiRNA-1, SiRNA-2 и SiRNA-3.
  3. После инкубации клеток в течение 4-6 ч замените половину среды в трех подлунках 6-луночной планшета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При замене половины полной среды отсасывайте половину исходной полной среды и пополняйте половину свежей полной среды.
  4. Через 24-48 ч использовали TMEM200A клетки , трансфицированные миРНК, в качестве экспериментальной группы, и нетрансфицированные клетки в качестве отрицательной контрольной группы. Проведите количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (qRT-PCR, см. раздел 20) для оценки влияния трансфекции на клетки.

20. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

  1. Отбросьте питательную среду для клеток в каждой подгруппе и осторожно промойте клетки дважды 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Выделите общую РНК с помощью набора для выделения РНК (см. таблицу материалов).
  3. Оцените концентрацию РНК и синтезируйте кДНК с 1 мкг РНК с помощью набора для синтеза кДНК, следуя инструкциям производителя.
  4. Выполняйте количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) на 10-кратных разведениях кДНК в 10 мкл реакционной смеси, включая прямые и обратные праймеры для GAPDH (для стандартизации), TMEM200A (см. таблицу материалов) и мастер-микс для кПЦР в реальном времени, используя систему анализа ПЦР в реальном времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте каждый эксперимент в трех экземплярах.
  5. Используют следующие условия реакции кПЦР: инициализация, 95 °C в течение 3 мин; денатурация, 95 °С в течение 10 с; отжиг, 60 °С в течение 30 с; и удлинения, 80 °C в течение 10 с; Повторите денатурацию, отжиг и удлинение 40х. Определите относительную экспрессию каждого гена с помощью метода 2-ΔΔCt 28.
  6. Повторите эксперименты не менее трех раз, чтобы получить биологические трипликаты.

21. Вестерн-блоттинг экспрессии соответствующего белка

  1. Выбросьте питательную среду для клеток в каждой подгруппе и аккуратно промойте клетки 2 x 1 мл PBS.
  2. Охладите 6-луночные планшеты, содержащие клетки на льду, и добавьте 150 мкл предварительно охлажденного буфера для лизиса радиоиммунного анализа (RIPA) (150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0 и свежедобавленный коктейль ингибиторов протеазы). Дайте лизису продолжаться на льду в течение 10 минут.
  3. Используя пластиковый скребок для клеток, удалите прилипшие клетки из чашки и осторожно перенесите клеточный раствор в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку.
  4. Центрифугируют клеточный лизат в течение 10 мин при 1,5 × 104 г при 4 °С. Перелейте надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Используйте набор для анализа белка BCA, чтобы определить содержание белка в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Загрузите 30 г белка из каждого образца на 10%-ный гель для электрофореза с полиакриламидным гелем на основе додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и запустите при 80 В в течение 0,5 ч, а затем 1,5 ч при 120 В.
  7. Переносят белки из геля на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) 45 мкм при напряжении 300 мА в течение 1-1,5 ч.
  8. Поместив мембрану из ПВДФ на шейкер и встряхивая ее в течение 3 x 5 мин, добавьте Tris-буферный физиологический раствор с Tween 20 (TBST, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl и 0,1% Tween 20) в соответствующий контейнер белковой стороной (гелевой стороной) вверх.
  9. Поместите мембрану в блокирующий буфер (см. таблицу материалов) и инкубируйте ее в течение 0,5 ч при комнатной температуре.
  10. Промывайте мембрану TBST в течение 3 x 10 мин.
  11. Инкубируют мембрану с первичными антителами против фосфо-АКТ (p-AKT; 1:1,000), общего AKT 1:1,000, E-кадгерина (E-ca; 1:1,000), N-кадгерина (N-ca; 1:1,000), виментина 1:1,000, улитки 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH; 1:1,000), в течение ночи при 4 °C.
  12. Промывают мембрану в течение 3 х 10 мин и инкубируют мембрану с вторичными антителами кролика или мыши (1:5 000) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  13. Инкубируйте мембрану PVDF с подложкой ECL в течение 30 секунд и детектируйте сигнал с помощью системы визуализации.

22. Проба CCK-8

  1. Высейте человеческие клетки STAD HGC-27 в хороших условиях роста в 96-луночные планшеты.
  2. Когда плотность клеток достигнет 60-70%, трансфицируют клетки TMEM200A миРНК (как на шаге 19.3).
  3. Трансфицированные клетки засевают в 96-луночные планшеты с плотностью клеток 5 × 10 3 на лунку (подсчитывают жизнеспособные клетки с помощью счетчика клеток), разделяют на группы NC и TMEM200A миРНК (с тремя реплицированными лунками в каждой группе) и инкубируют при 37 °C.
  4. Реагент CCK-8 добавляют через 0, 24, 48, 72 и 96 ч и инкубируют при 37 °C в течение 2 ч. Измерьте абсорбцию (450 нм) с помощью многофункционального этикетировщика ферментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспрессия TMEM200A при различных видах рака
Как показано на рисунке 1, сначала мы проанализировали дифференциальные уровни экспрессии TMEM200A при различных видах рака с помощью различных баз данных. TMEM200A экспрессия была повышена при холангиокарциноме (CHOL), плоскоклеточной карциноме головы и шеи (HNSC), почечной светлоклеточной карциноме (KIRC), почечно-папиллярной карциноме (KIRP), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), STAD и карциноме щитовидной железы (THCA) по сравнению с соседними нормальными тканями исключительно на основе данных TCGA. Однако экспрессия TMEM200A снижалась при уроэпителиальной карциноме мочевого пузыря (BLCA), плоскоклеточной карциноме шейки матки и аденокарциноме шейки матки (CESC), мультиформной глиобластоме (GBM), хромофобии почки (KICH), плоскоклеточной карциноме легкого (LUSC), феохромоцитоме и параганглиоме (PCPG), аденокарциноме прямой кишки (READ) и карциноме эндометрия тела матки (UCEC) (рисунок 2A). В базе данных TIMER2.0 экспрессия TMEM200A увеличилась в CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC и STAD. Кроме того, экспрессия TMEM200A увеличивалась при BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, кожной меланоме (SKCM) и UCEC (рис. 2B).

Сравнивая результаты двух баз данных, мы обнаружили, что панраковая экспрессия TMEM200A была одинаковой в каждой базе данных. Мы получили данные клинического наблюдения и секвенирования РНК 33 пациентов с раком из базы данных TCGA, рассчитали TMEM200A баллы в каждом образце рака с помощью анализа ssGSEA, а затем рассчитали активность генов TMEM200A опухолях и нормальные ткани во многих опухолях. Мы обнаружили, что TMEM200A была высоко выражена в GBM, HNSC, почечном KIRC и THCA (рис. 2C); Таким образом, активность генов TMEM200A была ранжирована в каждой опухолевой ткани. Установлено, что генная активность TMEM200A была самой высокой при KIRC и самой низкой при увеальной меланоме (UVM) (рис. 2D). Последующая оценка уровней экспрессии TMEM200A в тканях человека, проведенная в базе данных HPA, показала, что уровни экспрессии TMEM200A были низкими в большинстве нормальных тканей, но высокими в коре надпочечников, прямой кишке, эндометрии и гладких мышцах (рис. 2E).

В нормальных тканевых клеточных линиях несколько клеточных линий, таких как гранулезные клетки, биполярные клетки, клетки скелетных мышц, стромальные клетки эндометрия и Т-клетки, показали высокую экспрессию TMEM200A, в то время как экспрессия TMEM200A была низкой в большинстве других клеточных линий (рис. 2F). Мы также изучили данные иммуногистохимии (ИГХ) в базе данных HPA, чтобы изучить экспрессию TMEM200A на белковом уровне. Данные, касающиеся окрашивания и интенсивности, показали гораздо более высокие и выраженные уровни экспрессии TMEM200A в тканях колоректального рака (КРР), рака легких (LUAD), рака печени (LIHC), рака молочной железы (BRCA) и рака предстательной железы (PRAD) по сравнению с нормальными тканями (рис. 2G). Эти данные свидетельствуют о том, что TMEM200A широко экспрессируется в различных видах рака и влияет на развитие рака через различные механизмы в разных опухолях.

Клинико-патологическая взаимосвязь и прогноз выживаемости
Для 33 злокачественных опухолей человека мы собрали информацию и клинические данные в когорте панраковых опухолей TCGA (PanCan) с веб-сайта базы данных UCSC Xena и исследовали корреляцию между экспрессией TMEM200A в PanCan и возрастом, степенью патологии, клинико-патологической стадией и статусом выживаемости пациентов. Это исследование показало, что в шести видах рака экспрессия TMEM200A была связана с клинико-патологической стадией, включая BLCA, инвазивную карциному молочной железы (BRCA), карциному пищевода (ESCA), KIRP, SKCM и карциному яичка (TGCT) (рис. 3A). Возраст коррелировал с шестью опухолями, включая инвазивный BRCA, GBM, острый миелоидный лейкоз (LAML), SKCM, карциному тимуса (THYM) и рак эндометрия (UCEC) (рис. 3B). Патологическая степень ассоциировалась с шестью опухолями, включая карциному пищевода (ESCA), HNSC, KIRC, низкодифференцированную глиому головного мозга (LGG), аденокарциному поджелудочной железы (PAAD) и карциному эндометрия (UCEC) (рис. 3C). Статус выживаемости ассоциировался с пятью опухолями, включая карциному коры надпочечников (ACC), BLCA, KIRC, PCPG и увеальную меланому (UVM) (рис. 3D).

Мы провели исследования для различных видов рака на OS, DSS, PFI и DFI с использованием одностороннего регрессионного анализа Кокса с медианным групповым порогом, чтобы узнать больше о корреляции между экспрессией TMEM200A и прогнозом. Результаты анализа ОВ показали, что среди четырех опухолей более высокая экспрессия TMEM200A оказывала большее влияние на прогноз ОВ при четырех опухолях, включая карциному коры надпочечников (АЦЦ ) (Р = 0,037), БЛКА (Р = 0,036), острый миелоидный лейкоз (ЛАМЛ ) (Р = 0,011) и ГК (СТАД) (Р = 0,005). Напротив, более высокая экспрессия TMEM200A имела лучший прогноз для ОВ при пяти опухолях, включая KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), низкодифференцированную глиому головного мозга (LGG ) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) и меланому кожи (SKCM) (P = 0,043) (рис. 3E, F). Для DSS высокая экспрессия TMEM200A имела неблагоприятный прогноз при двух типах опухолей, включая карциному коры надпочечников (АЦЦ ) (P = 0,026) и BLCA (P = 0,015). Высокая экспрессия TMEM200A имела лучший прогноз при четырех типах опухолей, включая KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), низкодифференцированную глиому головного мозга (LGG ) (P = 0,025) и PCPG (P = 0,007) (рис. 3G). Кроме того, для ПФИ более высокая экспрессия TMEM200A имела неблагоприятный прогноз при трех типах опухолей, включая карциному коры надпочечников (АЦЦ) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) и увеальную меланому (UVM ) (P = 0,020). Более высокая экспрессия TMEM200A имела лучший прогноз при двух типах опухолей, включая KIRC (P < 0,001) и глиому низкой степени злокачественности (LGG ) (P = 0,044) головного мозга (рис. 3H). При DFI более высокая экспрессия TMEM200A имела худший прогноз при адренокортикальной карциноме (АЦЦ) (P = 0,044) (рис. 3I).

Впоследствии мы отобрали несколько опухолей (KIRC и KIRP) для регрессионного анализа с несколькими ЦОГ. Результаты показали, что TMEM200A может индивидуально влиять на выживаемость онкологических больных по сравнению с другими клиническими факторами (рис. 3J и K). Эти результаты показали, что TMEM200A может быть использован в качестве независимого биопрогностического маркера при различных видах рака, чтобы повлиять на выживаемость пациентов с раком.

Анализ метилирования ДНК
Одним из эпигенетических изменений, которому уделяется максимальное внимание, является метилирование ДНК29. Было высказано предположение, что один из типов эпигенетических изменений, метилирование ДНК, оказывает существенное влияние на рост опухоли30. Таким образом, используя базу данных SMART, мы оценили уровни метилирования ДНК TMEM200A в нормальных и раковых тканях. Ткани PAAD и PRAD имели более высокие уровни метилирования ДНК TMEM200A , чем нормальные ткани. Тем не менее, TMEM200A имели более низкие уровни метилирования ДНК в COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA и UCEC, чем в нормальных тканях (рис. 4A). Уровни метилирования ДНК TMEM200A были значительно выше в базе данных TCGA в KIRP, PRAD, PCPG и THYM на основе базы данных UALCAN (рис. 4B), но не в BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA и UCEC. Уровень метилирования TMEM200A достоверно снижался в LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA и UCEC (рис. 4C). Для дальнейшего изучения взаимосвязи между уровнем экспрессии TMEM200A и метилирования ДНК и клинико-патологическими факторами мы снова использовали базу данных SMART и обнаружили, что уровень метилирования ДНК TMEM200A в BLCA, HNSC, LUAD и STAD изменялся в зависимости от патологической стадии (рис. 4D). Клинические факторы влияют на уровень метилирования ДНК TMEM200A в вышеуказанных опухолях.

Анализ генных мутаций
Одной из причин развития опухолей является накопление генных мутаций31. Поэтому частота мутаций соматических TMEM200A была проанализирована путем оценки частоты TMEM200A мутаций в панраковых клинических образцах с использованием базы данных cBioPortal. TMEM200A мутирует при многих видах рака, таких как рак легких, эндометриоидная карцинома матки, меланома, рак пищевода, рак костей, рак шейки матки, гепатобилиарный рак, зрелая В-клеточная лимфома, BRCA, рак эндометрия, рак яичников, эмбриональная опухоль, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, КРР, глиома, немелкоклеточный рак легкого, саркома мягких тканей и рак неизвестной первичной локализации (рис. 5A). Кроме того, изменения ДНК могут привести к структурным или аминокислотным изменениям на белковом уровне. На рисунке 5B показана 3D-структура TMEM200A. Используя базу данных cBioPortal, мы нашли сайты мутаций в аминокислотах TMEM200A; миссенс-мутации были наиболее распространенной формой мутаций (рис. 5C).

Мы проанализировали данные с помощью Sangerbox 3.0 для проверки точности сайтов мутаций и достигли тех же результатов, что и ранее. Миссенс-мутации являются наиболее частой формой мутаций в TMEM200A и могут встречаться до 7,8% в SKCM (рис. 5D). Миссенс-мутация — это мутация, при которой кодон, кодирующий одну аминокислоту, претерпевает замену основания и становится кодоном, кодирующим другую аминокислоту, что приводит к изменению типа аминокислоты и последовательности полипептидной цепи. Результатом миссенс-мутации обычно является то, что полипептидная цепь теряет свою первоначальную функцию. Многие белковые аномалии вызваны миссенс-мутацией, которая является распространенным типом мутации опухоли. Было обнаружено, что миссенс-мутации играют ключевую роль в стабильности белков, и наличие мутаций может оказывать существенное влияние на сродство связывания между белками32, изменяя взаимодействия между белками и окружающими коррелятивными макромолекулами33.

Таким образом, миссенс-мутации, скорее всего, влияют на биологическую функцию трансмембранного белка 200А при различных видах рака. Также была изучена корреляция между мутацией гена TMEM200A и прогнозом клинической выживаемости пациентов с онкологическими заболеваниями. Вероятность развития ОВ увеличилась по сравнению с таковой в группе с мутацией TMEM200A, но не в группе без заболевания (рис. 5E). Исследование корреляций генов показало , что TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 и SLC18B1 были среди генов, которые мутировали с TMEM200A (рис. 5F). Мы смогли идентифицировать несколько типов мутаций и однонуклеотидных вариаций (SNV) с помощью базы данных COSMIC, чтобы узнать больше о TMEM200A мутациях в GC. Частота миссенс-замен была самой высокой (38,86%) (рис. 5G), а данные SNV показали, что наиболее распространенными SNV в STAD были G>A (31,73%), за которыми следовали C>T (26,35%) и G>T (11,73%) (рис. 5H).

Одноклеточный анализ TMEM200A при раке
Мы проанализировали уровни экспрессии TMEM200A в различных одиночных клетках с помощью веб-сайта TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center). Онлайн-инструмент TISCH отобразил выражение TMEM200A для 65 наборов данных и 28 типов ячеек на тепловой карте, показанной на рисунке 6A. Результаты показали, что TMEM200A в основном экспрессируется в CD8+ Т-клетках и фибробластах. В этом отношении заслуживает внимания GSE72056 датасет, включающий клетки пациентов с метастатической меланомой кожи (СККМ). TMEM200A была широко экспрессирована в В-клетках, CD4+ Т-лимфоцитах, истощенных CD8+ Т-клетках, эндотелиальных клетках, фибробластах и других типах клеток в микроокружении SKCM (рис. 6B, C). В наборе данных GSE146771, который содержит клетки пациентов с КРР, TMEM200A была широко экспрессирована в В-клетках, CD4+ Т-лимфоцитах, CD8+ Т-клетках, истощенных CD8+ Т-клетках, эндотелиальных клетках, фибробластах и других типах клеток в микроокружении КРР (рис. 6D, E). С помощью базы данных CancerSEA определяли уровни экспрессии и функциональное состояние TMEM200A в конкретных опухолевых клетках (рис. 6G). TMEM200A экспрессия сильно коррелировала с функциональным состоянием клеток при ряде видов рака, включая глиобластому (ГБМ), аденокарциному легкого (ЛУАД), хронический гранулоцитарный лейкоз (ХМЛ), КРР, ретинобластому (РБ) и увеальную меланому (УМ). Ангиогенез, апоптоз, дифференцировка и воспаление положительно коррелировали с экспрессией TMEM200A в большинстве опухолевых клеток, в то время как повреждение ДНК, репарация, инвазия и метаболизм ДНК отрицательно коррелировали с экспрессией TMEM200A (рис.

Функциональный анализ и обогащение путей TMEM200A при различных видах рака
Мы изучили связь между TMEM200A и белками со схожими функциями, используя сеть GGI для изучения функции TMEM200A при различных видах рака (рис. 7A). Геномная и протеомная информация анализируется GeneMANIA с помощью списка целевых генов. Обнаружив гены, которые работают аналогично TMEM200A, были обнаружены 40 белков, которые непосредственно взаимодействуют с этим геном. Корреляция этих генов показана сетью PPI (рис. 7B). Впоследствии, GO и KEGG анализ обогащения этих 20 генов, тесно связанных с TMEM200A , показал, что эти соседние гены в основном вовлечены в негативную регуляцию РНК подавления экспрессии генов. Анализ KEGG показал, что TMEM200A был в изобилии в путях, включая сигнальный путь Wnt и клеточное старение (рис. 7C). Анализ обогащения ГО показал, что в молекулярной функции TMEM200A был в основном в изобилии в кальциевых каналах и отрицательно регулировался подавлением экспрессии генов РНК (рис. 7D).

Корреляционный анализ между TMEM200A и иммунной инфильтрацией
Далее мы исследовали корреляцию между экспрессией TMEM200A и инфильтрацией иммунных клеток, чтобы продемонстрировать корреляцию между TMEM200A и иммунитетом к раку. Мы провели анализ иммунной инфильтрации CIBERSORT с использованием панраковых данных Sangerbox 3.0. Результаты показали, что панраковая экспрессия TMEM200A коррелировала с CD8+ Т-клетками, CD4+ Т-клетками, В-клетками, Т-хелперами, естественными киллерами, регуляторными Т-клетками, моноцитами, макрофагами, дендритными клетками, эозинофилами, базофилами и гранулоцитами (рис. 8А). Затем мы рассмотрели корреляцию между экспрессией TMEM200A и TIL (опухолевые инфильтрирующие лимфоциты) с использованием базы данных TISIDB, показав тесную корреляцию между экспрессией TMEM200A и обилием 28 TIL при различных типах рака (рис. 8B). Мы использовали базу данных TISIDB для оценки корреляции между экспрессией TMEM200A и иммуносупрессивными препаратами при злокачественных новообразованиях человека, чтобы более тщательно изучить, как связаны иммуномодуляторы и экспрессия TMEM200A. Результаты показали, что уровни экспрессии TMEM200A значительно коррелировали с иммунодепрессантами при различных видах рака (рис. 8C). Значимые корреляции между экспрессией TMEM200A и некоторыми иммуносупрессивными агентами были обнаружены при раке яичек и УМ (рис. 8D-F). Затем мы провели корреляционный анализ экспрессии TMEM200A с иммуностимулирующими факторами и молекулами MHC с использованием базы данных TISIDB (рис. 8G, H). Результаты показали, что экспрессия TMEM200A коррелировала с выбранными иммуностимуляторами и молекулами MHC при уротелиальной карциноме мочевого пузыря, карциноме яичка, карциноме коры надпочечников и УМ (рис. 8I-L). Следующим шагом было исследование корреляции между экспрессией TMEM200A и иммунологическими или молекулярными подтипами в когорте TCGA PanCan в базе данных TISIDB. Мы обнаружили, что иммунологические подгруппы девяти различных типов рака экспрессировались TMEM200A по-разному, включая BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT и BRCA (рис. 8M). Кроме того, шесть различных форм рака с различными молекулярными подгруппами, включая HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV и LUSC, демонстрировали вариабельную экспрессию TMEM200A (рис. 8N).

TMEM200A и анализ ответа на иммунотерапию
Эффективность ингибиторов PD-1/PD-L1 высоко коррелирует с TMB, и некоторых пациентов с опухолями можно в некоторой степени предсказать с помощью маркеров TMB для эффективности иммунотерапии34. Микросателлитная нестабильность (MSI) - это термин, используемый для описания функции дефектной репарации несоответствия ДНК (MMR), когда ошибки репликации микросателлитов не исправляются и накапливаются, изменяя длину или состав оснований микросателлитов35. MSI является онкомаркером клинического значения 36. Таким образом, мы оценили влияние экспрессии TMEM200A на иммунотерапию, изучив корреляцию между экспрессией TMEM200A и TMB или MSI. Результаты продемонстрировали существенную положительную корреляцию между экспрессией TMEM200A и TMB в THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP и KIRC, но TMEM200A экспрессия отрицательно коррелировала с UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM и BRCA (рис. 9A). Экспрессия MSI и TMEM200A были сильно и благоприятно связаны при TGCT, в то время как экспрессия TMEM200A значимо и отрицательно коррелировала с MSI в UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC и CHOL (рис. 9B). Мы также оценили потенциал TMEM200A в качестве биомаркера для изучения эффективности ICB. Результаты показали, что только TMEM200A предсказывали реакцию ICB с точностью Area Under Curve (AUC) > 0,5 в 7 из 25 субпопуляций ICB. TMEM200A показали более высокую прогностическую ценность, чем клоны Т- и В-клеток, оба из которых имели значение 5. Однако значение для TMEM200A было ниже, чем для TIDE (AUC > 0,5 в 11 субпопуляциях ICB), показателя MSI (AUC > 0,5 в 11 субпопуляциях ICB), CD274 (AUC > 0,5 в 15 субпопуляциях ICB), CD8 (AUC > 0,5 в 17 субпопуляциях ICB), IFNG (AUC > 0,5 в 16 субпопуляциях ICB) и Merck18 (AUC > 0,5 в 17 субпопуляциях ICB) (рис. 9C). Неблагоприятный прогноз выживаемости в когортах ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 и ICB_Hugo 2016_PD1 коррелировал с высокой экспрессией TMEM200A . Тем не менее, нокдаун TMEM200A усиливал опосредованный лимфоцитами потенциал уничтожения опухоли в средней когорте Kearney 2018 T_PD1 и Pan 2018 OT1 (рис. 9D).

Анализ обогащения TMEM200A при различных видах рака с помощью GSEA
Мы использовали ДЭГ между TMEM200A подгруппами с высокой экспрессией и TMEM200A подгруппами с низкой экспрессией в 32 злокачественных новообразованиях, чтобы изучить характеристики рака, связанные с TMEM200A. Мы обнаружили существенную корреляцию между первичным иммунодефицитом, сигнальным путем RIG (ген, индуцируемый ретиноевой кислотой)-I-подобным рецептором, и экспрессией TMEM200A при панраке, особенно при BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC и SKCM (рис. 10). Вирусный цитоплазматический белок рибонуклеиновая кислота обнаруживается сигнальным путем RIG-I-подобного рецептора. RIG-I-подобные рецепторы могут влиять на выработку различных воспалительных цитокинов в организме, активируя сигнальный путь NF-kB путем вовлечения определенных белков внутриклеточного соединения. В результате трансмембранный белок 200A (TMEM200A) может играть решающую роль в рекрутировании внутриклеточных белков RIG-I-подобным рецептором. Эти результаты свидетельствуют о сильной корреляции между экспрессией TMEM200A и иммунологической инфильтрацией. Кроме того, анализ обогащения GSEA показал, что панраковая экспрессия TMEM200A коррелирует с передачей сигналов хемокинов, клеточной адгезией, соединениями цитокиновых рецепторов, путями чувствительности клеточных мембран и контролем аутофагии (рис. 10). Трансмембранные белки могут функционировать как молекулы адгезии, воздействуя на микроокружение опухоли, в дополнение к тому, что они играют решающую роль в контроле поступления ионов кальция в клетку из резервуаров кальция 36. Таким образом, результаты, полученные в результате анализа обогащения GSEA, могут быть обусловлены участием TMEM200A во многих физиологических процессах, включая активацию путей передачи сигнала, формирование ионных каналов плазматической мембраны, а также регуляцию клеточного хемотаксиса, адгезии, апоптоза и аутофагии9.

Мы идентифицировали 50 основных генов STAD, как положительно, так и отрицательно коррелирующих с TMEM200A из базы данных LinkedOmics, которые были совместно экспрессированы в STAD, в виде тепловых карт (рис. 11A,B). Мы положительно оценили 5 основных генов и 5 генов, отрицательно ассоциированных с TMEM200A при ГК (рис. 11C). Наши результаты показали, что экспрессия TMEM200A коррелировала с коэкспрессией SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) и SYTL1 (r = -0,33). Мы проанализировали результаты пороговой визуализации, чтобы лучше понять роль TMEM200A в STAD. Для скрининга использовали следующие критерии: log2-кратное изменение (FC) > 2,0 и скорректированное значение P 0,05. Мы обнаружили 483 ДЭГ, из которых 385 были повышены, а 98 понижены, и выбрали 100 из них для визуализации для создания тепловой карты (рис. 11D). Затем, для ДЭГ, которые удовлетворяли критериям отбора, мы провели анализ обогащения GO и KEGG. Результаты анализа обогащения ГО показали, что обогащение БП (биологический процесс) в основном ассоциировалось с внеклеточным матриксом и структурной тканью, обогащение КК (клеточным компонентом) в основном ассоциировалось с коллагенсодержащим внеклеточным матриксом и базальной мембраной, а МФ (молекулярная функция) в основном обогащалось структурой внеклеточного матрикса и связыванием гликозаминогликанов (рис. 11E и рис. 11G). Обогащение KEGG-анализа показало, что TMEM200A в основном обогащен по пути взаимодействия рецепторов внеклеточного матрикса, цитохрома Р450 и ренин-ангиотензиновой системы (рис. 11F и рис. 11H).

Прогностическая модель на основе TMEM200A и клинические особенности рака желудка
Мы исследовали корреляцию между TMEM200A и клиническими данными пациентов с STAD и, следовательно, проанализировали клинико-патологические характеристики пациентов в когорте TCGA-STAD методом логистического регрессионного анализа и на основе уровней экспрессии TMEM200A (рис. 12А). Возраст, клиническая стадия и экспрессия TMEM200A существенно коррелировали с ОВ у пациентов с СТАД, согласно одномерному регрессионному анализу Кокса (рис. 12B). Многофакторный регрессионный анализ Кокса показал, что экспрессия TMEM200A может быть самостоятельным прогностическим фактором для ОВ у пациентов с СТАД (ОР = 1,282, 95% ДИ = 1,066-1,541, P = 0,008) (рис. 12C). Мы изучили потенциал этих клинико-патологических характеристик для прогнозирования ОВ через 1, 3 и 5 лет в STAD с использованием стандартной модели линейного столбчатого графика в сочетании с несколькими клиническими параметрами (рис. 12D). Калибровочные кривые вероятности выживаемости в течение 1 года в значительной степени согласуются с вероятностями, предсказанными на графике столбцов (рис. 12E).

TMEM200A апрегуляция в клетках STAD и усиление клеточной пролиферации
Изучив литературу, относящуюся к TMEM200A, мы обнаружили, что высокая экспрессия TMEM200A указывает на плохой прогноз 13, а на иммунное микроокружение ГК может влиять TMEM200A, действующая как молекула адгезии37, тем самым способствуя инвазии и метастазированию клеток ГК. Мы изучили уровни белков и транскриптов мРНК TMEM200A в клеточных линиях STAD, чтобы подтвердить результаты вышеупомянутого исследования. Клеточная линия ГХ HGC-27 значительно переэкспрессировала TMEM200A по сравнению со здоровой эпителиальной клеточной линией слизистой оболочки желудка GES-1 как на уровне белка, так и на уровне транскрипта мРНК (рис. 13A, B), что указывает на то, что TMEM200A была сверхэкспрессией в клетках HGC-27. В результате были проведены следующие тесты с использованием клеток HGC-27. Между тем, чтобы доказать точность экспериментальных результатов, мы использовали кОТ-ПЦР для сравнения дифференциальной экспрессии мРНК TMEM200A в клетках ГК человека SGC-7901 и эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка GES-1, и результаты показали, что TMEM200A высоко экспрессируется в клетках SGC-7901 (рис. 13B). TMEM200A сбивали в клетках HGC-27 для изучения возможного участия TMEM200A в STAD (рис. 13C). На основании результатов анализа базы данных и корреляционного анализа TMEM200A было установлено, что TMEM200A в основном участвует в пути взаимодействия рецепторов внеклеточного матрикса, что связано с пролиферацией и инвазией рака. Таким образом, мы использовали анализ CCK-8, чтобы установить, как экспрессия TMEM200A влияет на рост клеток. Анализ CCK-8 показал, что TMEM200A нокдаунных группах (Si-RNA2 и Si-RNA3) показали заметное снижение жизнеспособности клеток по сравнению с группой NC (рис. 13D). Эти данные свидетельствуют о том, что TMEM200A был повышен в STAD, и его уровень экспрессии мог влиять на пролиферацию GC-клеток. Основываясь на результатах анализа обогащения KEGG на рисунке 11F, мы обнаружили, что TMEM200A ассоциирован с сигнальным путем PI3K/AKT при ГК, и TMEM200A, как фактор клеточной адгезии, может влиять на механизм канцерогенеза желудка, влияя на ЭМП. Поэтому мы использовали вестерн-блоттинг для проверки влияния нокдауна TMEM200A на EMT и сигнальный путь PI3K/AKT до и после нокдауна. Результаты показали, что экспрессия белка P-AKT была снижена в группе TMEM200A нокдауна (TMEM200A-SiRNA2) по сравнению с отрицательной контрольной группой (NC), в то время как уровни белков N-кадгерина, виментина и Snai также были снижены, а экспрессия белка E-кадгерина была увеличена (рис. 13E). Все эти результаты свидетельствуют о том, что TMEM200A может влиять на ЭМП через сигнальный путь PI3K/AKT и, таким образом, играть определенную роль в ГХ.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс исследования. Сокращения: TCGA = База данных Атласа генома рака; TIMER2.0 = база данных TIMER2.0; OS= общая выживаемость; PFS = Время выживания без прогрессии; DSS = выживаемость при конкретном заболевании; DFS = безрецидивная выживаемость; TMB = мутационная нагрузка опухоли; MSI = Микросателлитная нестабильность; PPI = белок-белковое взаимодействие; GGI = Ген-генное взаимодействие; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; GO = онтология гена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Уровни экспрессии TMEM200A при различных видах рака. (A) Повышенная или пониженная экспрессия TMEM200A из набора данных TCGA при различных злокачественных новообразованиях человека. (B) Анализ уровней экспрессии TMEM200A в опухолевых и нормальных тканях с использованием базы данных TIMER2.0. (C) Дифференциальный анализ активности TMEM200A генов при различных видах рака человека из набора данных TCGA. (D) Ранжирование уровней активности генов TMEM200A при различных видах рака человека на основе оценки ssGSEA. (E) TMEM200A уровни экспрессии из базы данных HPA в здоровых тканях. (F) Уровни экспрессии TMEM200A в базе данных HPA в нормальных клеточных линиях. (G) Исходы ИГХ для экспрессии TMEM200A белка при раке из базы данных HPA. Сокращения: TCGA = Атлас генома рака; ssGSEA = Анализ обогащения набора генов в одном образце; HPA = Атлас белков человека; ИГХ = иммуногистохимия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Корреляция экспрессии TMEM200A с клинико-патологическими характеристиками и прогнозом различных опухолей. (A) Корреляция экспрессии TMEM200A в когорте TCGA pan-cancer (PanCan) с клинико-патологической стадией в каждой опухоли была проанализирована с использованием базы данных UCSC Xena. (B) Корреляция экспрессии TMEM200A в когорте TCGA PANCAN с возрастом пациента в каждой опухоли. (C) Корреляция экспрессии TMEM200A в когорте TCGA PANCAN с патологической степенью опухоли в каждой опухоли. (D) Корреляция экспрессии TMEM200A в когорте TCGA PanCan со статусом выживаемости пациентов в каждой опухоли. (E) Корреляционный анализ экспрессии TMEM200A с общей выживаемостью при различных видах рака с использованием регрессионной модели Кокса. (F) Корреляция между экспрессией TMEM200A и прогнозом панраковой ОВ в когорте TCGA PanCan. (G) Корреляция между экспрессией TMEM200A и выживаемостью при конкретном заболевании. (H) Корреляция между экспрессией TMEM200A и интервальным прогнозом без прогрессирования в когорте TCGA PanCan. (I) Корреляция между экспрессией TMEM200A и интервалом отсутствия заболевания. (J) Многофакторный регрессионный анализ ЦОГ был выполнен на KIRC. (K) Многофакторный регрессионный анализ ЦОГ был проведен на KIRP. Сокращения: TCGA = Атлас генома рака; KIRC: Светлоклеточная карцинома почки; KIRP: Почечно-папиллярноклеточная карцинома; OS = Общая выживаемость; DSS = выживаемость при конкретном заболевании; PFI = интервал без прогрессии; DFI = Интервал без заболеваний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ метилирования ДНК TMEM200A при различных видах рака. (A) Уровни метилирования промоторов TMEM200A были изучены при нескольких типах рака, согласно базе данных SMART. (B) Более высокие уровни метилирования промоторов TMEM200A при различных типах рака, чем в нормальных тканях, были изучены в соответствии с базой данных UALCAN. (C) Используя базу данных UALCAN, было определено, что нормальные ткани имеют более низкие уровни метилирования промоторов TMEM200A при нескольких типах рака. (Д) Уровень метилирования ДНК TMEM200A в BLCA, HNSC, LUAD и STAD изменялся в зависимости от патологической стадии. Сокращения: BLCA=уротелиальная карцинома мочевого пузыря; HNSC= плоскоклеточная карцинома головы и шеи; LUAD=Аденокарцинома легкого; STAD= Аденокарцинома желудка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: TMEM200A генных мутаций при различных видах рака. (A) Анализ TMEM200A типов генных мутаций при различных видах рака с использованием базы данных cBioPortal. (Б) 3D белковая структура TMEM200A. Область связывания обозначена цветной частью, в то время как другие участки TMEM200A показаны серой частью. (C) Изоформы и распределение TMEM200A соматических мутаций. Ось Х, аминокислотные сайты; ось y, количество мутаций TMEM200A ; зеленые точки, миссенс-мутации; и серые точки, усеченные мутации. (D) Валидация изоформ и распределения TMEM200A соматических мутаций с использованием данных Sangerbox 3.0. (E) Для всех опухолей TCGA корреляция между мутационным статусом и прогнозом общей выживаемости пациентов была исследована с использованием базы данных cBioPortal, где красные квадраты обозначали TMEM200A мутационную группу, а синие квадраты — немутировавшую группу. (F) Гены, комутировавшие с TMEM200A , были проанализированы с помощью инструмента cBioPortal: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 и SLC18B1. (G) Анализ TMEM200A типов мутаций в ГК с использованием базы данных COSMIC (H) Анализ TMEM200A типов SNV в GC был проведен с использованием базы данных COSMIC . Сокращения: TCGA = Атлас генома рака; OS = общая выживаемость; COSMIC = каталог соматических мутаций в раковых клетках; GC = Рак желудка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Одноклеточный корреляционный анализ экспрессии TMEM200A при различных видах рака. (A) Краткая информация о выражении TMEM200A на веб-сайте TISCH. (B) Распределение восьми различных типов клеток в наборе данных о метастатической меланоме кожи GSE72056. (C) Уровни экспрессии TMEM200A в клетках кожной метастатической меланомы из набора данных GSE72056. (D) Распределение 13 различных типов клеток в наборе данных о колоректальном раке из GSE146771. (E) TMEM200A уровни экспрессии в клетках колоректального рака из набора данных GSE146771. (F) Корреляция экспрессии TMEM200A с одноклеточным функциональным статусом при множественных опухолях была продемонстрирована с использованием базы данных CancerSEA. (G) Карты T-SNE, иллюстрирующие уровни экспрессии TMEM200A в отдельных опухолевых клетках, включая GBM, LUAD, CML, CRC, RB и UM. Сокращения: GBM = Глиобластома; LUAD = Аденокарцинома легкого; ХМЛ = Хронический гранулоцитарный лейкоз; CRC = колоректальный рак; RB = Ретинобластома; UM = Увеальная меланома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Анализ сети коэкспрессии и функционального обогащения TMEM200A на генном уровне. (A) Сеть TMEM200A GGI и ее коэкспрессируемые гены. (B) Сеть PPI. (С,Д) TMEM200A и совместно экспрессируемые гены были проанализированы на обогащение путей GO и KEGG. Сокращения: ИПП = белок-белковое взаимодействие; GGI = Ген-генное взаимодействие; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; GO = онтология гена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Корреляция между экспрессией TMEM200A и иммунных клеток, иммунодепрессантов, иммуностимулирующих веществ и молекул MHC при различных типах рака. (A) Тепловая карта Sangerbox 3.0, демонстрирующая корреляцию между экспрессией TMEM200A и иммунными инфильтрирующими клетками. (B) Тепловая карта, показывающая корреляцию между иммунно инфильтрирующими клетками и экспрессией TMEM200A в базе данных TISIDB. (C) Тепловая карта, показывающая корреляцию между иммуносупрессивными клетками и экспрессией TMEM200A в базе данных TISIDB. (Д-Ж) Корреляция между экспрессией TMEM200A и некоторыми иммунодепрессантами при раке яичек и увеальной меланоме. (G) Тепловая карта, показывающая корреляцию между иммуностимулирующими факторами и экспрессией TMEM200A в базе данных TISIDB. (H) Тепловая карта корреляции между экспрессией TMEM200A и молекулами MHC в базе данных TISIDB. (И-Л) Корреляция между экспрессией TMEM200A и некоторыми иммуностимулирующими факторами и молекулами MHC при уротелиальной карциноме мочевого пузыря, карциноме яичка, карциноме коры надпочечников и увеальной меланоме. (M) Корреляция между панраковыми иммунными подгруппами и экспрессией TMEM200A. (N) Корреляция между панраковыми молекулярными подгруппами и экспрессией TMEM200A. Сокращения: MHC = Major histocompatibility complex. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Анализ иммунотерапевтического ответа TMEM200A при панцитопении. (А) Корреляция экспрессии TMEM200A при различных видах рака с ТМБ. (B) Корреляция между MSI при панраке и экспрессией TMEM200A . (с) TMEM200A потенциал в качестве биомаркера для прогнозирования ответа на блокаду контрольных точек иммунного ответа. (D) Для ранжирования использовали средневзвешенное значение корреляции TMEM200A с результатом выживаемости ICB и логарифмическим изменением складки (logFC) при скрининге CRISPR. Сокращения: TMB = мутационная нагрузка опухоли; ICB = блокада иммунных контрольных точек; CRISPR = Кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Анализ обогащения TMEM200A при различных видах рака. Пять основных путей, в которых TMEM200A играли важную функциональную роль в регуляции 32 видов рака, были идентифицированы с помощью анализа обогащения GSEA. На левой панели показаны результаты анализа обогащения GSEA для TMEM200A в ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ и SARC. На правой панели показаны результаты анализа обогащения GSEA для TMEM200A в SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS и UVM. Сокращения: GSEA = Анализ обогащения набора генов; ACC = Карцинома коры надпочечников; BLCA = уротелиальная карцинома мочевого пузыря; BRCA = инвазивная карцинома молочной железы; CESC = плоскоклеточный рак шейки матки и эндоцервикальная аденокарцинома; CHOL = холангиокарцинома; COAD = аденокарцинома толстой кишки; ESCA = карцинома пищевода; GBM = мультиформная глиобластома; HNSC = плоскоклеточная карцинома головы и шеи; KICH = хромофоб почек; KIRC = Светлоклеточная карцинома почки; KIRP = Почечно-почечно-папиллярная карцинома; LAML = острый миелоидный лейкоз; LGG = глиома головного мозга низшей степени злокачественности; LIHC = Гепатоцеллюлярная карцинома печени; LUAD = Аденокарцинома легкого; LUSC = плоскоклеточная карцинома легкого; MESO = Мезотелиома; OV = Серозная цистаденокарцинома яичника; PAAD = аденокарцинома поджелудочной железы; PCPG = феохромоцитома и параганглиома; PRAD = аденокарцинома предстательной железы; ПРОЧИТАЙТЕ: Аденокарцинома прямой кишки; SARC=Саркома; SKCM = кожная меланома; STAD = аденокарцинома желудка; ТГКТ = герминогенные опухоли яичек; THCA = Карцинома щитовидной железы; THYM = тимома; UCEC = карцинома эндометрия тела матки; UCS = Карциносаркома матки; UVM = Увеальная меланома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11: TMEM200A в STAD. (A) Топ-50 генов, обнаруженных с отрицательной корреляцией с экспрессией TMEM200A в STAD по базе данных LinkedOmics. (B) Топ-50 генов в STAD, которые были положительно связаны с TMEM200A. (C) TMEM200A пять самых позитивно и пять отрицательно коррелированных генов в STAD. (D) Тепловая карта ДЭГ в STAD. (Э-Н) Исследование обогащенных путей GO и KEGG с использованием скрининговых ДЭГ. Сокращения: STAD=Аденокарцинома желудка; DEGs= Дифференциальная экспрессия генов; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; GO = онтология гена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 12
Рисунок 12: Корреляция между клиническими признаками STAD и уровнем экспрессии TMEM200A . (A) Анализ уровней экспрессии TMEM200A и клинических признаков STAD с использованием логистической регрессии. (В,В) Кокс-анализ лесных участков STAD по одной и нескольким переменным. (D) Столбчатые линейные диаграммы, прогнозирующие ОВ у пациентов с STAD на основе пола, степени патологии, возраста, патологической стадии и экспрессии TMEM200A . (E) Калибровочные графики, показывающие калибровку модели столбчатого линейного графика. Сокращения: STAD= Аденокарцинома желудка; OS=Общая выживаемость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 13
Рисунок 13: Экспрессия TMEM200A повышается в STAD и способствует пролиферации раковых клеток желудка. (А) Обнаружение экспрессии TMEM200A в клетках рака желудка HGC-27 и эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка GES-1 методом вестерн-блоттинга. (B) Обнаружение экспрессии TMEM200A в клетках ГК HGC-27 и SGC-7901, а также эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка GES-1 методом ОТ-ПЦР. (C) Эффективность экспрессии TMEM200A была значительно снижена в группе TMEM200A нокдауна по сравнению с группой без нокдауна в GC-клетках HGC-27, что было продемонстрировано с помощью ОТ-ПЦР. (D) TMEM200A нокдаун значительно ингибировал пролиферацию клеток GC, измеренную с помощью анализа CCK8. (E) Нокдаун TMEM200A значительно ингибировал родственные белки в EMT и влиял на фосфорилирование AKT в сигнальном пути PI3K/AKT. Аббревиатура: GC = Рак желудка; qRT-PCR: количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; EMT=эпителиально-мезенхимальный переход; AKT=Протеинкиназа B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TMEM200A принадлежит к семейству ТМЭМ, которые необходимы для пролиферации раковых клеток38. Вариабельная экспрессия TMEM200A при различных злокачественных новообразованиях привлекла меньше внимания, и отсутствует тщательное панраковое исследование. Тем не менее, продолжают накапливаться данные, показывающие, что семейство трансмембранных белков TMEM может играть важную роль в поддержании злокачественности раковых клеток за счет взаимодействия с несколькими белками, например, активация TMEM16A Ca2+-активированных Cl-каналов ROCK1/moesin способствует метастазированию BRCA39. Поэтому в текущей работе наш анализ был сосредоточен на изучении возможности использования TMEM200A в качестве терапевтической мишени для лечения рака и диагностического маркера опухоли. В частности, мы исследовали уровни экспрессии TMEM200A в 33 злокачественных опухолях с использованием данных РНК-секвенирования из базы данных UCSC Xena, а результаты базы данных TIMER2.0 успешно подтвердили результаты анализов в базе данных UCSC Xena.

Впоследствии для анализа уровней экспрессии TMEM200A в различных типах моноцитов был использован веб-инструмент Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) и база данных CancerSEA. Веб-сайты Sangerbox и TISIDB были использованы для того, чтобы понять , как TMEM200A влияет на иммунную инфильтрацию. Мы также определили сигнальные пути, в которых TMEM200A играет ключевую функцию при каждом раке, с помощью анализа обогащения GSEA, чтобы понять основные функциональные роли TMEM200A в каждом злокачественном новообразовании.

TMEM200A может действовать как молекула адгезии, контролируя иммунную среду ГК и способствуя инвазивному распространению клеток ГК. Таким образом, мы идентифицировали 483 дифференциально экспрессируемых гена (ДЭГ), ассоциированных с уровнем экспрессии TMEM200A , с помощью базы данных TCGA, и проанализировали обогащение этих 483 ДЭГ GO и KEGG. Результаты обогащения показали, что путь PI3K/AKT играет ключевую роль в развитии рака, а путь PI3K/AKT может быть одним из движущих факторов рака.

Кроме того, мы провели клеточные и молекулярные тесты после того, как узнали больше о важнейшей функции TMEM200A в стимулировании развития рака, чтобы подтвердить корреляцию между экспрессией TMEM200A и активностью клеток STAD. Как и ожидалось, мы обнаружили, что подавление TMEM200A в клетках STAD значительно снижает клеточную пролиферацию, и что линии раковых клеток экспрессируют TMEM200A на значительно более высоких уровнях, чем нормальные клеточные линии. Изучив литературу, относящуюся к семейству трансмембранных белков в последние годы, мы обнаружили, что трансмембранные белки, как молекулы клеточной адгезии37, играют регуляторную роль в ЭМП.

Кроме того, по результатам анализа обогащения генов, связанных с TMEM200A при ГК, мы обнаружили, что TMEM200A может играть регуляторную роль в сигнальном пути PI3K/AKT при ГК. Эксперименты с вестерн-блоттингом показали, что нокдаун TMEM200A может уменьшать белки виментина, N-кадгерина и Snai и ингибировать фосфорилирование AKT, предполагая, что TMEM200A регулирует микроокружение опухоли, влияя на EMT, и что сигнальный путь PI3K/AKT может быть вовлечен в TMEM200A-опосредованную регуляцию развития ГК. В последние годы некоторые исследования показали, что ЭМП является основной причиной резистентности к химиотерапевтическим препаратам у пациентов с ГК. Эпителиально-мезенхимальная пластичность (ЭМИ) и микроокружение опухоли описаны как лимитирующие факторы для эффективного лечения многих типов рака40. Возникновение ЭМП может привести к тому, что клетки ГК потеряют свои характерные свойства и проявят характеристики мезенхимальных клеток41. Эта особенность не только снижает чувствительность пациентов с ГК к химиотерапевтическим препаратам, но и усиливает инвазивную и миграционную способность клеток ГК, приводя к метастазированию опухоли. Таким образом, по причинам, упомянутым выше, наше исследование способствует исследованию и разработке ключевых регуляторных точек в ЭМП и разработке новых таргетных терапевтических подходов, изучая специфический механизм действия TMEM200A, влияющих на ЭМП.

В последние годы использование биоинформатики в научных исследованиях возросло, и для этого исследования мы обратились к данным из нескольких интернет-баз данных. Использование этих онлайновых баз данных в биоинформатике упростило и ускорило изучение рака, а также предоставило исследователям доступные средства проверки своих результатов.

Однако метод биоинформатики имеет определенные недостатки. Когда мы используем эти базы данных для анализа, одно и то же исследование может дать противоречивые или даже противоречивые результаты в нескольких базах данных, поскольку многие онлайн-базы данных включают данные из нескольких наборов данных. Кроме того, многие базы данных не обновляются в течение очень долгого времени, и из-за трудностей с авторским правом их содержание никогда не может быть расширено; Поэтому аналитические выводы, которые исследователи получают из этих баз данных, всегда ограничены. Поэтому в этом исследовании мы использовали различные базы данных для коллективного изучения результатов, чтобы преодолеть эти ограничения и обеспечить правильность выводов. Чтобы убедиться в том, что полученные нами результаты не претерпели существенных изменений, мы повторили процедуру при использовании различных баз данных для анализа. Результаты экспериментов с вестерн-блоттингом подтвердили наше биоинформатическое предсказание о том, что TMEM200A можем контролировать ЭМП при ГК, регулируя сигнальный путь PI3K/AKT, который затем будет влиять на пролиферацию клеток ГК. Мы спрогнозировали механизм действия TMEM200A с помощью биоинформатики совместно с соответствующей литературой.

Таким образом, данная работа демонстрирует, как инструменты биоинформатики могут значительно облегчить планирование экспериментов и быть использованными для составления многих других типов прогнозов научных исследований. Будущие исследователи рака, скорее всего, примут первичную парадигму сочетания экспериментальной проверки с биоинформатическим прогнозированием, и эта работа служит хорошей моделью для достижения этой цели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82160550).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Tags

TMEM200A Мультиомный анализ Панраковый биомаркер Трансмембранный белок Иммунная инфильтрация Данные РНК-секвенирования Диагностический биомаркер Прогностический биомаркер Рак желудка (ГК) Культуры клеток in vitro Нокдаун Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР) Вестерн-блоттинг Злокачественное поведение Образование опухолей Эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) Сигнальный путь PI3K/AKT Ингибирование пролиферации
Мультиомный анализ <em>TMEM200A</em> как панракового биомаркера
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter