Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Pan-Kanser Biyobelirteci Olarak TMEM200A'in Multiomik Analizi

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

Burada, kanserde TMEM200A biyolojik fonksiyonlarını incelemek için çoklu biyoinformatik araçların birleştirildiği bir protokol sunulmaktadır. Ek olarak, biyoinformatik tahminleri deneysel olarak da doğruluyoruz.

Abstract

TMEM200A transmembran proteinin insan kanserleri ve immün infiltrasyon ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Burada, yaygın kanserlerde TMEM200A fonksiyonunu multiomik analiz ile değerlendirdik ve sonuçları doğrulamak için mide hücrelerinin in vitro hücre kültürlerini kullandık. Çeşitli insan kanser türlerinde TMEM200A ekspresyonu, UCSC Xena veri tabanından alınan RNA-seq verileri kullanılarak değerlendirildi. Biyoinformatik analiz, TMEM200A'in tanısal ve prognostik bir biyobelirteç olarak potansiyel bir rolünü ortaya koymuştur.

Normal mide ve kanser hücre hatlarının kültürleri büyütüldü ve TMEM200A yıkıldı. TMEM200A ekspresyon düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ve western blotlama kullanılarak ölçüldü. Daha sonra mide kanseri (GC) hücrelerinin malign davranışı ve tümör oluşumunda TMEM200A rollerini belirlemek için in vitro fonksiyon kaybı çalışmaları kullanıldı. Yıkımın GC'de epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve PI3K/AKT sinyal yolu üzerindeki etkisini değerlendirmek için Western blotları kullanıldı. Biyoinformatik analiz, TMEM200A GC'de yüksek düzeyde eksprese edildiğini göstermiştir.

GC hücrelerinin proliferasyonu, vimentin, N-kaderin ve Snai proteinlerini de azaltan ve AKT fosforilasyonunu inhibe eden TMEM200A yıkımı ile inhibe edildi. PI3K/AKT sinyal yolunun, GC gelişiminin TMEM200A aracılı düzenlenmesinde de rol oynadığı görülmüştür. Burada sunulan sonuçlar , TMEM200A'in EMT'yi etkileyerek tümör mikroçevresini düzenlediğini göstermektedir. TMEM200A ayrıca PI3K / AKT sinyali yoluyla EMT'yi etkileyebilir, böylece tümör mikroçevresini etkileyebilir. Bu nedenle, pan-kanserlerde, özellikle GC'de, TMEM200A potansiyel bir biyobelirteç ve onkogen olabilir.

Introduction

Kanser, dünya çapında yüksek morbidite ve mortalite oranları nedeniyleküresel olarak insan sağlığını tehlikeye atan kalıcıbir halk sağlığı sorunu olarak ortaya çıkmıştır1 ve topluma ağır bir mali ve tıbbi yük oluşturmaktadır 2. Kanser belirteçlerininkeşfi sayesinde son yıllarda kanser tedavisinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir 3 ve araştırmacılar kanseri tedavi etmek için yeni tanı yöntemleri ve yeni ilaçlar geliştirmiştir. Bununla birlikte, kanserli bazı hastalar, ilaç direnci, ilaçların yan etkileri ve kimyasal duyarlılık gibi faktörler nedeniyle hala kötü prognoza sahiptir4. Bu nedenle, erken evre kanserlerin taranması ve tedavisi için yeni biyobelirteçlerin belirlenmesine acil ihtiyaç vardır5.

Zar proteinleri, hücrelere ve organel zarlarınabağlanabilen ve entegre olabilen proteinlerdir 6. Bunlar, zara bağlanma gücüne ve konumlarına bağlı olarak üç kategoride gruplandırılabilir: lipid bağlantılı proteinler, integral proteinler ve periferik zar proteinleri 7,8. Bir transmembran (TMEM) proteini, biyolojik membrandan tamamen veya kısmen geçen en az bir transmembran segment9'dan oluşan entegre bir membran proteinidir.

TMEM ailesine ait proteinlerin etki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamış olsa da, bu proteinlerin çeşitli kanser türlerinde rol oynadığı bilinmektedir10. Birkaç TMEM proteini göçmen, proliferatif ve invaziv fenotiplerle ilişkilidir ve ekspresyonu genellikle hastanın prognozuile ilişkilidir 11. Bu nedenle TMEM ailesi üyeleri araştırmaların hedefi haline gelmiştir. TMEM ile ilgili mevcut raporların kapsamlı bir incelemesi, bunların çoğunlukla hücreler arası ve hücre içi sinyal12, bağışıklık ile ilişkili hastalıklar ve tümöroluşumu 10 ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Birçok TMEM ayrıca, örneğin plazma zarındaki iyon kanalları, sinyal iletim yollarının aktivasyonu ve ayrıca hücre kemotaksisi, adezyon, apoptoz ve otofajinin aracılık etmesi gibi önemli fizyolojik işlevlere sahiptir10. Bu nedenle, TMEM proteinlerinin tümörlerin saptanması ve tedavisinde önemli prognostik belirteçler olabileceğini varsaydık.

TMEM200A ekspresyonu mide kanserinde (GK) önemli ölçüde yüksektir. Kromozom 6q23.1 üzerinde sekiz ekzon ve tam uzunluğu 77.536 kb olan TMEM200A13'ün daha yüksek ekspresyonu, GC vakalarında genel sağkalım (OS) için kötü bir prognoz ile ilişkilendirilmiştir. Yine de ekspresyonundaki değişiklikler onkoloji çalışmalarında nadiren bildirilmiştir. Bu makale, halka açık farklı veri kümelerini kullanarak çeşitli kanser çalışmalarında terapötik bir hedef ve tümör tanı belirteci olarak TMEM200A'in yararlılığını karşılaştırmakta ve analiz etmektedir. UCSC Xena ve TCGA veri tabanlarından RNA-seq verilerinin yanı sıra gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve western blotlama kullanarak pan-kanser tanısal ve prognostik bir biyobelirteç olarak TMEM200A'nin etkinliğini ve çeşitli insan kanseri türlerinde ekspresyon seviyelerini değerlendirdik.

TMEM200A ekspresyon seviyelerinin mutasyon oranları, düzenleyici süreçler, tümör teşhisi ve prognozu, immün infiltrasyon ve immünoterapi üzerindeki etkisi, hesaplama araçları ve veri seti web sitelerinin bir karışımı kullanılarak daha fazla araştırıldı. TMEM200A'deki mutasyonları incelemek için CBioPortal ve Kanser Hücrelerinde Somatik Mutasyonlar Kataloğu (COSMIC) veri tabanları kullanıldı. TMEM200A immün infiltrasyonu nasıl etkilediğini anlamak için Sangerbox ve TISIDB web siteleri kullanıldı. TMEM200A işlevini araştırmak için Tümör İmmün Tek Hücre Merkezi (TISCH) çevrimiçi aracı ve CancerSEA veritabanı kullanıldı. Son olarak, TMEM200A'in GC hücrelerinin malign davranışı ve tümör gelişim fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bir in vitro testte bir fonksiyon kaybı deneyi yapıldı. Ek olarak, TMEM200A yıkımın PI3K/AKT sinyal yolunu ve GC'deki epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) nasıl etkilediğini değerlendirmek için western blotlama yapıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kanser Genom Atlası (TCGA) veritabanı

NOT: Kanser Genom Atlası (TCGA) veri tabanı, farklı tümör dokularındaki genlerin dizileme verilerini içerir14. Milyonda parça başına TMEM200A transkript (TPM) formatlarının incelenmesi için TCGA'daki RNA-seq verileri, UCSC Xena web sitesinden15 (https://xenabrowser. net/datapages/) çıkarıldı ve log2, örnekler arasındaki ifadeleri karşılaştırmak için dönüştürüldü.

  1. UCSC Xena web sitesi arayüzüne gidin.
  2. Xena'yı Başlat sekmesine tıklayın.
  3. Ekranın üst kısmındaki VERİ SETLERİ sekmesine tıklayın.
  4. Bu sayfadaki 129 kohort ve 1.571 veri kümesinden, GDC TCGA Akut Miyeloid Lösemi (LAML), GDC TCGA Adrenokortikal Kanser (ACC), GDC TCGA Safra Kanalı Kanseri (CHOL) ve daha fazlası gibi toplam 33 kanser için sekmeye tıklayın.
  5. Gen ekspresyonu RNAseq menüsünden HTSeq - FPKM GDC Hub sekmesini seçin ve tıklayın.
    NOT: HTSeq - FPKM GDC Hub , onay ile düzeltilmiş verileri temsil eder.
  6. İndirme menüsünden, ilgili bağlantıya tıklayın.
    NOT: Yukarıdaki yöntemle 33 farklı kanser türü için RNA-Seq verileri indirilmiştir.
  7. 33 farklı kanser türü için RNA-seq verilerinin zip arşivini bilgisayarın masaüstü klasöründeki tek bir dosyada açın.
  8. Sıkıştırılmış txt dosyalarını aynı klasörde birleştirin ve Perl betiklerini bu klasöre yerleştirin.
  9. Perl yazılımını açın, klasörün yolunu kopyalayıp fare imlecinin bulunduğu Perl yazılımına yapıştırın, Enter tuşuna basın, Perl kodunun adını ve genin adını (TMEM200A) girin ve ardından yeni bir txt dosyası (singleGeneExp.txt) almak için Enter tuşuna basın.
    NOT: Bu yeni txt dosyası (singleGeneExp.txt), farklı hastalarda 33 kanserde TMEM200A gen ekspresyonunu içerir.
  10. R kodunu (diffR) açın ve R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra singleGeneExp.txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp yapıştırın.
  11. R yazılımını açın, değiştirilmiş R kodunu (diffR) çalıştırın ve resmi "ggpubr" paketi aracılığıyla çizin.

2. TIMER2.0 veritabanı

  1. TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) veritabanı 16 web sitesi arayüzüne gidin.
  2. Kanser Keşfi sekmesine tıklayın.
  3. Arama kutusuna gen kimliğini (TMEM200A) girin ve farklı tümör tiplerinde TMEM200A diferansiyel ifade görüntülerini almak için Gönder sekmesine tıklayın.

3. İnsan Protein Atlası (HPA)

  1. İnsan Protein Atlası (HPA) (www.proteinatlas.org) 17web arayüzüne gidin.
  2. Arama kutusuna kimlik (TMEM200A) yazın ve Ara düğmesini tıklayın. DOKU alt atlas'ı seçin.
  3. Sayfanın üzerine gelin ve Protein İfadesine Genel Bakış sekmesini bulmak için aşağı kaydırın.
    NOT: Protein Ekspresyonuna Genel Bakış bölümü, insan vücudundaki 45 organdaki TMEM200A protein ekspresyon seviyelerini gösterir.

4. HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA metilasyon platformu dizisi

NOT: Metilasyon hakkında veri toplamak için HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA metilasyon platformu dizisi kullanıldı. SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) veri tabanını kullanarak TMEM200A DNA metilasyon seviyelerini değerlendirebiliriz18.

  1. SMART web sitesi arayüzüne gidin.
  2. Kromozomlardaki TMEM200A dağılımını ve farklı malignite türlerinde TMEM200A metilasyon seviyesini elde etmek için arama kutusuna gen kimliğini (TMEM200A) girin.
  3. Sayfayı aşağı kaydırarak CpG ile birleştirilmiş metilasyonu kontrol etmek için tıklayın menüsüne gidin ve Çizim düğmesine tıklayın. Sayfanın alt kısmında, Şekli İndir düğmesini bulun ve tıklayın. Şekli indirin.

5. UALCAN veritabanı

  1. UALCAN web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: Çeşitli malignitelerde TMEM200A promotör metilasyon seviyelerinin kutu grafikleri UALCAN veri tabanı (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19 aracılığıyla oluşturulmuştur.
  2. Sayfanın üst kısmındaki TCGA düğmesine tıklayın.
  3. Ekrandaki Gene ID giriş kutusuna TMEM200A girin. TCGA veri kümesi menüsünde aşağı kaydırın ve sorgulanacak kanser türünü seçin.
  4. Keşfet düğmesine tıkladıktan sonra, bu tümörün metilasyon sonuçlarını almak için Analiz için Bağlantılar menüsündeki alt grup analizi Metilasyonuna tıklayın.
    NOT: Bu yöntemle UALCAN veri tabanında bulunan 22 tümör için metilasyon sonuçları elde edilmiştir.

6. Kanser Hücrelerinde Somatik Mutasyonlar Kataloğu (COSMIC) veritabanı

  1. Kanser Hücrelerinde Somatik Mutasyonlar Kataloğu (COSMIC) web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: İnsan genomundaki kodlama mutasyonları, kodlamayan mutant genomik yeniden düzenlemeler ve füzyon genleri hakkındaki veriler, çeşitli kanserlerde çeşitli TMEM200A mutasyonlarının sıklığını belirlemek için de kullanılan Kanser Hücrelerinde Somatik Mutasyonlar Kataloğu (COSMIC) veritabanı20'den (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/) edinilebilir.
  2. Arama kutusuna gen kimliğini (TMEM200A) girin ve yeni bir ekrana gitmek için ARA düğmesine tıklayın.
  3. Genler menüsünde, TMEM200A gen kimliği adının göründüğü bağlantıyı bulun ve tıklayın.
  4. Tümördeki TMEM200A mutasyon durumunu almak için yeni sayfada Mutasyon dağılım gruplandırma sütununu bulun.

7. CBio Portalı

  1. CBioPortal web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: Kanser genomik verileri, cBioPortal (www.cioportal.org) veritabanı kullanılarak bulunabilir, indirilebilir, analiz edilebilir ve görselleştirilebilir. Somatik mutasyonlar, DNA kopya sayısı değişiklikleri (CNA'lar), mRNA ve mikroRNA (miRNA) ekspresyonu, DNA metilasyonu, protein bolluğu ve fosfoprotein bolluğu, cBioPortal21 tarafından entegre edilen genomik veri türlerinden sadece birkaçıdır. cBioPortal ile çok çeşitli çalışmalar yapılabilir; Bununla birlikte, en büyük vurgu, mutasyonlar ve bunların görselleştirilmesi ile ilgili farklı analizler üzerindedir.
  2. Görselleştirme ve Analiz için Seçme Çalışmaları bölümünün PanKanser Çalışmaları alt bölümünden tüm genomların Pan-kanser analizi veri kümesini seçin. Ardından, Genle Sorgula düğmesine tıklayın.
  3. Genleri Girin sorgu kutusuna hedef gen kimliğini (TMEM200A) girin. Sorguyu Gönder düğmesini tıklayın.
  4. Çeşitli kanser türlerinde TMEM200A mutasyonlarını almak için sayfanın üst kısmındaki Kanser Türü Ayrıntılı düğmesine tıklayın.

8. Sangerbox 3.0 aracı

  1. Sangerbox 3.0 araç arayüzüne gidin.
    NOT: Tüm kanserlerde TMEM200A ekspresyonunun immün infiltrasyon hücreleri, immünosupresif ajanlar, immünostimülatör faktörler ve MHC molekülleri (majör histouyumluluk kompleksi) ile korelasyonu, Sangerbox 3.0 aracı22'deki pan-kanser immün infiltrasyon verileri kullanılarak CIBERSORT immün infiltrasyonu ile analiz edildi (http://vip.sangerbox.com/).
  2. Sayfanın sol tarafında bulunan araç çubuğundan Pan-Kanser Analizi menüsünden İmmünselüler Analiz (CIBERSORT) sekmesini seçin ve tıklayın.
  3. Genleri Girin sorgu kutusuna hedef gen kimliğini (TMEM200A) girin. Gönder düğmesine tıklayın.

9. TISIDB veritabanı

  1. TISIDB web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: Çeşitli kanserlerde TMEM200A ekspresyonunun immün infiltre eden hücreler, immünosupresif ajanlar, immünostimülatör faktörler ve MHC molekülleri ile korelasyonunu incelemek için TISIDB veritabanı23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) kullanıldı.
  2. Genleri Girin sorgu kutusuna hedef Gen Sembolünü (TMEM200A) girin. Gönder düğmesine tıklayın.
  3. Sayfanın üst kısmındaki Lenfositler, İmmünomodülatörler, Kemokinler ve Alt Tip bölümlerine tıklayın. Sayfanın alt kısmından ilgili görselleri indirin.

10. TIDE veritabanı

  1. TIDE web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: TIDE veri tabanı (http://tide.dfci.harvard.edu/), tümör immün kontrol noktası blokaj tedavisine yanıtı tahmin etmek için bir biyobelirteç olarak TMEM200A potansiyelini değerlendirmek için kullanıldı.
  2. Hesabı kaydetmek ve oturum açmak için ilk ekranda e-posta adresini girin.
  3. Sayfanın üst kısmındaki Biyobelirteç Değerlendirmesi alt bölümünü bulun ve üzerine tıklayın.
  4. Sayfanın altındaki Genleri Girin sorgu kutusuna hedef gen kimliğini (TMEM200A) girin. Ardından, Gönder düğmesine tıklayın.
  5. Sayfada, analiz sonuçlarını bulmak üzere sayfayı aşağı kaydırmak için fareyi sürükleyin.

11. CancerSEA veritabanı

  1. CancerSEA web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: Tek hücreli dizileme verileri kullanılarak, TMEM200A ekspresyonu ile farklı tümör hücrelerinin fonksiyonel durumu arasındaki ilişkiler araştırıldı. Bu, CancerSEA veritabanı24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/) kullanılarak yapıldı.
  2. Sayfanın üst kısmında, Arama sekmesini bulun ve tıklayın.
  3. Genleri Girin sorgu kutusuna hedef gen kimliğini (TMEM200A) girin. Gönder düğmesine tıklayın.

12. Tümör immün tek hücreli merkez (TISCH) ağ aracı

  1. Tümör bağışıklık tek hücre merkezi (TISCH) ağ aracı web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: TMEM200A ve kanser hücrelerinin ekspresyon seviyeleri arasındaki korelasyon, tümör immün tek hücre merkezi (TISCH) ağ aracı25 kullanılarak da gösterilmiştir.
  2. Genleri Girin sorgu kutusuna hedef gen kimliğini (TMEM200A) girin. Keşfet düğmesine tıklayın.
  3. Bu sayfadaki Kanser türü menüsünde, Tüm Kanserler veri kümesini seçin ve tıklayın. Ardından, sayfayı aşağı kaydırın ve Ara düğmesini tıklayın.

13. GeneMANIA (GeneMANIA)

  1. GeneMANIA web sitesi arayüzüne gidin.
    NOT: TMEM200A ve işlevsel olarak ilgili genleri arasındaki korelasyon, gen-gen etkileşimi (GGI) ağları oluşturmak için gen çoklu ilişkilendirme ağı Web Sitesi GeneMANIA (www.genemania.org)26 için entegrasyon stratejisi kullanılarak tahmin edildi.
  2. Sayfanın sol üst köşesindeki arama kutusuna gen kimliğini (TMEM200A) girin ve Arama Araçları'na tıklayın.
    NOT: GeneMANIA web aracı, TMEM200A ile ilişkili 20 geni bulmak için kullanıldı.

14. Fonksiyonel zenginleştirme analizi

  1. Zenginleştirme için analiz edilecek genlerin sembol kimliklerini txt dosya formatında kaydedin.
  2. R kodunu (symbolidR) açın ve yukarıdaki txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
  3. R yazılımını açın ve değiştirilen R kodunu (symbolidR) çalıştırın. Bu genlerin sembol kimliklerini "org. Hs.eg.db" paketi. id.txt dosyasını alın.
  4. R kodunu (GOR ve KEGGR) açın ve R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra id.txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp yapıştırın.
  5. R yazılımını açın ve değiştirilmiş R kodunu (GOR ve KEGGR) çalıştırın. Bu protokolü takip etmek için, bu genleri GO ve KEGG zenginleştirmesi için "clusterProfiler", "org" paketleriyle analiz edin. Hs.eg.db" ve "enrichplot" ve "gglot2" paketini kullanarak zenginleştirme sonuçlarını çizin.

15. Gen aktivitesindeki farklılıkların analizi

NOT: Her kanser örneğinde TMEM200A skorlama, ssGSEA (tek örnekli gen seti zenginleştirme analizi)27 kullanılarak hesaplandı ve çeşitli kanserler için kanserli ve sağlıklı dokulardaki TMEM200A gen aktivitesinin ayırıcı analizi yapıldı.

  1. Adım 1.7'de indirilen 33 tümör tipinin RNA dizisi verilerine dayanarak, indirilen tüm dosyaları açın ve bunları birleşik bir klasöre yerleştirin.
  2. merge.txt dosyasını yukarıdaki klasöre yerleştirin.
    NOT: BioWolf (www.biowolf.cn)'dan alınan merge.txt dosyadaki veriler, Kanser Genom Atlası (TCGA) veritabanındaki tüm tümörlerdeki tüm hastalar için gen ekspresyonunu içerir.
  3. R kodunu (ssGSEAR) açın ve R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yukarıdaki klasörün bulunduğu yolu kopyalayıp yapıştırın.
  4. geneName'in R kodunda (ssGSEAR) olduğu satırı alın ve gen kimliğini (TMEM200A) girin.
  5. R yazılımını açın ve değiştirilen R kodunu (ssGSEAR) çalıştırın. Gen aktivitesi için puanlama dosyasını alın: scores.txt.
    NOT: ssGSEA algoritması ile öncelikle merge.txt dosyasında verilen verilere göre genler arası korelasyon katsayılarını baz alarak bir gen set dosyası oluşturuyoruz ve dosyadan hedef gen (TMEM200A) ile korelasyonu daha yüksek olan genleri belirliyoruz. Daha sonra, daha yüksek korelasyona sahip genler, TMEM200A aktif genleri olarak birleştirilir ve son olarak, her örnekteki aktif genlerin skorlamasını elde ederiz.
  6. R kodunu (scoreDiffR) açın ve R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra scores.txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp yapıştırın.
  7. R yazılımını açın, değiştirilmiş R kodunu (scoreDiffR) çalıştırın ve resmi "plyr", "reshape2" ve "ggpubr" paketleri aracılığıyla çizin.

16. Klinikopatolojik korelasyon ve sağkalım prognoz analizi

  1. UCSC Xena web sitesi arayüzüne gidin.
  2. Xena'yı Başlat sekmesine tıklayın.
  3. Ekranın üst kısmındaki VERİ SETLERİ sekmesine tıklayın.
  4. Sayfanın üzerine gelin ve TCGA Pan-Cancer (PANCAN) sekmesini bulmak için aşağı kaydırın.
  5. Bu sayfadaki 129 kohort ve 1.571 veri kümesinden TCGA Pan-Cancer (PANCAN) sekmesine tıklayın.
  6. Fenotip menüsünden, Küratörlü klinik veriler sekmesini seçin ve tıklayın.
  7. İndirme menüsünden, ilgili bağlantıya tıklayın.
    NOT: Yukarıdaki bağlantıdaki TCGA veri tabanından 33 kanser için klinik verileri indirin.
  8. İndirilen klinik veri dosyasını açın ve sıkıştırılmış dosyayı xls dosya biçiminde açın.
  9. Gerekli klinik verileri (evre, yaş, patolojik evre ve hasta durumu) dosyada düzenleyin ve saklayın, kalan gereksiz klinik verileri silin ve klinik olarak yeniden adlandırdıktan sonra tüm dosyayı txt formatında bir dosya olarak kaydedin.
  10. Adım 1.9'da elde edilen singleGeneExp.txt bağlı olarak, bu dosyayı düzenlenen clinical.txt dosyasıyla aynı klasöre koyun.
  11. İndirilen klinik verileri açın ve singleGeneExp.txt ve clinical.txt dosyalarını , sıkıştırılmış klinik dosyalarla aynı klasöre yerleştirin.
  12. R kodunu (clinicalDiffR) açın ve yukarıdaki klasörün bulunduğu yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
  13. R yazılımını açın, değiştirilmiş R kodunu (clinicalDiffR) çalıştırın ve "ggpubr" paketini kullanarak resmi çizin.
  14. UCSC Xena web sitesi arayüzüne gidin.
  15. Xena'yı Başlat sekmesine tıklayın.
  16. Ekranın üst kısmındaki VERİ SETLERİ sekmesine tıklayın.
  17. Bu sayfadaki 129 kohort ve 1.571 veri kümesinden, GDC TCGA Akut Miyeloid Lösemi (LAML), GDC TCGA Adrenokortikal Kanser (ACC), GDC TCGA Safra Kanalı Kanseri (CHOL) ve daha fazlası gibi toplam 33 kanser için sekmeye tıklayın.
  18. Fenotip menüsünden, hayatta kalma verileri sekmesini seçin ve tıklayın.
  19. İndirme menüsünden, ilgili bağlantıya tıklayın.
  20. 33 farklı kanser türü için hayatta kalma verilerinin zip arşivini bilgisayarın masaüstü klasöründeki tek bir dosyada açın.
  21. Sıkıştırılmamış hayatta kalma verilerini, adım 1.9'da elde edilen singleGeneExp.txt dosyasıyla aynı klasöre koyun.
  22. R kodunu (preOSR) açın ve yukarıdaki klasörün bulunduğu yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
  23. R yazılımını açın ve değiştirilen R kodunu (preOSR) çalıştırın. Pan-kanserde TMEM200A hayatta kalması hakkında bir veri dosyası elde etmek için "limma" paketi aracılığıyla hesaplayın: expTime.txt.
  24. R kodunu (OSR) açın ve R kodunda expTime.txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
  25. R yazılımını açın ve değiştirilen R kodunu (OSR) çalıştırın. expTime.txt dosyasındaki verilere dayalı olarak "survival" ve "survminer" paketlerini kullanarak bir KM analizi gerçekleştirin ve pan-kanserde TMEM200A için hayatta kalma eğrilerini çizin.

17. Orman parseli yapımı ile tek değişkenli ve çok değişkenli Cox regresyon analizleri

  1. R kodunu (COXR) açıyoruz ve 16.23 çıkışlı expTime.txt dosyasını aldığımız yolu R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra kopyalayıp yapıştırın.
  2. R yazılımını açın ve değiştirilen R kodunu (COXR) çalıştırın. expTime.txt dosyasındaki verilere dayanarak, farklı kanserlerde tek değişkenli bir orman TMEM200A grafiği çizmek için "survival", "survminer" ve "forestplot" paketlerini kullanarak tek değişkenli COX regresyon analizleri gerçekleştirin.
  3. 16.23 adımındaki expTime.txt dosyasını ve 16.10 adımındaki clinical.txt dosyayı aynı klasöre yerleştirin.
  4. R kodunu (multicoxR) açın ve 16.23. adımdaki expTime.txt dosyasını ve 16.10. adımdaki clinical.txt dosyayı içeren klasörün bulunduğu yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
  5. R yazılımını açın ve değiştirilen R kodunu (multicoxR) çalıştırın. expTime.txt ve clinical.txt dosyalarındaki verilere dayalı olarak farklı kanserlerde çok değişkenli bir TMEM200A orman grafiği çizmek için "hayatta kalma" ve "survminer" paketlerini kullanarak çok değişkenli bir COX regresyon analizi gerçekleştirin.

18. Mide kanserinin TMEM200A ekspresyonu ve klinik özelliklere dayalı prognostik modeli

  1. 16.10. adımdaki clinical.txt dosyasını ve 16.23. adımdaki expTime.txt dosyasını aynı klasöre yerleştirin.
  2. R kodunu (NomoR) açın ve yukarıdaki txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
  3. R yazılımını açın ve değiştirilen R kodunu (NomoR) çalıştırın. Hasta sağkalımını tahmin etmek için prognostik bir model oluşturmak için GC ve klinik verilerdeki TMEM200A ekspresyon verileri için "survival", "regplot" ve "rms" yazılım paketlerini kullanın.

19. Hücre kültürü ve siRNA transfeksiyonu TMEM200A

NOT: İnsan STAD HGC-27 hücreleri, SGC-7901 hücreleri ve insan gastrik mukozal epitelyal GES-1 hücreleri ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız), yeniden canlandırıldı, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 tam besiyerinde aşılandı (% 10 yenidoğan fetal sığır serumu ve% 1 penisilin karışımı içerir) ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de kültürlendi hücre kültürü inkübatörü. Kültür ortamı 2-3 günde bir değiştirildi. İyi büyüme durumundaki hücreler, oyuk başına (2-3) × 105 hücreye göre altı oyuklu plakalara aşılandı.

  1. İlk olarak, üç mikrosantrifüj tüpü alın ve her tüpe 8 μL transfeksiyon reaktifi (Malzemelerin T yeteneğine bakın) ve 200 μL bazal ortam ekleyin. Ardından, her tüpe sırasıyla 4 μg SiRNA1, SiRNA2 ve SiRNA3 ekleyin.
    NOT: TMEM200A yıkım için siRNA tasarlanmış ve satın alınmıştır (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Karışımı üç mikrosantrifüj tüpünde iyice karıştırın ve 6 oyuklu plakanın üç oyuğunun her birine ekleyin. Karışımı eşit şekilde dağıtmak için 6 oyuklu plakayı hafifçe sallayın. Karışımın eklendiği üç kuyucuğu SiRNA-1, SiRNA-2 ve SiRNA-3 olarak etiketleyin.
  3. Hücreler 4-6 saat inkübe edildiğinde, 6 oyuklu plakadaki üç alt kuyucuktaki ortamın yarısını değiştirin.
    NOT: Tam ortamın yarısını değiştirirken, orijinal tam ortamın yarısını aspire edin ve taze tam ortamın yarısı ile doldurun.
  4. Yirmi dört ila 48 saat sonra, deney grubu olarak TMEM200A siRNA ile transfekte edilmiş hücre ve negatif kontrol grubu olarak transfekte edilmemiş hücreler kullanın. Transfeksiyonun hücreler üzerindeki etkisini değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR, bkz. bölüm 20) gerçekleştirin.

20. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu

  1. Her alt gruptaki hücre kültürü ortamını atın ve hücreleri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez nazikçe yıkayın.
  2. Bir RNA izolasyon kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin ( Malzeme Tablosuna bakın).
  3. RNA konsantrasyonunu tahmin edin ve üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA Sentez Kiti kullanarak cDNA'yı 1 μg RNA ile sentezleyin.
  4. Gerçek Zamanlı PCR Test Sistemini kullanarak GAPDH (standardizasyon için), TMEM200A (Malzeme Tablosuna bakın) ve qPCR Master Mix için insana özgü ileri ve geri primerler dahil olmak üzere 10 μL reaksiyon karışımında 10 kat cDNA dilüsyonları üzerinde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirin.
    NOT: Her deneyi üç kopya halinde gerçekleştirin.
  5. Aşağıdaki qPCR reaksiyon koşullarını kullanın: başlatma, 3 dakika boyunca 95 °C; denatürasyon, 10 saniye boyunca 95 °C; tavlama, 30 saniye boyunca 60 °C; ve uzatma, 10 saniye boyunca 80 °C; Denatürasyon, tavlama ve uzatmayı 40x tekrarlayın. 2-ΔΔCt tekniğini kullanarak her bir genin nispi ekspresyonunu belirleyin28.
  6. Biyolojik üçlüler elde etmek için deneyleri en az üç kez tekrarlayın.

21. İlgili protein ekspresyonunun Western blot tespiti

  1. Her bir alt gruptaki hücre kültürü ortamını atın ve hücreleri 2 x 1 mL PBS ile nazikçe yıkayın.
  2. Hücreleri içeren 6 oyuklu plakaları buz üzerinde soğutun ve 150 μL önceden soğutulmuş radyo immün çökeltme testi (RIPA) lizis tamponu (150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 ve taze eklenmiş proteaz inhibitör kokteyli). Lizisin 10 dakika boyunca buz üzerinde ilerlemesine izin verin.
  3. Plastik bir hücre sıyırıcı kullanarak, yapışan hücreleri tabaktan çıkarın ve hücre çözeltisini önceden soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne hassas bir şekilde aktarın.
  4. Hücre lizatını 1.5 ° C'de 10 ×10 4 g'de 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Protein içeriğini üreticinin talimatlarına göre belirlemek için bir BCA protein tahlil Kiti kullanın.
  6. Her numuneden %10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jeli üzerine 30 g protein yükleyin ve 0,5 saat boyunca 80 V'ta, ardından 120 V'ta 1,5 saat çalıştırın.
  7. Proteinleri jelden 1-1.5 saat boyunca 300 mA voltajda 45 μm poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarın.
  8. PVDF membranını bir çalkalayıcı üzerine yerleştirdikten ve 3 x 5 dakika çalkaladıktan sonra, protein tarafı (jel tarafı) yukarı bakacak şekilde uygun kaba Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl ve %0.1 Tween 20) ile Tris-tamponlu salin ekleyin.
  9. Membranı bloke edici tampona yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığında 0,5 saat inkübe edin.
  10. Membranı TBST ile 3 x 10 dakika yıkayın.
  11. Membranı fosfo-AKT (p-AKT; 1:1,000), toplam AKT 1:1,000, E-kaderin (E-ca; 1:1,000), N-kaderin (N-ca; 1:1,000), Vimentin 1:1,000, salyangoz 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH; 1:1.000), gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  12. Membranı 3 x 10 dakika yıkayın ve membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir tavşan veya fare ikincil antikoru (1: 5.000) ile inkübe edin.
  13. PVDF membranını ECL substratı ile 30 saniye boyunca inkübe edin ve bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyali tespit edin.

22. CCK-8 testi

  1. 96 oyuklu plakalarda iyi büyüme koşullarında tohum insan STAD HGC-27 hücreleri.
  2. Hücre yoğunluğu %60-70'e ulaştığında, hücreleri TMEM200A siRNA ile transfekte edin (adım 19.3'te olduğu gibi).
  3. Transfekte edilmiş hücreleri, 5 × 10 3 / kuyucuklu bir hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara tohumlayın (bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın), NC ve TMEM200A siRNA grubuna bölün (her grupta üç kopya kuyucuk ile) ve 37 ° C'de inkübe edildi.
  4. CCK-8 reaktifini 0, 24, 48, 72 ve 96 saat sonra ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Çok işlevli bir enzim etiketleyici kullanarak absorbansı (450 nm) ölçün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Çeşitli kanserlerde TMEM200A ekspresyonu
Şekil 1'de gösterildiği gibi, ilk olarak farklı veri tabanları aracılığıyla çeşitli kanserlerde TMEM200A diferansiyel ekspresyon seviyelerini analiz ettik. Kolanjiokarsinom (CHOL), baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomu (HNSC), renal berrak hücreli karsinom (KIRC), renal papiller hücreli karsinom (KIRP), hepatosellüler karsinom (LIHC), STAD ve tiroid karsinomunda (THCA) TMEM200A ekspresyonu sadece TCGA verilerine dayanan bitişik normal dokularla karşılaştırıldığında artmıştır. Bununla birlikte, mesane üroepitelyal karsinomu (BLCA), servikal skuamöz hücreli karsinom ve servikal adenokarsinom (CESC), glioblastoma multiforme (GBM), böbrek kromofobu (KICH), akciğer skuamöz karsinomu (LUSC), feokromasitoma ve paraganglioma (PCPG), rektal adenokarsinom (READ) ve uterin korpus endometriyal karsinomda (UCEC) TMEM200A ekspresyonu azalmıştır (Şekil 2A). TIMER2.0 veritabanında TMEM200A ifadesi CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC ve STAD'da artmıştır. Ayrıca, BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, deri kutanöz melanomu (SKCM) ve UCEC'de TMEM200A ekspresyonu artmıştır (Şekil 2B).

İki veri tabanının sonuçlarını karşılaştırarak, TMEM200A pan-kanser ekspresyonunun her veri tabanında aynı olduğunu bulduk. TCGA veri tabanından 33 kanserli hastanın klinik takip verilerini ve RNA dizileme verilerini elde ettik, ssGSEA analizini kullanarak her kanser örneğinde TMEM200A skorlaması hesapladık ve ardından birçok tümörde tümör ve normal dokulardaki TMEM200A gen aktivitesini hesapladık. TMEM200A'nin GBM, HNSC, böbrek KIRC ve THCA'da yüksek oranda eksprese edildiğini keşfettik (Şekil 2C); bu nedenle, TMEM200A gen aktivitesi her tümör dokusunda sıralandı. TMEM200A'nin gen aktivitesinin KIRC'de en yüksek, uveal melanomda (UVM) en düşük olduğu bulundu (Şekil 2D). İnsan dokularındaki TMEM200A ekspresyon seviyelerinin daha sonraki HPA veri tabanı değerlendirmesi, TMEM200A ekspresyon seviyelerinin çoğu normal dokuda düşük, ancak adrenal korteks, rektum, endometriyum ve düz kasta yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 2E).

Normal doku hücre hatlarında, granüloza hücreleri, bipolar hücreler, iskelet kası hücreleri, endometriyal stromal hücreler ve T hücreleri gibi birkaç hücre hattı yüksek TMEM200A ekspresyonu gösterirken, diğer hücre hatlarının çoğunda TMEM200A ekspresyonu düşüktü (Şekil 2F). Protein düzeyinde TMEM200A ekspresyonuna bakmak için HPA veri tabanındaki immünohistokimya (IHC) verilerini de inceledik. Boyanma ve yoğunluk ile ilgili veriler, kolorektal kanser (KRK), akciğer kanseri (LUAD), karaciğer kanseri (LIHC), meme kanseri (BRCA) ve prostat kanseri (PRAD) dokularında normal dokulara kıyasla çok daha fazla ve daha belirgin TMEM200A ekspresyon seviyeleri ortaya koymuştur (Şekil 2G). Bu bulgular , TMEM200A farklı kanserlerde yaygın olarak eksprese edildiğini ve farklı tümörlerde farklı mekanizmalarla kanser gelişimini etkilediğini düşündürmektedir.

Klinikopatolojik ilişki ve sağkalım prognozu
33 insan malignitesi için, UCSC Xena veritabanı web sitesinden TCGA pan-kanser (PanCan) kohortunda bilgi ve klinik veriler topladık ve PanCan'daki TMEM200A ekspresyonu ile yaş, patolojik derece, klinikopatolojik evre ve hasta sağkalım durumu arasındaki ilişkiyi araştırdık. Bu çalışma, altı kanserde TMEM200A ekspresyonunun BLCA, invaziv meme karsinomu (BRCA), özofagus karsinomu (ESCA), KIRP, SKCM ve testis karsinomu (TGCT) dahil olmak üzere klinikopatolojik evre ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 3A). Yaş, invaziv BRCA, GBM, akut miyeloid lösemi (LAML), SKCM, timik karsinom (THYM) ve endometriyal kanser (UCEC) dahil olmak üzere altı tümör ile korelasyon gösterdi (Şekil 3B). Patolojik derece, özofagus karsinomu (ESCA), HNSC, KIRC, düşük dereceli beyin gliomu (LGG), pankreas adenokarsinomu (PAAD) ve endometriyal karsinom (UCEC) dahil olmak üzere altı tümör ile ilişkiliydi (Şekil 3C). Sağkalım durumu, adrenokortikal karsinom (ACC), BLCA, KIRC, PCPG ve uveal melanom (UVM) dahil olmak üzere beş tümör ile ilişkiliydi (Şekil 3D).

TMEM200A ekspresyonu ve prognoz arasındaki korelasyon hakkında daha fazla bilgi edinmek için medyan grup eşiği ile tek yönlü Cox regresyon analizi kullanarak OS, DSS, PFI ve DFI üzerinde farklı kanserler için çalışmalar yürüttük. OS analizinin sonuçları, dört tümör arasında, adrenokortikal karsinom (ACC) (P = 0.037), BLCA (P = 0.036), akut miyeloid lösemi (LAML) (P = 0.011) ve GC (STAD) (P = 0.005) dahil olmak üzere dört tümörde daha yüksek TMEM200A ekspresyonunun OS prognozu üzerinde daha büyük bir etkiye sahip olduğunu ortaya koydu. Buna karşılık, KIRC (P < 0.001), KIRP (P = 0.020), beynin düşük dereceli gliomu (LGG) (P = 0.042), PCPG (P = 0.002) ve kutanöz melanom (SKCM) (P = 0.043) dahil olmak üzere beş tümörde daha yüksek TMEM200A ekspresyonu OS için daha iyi bir prognoza sahipti (Şekil 3E, F). DSS için, adrenokortikal karsinom (ACC) (P = 0.026) ve BLCA (P = 0.015) dahil olmak üzere iki tümör tipinde yüksek TMEM200A ekspresyonu kötü prognoza sahipti. KIRC (P < 0.001), KIRP (P = 0.001), beynin düşük dereceli gliomu (LGG) (P = 0.025) ve PCPG (P = 0.007) dahil olmak üzere dört tümör tipinde yüksek TMEM200A ekspresyonu daha iyi bir prognoza sahipti (Şekil 3G). Ek olarak, PFI için, adrenokortikal karsinom (ACC) (P = 0.007), BLCA (P = 0.040) ve uveal melanom (UVM) (P = 0.020) dahil olmak üzere üç tümör tipinde yüksek TMEM200A ekspresyonu kötü prognoza sahipti. Daha yüksek TMEM200A ekspresyonu, beynin KIRC (P < 0.001) ve düşük dereceli gliomu (LGG) (P = 0.044) dahil olmak üzere iki tümör tipinde daha iyi bir prognoza sahipti (Şekil 3H). DFI'de adrenokortikal karsinomda (ACC) daha yüksek TMEM200A ekspresyonu daha kötü prognoza sahipti (P = 0.044) (Şekil 3I).

Daha sonra, multi-COX regresyon analizi için birkaç tümör (KIRC ve KIRP) seçtik. Sonuçlar , TMEM200A diğer klinik faktörlere kıyasla kanser hastalarının sağkalım oranını bireysel olarak etkileyebileceğini göstermiştir (Şekil 3J ve K). Bu sonuçlar , TMEM200A kanserli hastaların sağkalımını etkilemek için farklı kanserlerde bağımsız bir biyoprognostik belirteç olarak kullanılabileceğini göstermiştir.

DNA metilasyon analizi
En fazla dikkat çeken epigenetik değişikliklerden biri DNA metilasyonudur29. Bir tür epigenetik değişiklik olan DNA metilasyonunun tümör büyümesi üzerinde önemli bir etkisi olduğu öne sürülmüştür30. Bu nedenle, SMART veri tabanını kullanarak, normal ve kanserli dokulardaki TMEM200A DNA metilasyon seviyelerini değerlendirdik. PAAD ve PRAD dokuları, normal dokulardan daha TMEM200A daha yüksek DNA metilasyon seviyelerine sahipti. Bununla birlikte, TMEM200A COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA ve UCEC'de normal dokulara göre daha düşük DNA metilasyon seviyelerine sahipti (Şekil 4A). TMEM200A'nin DNA metilasyon seviyeleri, UALCAN veri tabanına (Şekil 4B) dayalı olarak KIRP, PRAD, PCPG ve THYM'deki TCGA veri tabanında önemli ölçüde daha yüksekti, ancak BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA ve UCEC'de değil. TMEM200A metilasyon seviyesi LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA ve UCEC'de önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 4C). TMEM200A ekspresyon seviyesi ile DNA metilasyonu ve klinikopatolojik faktörler arasındaki ilişkiyi daha da araştırmak için yine SMART veri tabanını kullandık ve BLCA, HNSC, LUAD ve STAD'daki TMEM200A DNA metilasyon seviyesinin patolojik evre ile değiştiğini bulduk (Şekil 4D). Klinik faktörler, yukarıdaki tümörlerde TMEM200A DNA metilasyon seviyesini etkiler.

Gen mutasyon analizi
Tümörlerin gelişmesinin nedenlerinden biri gen mutasyonlarının birikmesidir31. Bu nedenle, somatik TMEM200A mutasyonlarının sıklığı, cBioPortal veri tabanı kullanılarak pan-kanser klinik örneklerinde TMEM200A mutasyonların sıklığı tahmin edilerek analiz edildi. TMEM200A, akciğer kanseri, uterin endometrioid karsinom, melanom, özofagogastrik kanser, kemik kanseri, rahim ağzı kanseri, hepatobiliyer kanser, matür B hücreli lenfoma, BRCA, endometriyal kanser, yumurtalık kanseri, embriyonal tümör, pankreas kanseri, baş boyun kanseri, KRK, glioma, küçük hücreli dışı akciğer kanseri, yumuşak doku sarkomu ve primeri bilinmeyen kanser gibi birçok kanserde mutasyona uğramıştır (Şekil 5A). Ek olarak, DNA değişiklikleri protein düzeyinde yapısal veya amino asit değişikliklerine yol açabilir. Şekil 5B, TMEM200A'in 3B yapısını göstermektedir. cBioPortal veritabanını kullanarak, TMEM200A amino asitlerinde mutasyon bölgeleri bulduk; yanlış anlamlı mutasyonlar, mutasyonların en yaygın şekliydi (Şekil 5C).

Mutasyon bölgelerinin doğruluğunu doğrulamak için Sangerbox 3.0 kullanarak verileri analiz ettik ve daha önce olduğu gibi aynı sonuçları elde ettik. Yanlış anlamlı mutasyonlar, TMEM200A'de en sık görülen mutasyon şeklidir ve SKCM'de %7.8 kadar sıklıkla ortaya çıkabilir (Şekil 5D). Yanlış anlamlı mutasyon, bir amino asidi kodlayan bir kodonun bir baz ikamesine uğradığı ve başka bir amino asidi kodlayan bir kodon haline geldiği ve bunun sonucunda amino asit tipinde ve polipeptit zincirinin dizisinde bir değişikliğe neden olduğu bir mutasyondur. Yanlış anlamlı mutasyonun sonucu genellikle polipeptit zincirinin orijinal işlevini kaybetmesidir. Birçok protein anormalliği, yaygın bir tümör mutasyonu türü olan yanlış anlamlı mutasyondan kaynaklanır. Yanlış anlamlı mutasyonların proteinlerin stabilitesinde önemli bir rol oynadığı ve mutasyonların varlığının proteinler32 arasındaki bağlanma afinitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceği, proteinler ve çevredeki bağıntılı makromoleküller arasındaki etkileşimleri değiştirdiğibulunmuştur 33.

Bu nedenle, yanlış anlamlı mutasyonlar büyük olasılıkla farklı kanserlerde transmembran protein 200A'nın biyolojik işlevini etkiler. TMEM200A gen mutasyonu ile kanserli hastaların klinik sağkalım prognozu arasındaki korelasyon da incelendi. OS olasılığı, TMEM200A mutasyona uğramış gruptakine kıyasla artmış, ancak hastalıksız grupta artmamıştır (Şekil 5E). Gen korelasyonlarının incelenmesi , TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 ve SLC18B1'nin TMEM200A ile birlikte mutasyona uğrayan genler arasında olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 5F). GC'deki TMEM200A mutasyonlar hakkında daha fazla bilgi edinmek için COSMIC veritabanı aracılığıyla çeşitli mutasyon tiplerini ve tek nükleotid varyasyonlarını (SNV'ler) tanımlayabildik. Yanlış anlam ikamelerinin sıklığı en yüksekti (% 38.86) (Şekil 5G) ve SNV verileri, STAD'de en yaygın SNV'lerin G>A (% 31.73), ardından C>T (% 26.35) ve G>T (% 11.73) olduğunu gösterdi (Şekil 5H).

Kanserde TMEM200A tek hücreli analizi
TISCH (Tümör İmmünolojisi Tek Hücre Merkezi) web sitesini kullanarak farklı tek hücrelerde TMEM200A ekspresyon seviyelerini analiz ettik. TISCH çevrimiçi aracı, Şekil 6A'da gösterilen ısı haritasında 65 veri kümesi ve 28 hücre tipi için TMEM200A ifadesini görüntüledi. Bulgular, TMEM200A en çok CD8+ T hücrelerinde ve fibroblastlarda eksprese edildiğini gösterdi. Metastatik kutanöz melanomlu (SKCM) hastalardan alınan hücreleri içeren GSE72056 veri seti bu açıdan dikkat çekicidir. TMEM200A, B hücrelerinde, CD4 + T lenfositlerinde, tükenmiş CD8 + T hücrelerinde, endotel hücrelerinde, fibroblastlarda ve SKCM mikroçevresindeki diğer hücre tiplerinde yaygın olarak yüksek oranda eksprese edilmiştir (Şekil 6B, C). KRK'li hastalardan alınan hücreleri içeren GSE146771 veri setinde, TMEM200A, B hücrelerinde, CD4+ T lenfositlerinde, CD8+ T hücrelerinde, tükenmiş CD8+ T hücrelerinde, endotel hücrelerinde, fibroblastlarda ve KRK mikroçevresindeki diğer hücre tiplerinde yaygın olarak yüksek oranda eksprese edilmiştir (Şekil 6D,E). CancerSEA veri tabanı kullanılarak, spesifik tümör hücrelerinde TMEM200A ekspresyon seviyeleri ve fonksiyonel durumu belirlendi (Şekil 6G). TMEM200A ekspresyonu, glioblastoma (GBM), akciğer adenokarsinomu (LUAD), kronik granülositik lösemi (KML), CRC, retinoblastom (RB) ve uveal melanom (UM) dahil olmak üzere bir dizi kanserde hücresel fonksiyonel durum ile güçlü bir şekilde ilişkiliydi. Anjiyogenez, apoptoz, farklılaşma ve inflamasyon, tümör hücrelerinin çoğunda TMEM200A ekspresyonu ile pozitif korelasyon gösterirken, DNA hasarı, DNA onarımı, invazyonu ve metabolizması TMEM200A ekspresyonu ile negatif korelasyon gösterdi (Şekil 6F).

Çeşitli kanserlerde TMEM200A fonksiyonel ve yolak zenginleştirme analizi
Farklı kanserlerde TMEM200A fonksiyonunu araştırmak için GGI ağını kullanarak TMEM200A ve benzer işlevlere sahip proteinler arasındaki bağlantıyı inceledik (Şekil 7A). Genomik ve proteomik bilgiler, hedef genlerin bir sorgu listesi kullanılarak GeneMANIA tarafından analiz edilir. TMEM200A'ye benzer şekilde çalışan genlerin yerini belirleyerek, bu genle doğrudan etkileşime giren 40 protein keşfedildi. Bu genlerin korelasyonu PPI ağı tarafından gösterilmiştir (Şekil 7B). Daha sonra, TMEM200A yakından ilişkili olan bu 20 genin GO ve KEGG zenginleştirme analizleri, bu bitişik genlerin çoğunlukla RNA'nın gen susturma konusundaki negatif düzenlemesinde rol oynadığını ortaya çıkardı. KEGG analizi, Wnt sinyal yolu ve hücresel yaşlanma dahil olmak üzere yolaklarda bol miktarda TMEM200A olduğunu ortaya koydu (Şekil 7C). GO zenginleştirme analizi, moleküler fonksiyonda, TMEM200A'nin esas olarak kalsiyum kanallarında bol miktarda bulunduğunu ve RNA tarafından gen susturulmasının negatif regülasyonunu göstermiştir (Şekil 7D).

TMEM200A ve immün infiltrasyon arasındaki korelasyon analizi
TMEM200A ve kanser bağışıklığı arasındaki ilişkiyi göstermek için TMEM200A ekspresyonu ile immün hücre infiltrasyonu arasındaki ilişkiyi daha fazla araştırdık. Sangerbox 3.0 pan-kanser verilerini kullanarak CIBERSORT immün infiltrasyon analizi gerçekleştirdik. Sonuçlar, pan-kanser TMEM200A ekspresyonunun CD8+ T hücreleri, CD4+ T hücreleri, B hücreleri, yardımcı T hücreleri, doğal öldürücü hücreler, düzenleyici T hücreleri, monositler, makrofajlar, dendritik hücreler, eozinofiller, bazofiller ve granülositler ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 8A). Daha sonra, farklı kanser türlerinde TMEM200A ekspresyonu ile 28 TIL bolluğu arasında yakın bir korelasyon gösteren TISIDB veri tabanını kullanarak TMEM200A ekspresyonu ile TIL (Tümör İnfiltre Lenfositler) arasındaki korelasyona baktık (Şekil 8B). İmmünomodülatörler ve TMEM200A ekspresyonunun nasıl ilişkili olduğunu daha ayrıntılı olarak araştırmak için insan malignitelerinde TMEM200A ekspresyonu ve immünsüpresif ilaçlar arasındaki korelasyonu değerlendirmek için TISIDB veri tabanını kullandık. Sonuçlar, TMEM200A ekspresyon düzeylerinin çeşitli kanserlerde immünosupresif ajanlarla anlamlı olarak ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 8C). Testis kanseri ve UM'de TMEM200A ekspresyonu ile bazı immünsüpresif ajanlar arasında anlamlı korelasyon bulundu (Şekil 8D-F). Daha sonra TISIDB veri tabanını kullanarak immünostimülatör faktörler ve MHC molekülleri ile TMEM200A ekspresyonunun korelasyon analizini gerçekleştirdik (Şekil 8G,H). Sonuçlar, mesanenin ürotelyal karsinomu, testis karsinomu, adrenokortikal karsinom ve UM'de TMEM200A ekspresyonunun seçilmiş immünostimülanlar ve MHC molekülleri ile ilişkili olduğunu gösterdi (Şekil 8I-L). Bir sonraki adım, TISIDB veritabanındaki TCGA PanCan kohortunda TMEM200A ekspresyonu ile immünolojik veya moleküler alt tipler arasındaki korelasyonu araştırmaktı. BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT ve BRCA dahil olmak üzere dokuz farklı kanser türünün immünolojik alt gruplarının TMEM200A farklı şekilde ifade ettiğini bulduk (Şekil 8M). Ek olarak, HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV ve LUSC dahil olmak üzere çeşitli moleküler alt gruplara sahip altı farklı kanser formu, değişken TMEM200A ekspresyonu sergiledi (Şekil 8N).

TMEM200A ve immünoterapi yanıt analizi
PD-1/PD-L1 inhibitörlerinin etkinliği TMB ile yüksek oranda ilişkilidir ve tümörlü bazı hastalar, immünoterapinin etkinliği için TMB belirteçleri kullanılarak bir şekilde tahmin edilebilir34. Mikrosatellit kararsızlığı (MSI), mikrosatellit replikasyon hataları düzeltilmediğinde ve biriktiğinde, mikrosatellitlerin uzunluğunu veya baz bileşimini değiştirdiğinde hatalı DNA uyumsuzluk onarımı (MMR) işlevini tanımlamak için kullanılan terimdir35. MSI, klinik öneme sahip bir tümör belirtecidir 36. Bu nedenle , TMEM200A ekspresyonunun immünoterapi üzerindeki etkisini , TMEM200A ekspresyonu ile TMB veya MSI arasındaki korelasyonu araştırarak değerlendirdik. Bulgular, THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP ve KIRC'de TMEM200A ekspresyonu ile TMB arasında anlamlı bir pozitif korelasyon olduğunu gösterdi, ancak TMEM200A ekspresyonu UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM ve BRCA ile negatif korelasyon gösterdi (Şekil 9A). MSI ve TMEM200A ekspresyonu TGCT'de güçlü ve pozitif bir şekilde bağlantılıyken, TMEM200A ekspresyonu UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC ve CHOL'da MSI ile anlamlı ve negatif korelasyon gösterdi (Şekil 9B). Ayrıca , ICB'nin etkinliğini incelemek için bir biyobelirteç olarak TMEM200A potansiyelini de değerlendirdik. Sonuçlar, TMEM200A'in tek başına ICB yanıtlarını 25 ICB alt popülasyonundan 7'sinde 0,5'> Eğri Altındaki Alan (AUC) doğruluğu ile tahmin ettiğini gösterdi. TMEM200A , her ikisi de 5 değerine sahip olan T ve B hücresi klonlarından daha yüksek bir prediktif değer gösterdi. Bununla birlikte, TMEM200A değeri TIDE (11 ICB alt popülasyonunda AUC > 0.5), MSI skoru (11 ICB alt popülasyonunda AUC > 0.5), CD274 (15 ICB alt popülasyonunda AUC > 0.5), CD8 (17 ICB alt popülasyonunda AUC > 0.5), IFNG (16 ICB alt popülasyonunda AUC > 0.5) ve Merck18 (17 ICB alt grubunda AUC > 0.5) (Şekil 9C). ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 ve ICB_Hugo 2016_PD1 kohortlarında kötü sağkalım prognozu yüksek TMEM200A ekspresyonu ile korelasyon gösterdi. Bununla birlikte, Kearney 2018 T_PD1 ve Pan 2018 OT1'in ortalama kohortunda TMEM200A yıkımı, lenfosit aracılı tümör öldürme potansiyelini arttırdı (Şekil 9D).

Farklı kanserlerde TMEM200A GSEA zenginleştirme analizi
TMEM200A ilişkili kanser özelliklerini araştırmak için 32 malignitede TMEM200A yüksek ekspresyonlu ve TMEM200A düşük ekspresyonlu alt grup arasındaki DEG'leri kullandık. Primer immün yetmezlik, RIG (Retinoik asitle indüklenebilir gen)-I benzeri reseptör sinyal yolu ve pan-kanserde, özellikle BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC ve SKCM'de TMEM200A ekspresyonu arasında önemli bir korelasyon keşfettik (Şekil 10). Viral sitoplazmik protein ribonükleik asit, RIG-I benzeri reseptör sinyal yolu ile tespit edilir. RIG-I benzeri reseptörler, belirli hücre içi bağlantı proteinlerini devreye sokarak NF-kB sinyal yolunu aktive ederek vücuttaki çeşitli enflamatuar sitokinlerin üretimini etkileyebilir. Sonuç olarak, transmembran protein 200A (TMEM200A), RIG-I benzeri reseptör tarafından hücre içi proteinlerin alınmasında çok önemli bir rol oynayabilir. Bu bulgular, TMEM200A ekspresyonu ile immünolojik infiltrasyon arasında güçlü bir korelasyon olduğunu ima etti. Ek olarak, GSEA zenginleştirme analizi, pan-kanser TMEM200A ekspresyonunun kemokin sinyali, hücre adezyonu, sitokin reseptör bağlantıları, hücre zarı algılama yolları ve otofaji kontrolü ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 10). Transmembran proteinler, kalsiyum iyonlarının kalsiyum rezervuarlarından hücreye girişini kontrol etmede kritik bir rol oynamanın yanı sıra, tümör mikroçevresini etkilemek için adezyon molekülleri olarak işlev görebilir 36. Bu nedenle, GSEA zenginleştirme analizinden elde edilen sonuçlar, sinyal iletim yollarının aktivasyonu, plazma membran iyon kanallarının oluşumu ve hücre kemotaksisi, adezyon, apoptoz ve otofajinin düzenlenmesi dahil olmak üzere birçok fizyolojik sürece TMEM200A katılımından kaynaklanıyor olabilir9.

En iyi 50 STAD genini, STAD'de birlikte ifade edilen LinkedOmics veritabanından TMEM200A ile hem pozitif hem de negatif korelasyon gösteren ısı haritaları şeklinde belirledik (Şekil 11A, B). GC'de ilk 5 geni pozitif, TMEM200A ile negatif ilişkili ilk 5 geni değerlendirdik (Şekil 11C). Sonuçlarımız , TMEM200A ekspresyonunun SPON1 (r = 0.51), CDH11 (r = 0.50), EPB41L2 (r = 0.49), LUM (r = 0.49), SAMD3 (r = 0.49), OVOL2 (r = -0.37), RASAL1 (r = -0.36), IRX5 (r = -0.35), SLC4A11 (r = -0.34) ve SYTL1 (r = -0.33) birlikte ekspresyonu ile ilişkili olduğunu gösterdi. STAD'de TMEM200A rolünü daha iyi anlamak için eşik görselleştirme sonuçlarını analiz ettik. Tarama için aşağıdaki kriterler kullanıldı: log2 kat değişim (FC) > 2.0 ve düzeltilmiş P değeri 0.05. 385'i yukarı regüle ve 98'i aşağı regüle edilmiş 483 ° C bulduk ve bir ısı haritası oluşturmak için görselleştirilmek üzere 100 tanesini seçtik (Şekil 11D). Ardından, tarama kriterlerini karşılayan DEG'ler için GO ve KEGG zenginleştirme analizleri yaptık. GO zenginleştirme analizinin sonuçları, BP'nin (Biyolojik Proses) zenginleşmesinin esas olarak hücre dışı matriks ve yapısal doku ile ilişkili olduğunu, CC'nin (Hücresel Bileşen) zenginleşmesinin esas olarak kollajen içeren hücre dışı matriks ve bazal membran ile ilişkili olduğunu ve MF'nin (Moleküler Fonksiyon) esas olarak hücre dışı bir matriks yapısı ve glikozaminoglikan bağlanması açısından zenginleştirildiğini göstermiştir (Şekil 11E ve Şekil 11G). KEGG analizinin zenginleştirilmesi, TMEM200A esas olarak hücre dışı matriks reseptör etkileşim yolu, sitokrom P450 ve renin-anjiyotensin sisteminde zenginleştirildiğini göstermiştir (Şekil 11F ve Şekil 11H).

TMEM200A Tabanlı Prognostik Model ve Mide Kanserinin Klinik Özellikleri
STAD'li hastaların klinik verileri ile TMEM200A arasındaki korelasyonu araştırdık ve bu nedenle TCGA-STAD kohortundaki hastaların klinikopatolojik özelliklerini lojistik regresyon analizi ve TMEM200A ekspresyon düzeylerine göre analiz ettik (Şekil 12A). Tek değişkenli Cox regresyon analizine göre, STAD'li hastalarda yaş, klinik evre ve TMEM200A ekspresyonu OS ile önemli ölçüde ilişkiliydi (Şekil 12B). Çok değişkenli Cox regresyon analizi , TMEM200A ekspresyonunun STAD'li hastalarda OS için bağımsız bir prediktif faktör olabileceğini gösterdi (HR = 1.282,% 95 CI = 1.066-1.541, P = 0.008) (Şekil 12C). Bu klinikopatolojik özelliklerin, çeşitli klinik parametrelerle birlikte standart kolon çizgisi çizim modelini kullanarak STAD'de 1, 3 ve 5 yıl sonra OS'yi öngörme potansiyelini inceledik (Şekil 12D). 1 yıllık sağkalım olasılıkları için kalibrasyon eğrileri, kolon çizgisi grafiği tarafından tahmin edilen olasılıklarla oldukça tutarlıydı (Şekil 12E).

STAD hücrelerinde TMEM200A upregülasyonu ve hücre proliferasyonunun arttırılması
TMEM200A ile ilgili literatürü gözden geçirerek, yüksek TMEM200A ekspresyonunun kötü bir prognoza 13 işaret ettiğini ve GC immün mikroçevresinin bir adezyon molekülü37 olarak hareket eden TMEM200A etkilenebileceğini ve böylece GC hücrelerinin invazyonunu ve metastazını teşvik edebileceğini keşfettik. Yukarıda bahsedilen çalışmanın bulgularını doğrulamak için STAD hücre hatlarındaki protein düzeylerini ve TMEM200A mRNA transkript düzeylerini inceledik. GC hücre hattı HGC-27, hem protein hem de mRNA transkript seviyelerinde sağlıklı gastrik mukozal epitel hücre hattı GES-1 ile karşılaştırıldığında TMEM200A dramatik bir şekilde aşırı eksprese etti (Şekil 13A, B), bu da HGC-27 hücrelerinde TMEM200A aşırı eksprese edildiğini gösterir. Sonuç olarak HGC-27 hücreleri kullanılarak aşağıdaki testler yapılmıştır. Bu arada, deneysel sonuçların doğruluğunu kanıtlamak için, insan GC hücreleri SGC-7901 ve gastrik mukozal epitel hücreleri GES-1'deki TMEM200A'nin diferansiyel mRNA ekspresyonunu karşılaştırmak için qRT-PCR kullandık ve sonuçlar, TMEM200A'in SGC-7901 hücrelerinde yüksek oranda eksprese edildiğini gösterdi (Şekil 13B). TMEM200A, TMEM200A'nin STAD'a olası katılımını incelemek için HGC-27 hücrelerinde yıkıldı (Şekil 13C). Veri tabanı madenciliği sonuçlarına ve TMEM200A korelasyon analizimize dayanarak, TMEM200A'in esas olarak kanser proliferasyonu ve invazyonu ile ilişkili olan hücre dışı matriks reseptör etkileşimleri yolunda yer aldığı bulundu. Bu nedenle, TMEM200A ekspresyonunun hücre büyümesini nasıl etkilediğini belirlemek için CCK-8 tahlillerini kullandık. CCK-8 testleri, TMEM200A yıkım grubunun (Si-RNA2 ve Si-RNA3), NC grubuna kıyasla hücre canlılığında kayda değer bir düşüş gösterdiğini gösterdi (Şekil 13D). Bu bulgular, TMEM200A STAD'de yukarı regüle edildiğini ve ekspresyon seviyesinin GC hücrelerinin proliferasyonunu etkileyebileceğini düşündürmektedir. Şekil 11F'deki KEGG zenginleştirme analizinin sonuçlarına dayanarak, TMEM200A'nin GC'deki PI3K / AKT sinyal yolu ile ilişkili olduğunu ve bir hücre adezyon faktörü olarak TMEM200A'nin EMT'yi etkileyerek mide karsinogenezi mekanizmasını etkileyebileceğini bulduk. Bu nedenle, TMEM200A knockdown'ın EMT ve knockdown'dan önce ve sonra PI3K/AKT sinyal yolu üzerindeki etkilerini doğrulamak için western blotting kullandık. Sonuçlar, TMEM200A yıkım grubunda (TMEM200A-SiRNA2) negatif kontrol grubuna (NC) kıyasla P-AKT protein ekspresyonunun azaldığını, N-kaderin, Vimentin ve Snai proteinlerinin seviyelerinin de azaldığını ve E-kaderin protein ekspresyonunun arttığını göstermiştir (Şekil 13E). Tüm bu sonuçlar, TMEM200A PI3K / AKT sinyal yolu yoluyla EMT'yi etkileyebileceğini ve dolayısıyla GC'de bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Figure 1
Şekil 1: Etüdün iş akışı. Kısaltmalar: TCGA = Kanser Genom Atlası veritabanı; TIMER2.0 = TIMER2.0 veritabanı; OS= Genel Hayatta Kalma; PFS = İlerlemesiz Hayatta Kalma süresi; DSS = Hastalığa Özgü Sağkalım; DFS = Hastalıksız Sağkalım; TMB = Tümör Mutasyon Yükü; MSI = Mikrosatellit kararsızlığı; PPI = Protein-protein etkileşimi; GGI = Gen-gen etkileşimi; KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi; GO = Gen Ontolojisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farklı kanserlerde TMEM200A ekspresyon seviyeleri. (A) Farklı insan malignitelerinde TCGA veri setinden TMEM200A ekspresyonu yukarı veya aşağı regüle edildi. (B) TIMER2.0 veri tabanını kullanarak tümör ve normal dokulardaki TMEM200A ekspresyon seviyelerinin analizi. (C) TCGA veri setinden çeşitli insan kanserlerinde TMEM200A gen aktivitesinin diferansiyel analizi. (D) Çeşitli insan kanserlerinde TMEM200A gen aktivite seviyelerinin ssGSEA puanlamasına göre sıralanması. (E) Sağlıklı dokularda HPA veri tabanından TMEM200A ekspresyon seviyeleri. (F) HPA veritabanının normal hücre hatlarındaki TMEM200A ekspresyon seviyeleri. (G) HPA veri tabanından kanserde TMEM200A protein ekspresyonu için IHC sonuçları. Kısaltmalar: TCGA = Kanser Genom Atlası; ssGSEA = Tek Örneklem Gen Seti Zenginleştirme Analizi; HPA = İnsan Protein Atlası; IHC = İmmünohistokimya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Farklı tümörlerin klinikopatolojik özellikleri ve prognozu ile TMEM200A ekspresyonunun korelasyonu. (A) TCGA pan-kanser (PanCan) kohortundaki TMEM200A ekspresyonunun her tümörde klinikopatolojik evreleme ile korelasyonu UCSC Xena veritabanı kullanılarak analiz edildi. (B) TCGA PANCAN kohortundaki TMEM200A ekspresyonunun her tümörde hasta yaşı ile korelasyonu. (C) TCGA PANCAN kohortundaki TMEM200A ekspresyonunun her tümördeki tümör patolojik derecesi ile korelasyonu. (D) TCGA PanCan kohortundaki TMEM200A ekspresyonunun her tümördeki hastaların sağkalım durumu ile korelasyonu. (E) Cox regresyon modeli kullanılarak çeşitli kanserlerde TMEM200A ekspresyonunun pan-kanser genel sağkalımı ile korelasyon analizi. (F) TCGA PanCan kohortunda TMEM200A ekspresyonu ile pan-kanser OS prognozu arasındaki korelasyon. (G) TMEM200A ekspresyonu ile hastalığa özgü sağkalım arasındaki korelasyon. (H) TCGA PanCan kohortunda TMEM200A ekspresyonu ile progresyonsuz aralık prognozu arasındaki korelasyon. (I) TMEM200A ekspresyonu ile hastalıksız aralık arasındaki korelasyon. (J) KIRC üzerinde çok faktörlü bir COX regresyon analizi yapıldı. (K) KIRP'de multifaktöriyel COX regresyon analizi yapıldı. Kısaltmalar: TCGA = Kanser Genom Atlası; KIRC: Böbrek renal berrak hücreli karsinom; KIRP: Böbrek renal papiller hücreli karsinom; OS = Genel sağkalım; DSS = Hastalığa özgü sağkalım; PFI = Progresyonsuz aralık; DFI = Hastalıksız aralık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Farklı kanserlerde TMEM200A DNA metilasyon analizi. (A) SMART veri tabanına göre , TMEM200A'nin promotör metilasyon seviyeleri çeşitli kanser türlerinde incelenmiştir. (B) Farklı kanser tiplerinde normal dokulara göre daha yüksek promotör metilasyon TMEM200A seviyeleri UALCAN veri tabanına göre incelenmiştir. (C) UALCAN veri tabanı kullanılarak, çeşitli kanser türlerinde normal dokuların daha düşük promotör metilasyon TMEM200A seviyelerine sahip olduğu belirlendi. (D) BLCA, HNSC, LUAD ve STAD'daki TMEM200A DNA metilasyon seviyesi patolojik evre ile değişti. Kısaltmalar: BLCA = Mesane Ürotelyal Karsinomu; HNSC= Baş ve Boyun skuamöz hücreli karsinom; LUAD = Akciğer adenokarsinomu; STAD= Mide adenokarsinomu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Farklı kanserlerde TMEM200A gen mutasyonları. (A) cBioPortal veri tabanını kullanarak farklı kanserlerde TMEM200A gen mutasyon tiplerinin analizi. (B) TMEM200A'nin 3 boyutlu protein yapısı. Ciltleme alanı renkli kısım ile gösterilirken, TMEM200A diğer kısımları gri kısım ile gösterilir. (C) İzoformlar ve TMEM200A somatik mutasyonların dağılımı. X ekseni, amino asit bölgeleri; y ekseni, TMEM200A mutasyon sayısı; yeşil noktalar, yanlış anlamlı mutasyonlar; ve gri noktalar, kesik mutasyonlar. (D) Sangerbox 3.0'daki veriler kullanılarak izoformların doğrulanması ve TMEM200A somatik mutasyonların dağılımı. (E) Tüm TCGA tümörleri için, mutasyon durumu ile hastaların genel sağkalım tahmini arasındaki korelasyon, mutasyon TMEM200A grubunu gösteren kırmızı kareler ve mutasyona uğramamış grubu gösteren mavi kareler ile cBioPortal veritabanı kullanılarak araştırıldı. (F) TMEM200A ile birlikte mutasyona uğrayan genler cBioPortal aracı kullanılarak analiz edildi: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 ve SLC18B1. (G) COSMIC veri tabanını kullanarak GC'deki TMEM200A mutasyon tiplerinin analizi. (H) GC'deki TMEM200A SNV tiplerinin analizi COSMIC veri tabanı kullanılarak yapılmıştır. Kısaltmalar: TCGA = Kanser Genom Atlası; OS = Genel Hayatta Kalma; COSMIC = Kanser Hücrelerinde Somatik Mutasyonlar Kataloğu; GC = Mide kanseri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Farklı kanserlerde TMEM200A ekspresyonunun tek hücreli korelasyon analizi. (A) TISCH web sitesinde TMEM200A ifadesinin özeti. (B) Metastatik kutanöz melanom GSE72056 veri setinde sekiz farklı hücre tipinin dağılımı. (C) GSE72056 veri setinden kutanöz metastatik melanom hücrelerinde TMEM200A ekspresyon seviyeleri. (D) GSE146771'den kolorektal kanser veri setinde 13 farklı hücre tipinin dağılımı. (E) GSE146771 veri setinden kolorektal kanser hücrelerinde TMEM200A ekspresyon seviyeleri. (F) Çoklu tümörlerde TMEM200A ekspresyonunun tek hücreli fonksiyonel durum ile korelasyonu CancerSEA veri tabanı kullanılarak gösterilmiştir. (G) GBM, LUAD, CML, CRC, RB ve UM dahil olmak üzere bireysel tümör hücrelerinde TMEM200A ekspresyon seviyelerini gösteren T-SNE haritaları. Kısaltmalar: GBM = Glioblastoma; LUAD = Akciğer adenokarsinomu; KML = Kronik granülositik lösemi; CRC = Kolorektal kanser; RB = Retinoblastom; UM = Uveal melanom. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Gen düzeyinde TMEM200A birlikte ekspresyon ağı ve fonksiyonel zenginleştirme analizi. (A) TMEM200A GGI ağı ve birlikte eksprese edilen genleri. (B) ÜFE ağı. (C,D) TMEM200A ve birlikte eksprese edilen genler, GO ve KEGG yolağı zenginleştirmesi için analiz edildi. Kısaltmalar: PPI = Protein-protein etkileşimi; GGI = Gen-gen etkileşimi; KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi; GO = Gen Ontolojisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Çeşitli kanser türlerinde TMEM200A ve immün hücrelerin, immünsüpresif ajanların, immünostimülatör maddelerin ve MHC moleküllerinin ekspresyonu arasındaki korelasyon. (A) TMEM200A ekspresyonu ile immün infiltre eden hücreler arasındaki korelasyonu gösteren Sangerbox 3.0 ısı haritası. (B) İmmün infiltre eden hücreler ile TISIDB veri tabanındaki TMEM200A ekspresyonu arasındaki korelasyonu gösteren ısı haritası. (C) TISIDB veri tabanındaki immünosüpresif hücreler ile TMEM200A ekspresyonu arasındaki korelasyonu gösteren ısı haritası. (D-F) Testis kanseri ve uveal melanomda TMEM200A ekspresyonu ile bazı immünsüpresif ajanlar arasındaki korelasyon. (G) İmmünostimülatör faktörler ile TISIDB veri tabanındaki TMEM200A ekspresyonu arasındaki korelasyonu gösteren ısı haritası. (H) TISIDB veri tabanındaki TMEM200A ekspresyonu ile MHC molekülleri arasındaki korelasyonun ısı haritası. (I-L) Mesanenin ürotelyal karsinomunda, testis karsinomu, adrenokortikal karsinom ve uveal melanomda TMEM200A ekspresyonu ile bazı immünostimülatör faktörler ve MHC molekülleri arasındaki korelasyon. (M) Pan-kanser bağışıklık alt grupları ile TMEM200A ekspresyonu arasındaki korelasyon. (N) Pan-kanser moleküler alt grupları ile TMEM200A ekspresyonu arasındaki korelasyon. Kısaltmalar: MHC = Majör doku uyumluluk kompleksi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Pansitopenide TMEM200A immünoterapötik yanıtının analizi. (A) Farklı kanserlerde TMEM200A ekspresyonunun TMB ile korelasyonu. (B) Pan-kanserde MSI ile TMEM200A ekspresyonu arasındaki korelasyon. (C) TMEM200A'nin bağışıklık kontrol noktası blokaj yanıtını tahmin etmek için bir biyobelirteç olarak potansiyeli. (D) Sıralamak için TMEM200A'nin ICB sağkalım sonucu ve CRISPR taramasındaki logaritmik kat değişimi (logFC) ile korelasyonunun ağırlıklı ortalaması kullanıldı. Kısaltmalar: TMB = Tümör mutasyon yükü; ICB = Bağışıklık Kontrol Noktası Ablukası; CRISPR = Kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Farklı kanserlerde TMEM200A GSEA zenginleştirme analizi. GSEA zenginleştirme analizi ile TMEM200A 32 kanserin düzenlenmesinde önemli bir fonksiyonel rol oynadığı ilk beş yol belirlendi. Soldaki panel, ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ ve SARC'deki TMEM200A için GSEA zenginleştirme analizinin sonuçlarını gösterir. Sağdaki panel, SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS ve UVM'deki TMEM200A için GSEA zenginleştirme analizinin sonuçlarını gösterir. Kısaltmalar: GSEA = Gen Seti Zenginleştirme Analizi; ACC = Adrenokortikal karsinom; BLCA = Mesane Ürotelyal Karsinomu; BRCA = Meme invaziv karsinomu; CESC = Servikal skuamöz hücreli karsinom ve endoservikal adenokarsinom; CHOL = Kolanjiokarsinom; COAD = Kolon adenokarsinomu; ESCA = Özofagus karsinomu; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = Baş ve Boyun skuamöz hücreli karsinom; KICH = Böbrek Kromofobisi; KIRC = Böbrek renal berrak hücreli karsinom; KIRP = Böbrek, renal papiller hücreli karsinom; LAML = Akut Miyeloid Lösemi; LGG = Beyin Alt Dereceli Gliom; LIHC = Karaciğer hepatosellüler karsinomu; LUAD = Akciğer adenokarsinomu; LUSC = Akciğer skuamöz hücreli karsinomu; MESO = Mezotelyoma; OV = Yumurtalık seröz kistadenokarsinom; PAAD = Pankreas adenokarsinomu; PCPG = Feokromositoma ve Paraganglioma; PRAD = Prostat adenokarsinomu; OKUYUN: Rektum adenokarsinomu; SARC=Sarkom; SKCM = Deri Kutanöz Melanomu; STAD = Mide adenokarsinomu; TGCT = Testis Germ Hücreli Tümörler; THCA = Tiroid karsinomu; THYM = Timoma; UCEC = Uterin Korpus Endometriyal Karsinom; UCS = Uterin Karsinosarkom; UVM = Uveal Melanom. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 11
Şekil 11: STAD'da TMEM200A. (A) LinkedOmics veritabanı tarafından STAD'de TMEM200A ekspresyonu ile negatif korelasyon bulunan ilk 50 gen. (B) STAD'da TMEM200A pozitif bağlantılı ilk 50 gen. (C) STAD'da TMEM200A'in ilk beş pozitif ve beş negatif ilişkili geni. (D) STAD'daki DEG'lerin ısı haritası. (E-H) Taranmış DEG'ler kullanılarak zenginleştirilmiş GO ve KEGG yollarının araştırılması. Kısaltmalar: STAD=Mide adenokarsinomu; DEGs= Genlerin diferansiyel ekspresyonu; KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi; GO = Gen Ontolojisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 12
Şekil 12: STAD'ın klinik özellikleri ile TMEM200A ekspresyon düzeyi arasındaki korelasyon. (A) Lojistik regresyon kullanılarak TMEM200A ekspresyon düzeylerinin ve STAD klinik özelliklerinin analizi. (B,C) Tek ve çok değişkenli STAD orman parsellerinin Cox analizi. (D) STAD'li hastalarda cinsiyet, patolojik derece, yaş, patolojik evre ve TMEM200A ekspresyonuna dayalı olarak OS'yi tahmin eden sütun çizgisi grafikleri. (E) Kolon çizgi grafiği modelinin kalibrasyonunu gösteren kalibrasyon grafikleri. Kısaltmalar: STAD= Mide adenokarsinomu; İşletim Sistemi = Genel Hayatta Kalma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 13
Şekil 13: TMEM200A ekspresyonu STAD'de yukarı regüle edilir ve mide kanseri hücrelerinin proliferasyonunu teşvik eder. (A) Mide kanseri hücreleri HGC-27 ve gastrik mukozal epitel hücreleri GES-1'de western blotlama ile TMEM200A ekspresyonunun saptanması. (B) GC hücreleri HGC-27 ve SGC-7901'de ve gastrik mukozal epitel hücrelerinde GES-1'de TMEM200A ekspresyonunun qRT-PCR ile saptanması. (C) TMEM200A ekspresyon etkinliği, qRT-PCR ile gösterildiği gibi, GC hücreleri HGC-27'deki yıkılmayan gruba kıyasla TMEM200A yıkım grubunda büyük ölçüde azalmıştır. (D) TMEM200A yıkımı, CCK8 testi ile ölçüldüğü gibi GC hücrelerinin proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe etti. (E) TMEM200A'nin yıkılması, EMT'deki ilgili proteinleri önemli ölçüde inhibe etti ve PI3K / AKT sinyal yolunda AKT'nin fosforilasyonunu etkiledi. Kısaltma: GC = Mide kanseri; qRT-PCR: Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu; EMT=Epitelyal-Mezenkimal Geçiş; AKT=Protein kinaz B. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TMEM200A , kanser hücrelerinin çoğalması için gerekli olan bir TMEM ailesine aittir38. Farklı malignitelerde TMEM200A'nin değişken ekspresyonu daha az dikkat çekmiştir ve kapsamlı bir pan-kanser araştırması eksiktir. Bununla birlikte, TMEM transmembran protein ailesinin, çeşitli proteinlerle etkileşimler yoluyla kanser hücrelerini kötü huylu tutmada önemli olabileceğini gösteren kanıtlar birikmeye devam ediyor, örneğin, TMEM16A Ca2+ ile aktive edilen Cl- kanallarının ROCK1 / moesin tarafından aktivasyonu BRCA metastazını teşvik eder39. Bu nedenle, mevcut çalışmada analizlerimiz, terapötik bir kanser hedefi ve tümör tanı belirteci olarak TMEM200A fizibilitesini araştırmaya odaklanmıştır. Özellikle, UCSC Xena veri tabanından RNA-seq verilerini kullanarak 33 malign tümörde TMEM200A ekspresyon düzeylerini araştırdık ve TIMER2.0 veri tabanından elde edilen sonuçlar, UCSC Xena veri tabanındaki analizleri başarıyla doğruladı.

Daha sonra, farklı monosit tiplerinde TMEM200A ekspresyon seviyelerini analiz etmek için Tümör İmmün Tek Hücre Merkezi (TISCH) web aracı ve CancerSEA veritabanı kullanıldı. Sangerbox ve TISIDB web siteleri , TMEM200A bağışıklık infiltrasyonunu nasıl etkilediğini anlamaya yardımcı olmak için kullanıldı. Ayrıca, her bir malignitede TMEM200A majör fonksiyonel rollerini anlamak için GSEA zenginleştirme analizi ile TMEM200A her kanserde anahtar bir işlev oynadığı sinyal yolaklarını belirledik.

TMEM200A , GC'nin bağışıklık ortamını kontrol etmek ve GC hücrelerinin invaziv yayılmasını teşvik etmek için bir yapışma molekülü olarak hareket edebilir. Bu nedenle, TCGA veri tabanı aracılığıyla TMEM200A ekspresyon seviyesi ile ilişkili 483 diferansiyel olarak ifade edilen geni (DEG) tanımladık ve bu 483 DEG'nin GO ve KEGG zenginleştirmesini analiz ettik. Zenginleştirme sonuçları, PI3K/AKT yolunun kanser gelişiminde önemli bir rol oynadığını ve PI3K/AKT yolunun kanserin itici faktörlerinden biri olabileceğini gösterdi.

Ayrıca, TMEM200A ekspresyonu ile STAD hücre aktivitesi arasındaki korelasyonu doğrulamak için kanser gelişimini yönlendirmede TMEM200A önemli işlevi hakkında daha fazla bilgi edindikten sonra hücresel ve moleküler testler gerçekleştirdik. Beklendiği gibi, STAD hücrelerindeki TMEM200A aşağı regüle edilmesinin hücre proliferasyonunu büyük ölçüde azalttığını ve kanser hücre hatlarının normal hücre hatlarından çok daha yüksek seviyelerde TMEM200A ifade ettiğini keşfettik. Son yıllarda transmembran protein ailesi ile ilgili literatürü tarayarak, hücre adezyon molekülleri37 olarak transmembran proteinlerin EMT'de düzenleyici bir role sahip olduğunu bulduk.

Ayrıca, GC'de TMEM200A ilişkili genlerin zenginleştirme analizinin sonuçlarına göre, TMEM200A'in GC'de PI3K/AKT sinyal yolağında düzenleyici bir rolü olabileceğini bulduk. Western blotlama deneyleri, TMEM200A yıkımın Vimentin, N-kaderin ve Snai proteinlerini azaltabileceğini ve AKT fosforilasyonunu inhibe edebileceğini ortaya koydu, bu da TMEM200A'in EMT'yi etkileyerek tümör mikroçevresini düzenlediğini ve PI3K / AKT sinyal yolunun GC gelişiminin TMEM200A aracılı düzenlenmesinde rol oynayabileceğini düşündürdü. Son yıllarda yapılan bazı çalışmalarda GK hastalarında kemoterapi ilaç direncinin ana nedeninin EMT olduğu saptanmıştır. Epitelyal-mezenkimal plastisite (EMP) ve tümör mikroçevresi birçok kanser tipinde etkili tedavi için sınırlayıcı faktörler olarak tanımlanmıştır40. EMT'nin oluşumu, GC hücrelerinin karakteristik özelliklerini kaybetmesine ve mezenkimal hücrelerin özelliklerini göstermesine neden olabilir41. Bu özellik sadece GC hastalarının kemoterapötik ilaçlara duyarlılığını azaltmakla kalmaz, aynı zamanda GC hücrelerinin invaziv ve migrasyon yeteneğini artırarak tümör metastazına yol açar. Bu nedenle, yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı, çalışmamız, EMT'yi etkileyen TMEM200A spesifik etki mekanizmasını araştırarak, EMT'deki kilit düzenleyici noktaların araştırılmasına ve geliştirilmesine ve yeni hedefli terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yardımcı olmaktadır.

Biyoinformatiğin araştırma amaçlı kullanımı son yıllarda artmıştır ve bu çalışma için çeşitli internet veri tabanlarından verilere eriştik. Bu çevrimiçi veritabanlarının biyoinformatikte kullanılması, kanser çalışmalarını kolaylaştırdı ve hızlandırdı ve ayrıca araştırmacılara sonuçlarını doğrulamak için uygun fiyatlı bir araç sağladı.

Bununla birlikte, biyoinformatik tekniğinin bazı dezavantajları vardır. Bu veritabanlarını analiz için kullandığımızda, birçok çevrimiçi veritabanı birkaç veri kümesinden veri içerdiğinden, aynı çalışma birden fazla veritabanında tutarsız ve hatta çelişkili bulgular sağlayabilir. Ayrıca, birçok veritabanı çok uzun süre güncellenmez ve telif hakkı zorlukları nedeniyle içerikleri asla genişletilemez; Bu nedenle, araştırmacıların bu veritabanlarından elde ettikleri analitik bulgular her zaman sınırlıdır. Bu nedenle, bu araştırmada, bu kısıtlamaların üstesinden gelmek ve bulguların doğruluğunu sağlamak için sonuçları toplu olarak incelemek için farklı veri tabanları kullandık. Elde ettiğimiz bulguların önemli ölçüde değişmediğinden emin olmak için, analiz için farklı veritabanları kullanırken prosedürü tekrarladık. Western blot deneylerinin sonuçları, TMEM200A'in PI3K / AKT sinyal yolunu düzenleyerek GC'deki EMT'yi kontrol edebileceği ve daha sonra GC hücrelerinin proliferasyonunu etkileyeceği biyoinformatik tahminimizi destekledi. Biyoinformatik kullanarak TMEM200A etki mekanizmasını ilgili literatür ile birlikte tahmin ettik.

Özetle, bu çalışma, biyoinformatik araçlarının deneysel tasarımı nasıl önemli ölçüde kolaylaştırabileceğini ve diğer birçok bilimsel araştırma tahminini yapmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Gelecekteki kanser araştırmacılarının, deneysel doğrulamayı biyoinformatik tahmin ile birleştirmenin birincil paradigmasını benimsemeleri muhtemeldir ve bu çalışma bu amaç için iyi bir model olarak hizmet etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82160550) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Tags

TMEM200A Multiomik Analiz Pan-kanser Biyobelirteci Transmembran Protein İmmün İnfiltrasyon RNA-seq Verileri Tanısal Biyobelirteç Prognostik Biyobelirteç Mide Kanseri (GC) İn Vitro Hücre Kültürleri Knockdown Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Western Blotting Malign Davranış Tümör Oluşumu Epitelyal-mezenkimal Geçiş (EMT) PI3K/AKT Sinyal Yolu Proliferasyon İnhibisyonu
Pan-Kanser Biyobelirteci Olarak <em>TMEM200A'in</em> Multiomik Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter