Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiomics-Analyse von TMEM200A als Pan-Cancer-Biomarker

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65795
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Summary

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, in dem mehrere bioinformatische Werkzeuge kombiniert werden, um die biologischen Funktionen von TMEM200A bei Krebs zu untersuchen. Darüber hinaus validieren wir die bioinformatischen Vorhersagen auch experimentell.

Abstract

Es ist bekannt, dass das Transmembranprotein TMEM200A mit menschlichen Krebserkrankungen und Immuninfiltration in Verbindung gebracht wird. Hier untersuchten wir die Funktion von TMEM200A bei häufigen Krebserkrankungen mittels Multiomics-Analyse und verwendeten in vitro Zellkulturen von Magenzellen, um die Ergebnisse zu verifizieren. Die Expression von TMEM200A in verschiedenen menschlichen Krebsarten wurde anhand der RNA-seq-Daten aus der UCSC Xena-Datenbank untersucht. Die bioinformatische Analyse ergab eine mögliche Rolle von TMEM200A als diagnostischer und prognostischer Biomarker.

Es wurden Kulturen von normalen Magen- und Krebszelllinien gezüchtet und TMEM200A wurde niedergeschlagen. Die Expressionsniveaus von TMEM200A wurden mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und Western Blot gemessen. In vitro Loss-of-Function-Studien wurden dann verwendet, um die Rolle von TMEM200A beim malignen Verhalten und der Tumorbildung von Magenkrebszellen (GC) zu bestimmen. Western Blots wurden verwendet, um die Wirkung des Knockdowns auf den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) und den PI3K/AKT-Signalweg in der GC zu untersuchen. Bioinformatische Analysen zeigten, dass TMEM200A in hohen Konzentrationen in GC exprimiert wurde.

Die Proliferation von GC-Zellen wurde durch TMEM200A Knockdown gehemmt, der auch Vimentin-, N-Cadherin- und Snai-Proteine verringerte und die AKT-Phosphorylierung hemmte. Der PI3K/AKT-Signalweg schien ebenfalls an der TMEM200A-vermittelten Regulation der GC-Entwicklung beteiligt zu sein. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMEM200A die Mikroumgebung des Tumors reguliert, indem es die EMT beeinflusst. TMEM200A kann auch die EMT durch PI3K/AKT-Signale beeinflussen und so die Mikroumgebung des Tumors beeinflussen. Daher kann TMEM200A bei Pankarzinomen, insbesondere GC, ein potenzieller Biomarker und ein Onkogen sein.

Introduction

Krebs hat sich aufgrund seiner weltweit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten zu einem anhaltendenProblem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, das die menschliche Gesundheit weltweit gefährdet 1 und eine schwere finanzielle und medizinische Belastung für die Gesellschaft darstellt2. In den letzten Jahren wurden dank der Entdeckung von Krebsmarkern3 bedeutende Fortschritte in der Krebstherapie erzielt, und Forscher haben neuartige Diagnosemethoden und neue Medikamente zur Behandlung von Krebs entwickelt. Einige Patienten mit Krebs haben jedoch aufgrund von Faktoren wie Medikamentenresistenz, Nebenwirkungen von Medikamenten und Chemikalienempfindlichkeit immer noch schlechte Prognosen4. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Identifizierung neuer Biomarker für das Screening und die Behandlung von Krebserkrankungen im Frühstadium5.

Membranproteine sind Proteine, die sich an Zellen und Organellenmembranen binden und integrieren können6. Diese können je nach Stärke der Bindung an die Membran und ihrer Lage in drei Kategorien eingeteilt werden: lipidverankerte Proteine, integrale Proteine und periphere Membranproteine 7,8. Ein Transmembranprotein (TMEM) ist ein integrales Membranprotein, das aus mindestens einem Transmembransegment9 besteht, das entweder ganz oder teilweise durch die biologische Membran verläuft.

Obwohl die Wirkmechanismen der Proteine der TMEM-Familie nicht gut verstanden sind, ist bekannt, dass diese Proteine an verschiedenen Krebsarten beteiligt sind10. Mehrere TMEM-Proteine sind mit migratorischen, proliferativen und invasiven Phänotypen assoziiert, und ihre Expression ist oft mit der Prognose eines Patienten verbunden11. Daher sind Mitglieder der TMEM-Familie zum Ziel der Forschung geworden. Eine umfassende Überprüfung bestehender Berichte über TMEM ergab, dass sie hauptsächlich mit inter- und intrazellulärer Signalübertragung12, immunbedingten Erkrankungen und Tumorgenese10 assoziiert sind. Viele TMEMs besitzen auch wichtige physiologische Funktionen, z. B. Ionenkanäle in der Plasmamembran, die Aktivierung von Signaltransduktionswegen sowie die Vermittlung von Zellchemotaxis, Adhäsion, Apoptose und Autophagie10. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass TMEM-Proteine wichtige prognostische Marker bei der Erkennung und Behandlung von Tumoren sein könnten.

TMEM200A Expression ist bei Magenkrebs (GC) signifikant erhöht. Eine höhere Expression von TMEM200A13, das acht Exons und eine Gesamtlänge von 77,536 kb auf Chromosom 6q23.1 aufweist, wurde mit einer schlechten Prognose für das Gesamtüberleben (OS) bei GC in Verbindung gebracht. Dennoch wurden die Veränderungen in seiner Expression in onkologischen Studien nur selten berichtet. Dieser Artikel vergleicht und analysiert die Nützlichkeit von TMEM200A als therapeutisches Ziel und tumordiagnostischer Marker in verschiedenen Krebsstudien unter Verwendung verschiedener öffentlich zugänglicher Datensätze. Wir untersuchten die Wirksamkeit von TMEM200A als diagnostischer und prognostischer Biomarker für Krebserkrankungen sowie seine Expressionsniveaus bei verschiedenen menschlichen Krebsarten mit Hilfe von RNA-seq-Daten aus den UCSC-Xena- und TCGA-Datenbanken sowie mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und Western Blotting.

Der Einfluss TMEM200A Expressionsniveaus auf Mutationsraten , regulatorische Prozesse, Tumordiagnose und -prognose, Immuninfiltration und Immuntherapie wurde mit einer Mischung aus Computerwerkzeugen und Datensatz-Websites weiter untersucht. CBioPortal und die COSMIC-Datenbanken (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) wurden verwendet, um Mutationen in TMEM200A zu untersuchen. Sangerbox- und TISIDB-Websites wurden verwendet, um zu verstehen, wie TMEM200A die Immuninfiltration beeinflusst. Mit dem Online-Tool des Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) und der Datenbank CancerSEA wurde die Funktion von TMEM200A untersucht. Um den Einfluss von TMEM200A auf das maligne Verhalten und die Tumorentwicklungsfunktion von GC-Zellen zu untersuchen, wurde schließlich ein Loss-of-Function-Experiment in einem In-vitro-Assay durchgeführt. Zusätzlich wurde ein Western Blot durchgeführt, um zu beurteilen , wie sich TMEM200A Knockdown auf den PI3K/AKT-Signalweg und die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) bei GC auswirkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Die Datenbank des Cancer Genome Atlas (TCGA)

HINWEIS: Die Datenbank des Cancer Genome Atlas (TCGA) enthält die Sequenzierungsdaten von Genen in verschiedenen Tumorgeweben14. RNA-seq-Daten in TCGA für die Untersuchung von TMEM200A Transkripten pro Teil pro Million (TPM) Formaten wurden von der UCSC Xena-Website extrahiert 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) und log2 transformiert, um die Expressionen zwischen den Proben zu vergleichen.

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UCSC Xena-Website auf.
  2. Klicken Sie auf die Registerkarte Xena starten .
  3. Klicken Sie auf die Registerkarte DATENSÄTZE am oberen Bildschirmrand.
  4. Klicken Sie aus den 129 Kohorten und 1.571 Datensätzen auf dieser Seite auf die Registerkarte für insgesamt 33 Krebsarten wie GDC TCGA Akute myeloische Leukämie (LAML), GDC TCGA Nebennierenrindenkrebs (ACC), GDC TCGA Gallengangskrebs (CHOL) und mehr.
  5. Wählen Sie im Menü Genexpression RNAseq die Registerkarte HTSeq - FPKM GDC Hub aus und klicken Sie darauf.
    HINWEIS: HTSeq - FPKM GDC Hub stellt Daten dar, die durch Einwilligung korrigiert wurden.
  6. Klicken Sie im Download-Menü auf den entsprechenden Link.
    HINWEIS: Mit der oben genannten Methode wurden RNA-Seq-Daten für 33 verschiedene Krebsarten heruntergeladen.
  7. Entpacken Sie das Zip-Archiv mit RNA-seq-Daten für 33 verschiedene Krebsarten in einer einzigen Datei im Desktop-Ordner des Computers.
  8. Vereinheitlichen Sie die entpackten txt-Dateien im selben Ordner und legen Sie die Perl-Skripte in diesem Ordner ab.
  9. Öffnen Sie die Perl-Software , kopieren Sie den Pfad des Ordners und fügen Sie ihn in die Perl-Software ein, in der sich der Mauszeiger befindet, drücken Sie die Eingabetaste , geben Sie den Namen des Perl-Codes und den Namen des Gens (TMEM200A) ein, und drücken Sie dann die Eingabetaste , um eine neue TXT-Datei(singleGeneExp.txt) zu erhalten.
    HINWEIS: Diese neue txt-Datei (singleGeneExp.txt) enthält die Genexpression von TMEM200A bei 33 Krebsarten bei verschiedenen Patienten.
  10. Öffnen Sie den R-Code (diffR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die singleGeneExp.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  11. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code (diffR) aus, und zeichnen Sie das Bild durch das Paket "ggpubr".

2. Die TIMER2.0-Datenbank

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) Datenbank 16 auf.
  2. Klicken Sie auf die Registerkarte Krebsforschung.
  3. Geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Registerkarte Senden , um die differentiellen Expressionsbilder von TMEM200A in verschiedenen Tumorarten zu erhalten.

3. Humaner Proteinatlas (HPA)

  1. Rufen Sie die Weboberfläche des Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) 17auf.
  2. Geben Sie ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen . Wählen Sie den Subatlas TISSUE aus.
  3. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Seite und scrollen Sie nach unten, um die Registerkarte Übersicht über die Proteinexpression zu finden.
    HINWEIS: Der Abschnitt Übersicht über die Proteinexpression zeigt die Proteinexpressionsniveaus von TMEM200A in 45 Organen des menschlichen Körpers.

4. Das HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-Methylierungsplattform-Array

HINWEIS: Das HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-Methylierungsplattform-Array wurde verwendet, um Daten zur Methylierung zu sammeln. Wir konnten den TMEM200A DNA-Methylierungsgrad mit Hilfe der SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) Datenbank18 bestimmen.

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der SMART-Website auf.
  2. Geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein, um die Verteilung der TMEM200A in den Chromosomen und den Methylierungsgrad von TMEM200A bei verschiedenen Arten von Malignomen zu erhalten.
  3. Scrollen Sie auf der Seite nach unten zum Menü Klicken Sie, um die aggregierte CpG-Methylierung zu überprüfen , und klicken Sie auf die Schaltfläche Plotten . Suchen Sie unten auf der Seite die Schaltfläche Abbildung herunterladen und klicken Sie darauf. Laden Sie die Abbildung herunter.

5. Die UALCAN-Datenbank

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UALCAN-Website auf.
    ANMERKUNG: Boxplots der TMEM200A Promotormethylierungsniveaus bei verschiedenen Malignomen wurden über die UALCAN-Datenbank (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19 erstellt
  2. Klicken Sie oben auf der Seite auf die Schaltfläche TCGA .
  3. Geben Sie TMEM200A in das Eingabefeld Gen-ID auf dem Bildschirm ein. Scrollen Sie im Menü des TCGA-Datensatzes nach unten und wählen Sie die Art der Krebsart aus, die abgefragt werden soll.
  4. Nachdem Sie auf die Schaltfläche "Erkunden" geklickt haben, klicken Sie im Menü "Links zur Analyse" auf die Untergruppenanalyse Methylierung, um die Methylierungsergebnisse dieses Tumors zu erhalten.
    HINWEIS: Mit dieser Methode erhielten wir Methylierungsergebnisse für 22 Tumore in der UALCAN-Datenbank .

6. Datenbank des Katalogs somatischer Mutationen in Krebszellen (COSMIC)

  1. Rufen Sie die Website Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) auf.
    HINWEIS: Daten zu kodierenden Mutationen, nicht-kodierenden mutierten genomischen Umlagerungen und Fusionsgenen im menschlichen Genom sind in der Datenbank 20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/ des Katalogs für somatische Mutationen in Krebszellen (COSMIC) verfügbar, die auch zur Bestimmung der Häufigkeit verschiedener TMEM200A Mutationen bei verschiedenen Krebsarten verwendet wird.
  2. Geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Schaltfläche SUCHEN , um zu einem neuen Bildschirm zu gelangen.
  3. Suchen Sie im Menü Gene den Link, auf dem der Gen-ID-Name des TMEM200A angezeigt wird, und klicken Sie darauf.
  4. Suchen Sie auf der neuen Seite die Spalte Gruppierung der Mutationsverteilung , um den Mutationsstatus von TMEM200A im Tumor zu erhalten.

7. CBioPortal

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der CBioPortal-Website auf.
    HINWEIS: Krebsgenomik-Daten können mit der cBioPortal (www.cioportal.org) Datenbank gefunden, heruntergeladen, analysiert und visualisiert werden. Somatische Mutationen, Veränderungen der DNA-Kopienzahl (CNAs), mRNA- und microRNA (miRNA)-Expression, DNA-Methylierung, Proteinhäufigkeit und Phosphoproteinhäufigkeit sind nur einige der genomischen Datentypen, die von cBioPortal21 integriert werden. Mit cBioPortal kann ein breites Spektrum an Studien durchgeführt werden; Der Schwerpunkt liegt jedoch auf verschiedenen Analysen von Mutationen und deren Visualisierung.
  2. Wählen Sie den Datensatz Pan-Cancer analysis of whole genomes aus dem Unterabschnitt PanCancer Studies des Abschnitts Select Studies for Visualization & Analysis (Studien für Visualisierung und Analyse auswählen ) aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Nach Genen abfragen .
  3. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abfrage senden .
  4. Klicken Sie oben auf der Seite auf die Schaltfläche Krebsart detailliert , um die Mutationen von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten zu erhalten.

8. Sangerbox 3.0 Werkzeug

  1. Gehen Sie zur Benutzeroberfläche des Sangerbox 3.0-Tools .
    ANMERKUNG: Die Korrelation der TMEM200A Expression mit immuninfiltrierenden Zellen, Immunsuppressiva, immunstimulatorischen Faktoren und MHC-Molekülen (Haupthistokompatibilitätskomplex) bei allen Krebsarten wurde mittels CIBERSORT-Immuninfiltration unter Verwendung der Pan-Krebs-Immuninfiltrationsdaten in Sangerbox 3.0 Tool22 (http://vip.sangerbox.com/) analysiert.
  2. Wählen Sie in der Symbolleiste auf der linken Seite die Registerkarte Immunzelluläre Analyse (CIBERSORT) aus dem Menü Pan-Krebsanalyse aus und klicken Sie darauf.
  3. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden .

9. TISIDB-Datenbank

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der TISIDB-Website auf.
    ANMERKUNG: Die TISIDB-Datenbank23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) wurde verwendet, um die Korrelation der TMEM200A Expression mit immuninfiltrierenden Zellen, Immunsuppressiva, immunstimulatorischen Faktoren und MHC-Molekülen bei verschiedenen Krebsarten zu untersuchen.
  2. Geben Sie das Zielgensymbol (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden .
  3. Klicken Sie auf die Abschnitte Lymphozyten, Immunmodulatoren, Chemokine und Subtypen oben auf der Seite. Laden Sie die entsprechenden Bilder unten auf der Seite herunter.

10. Die TIDE-Datenbank

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der TIDE-Website auf.
    HINWEIS: Die TIDE-Datenbank (http://tide.dfci.harvard.edu/) wurde verwendet, um das Potenzial von TMEM200A als Biomarker für die Vorhersage des Ansprechens auf eine Tumor-Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie zu bewerten.
  2. Geben Sie auf dem Einstiegsbildschirm die E-Mail-Adresse ein, um das Konto zu registrieren und sich anzumelden.
  3. Suchen Sie den Unterabschnitt Biomarker-Bewertung oben auf der Seite und klicken Sie darauf.
  4. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld für Gene eingeben unten auf der Seite ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Senden .
  5. Ziehen Sie auf der Seite die Maus, um die Seite nach unten zu schieben und die Ergebnisse der Analyse zu finden.

11. Die CancerSEA-Datenbank

  1. Gehen Sie auf die Benutzeroberfläche der CancerSEA-Website .
    HINWEIS: Anhand von Einzelzellsequenzierungsdaten wurden die Zusammenhänge zwischen TMEM200A Expression und dem funktionellen Zustand verschiedener Tumorzellen untersucht. Dies geschah mit Hilfe der CancerSEA-Datenbank24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. Suchen und klicken Sie oben auf der Seite auf die Registerkarte Suchen .
  3. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden .

12. Das Tumor-Immun-Einzelzellzentrum (TISCH) Netzwerk-Tool

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche des Netzwerktools für das Tumorimmun-Einzelzellzentrum (TISCH) auf.
    ANMERKUNG: Die Korrelation zwischen den Expressionsniveaus von TMEM200A - und Krebszellen wurde auch unter Verwendung des TISCH-Netzwerkwerkzeugs (Tumor Immune Single-Cell Center)25 gezeigt.
  2. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erkunden .
  3. Wählen Sie im Menü Krebstyp auf dieser Seite das Dataset All Cancers aus, und klicken Sie darauf. Scrollen Sie dann auf der Seite nach unten und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen .

13. GeneMANIA

  1. Rufen Sie die GeneMANIA-Website auf.
    ANMERKUNG: Die Korrelation zwischen TMEM200A und seinen funktionell relevanten Genen wurde mit Hilfe der Integrationsstrategie für das Gen-Multi-Assoziations-Netzwerk Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 zur Konstruktion von Gen-Gen-Interaktionsnetzwerken (GGI) vorhergesagt.
  2. Geben Sie im Suchfeld oben links auf der Seite die Gen-ID (TMEM200A) ein und klicken Sie auf Suchtools.
    HINWEIS: Das Web-Tool GeneMANIA wurde verwendet, um 20 Gene zu finden, die mit TMEM200A assoziiert sind.

14. Analyse der funktionellen Anreicherung

  1. Speichern Sie die Symbol-IDs der zu analysierenden Gene zur Anreicherung im txt-Dateiformat.
  2. Öffnen Sie den R-Code (symbolidR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die obige txt-Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  3. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (symbolidR) aus. Wandeln Sie die Symbol-IDs dieser Gene über die "org. Hs.eg.db"-Paket. Rufen Sie die id.txt Datei ab.
  4. Öffnen Sie den R-Code (GOR und KEGGR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die id.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  5. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (GOR und KEGGR) aus. Um diesem Protokoll zu folgen, analysieren Sie diese Gene auf GO- und KEGG-Anreicherung mit den Paketen "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" und "enrichplot" und stellen Sie die Anreicherungsergebnisse mit dem Paket "gglot2" dar.

15. Analyse der Unterschiede in der Genaktivität

HINWEIS: TMEM200A Scoring in jeder Krebsprobe wurde mit Hilfe von ssGSEA (Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis)27 berechnet, und die differentielle Analyse der Genaktivität in TMEM200A Krebs- und gesunden Geweben wurde für verschiedene Krebsarten durchgeführt.

  1. Basierend auf den RNA-Seq-Daten von 33 Tumortypen, die in Schritt 1.7 heruntergeladen wurden, entpacken Sie alle heruntergeladenen Dateien und legen Sie sie in einem einheitlichen Ordner ab.
  2. Legen Sie die merge.txt Datei im obigen Ordner ab.
    HINWEIS: Die Daten in merge.txt Datei von BioWolf (www.biowolf.cn) enthalten die Genexpression für alle Patienten in allen Tumoren in der Datenbank The Cancer Genome Atlas (TCGA).
  3. Öffnen Sie den R-Code (ssGSEAR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich der obige Ordner befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  4. Nehmen Sie die Zeile, in der geneName im R-Code (ssGSEAR) steht, und geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) ein.
  5. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (ssGSEAR) aus. Holen Sie sich die Bewertungsdatei für die Genaktivität: scores.txt.
    HINWEIS: Mit dem ssGSEA-Algorithmus konstruieren wir zunächst eine Gensatzdatei basierend auf den Korrelationskoeffizienten zwischen Genen gemäß den in der merge.txt Datei bereitgestellten Daten und identifizieren die Gene mit einer höheren Korrelation mit dem Zielgen (TMEM200A) aus der Datei. Dann werden die Gene mit der höheren Korrelation als aktive Gene von TMEM200A vereinheitlicht, und schließlich erhalten wir die Bewertung der aktiven Gene in jeder Probe.
  6. Öffnen Sie den R-Code (scoreDiffR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die scores.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  7. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code (scoreDiffR) aus, und zeichnen Sie das Bild durch die Pakete "plyr", "reshape2" und "ggpubr".

16. Klinisch-pathologische Korrelations- und Überlebensprognoseanalyse

  1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UCSC Xena-Website auf.
  2. Klicken Sie auf die Registerkarte Xena starten .
  3. Klicken Sie auf die Registerkarte DATENSÄTZE am oberen Bildschirmrand.
  4. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Seite und scrollen Sie nach unten, um die Registerkarte TCGA Pan-Cancer (PANCAN) zu finden.
  5. Klicken Sie aus den 129 Kohorten und 1.571 Datensätzen auf dieser Seite auf die Registerkarte TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. Wählen Sie im Menü "Phänotyp " die Registerkarte "Kuratierte klinische Daten" aus und klicken Sie darauf.
  7. Klicken Sie im Download-Menü auf den entsprechenden Link.
    HINWEIS: Laden Sie klinische Daten für 33 Krebsarten aus der TCGA-Datenbank unter dem obigen Link herunter.
  8. Entpacken Sie die heruntergeladene klinische Datendatei und öffnen Sie die entpackte Datei im xls-Dateiformat.
  9. Organisieren und bewahren Sie die erforderlichen klinischen Daten (Stadium, Alter, pathologisches Stadium und Patientenstatus) in der Datei auf, löschen Sie die verbleibenden nicht benötigten klinischen Daten und speichern Sie die gesamte Datei als Datei im txt-Format, nachdem Sie sie in klinisch umbenannt haben.
  10. Legen Sie diese Datei basierend auf den in Schritt 1.9 ermittelten singleGeneExp.txt im selben Ordner wie die organisierte clinical.txt Datei ab.
  11. Entpacken Sie die heruntergeladenen klinischen Daten und legen Sie die singleGeneExp.txt - und clinical.txt Dateien im selben Ordner wie die entpackten klinischen Dateien ab.
  12. Öffnen Sie den R-Code (clinicalDiffR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich der obige Ordner befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  13. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code (clinicalDiffR) aus, und zeichnen Sie das Bild mit dem Paket "ggpubr".
  14. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UCSC Xena-Website auf.
  15. Klicken Sie auf die Registerkarte Xena starten .
  16. Klicken Sie auf die Registerkarte DATENSÄTZE am oberen Bildschirmrand.
  17. Klicken Sie aus den 129 Kohorten und 1.571 Datensätzen auf dieser Seite auf die Registerkarte für insgesamt 33 Krebsarten wie GDC TCGA Akute myeloische Leukämie (LAML), GDC TCGA Nebennierenrindenkrebs (ACC), GDC TCGA Gallengangskrebs (CHOL) und mehr.
  18. Wählen Sie im Phänotyp-Menü die Registerkarte Überlebensdaten aus und klicken Sie darauf.
  19. Klicken Sie im Download-Menü auf den entsprechenden Link.
  20. Entpacken Sie das Zip-Archiv mit Überlebensdaten für 33 verschiedene Krebsarten in einer einzigen Datei im Desktop-Ordner des Computers.
  21. Legen Sie die entpackten Überlebensdaten im selben Ordner wie die singleGeneExp.txt Datei ab, die Sie in Schritt 1.9 erhalten haben.
  22. Öffnen Sie den R-Code (preOSR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich der obige Ordner befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  23. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (preOSR) aus. Berechnen Sie mit dem Paket "limma", um eine Datendatei über das Überleben der TMEM200A bei Pankarzinom zu erhalten: expTime.txt.
  24. Öffnen Sie den R-Code (OSR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die expTime.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  25. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (OSR) aus. Führen Sie eine KM-Analyse mit den Paketen "survival" und "survminer" basierend auf den Daten in der expTime.txt Datei durch und zeichnen Sie die Überlebenskurven für TMEM200A bei Pan-Krebs auf.

17. Univariate und multivariate Cox-Regressionsanalysen mit Waldparzellenbau

  1. Öffnen Sie den R-Code (COXR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich die expTime.txt Datei von 16.23 befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  2. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (COXR) aus. Führen Sie basierend auf den Daten in der expTime.txt Datei univariate COX-Regressionsanalysen mit den Paketen "survival", "survminer" und "forestplot" durch, um ein univariates Forest-Diagramm von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten zu zeichnen.
  3. Legen Sie die expTime.txt Datei aus Schritt 16.23 und clinical.txt aus Schritt 16.10 im selben Ordner ab.
  4. Öffnen Sie den R-Code (multicoxR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich der Ordner mit der expTime.txt Datei aus Schritt 16.23 und clinical.txt Datei aus Schritt 16.10 befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  5. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (multicoxR) aus. Führen Sie eine multivariate COX-Regressionsanalyse mit den Paketen "survival" und "survminer" durch, um ein multivariates Forest-Diagramm der TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten basierend auf den Daten in den expTime.txt - und clinical.txt-Dateien zu zeichnen.

18. Prognostisches Modell des Magenkarzinoms basierend auf TMEM200A Expression und klinischen Merkmalen

  1. Legen Sie die clinical.txt Datei aus Schritt 16.10 und die expTime.txt Datei aus Schritt 16.23 im selben Ordner ab.
  2. Öffnen Sie den R-Code (NomoR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich die obige txt-Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  3. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (NomoR) aus. Verwenden Sie die Softwarepakete "survival", "regplot" und "rms" für TMEM200A Expressionsdaten in GC und klinischen Daten, um ein prognostisches Modell zur Vorhersage des Patientenüberlebens zu erstellen.

19. Zellkultur und siRNA-Transfektion von TMEM200A

ANMERKUNG: Humane STAD HGC-27-Zellen, SGC-7901-Zellen und humane GES-1-Zellen des Magenschleimhautepithels wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle), wiederbelebt, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 vollständigem Medium (mit 10 % neonatalem fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Mischung) geimpft und bei 37 °C in einem 5%igen CO2 kultiviert Zellkultur-Inkubator. Das Nährmedium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. Die Zellen in gutem Wachstumszustand wurden in Sechs-Well-Platten gemäß (2-3) × 105 Zellen pro Well inokuliert.

  1. Nehmen Sie zunächst drei Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 8 μl Transfektionsreagenz (siehe Table von Materialien) und 200 μl Basalmedium in jedes Röhrchen. Geben Sie dann 4 μg SiRNA1, SiRNA2 und SiRNA3 in jedes Röhrchen.
    HINWEIS: Für TMEM200A Knockdown wurde siRNA entworfen und gekauft (siehe Materialtabelle).
  2. Mischen Sie die Mischung in den drei Mikrozentrifugenröhrchen gründlich und geben Sie sie in jede der drei Vertiefungen der 6-Well-Platte. Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen. Kennzeichnen Sie die drei Vertiefungen, in denen das Gemisch zugegeben wurde , als SiRNA-1, SiRNA-2 und SiRNA-3.
  3. Wenn die Zellen 4-6 h inkubiert wurden, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums in den drei Unterwells der 6-Well-Platte.
    HINWEIS: Wenn Sie die Hälfte des vollständigen Mediums ersetzen, saugen Sie die Hälfte des ursprünglichen vollständigen Mediums an und füllen Sie es mit der Hälfte des frischen vollständigen Mediums auf.
  4. Vierundzwanzig bis 48 Stunden später werden TMEM200A siRNA-transfizierte Zellen als Versuchsgruppe und nicht transfizierte Zellen als negative Kontrollgruppe verwendet. Führen Sie eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR, siehe Abschnitt 20) durch, um die Wirkung der Transfektion auf die Zellen zu beurteilen.

20. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

  1. Verwerfen Sie das Zellkulturmedium in jeder Untergruppe und waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Isolieren Sie die Gesamt-RNA mit einem RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle).
  3. Schätzen Sie die RNA-Konzentration und synthetisieren Sie cDNA mit 1 μg RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) mit 10-fachen Verdünnungen von cDNA in 10 μl Reaktionsmischung, einschließlich humanspezifischer Vorwärts- und Rückwärtsprimer für GAPDH (zur Standardisierung), TMEM200A (siehe Materialtabelle) und qPCR-Mastermix, unter Verwendung des Real-Time-PCR-Assay-Systems.
    HINWEIS: Führen Sie jedes Experiment in dreifacher Ausführung durch.
  5. Verwenden Sie die folgenden qPCR-Reaktionsbedingungen: Initialisierung, 95 °C für 3 min; Denaturierung, 95 °C für 10 s; Glühen, 60 °C für 30 s; und Verlängerung, 80 °C für 10 s; Wiederholen Sie die Denaturierung, das Glühen und die Verlängerung 40x. Bestimmen Sie die relative Expression jedes Gens unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Technik 28.
  6. Wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal, um biologische Triplikate zu erhalten.

21. Western-Blot-Nachweis relevanter Proteinexpression

  1. Verwerfen Sie das Zellkulturmedium in jeder Untergruppe und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 2 x 1 ml PBS.
  2. Kühlen Sie die 6-Well-Platten mit den Zellen auf Eis ab und fügen Sie 150 μl vorgekühlten RIPA-Lysepuffer (Radio Immune Precipitation Assay) hinzu (150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und frisch hinzugefügter Protease-Inhibitor-Cocktail). Lassen Sie die Lyse 10 Minuten lang auf Eis laufen.
  3. Entfernen Sie mit einem Kunststoff-Zellschaber anhaftende Zellen aus der Schale und geben Sie die Zelllösung vorsichtig in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen um.
  4. Das Zelllysat wird 10 min bei 1,5 ×10 4 g bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
  5. Verwenden Sie ein BCA-Protein-Assay-Kit, um den Proteingehalt gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.
  6. Laden Sie 30 g Protein aus jeder Probe auf ein 10%iges Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (SDS-PAGE) und lassen Sie es 0,5 h bei 80 V laufen, gefolgt von 1,5 h bei 120 V.
  7. Die Proteine aus dem Gel werden 1-1,5 h lang bei einer Spannung von 300 mA auf eine 45 μm Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran übertragen.
  8. Nachdem Sie die PVDF-Membran auf einen Schüttler gelegt und 3 x 5 Minuten lang geschüttelt haben, geben Sie Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl und 0,1 % Tween 20) mit der Proteinseite (Gelseite) nach oben in den entsprechenden Behälter.
  9. Legen Sie die Membran in den Blockierungspuffer (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 0,5 h bei Raumtemperatur.
  10. Waschen Sie die Membran 3 x 10 Minuten lang mit TBST.
  11. Die Membran wird mit Primärantikörpern gegen Phospho-AKT (p-AKT; 1:1.000), Gesamt-AKT 1:1.000, E-Cadherin (E-ca; 1:1.000), N-Cadherin (N-ca; 1:1.000), Vimentin 1:1.000, Schnecke 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; 1:1.000) über Nacht bei 4 °C inkubiert.
  12. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min lang und inkubieren Sie die Membran mit einem Sekundärantikörper von Kaninchen oder Maus (1:5.000) für 1 h bei Raumtemperatur.
  13. Inkubieren Sie die PVDF-Membran 30 s lang mit ECL-Substrat und detektieren Sie das Signal mit einem Bildgebungssystem.

22. CCK-8-Assay

  1. Besiedeln Sie humane STAD HGC-27-Zellen in gutem Wachstumszustand in 96-Well-Platten.
  2. Wenn die Zelldichte 60-70% erreicht, transfizieren Sie die Zellen mit TMEM200A siRNA (wie in Schritt 19.3).
  3. Die transfizierten Zellen werden in 96-Well-Platten mit einer Zelldichte von 5 × 10 3/Well (Zählung lebensfähiger Zellen mit einem Zellzähler) ausgesät, in NC - und TMEM200A siRNA-Gruppen (mit drei Replikat-Wells in jeder Gruppe) unterteilt und bei 37 °C inkubiert.
  4. CCK-8-Reagenz nach 0, 24, 48, 72 und 96 h zugeben und 2 h bei 37 °C inkubieren. Messen Sie die Extinktion (450 nm) mit einem multifunktionalen Enzymmarkierer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Expression von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten
Wie in Abbildung 1 dargestellt, analysierten wir zunächst die unterschiedlichen Expressionsniveaus von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten anhand verschiedener Datenbanken. TMEM200A Expression war bei Cholangiokarzinomen (CHOL), Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich (HNSC), klarzelligen Nierenkarzinomen (KIRC), renalen papillärzelligen Karzinomen (KIRP), hepatozellulären Karzinomen (LIHC), STAD und Schilddrüsenkarzinomen (THCA) im Vergleich zu benachbarten Normalgeweben allein auf der Grundlage von TCGA-Daten erhöht. TMEM200A Beim Uroepithelkarzinom der Harnblase (BLCA), dem zervikalen Plattenepithelkarzinom und dem zervikalen Adenokarzinom (CESC), dem Glioblastoma multiforme (GBM), dem Nierenchromophoben (KICH), dem Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC), dem Phäochromozytom und Paragangliom (PCPG), dem rektalen Adenokarzinom (READ) und dem Endometriumkarzinom des Uteruskorpus (UCEC) nahm die Expression jedoch ab (Abbildung 2A). In der TIMER2.0-Datenbank stieg TMEM200A Expression in CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC und STAD an. Darüber hinaus stieg TMEM200A Expression bei BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, Hautkutanmelanom (SKCM) und UCEC (Abbildung 2B).

Durch den Vergleich der Ergebnisse der beiden Datenbanken stellten wir fest, dass die Pan-Krebs-Expression von TMEM200A in beiden Datenbanken gleich war. Wir erhielten die klinischen Follow-up-Daten und RNA-Sequenzierungsdaten von 33 Patienten mit Krebs aus der TCGA-Datenbank, berechneten TMEM200A Scoring in jeder Krebsprobe mit Hilfe der ssGSEA-Analyse und berechneten dann TMEM200A Genaktivität in Tumoren und normalem Gewebe in vielen Tumoren. Wir entdeckten, dass TMEM200A in GBM, HNSC, Nieren-KIRC und THCA stark exprimiert wurde (Abbildung 2C); Daher wurde die Genaktivität von TMEM200A in jedem Tumorgewebe eingestuft. Es zeigte sich, dass die Genaktivität von TMEM200A beim KIRC am höchsten und beim Aderhautmelanom (UVM) am niedrigsten war (Abbildung 2D). Die anschließende HPA-Datenbankauswertung der TMEM200A Expressionsniveaus in menschlichem Gewebe zeigte, dass TMEM200A Expressionsniveaus in den meisten normalen Geweben niedrig, aber in der Nebennierenrinde, dem Rektum, der Gebärmutterschleimhaut und der glatten Muskulatur hoch waren (Abbildung 2E).

In normalen Gewebezelllinien zeigten einige Zelllinien wie Granulosazellen, Bipolarzellen, Skelettmuskelzellen, Endometriumstromazellen und T-Zellen eine hohe Expression von TMEM200A, während TMEM200A Expression in den meisten anderen Zelllinien gering war (Abbildung 2F). Wir untersuchten auch immunhistochemische (IHC) Daten in der HPA-Datenbank, um die Expression von TMEM200A auf Proteinebene zu untersuchen. Die Daten zur Färbung und Intensität zeigten eine viel größere und ausgeprägtere Expression von TMEM200A in Darmkrebs (CRC), Lungenkrebs (LUAD), Leberkrebs (LIHC), Brustkrebs (BRCA) und Prostatakrebs (PRAD) im Vergleich zu normalem Gewebe (Abbildung 2G). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten weit verbreitet ist und die Krebsentwicklung über unterschiedliche Mechanismen in verschiedenen Tumoren beeinflusst.

Klinisch-pathologischer Zusammenhang und Überlebensprognose
Für 33 maligne Erkrankungen beim Menschen sammelten wir Informationen und klinische Daten in der TCGA-Pan-Krebs-Kohorte (PanCan) von der UCSC Xena-Datenbank-Website und untersuchten die Korrelation zwischen TMEM200A Expression in PanCan und Alter, pathologischem Grad, klinisch-pathologischem Stadium und Überlebensstatus der Patienten. Diese Studie zeigte, dass bei sechs Krebsarten die Expression von TMEM200A mit dem klinisch-pathologischen Stadium assoziiert war, darunter BLCA, invasives Mammakarzinom (BRCA), Speiseröhrenkarzinom (ESCA), KIRP, SKCM und Hodenkarzinom (TGCT) (Abbildung 3A). Das Alter wurde mit sechs Tumoren korreliert, darunter invasives BRCA, GBM, akute myeloische Leukämie (LAML), SKCM, Thymuskarzinom (THYM) und Endometriumkarzinom (UCEC) (Abbildung 3B). Der pathologische Grad war mit sechs Tumoren assoziiert, darunter Ösophaguskarzinom (ESCA), HNSC, KIRC, niedriggradiges Gliom des Gehirns (LGG), Pankreas-Adenokarzinom (PAAD) und Endometriumkarzinom (UCEC) (Abbildung 3C). Der Überlebensstatus war mit fünf Tumoren assoziiert, darunter Nebennierenrindenkarzinom (ACC), BLCA, KIRC, PCPG und Aderhautmelanom (UVM) (Abbildung 3D).

Wir führten Studien für verschiedene Krebsarten auf OS, DSS, PFI und DFI durch, indem wir die einseitige Cox-Regressionsanalyse mit einem medianen Gruppenschwellenwert verwendeten, um mehr über die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und Prognose zu erfahren. Die Ergebnisse der OS-Analyse zeigten, dass unter den vier Tumoren eine höhere TMEM200A-Expression einen größeren Einfluss auf die OS-Prognose in vier Tumoren hatte, darunter Nebennierenrindenkarzinom (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), akute myeloische Leukämie (LAML) (P = 0,011) und GC (STAD) (P = 0,005). Im Gegensatz dazu hatte eine höhere TMEM200A-Expression eine bessere Prognose für das Gesamtüberleben bei fünf Tumoren, darunter KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), niedriggradiges Gliom des Gehirns (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) und kutanes Melanom (SKCM) (P = 0,043) (Abbildung 3E,F). Für DSS hatte eine hohe TMEM200A Expression eine schlechte Prognose bei zwei Tumorarten, darunter Nebennierenrindenkarzinom (ACC) (p = 0,026) und BLCA (p = 0,015). Eine hohe TMEM200A-Expression hatte eine bessere Prognose bei vier Tumorarten, darunter KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), niedriggradiges Gliom des Gehirns (LGG) (P = 0,025) und PCPG (P = 0,007) (Abbildung 3G). Darüber hinaus hatte eine höhere TMEM200A-Expression für PFI eine schlechte Prognose bei drei Tumorarten, darunter Nebennierenrindenkarzinom (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) und Aderhautmelanom (UVM) (P = 0,020). Eine höhere TMEM200A-Expression hatte eine bessere Prognose bei zwei Tumorarten, darunter KIRC (P < 0,001) und niedriggradige Gliome (LGG) (P = 0,044) des Gehirns (Abbildung 3H). Im DFI hatte eine höhere Expression von TMEM200A eine schlechtere Prognose beim Nebennierenrindenkarzinom (ACC) (p = 0,044) (Abbildung 3I).

Anschließend wählten wir mehrere Tumore (KIRC und KIRP) für die Multi-COX-Regressionsanalyse aus. Die Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A die Überlebensrate von Krebspatienten im Vergleich zu anderen klinischen Faktoren individuell beeinflussen können (Abbildung 3J und K). Diese Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A als unabhängiger bioprognostischer Marker bei verschiedenen Krebsarten verwendet werden kann, um das Überleben von Patienten mit Krebs zu beeinflussen.

DNA-Methylierungsanalyse
Eine der epigenetischen Veränderungen, die die meiste Aufmerksamkeit erhalten hat, ist die DNA-Methylierung29. Es wurde vermutet, dass eine Art epigenetischer Veränderung, die DNA-Methylierung, einen signifikanten Einfluss auf das Tumorwachstum hat30. Daher haben wir mit Hilfe der SMART-Datenbank den DNA-Methylierungsgrad von TMEM200A in normalem und krebsartigem Gewebe ausgewertet. PAAD- und PRAD-Gewebe wiesen eine höhere DNA-Methylierung von TMEM200A auf als normales Gewebe. TMEM200A wiesen jedoch niedrigere DNA-Methylierungswerte in COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA und UCEC auf als in normalem Gewebe (Abbildung 4A). Die DNA-Methylierungsgrade von TMEM200A waren in der TCGA-Datenbank in KIRP, PRAD, PCPG und THYM auf der Grundlage der UALCAN-Datenbank wesentlich höher, aber nicht in BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA und UCEC. Der Methylierungsgrad von TMEM200A in LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA und UCEC signifikant abgenommen (Abbildung 4C). Um den Zusammenhang zwischen dem Expressionsniveau von TMEM200A und der DNA-Methylierung und klinisch-pathologischen Faktoren noch weiter zu untersuchen, nutzten wir erneut die SMART-Datenbank und stellten fest, dass sich der DNA-Methylierungsgrad von TMEM200A in BLCA, HNSC, LUAD und STAD mit dem pathologischen Stadium änderte (Abbildung 4D). Klinische Faktoren beeinflussen den Grad der DNA-Methylierung von TMEM200A in den oben genannten Tumoren.

Analyse von Genmutationen
Einer der Gründe für die Entstehung von Tumoren ist die Anhäufung von Genmutationen31. Daher wurde die Häufigkeit von somatischen TMEM200A-Mutationen analysiert, indem die Häufigkeit von TMEM200A Mutationen in klinischen Proben von Pan-Krebs unter Verwendung der cBioPortal-Datenbank geschätzt wurde. TMEM200A ist bei vielen Krebsarten mutiert, wie z. B. Lungenkrebs, Uterusendometrioidkarzinom, Melanom, Ösophagogastricuskrebs, Knochenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, hepatobiliärem Krebs, reifem B-Zell-Lymphom, BRCA, Endometriumkarzinom, Eierstockkrebs, Embryonaltumor, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Darmkrebs, Gliom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Weichteilsarkom und Krebs unbekannter Primärtumore (Abbildung 5A). Darüber hinaus können DNA-Veränderungen zu Struktur- oder Aminosäureveränderungen auf Proteinebene führen. Abbildung 5B zeigt die 3D-Struktur von TMEM200A. Mit Hilfe der cBioPortal-Datenbank fanden wir Mutationsstellen in den Aminosäuren von TMEM200A; Missense-Mutationen waren die häufigste Form von Mutationen (Abbildung 5C).

Wir analysierten die Daten mit Sangerbox 3.0, um die Genauigkeit der Mutationsstellen zu überprüfen, und erzielten die gleichen Ergebnisse wie zuvor. Missense-Mutationen sind die häufigste Form von Mutationen bei TMEM200A und können bei SKCM bis zu 7,8 % auftreten (Abbildung 5D). Eine Missense-Mutation ist eine Mutation, bei der ein Codon, das für eine Aminosäure kodiert, einer Basensubstitution unterzogen wird und zu einem Codon wird, das für eine andere Aminosäure kodiert, was zu einer Änderung des Aminosäuretyps und der Aminosäuresequenz der Polypeptidkette führt. Das Ergebnis einer Missense-Mutation ist in der Regel, dass die Polypeptidkette ihre ursprüngliche Funktion verliert. Viele Proteinanomalien werden durch Missense-Mutationen verursacht, die eine häufige Art von Tumormutation sind. Es wurde festgestellt, dass Missense-Mutationen eine Schlüsselrolle für die Stabilität von Proteinen spielen, und das Vorhandensein von Mutationen kann einen signifikanten Einfluss auf die Bindungsaffinität zwischen Proteinenhaben 32 und die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und den umgebenden korrelativen Makromolekülenverändern 33.

Daher beeinflussen Missense-Mutationen höchstwahrscheinlich die biologische Funktion des Transmembranproteins 200A bei verschiedenen Krebsarten. Auch der Zusammenhang zwischen TMEM200A Genmutation und der klinischen Überlebensprognose von Patienten mit Krebs wurde untersucht. Die Wahrscheinlichkeit eines Gesamtüberlebens stieg im Vergleich zu der in der TMEM200A-mutierten Gruppe, aber nicht in der krankheitsfreien Gruppe (Abbildung 5E). Die Untersuchung der Genkorrelationen ergab, dass TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 und SLC18B1 zu den Genen gehörten, die mit TMEM200A komutierten (Abbildung 5F). Wir waren in der Lage, mehrere Mutationstypen und Einzelnukleotidvariationen (SNVs) über die COSMIC-Datenbank zu identifizieren, um mehr über TMEM200A Mutationen in der GC zu erfahren. Die Häufigkeit von Missense-Substitutionen war am höchsten (38,86 %) (Abbildung 5G), und die SNV-Daten zeigten, dass die häufigsten SNVs bei STAD G>A (31,73 %) waren, gefolgt von C>T (26,35 %) und G>T (11,73 %) (Abbildung 5H).

Einzelzellanalyse von TMEM200A bei Krebs
Wir analysierten TMEM200A Expressionsniveaus in verschiedenen Einzelzellen mit Hilfe der TISCH-Website (Tumor Immunology Single Cell Center). Das TISCH-Online-Tool zeigte den Ausdruck der TMEM200A für 65 Datensätze und 28 Zelltypen in der in Abbildung 6A dargestellten Heatmap an. Die Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A hauptsächlich in CD8+ T-Zellen und Fibroblasten exprimiert wurde. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang der GSE72056 Datensatz, der Zellen von Patienten mit metastasiertem kutanem Melanom (SKCM) enthält. TMEM200A wurde in B-Zellen, CD4+ T-Lymphozyten, depletierten CD8+ T-Zellen, Endothelzellen, Fibroblasten und anderen Zelltypen in der SKCM-Mikroumgebung stark exprimiert (Abbildung 6B,C). Im GSE146771-Datensatz, der Zellen von Patienten mit Darmkrebs enthält, wurde TMEM200A in B-Zellen, CD4+-T-Lymphozyten, CD8+-T-Zellen, depletierten CD8+-T-Zellen, Endothelzellen, Fibroblasten und anderen Zelltypen in der Darmkrebs-Mikroumgebung stark exprimiert (Abbildung 6D, E). Mit Hilfe der CancerSEA-Datenbank konnten die Expressionsniveaus und der funktionelle Status von TMEM200A in bestimmten Tumorzellen bestimmt werden (Abbildung 6G). TMEM200A Expression korrelierte stark mit dem zellulären Funktionszustand bei einer Reihe von Krebsarten, darunter Glioblastom (GBM), Lungenadenokarzinom (LUAD), chronische granulozytäre Leukämie (CML), Darmkrebs, Retinoblastom (RB) und Aderhautmelanom (UM). Angiogenese, Apoptose, Differenzierung und Entzündung korrelierten in einer Mehrheit der Tumorzellen positiv mit TMEM200A Expression, während DNA-Schäden, DNA-Reparatur, Invasion und Stoffwechsel negativ mit TMEM200A Expression korrelierten (Abbildung 6F).

Funktionelle und Pathway-Enrichment-Analyse von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten
Wir untersuchten den Zusammenhang zwischen TMEM200A und Proteinen mit ähnlichen Funktionen mithilfe des GGI-Netzwerks, um die Funktion von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten zu untersuchen (Abbildung 7A). Genomische und proteomische Informationen werden von GeneMANIA anhand einer Abfrageliste von Zielgenen analysiert. Durch die Lokalisierung von Genen, die ähnlich wie TMEM200A funktionieren, wurden die 40 Proteine entdeckt, die direkt mit diesem Gen interagieren. Die Korrelation dieser Gene wird durch das PPI-Netzwerk gezeigt (Abbildung 7B). In der Folge zeigten GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen dieser 20 Gene, die eng mit TMEM200A verwandt sind, dass diese benachbarten Gene hauptsächlich an der negativen Regulation des Gen-Silencings durch die RNA beteiligt waren. Die KEGG-Analyse ergab, dass TMEM200A in Signalwegen, einschließlich des Wnt-Signalwegs und der zellulären Seneszenz, reichlich vorhanden war (Abbildung 7C). Die GO-Anreicherungsanalyse zeigte, dass TMEM200A in der molekularen Funktion hauptsächlich in den Kalziumkanälen reichlich vorhanden war und die Gen-Stummschaltung durch RNA negativ regulierte (Abbildung 7D).

Korrelationsanalyse zwischen TMEM200A und Immuninfiltration
Wir untersuchten außerdem die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und Immunzellinfiltration, um die Korrelation zwischen TMEM200A und Krebsimmunität zu zeigen. Wir führten eine CIBERSORT-Immuninfiltrationsanalyse unter Verwendung der Sangerbox 3.0-Pankrebsdaten durch. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Pan-Cancer-TMEM200A mit CD8+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, B-Zellen, T-Helferzellen, natürlichen Killerzellen, regulatorischen T-Zellen, Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, Eosinophilen, Basophilen und Granulozyten korrelierte (Abbildung 8A). Anschließend untersuchten wir die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) mit Hilfe der TISIDB-Datenbank und zeigten eine enge Korrelation zwischen TMEM200A Expression und der 28 TIL-Häufigkeit bei verschiedenen Krebsarten (Abbildung 8B). Wir nutzten die TISIDB-Datenbank, um die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und Immunsuppressiva bei menschlichen Malignomen zu bewerten und genauer zu untersuchen, wie Immunmodulatoren und TMEM200A Expression zusammenhängen. Die Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A Expressionsniveaus bei einer Vielzahl von Krebsarten signifikant mit Immunsuppressiva korrelierten (Abbildung 8C). Signifikante Korrelationen zwischen TMEM200A Expression und bestimmten Immunsuppressiva wurden bei Hodenkrebs und UM gefunden (Abbildung 8D-F). Anschließend führten wir eine Korrelationsanalyse der TMEM200A Expression mit immunstimulatorischen Faktoren und MHC-Molekülen unter Verwendung der TISIDB-Datenbank durch (Abbildung 8G,H). Die Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A Expression mit ausgewählten Immunstimulanzien und MHC-Molekülen beim Urothelkarzinom der Harnblase, dem Hodenkarzinom, dem Nebennierenrindenkarzinom und dem UM korrelierte (Abbildung 8I-L). Der nächste Schritt bestand darin, die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und immunologischen oder molekularen Subtypen in der TCGA PanCan-Kohorte in der TISIDB-Datenbank zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die immunologischen Untergruppen von neun verschiedenen Krebsarten TMEM200A unterschiedlich exprimierten, darunter BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT und BRCA (Abbildung 8M). Darüber hinaus zeigten sechs verschiedene Krebsformen mit unterschiedlichen molekularen Untergruppen, darunter HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV und LUSC, eine variable Expression von TMEM200A (Abbildung 8N).

Analyse des TMEM200A - und Immuntherapie-Ansprechens
Die Wirksamkeit von PD-1/PD-L1-Inhibitoren korreliert stark mit TMB, und einige Patienten mit Tumoren können anhand von TMB-Markern für die Wirksamkeit der Immuntherapie etwas vorhergesagt werden34. Mikrosatelliten-Instabilität (MSI) ist der Begriff, der verwendet wird, um die fehlerhafte DNA-Mismatch-Reparaturfunktion (MMR) zu beschreiben, wenn Mikrosatelliten-Replikationsfehler nicht behoben werden und sich anhäufen, wodurch sich die Länge oder Basiszusammensetzung von Mikrosatelliten ändert35. MSI ist ein Tumormarker von klinischer Bedeutung 36. Wir untersuchten daher den Einfluss der TMEM200A Expression auf die Immuntherapie, indem wir die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und TMB oder MSI untersuchten. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante positive Korrelation zwischen TMEM200A Expression und TMB in THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP und KIRC, aber TMEM200A Expression war negativ korreliert mit UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM und BRCA (Abbildung 9A). MSI und TMEM200A Expression waren in TGCT stark und günstig verknüpft, während TMEM200A Expression signifikant und negativ mit MSI in UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC und CHOL korrelierte (Abbildung 9B). Wir bewerteten auch das Potenzial von TMEM200A als Biomarker, um die Wirksamkeit von ICB zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A allein ICB-Antworten mit einer Genauigkeit von Area Under Curve (AUC) > 0,5 in 7 von 25 ICB-Subpopulationen vorhersagten. TMEM200A zeigten einen höheren prädiktiven Wert als T- und B-Zell-Klone, die beide einen Wert von 5 aufwiesen. Der Wert für TMEM200A war jedoch niedriger als der für TIDE (AUC > 0,5 in 11 ICB-Subpopulationen), MSI-Score (AUC > 0,5 in 11 ICB-Subpopulationen), CD274 (AUC > 0,5 in 15 ICB-Subpopulationen), CD8 (AUC > 0,5 in 17 ICB-Subpopulationen), IFNG (AUC > 0,5 in 16 ICB-Subpopulationen) und Merck18 (AUC > 0,5 in 17 ICB-Subpopulationen) (Abbildung 9C). Eine schlechte Überlebensprognose in den Kohorten ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 und ICB_Hugo 2016_PD1 korrelierte mit einer hohen TMEM200A Expression. TMEM200A Knockdown erhöhte jedoch die Lymphozyten-vermittelte tumorabtötende Potenz in der durchschnittlichen Kohorte von Kearney 2018 T_PD1 und Pan 2018 OT1 (Abbildung 9D).

GSEA-Anreicherungsanalyse von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten
Wir verwendeten DEGs zwischen TMEM200A Hochexpressions- und TMEM200A Niedrigexpressions-Untergruppen in 32 Malignomen, um TMEM200A-assoziierte Krebsmerkmale zu untersuchen. Wir entdeckten eine substanzielle Korrelation zwischen der primären Immundefizienz, dem RIG-Signalweg (Retinsäure-induzierbares Gen)-I-ähnliches Rezeptor und TMEM200A Expression bei Pankarzinomen, insbesondere bei BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC und SKCM (Abbildung 10). Das virale zytoplasmatische Protein Ribonukleinsäure wird über den RIG-I-ähnlichen Rezeptor-Signalweg detektiert. RIG-I-ähnliche Rezeptoren können die Produktion einer Vielzahl von inflammatorischen Zytokinen im Körper beeinflussen, indem sie den NF-kB-Signalweg aktivieren, indem sie bestimmte intrazelluläre Verbindungsproteine aktivieren. Infolgedessen könnte das Transmembranprotein 200A (TMEM200A) eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung intrazellulärer Proteine durch den RIG-I-ähnlichen Rezeptor spielen. Diese Ergebnisse implizierten eine starke Korrelation zwischen TMEM200A Expression und immunologischer Infiltration. Darüber hinaus zeigte die GSEA-Anreicherungsanalyse, dass die Expression von Pan-Cancer-TMEM200A mit Chemokin-Signalwegen, Zelladhäsion, Zytokinrezeptorverbindungen, Zellmembran-Sensing-Signalwegen und Autophagie-Kontrolle korrelierte (Abbildung 10). Transmembranproteine können als Adhäsionsmoleküle fungieren, um die Mikroumgebung des Tumors zu beeinflussen und zusätzlich eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle des Eintritts von Kalziumionen in die Zelle aus Kalziumreservoirs zu spielen 36. Daher können die Ergebnisse der GSEA-Anreicherungsanalyse auf die Beteiligung von TMEM200A an vielen physiologischen Prozessen zurückzuführen sein, einschließlich der Aktivierung von Signaltransduktionswegen, der Bildung von Plasmamembran-Ionenkanälen und der Regulierung von Zellchemotaxis, Adhäsion, Apoptose und Autophagie9.

Wir identifizierten die Top 50 STAD-Gene, die sowohl positiv als auch negativ mit TMEM200A aus der LinkedOmics-Datenbank korrelierten, die in STAD in Form von Heatmaps co-exprimiert wurden (Abbildung 11A,B). Wir bewerteten die Top-5-Gene positiv und die Top-5-Gene, die negativ mit TMEM200A in der GC assoziiert sind (Abbildung 11C). Unsere Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A Expression mit der Koexpression von SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) und SYTL1 (r = -0,33) korrelierte. Wir analysierten die Ergebnisse der Schwellenvisualisierung, um die Rolle der TMEM200A in STAD besser zu verstehen. Für das Screening wurden folgende Kriterien herangezogen: log2-fache Veränderung (FC) > 2,0 und adjustierter P-Wert 0,05. Wir fanden 483 DEGs, von denen 385 hochreguliert und 98 herunterreguliert waren, und wir wählten 100 von ihnen aus, um sie zu visualisieren, um eine Heatmap zu erstellen (Abbildung 11D). Für die DEGs, die die Screening-Kriterien erfüllten, führten wir dann GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen durch. Die Ergebnisse der GO-Anreicherungsanalyse zeigten, dass die Anreicherung von BP (biologischer Prozess) hauptsächlich mit der extrazellulären Matrix und dem Strukturgewebe assoziiert war, die Anreicherung von CC (zelluläre Komponente) hauptsächlich mit kollagenhaltiger extrazellulärer Matrix und Basalmembran und MF (Molekulare Funktion) hauptsächlich mit einer extrazellulären Matrixstruktur und Glykosaminoglykanbindung angereichert war (Abbildung 11E und Abbildung 11G). Die Anreicherung der KEGG-Analyse zeigte, dass TMEM200A hauptsächlich im interaktionsweg der extrazellulären Matrixrezeptor, Cytochrom P450 und Renin-Angiotensin-System angereichert war (Abbildung 11F und Abbildung 11H).

TMEM200A-basiertes Prognosemodell und klinische Merkmale von Magenkrebs
Wir untersuchten die Korrelation zwischen TMEM200A und den klinischen Daten von Patienten mit STAD und analysierten daher die klinisch-pathologischen Charakteristika der Patienten in der TCGA-STAD-Kohorte mittels logistischer Regressionsanalyse und basierend auf TMEM200A Expressionsniveaus (Abbildung 12A). Alter, klinisches Stadium und TMEM200A Expression korrelierten bei Patienten mit STAD gemäß einer univariaten Cox-Regressionsanalyse im Wesentlichen mit dem Gesamtüberleben (Abbildung 12B). Die multivariate Cox-Regressionsanalyse zeigte, dass TMEM200A Expression ein eigenständiger prädiktiver Faktor für das Gesamtüberleben bei Patienten mit STAD sein könnte (HR = 1,282, 95% KI = 1,066-1,541, P = 0,008) (Abbildung 12C). Wir untersuchten das Potenzial dieser klinisch-pathologischen Merkmale zur Vorhersage des Gesamtüberlebens nach 1, 3 und 5 Jahren in STAD unter Verwendung des Standard-Säulenliniendiagrammmodells in Verbindung mit mehreren klinischen Parametern (Abbildung 12D). Die Kalibrierungskurven für die 1-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeiten waren sehr konsistent mit den vorhergesagten Wahrscheinlichkeiten für Säulenlinien (Abbildung 12E).

TMEM200A Hochregulierung in STAD-Zellen und Verbesserung der Zellproliferation
Bei der Durchsicht der Literatur zu TMEM200A entdeckten wir, dass die hohe Expression von TMEM200A auf eine schlechte Prognose hindeutet 13 und dass die Mikroumgebung des GC-Immunsystems möglicherweise beeinflusst wird, indem TMEM200A als Adhäsionsmolekül37 fungiert und so die Invasion und Metastasierung von GC-Zellen fördert. Wir untersuchten die Proteinspiegel und mRNA-Transkriptspiegel von TMEM200A in STAD-Zelllinien, um die Ergebnisse der oben genannten Studie zu bestätigen. Die GC-Zelllinie HGC-27 überexprimierte TMEM200A im Vergleich zur gesunden Magenschleimhautepithelzelllinie GES-1 sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Transkriptebene dramatisch (Abbildung 13A,B), was darauf hindeutet, dass TMEM200A in HGC-27-Zellen überexprimiert wurde. Die folgenden Tests wurden daher mit HGC-27-Zellen durchgeführt. Um die Genauigkeit der experimentellen Ergebnisse zu beweisen, verwendeten wir qRT-PCR, um die differentielle mRNA-Expression von TMEM200A in menschlichen GC-Zellen SGC-7901 und Magenschleimhautepithelzellen GES-1 zu vergleichen, und die Ergebnisse zeigten, dass TMEM200A in SGC-7901-Zellen stark exprimiert wurde (Abbildung 13B). TMEM200A wurde in HGC-27-Zellen ausgeschaltet, um die mögliche Beteiligung von TMEM200A an STAD zu untersuchen (Abbildung 13C). Basierend auf den Ergebnissen des Datenbank-Minings und unserer Korrelationsanalyse von TMEM200A wurde festgestellt, dass TMEM200A hauptsächlich am Interaktionsweg der extrazellulären Matrixrezeptoren beteiligt war, der mit der Proliferation und Invasion von Krebs in Verbindung gebracht wurde. Wir haben daher CCK-8-Assays eingesetzt, um festzustellen, wie sich TMEM200A Expression auf das Zellwachstum auswirkt. Die CCK-8-Assays zeigten, dass TMEM200A Knockdown-Gruppen (Si-RNA2 und Si-RNA3) im Vergleich zur NC-Gruppe einen deutlichen Rückgang der Zelllebensfähigkeit aufwiesen (Abbildung 13D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMEM200A in STAD hochreguliert ist und sein Expressionsniveau die Proliferation von GC-Zellen beeinflussen könnte. Basierend auf den Ergebnissen der KEGG-Anreicherungsanalyse in Abbildung 11F fanden wir heraus, dass TMEM200A mit dem PI3K/AKT-Signalweg in der GC assoziiert ist und TMEM200A als Zelladhäsionsfaktor den Mechanismus der Magenkarzinogenese beeinflussen kann, indem er die EMT beeinflusst. Daher haben wir Western Blot verwendet, um die Auswirkungen TMEM200A Knockdowns auf EMT und den PI3K/AKT-Signalweg vor und nach dem Knockdown zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass die P-AKT-Proteinexpression in der TMEM200A-Knockdown-Gruppe (TMEM200A-SiRNA2) im Vergleich zur negativen Kontrollgruppe (NC) verringert war, während die Spiegel von N-Cadherin-, Vimentin- und Snai-Proteinen ebenfalls verringert waren und die E-Cadherin-Proteinexpression erhöht war (Abbildung 13E). All diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMEM200A die EMT über den PI3K/AKT-Signalweg beeinflussen und somit eine Rolle bei der GC spielen können.

Figure 1
Abbildung 1: Der Ablauf der Studie. Abkürzungen: TCGA = The Cancer Genome Atlas database; TIMER2.0 = Die TIMER2.0-Datenbank; OS = Gesamtüberleben; PFS = progressionsfreie Überlebenszeit; DSS = Krankheitsspezifisches Überleben; DFS = Krankheitsfreies Überleben; TMB = Tumormutationslast; MSI = Mikrosatelliten-Instabilität; PPI = Protein-Protein-Interaktion; GGI = Gen-Gen-Interaktion; KEGG = Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome; GO = Gen-Ontologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Expressionsniveaus von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten. (A) Hoch- oder herunterregulierte Expression von TMEM200A aus dem TCGA-Datensatz bei verschiedenen malignen Erkrankungen beim Menschen. (B) Analyse der TMEM200A Expressionsniveaus in Tumoren und normalem Gewebe unter Verwendung der TIMER2.0-Datenbank. (C) Differentielle Analyse der Genaktivität von TMEM200A bei verschiedenen menschlichen Krebsarten aus dem TCGA-Datensatz. (D) Einstufung der Genaktivität von TMEM200A bei verschiedenen menschlichen Krebsarten auf der Grundlage von ssGSEA-Scoring. (E) TMEM200A Expressionsniveaus aus der HPA-Datenbank in gesunden Geweben. (F) Die TMEM200A Expressionsniveaus der HPA-Datenbank in normalen Zelllinien. (G) IHC-Ergebnisse für TMEM200A Proteinexpression bei Krebs aus der HPA-Datenbank. Abkürzungen: TCGA = The Cancer Genome Atlas; ssGSEA = Einzelproben-Gensatz-Anreicherungsanalyse; HPA = Human Protein Atlas; IHC = Immunhistochemie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Korrelation der TMEM200A Expression mit klinisch-pathologischen Merkmalen und Prognose verschiedener Tumoren. (A) Die Korrelation der TMEM200A Expression in der TCGA-Pan-Krebs-Kohorte (PanCan) mit dem klinisch-pathologischen Staging in jedem Tumor wurde unter Verwendung der UCSC Xena-Datenbank analysiert. (B) Korrelation der TMEM200A Expression in der TCGA PANCAN-Kohorte mit dem Alter der Patienten in jedem Tumor. (C) Korrelation der TMEM200A Expression in der TCGA PANCAN-Kohorte mit dem pathologischen Grad des Tumors in jedem Tumor. (D) Korrelation der TMEM200A Expression in der TCGA PanCan-Kohorte mit dem Überlebensstatus der Patienten in jedem Tumor. (E) Korrelationsanalyse der TMEM200A Expression mit dem Gesamtüberleben bei verschiedenen Krebsarten unter Verwendung des Cox-Regressionsmodells. (F) Korrelation zwischen TMEM200A Expression und der Prognose des Pan-Krebs-Gesamtüberlebens in der TCGA PanCan-Kohorte. (G) Korrelation zwischen TMEM200A Expression und krankheitsspezifischem Überleben. (H) Korrelation zwischen TMEM200A Expression und prognose des progressionsfreien Intervalls in der TCGA PanCan-Kohorte. (I) Korrelation zwischen TMEM200A Expression und krankheitsfreiem Intervall. (J) Eine multifaktorielle COX-Regressionsanalyse wurde am KIRC durchgeführt. (K) Eine multifaktorielle COX-Regressionsanalyse wurde mit KIRP durchgeführt. Abkürzungen: TCGA = The Cancer Genome Atlas; KIRC: Nieren-Klarzellkarzinom; KIRP: Nieren-Nieren-Papillenzellkarzinom; OS = Gesamtüberleben; DSS = Krankheitsspezifisches Überleben; PFI = progressionsfreies Intervall; DFI = Krankheitsfreies Intervall. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: DNA-Methylierungsanalyse von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten. (A) Die Promotormethylierungsniveaus von TMEM200A wurden laut der SMART-Datenbank bei mehreren Krebsarten untersucht. (B) Höhere Promotormethylierungsniveaus von TMEM200A in verschiedenen Krebsarten als in normalem Gewebe wurden in Übereinstimmung mit der UALCAN-Datenbank untersucht. (C) Mit Hilfe der UALCAN-Datenbank wurde festgestellt, dass normales Gewebe bei mehreren Krebsarten niedrigere Promotormethylierungswerte von TMEM200A aufwies. (D) Der DNA-Methylierungsgrad von TMEM200A in BLCA, HNSC, LUAD und STAD veränderte sich mit dem pathologischen Stadium. Abkürzungen: BLCA=Blasen-Urothelkarzinom; HNSC= Plattenepithelkarzinom Kopf und Hals; LUAD=Lungen-Adenokarzinom; STAD= Adenokarzinom des Magens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: TMEM200A Genmutationen bei verschiedenen Krebsarten. (A) Analyse TMEM200A Genmutationstypen bei verschiedenen Krebsarten mit Hilfe der cBioPortal-Datenbank. (B) 3D-Proteinstruktur von TMEM200A. Der Bindungsbereich wird durch den farbigen Teil angezeigt, während die anderen Abschnitte von TMEM200A durch den grauen Teil angezeigt werden. (C) Isoformen und Verteilung TMEM200A somatischen Mutationen. X-Achse, Aminosäurestellen; y-Achse, Anzahl der TMEM200A Mutationen; grüne Punkte, Missense-Mutationen; und graue Punkte, abgeschnittene Mutationen. (D) Validierung der Isoformen und der Verteilung TMEM200A somatischen Mutationen anhand der Daten in Sangerbox 3.0. (E) Für alle TCGA-Tumoren wurde die Korrelation zwischen dem Mutationsstatus und der Vorhersage des Gesamtüberlebens der Patienten mit Hilfe der cBioPortal-Datenbank untersucht, wobei rote Quadrate die TMEM200A Mutationsgruppe und blaue Quadrate die nicht mutierte Gruppe anzeigen. (F) Gene, die mit TMEM200A komutiert sind, wurden mit dem cBioPortal-Tool analysiert: TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 und SLC18B1. (G) Analyse TMEM200A Mutationstypen in GC mit Hilfe der COSMIC-Datenbank. (H) Eine Analyse von TMEM200A SNV-Typen in GC wurde mit Hilfe der COSMIC-Datenbank durchgeführt. Abkürzungen: TCGA = The Cancer Genome Atlas; OS = Gesamtüberleben; COSMIC = Katalog somatischer Mutationen in Krebszellen; GC = Magenkrebs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Einzelzell-Korrelationsanalyse der TMEM200A Expression bei verschiedenen Krebsarten. (A) Zusammenfassung der Expression von TMEM200A auf der TISCH-Website. (B) Verteilung von acht verschiedenen Zelltypen im Datensatz des metastasierten kutanen Melanoms GSE72056. (C) Expressionsniveaus von TMEM200A in kutanen metastasierten Melanomzellen aus dem GSE72056 Datensatz. (D) Verteilung von 13 verschiedenen Zelltypen im Darmkrebs-Datensatz von GSE146771. (E) TMEM200A Expressionsniveaus in Darmkrebszellen aus dem GSE146771-Datensatz. (F) Die Korrelation der TMEM200A Expression mit dem funktionellen Status einzelner Zellen in mehreren Tumoren wurde mit Hilfe der CancerSEA-Datenbank nachgewiesen. (G) T-SNE-Karten, die die Expression von TMEM200A in einzelnen Tumorzellen, einschließlich GBM, LUAD, CML, CRC, RB und UM, veranschaulichen. Abkürzungen: GBM = Glioblastom; LUAD = Lungen-Adenokarzinom; CML = Chronische granulozytäre Leukämie; CRC = Darmkrebs; RB = Retinoblastom; UM = Aderhautmelanom. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Analyse des Co-Expressionsnetzwerks und der funktionellen Anreicherung von TMEM200A auf Genebene. (A) GGI-Netzwerk von TMEM200A und seinen co-exprimierten Genen. (B) PPI-Netz. (C,D) TMEM200A und die co-exprimierten Gene wurden auf eine Anreicherung des GO- und KEGG-Signalwegs untersucht. Abkürzungen: PPI = Protein-Protein-Interaktion; GGI = Gen-Gen-Interaktion; KEGG = Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome; GO = Gen-Ontologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Korrelation zwischen der Expression von TMEM200A- und Immunzellen, Immunsuppressiva, immunstimulierenden Substanzen und MHC-Molekülen bei verschiedenen Krebsarten. (A) Sangerbox 3.0 Heatmap zeigt die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und immuninfiltrierenden Zellen. (B) Heatmap, die die Korrelation zwischen immuninfiltrierenden Zellen und TMEM200A Expression in der TISIDB-Datenbank zeigt. (C) Heatmap, die die Korrelation zwischen immunsuppressiven Zellen und TMEM200A Expression in der TISIDB-Datenbank zeigt. (D-F) Korrelation zwischen TMEM200A Expression und bestimmten Immunsuppressiva bei Hodenkrebs und Aderhautmelanom. (G) Heatmap, die die Korrelation zwischen immunstimulatorischen Faktoren und TMEM200A Expression in der TISIDB-Datenbank zeigt. (H) Heatmap der Korrelation zwischen TMEM200A Expression und MHC-Molekülen in der TISIDB-Datenbank. (I-L) Korrelation zwischen TMEM200A Expression und einigen immunstimulatorischen Faktoren und MHC-Molekülen im Urothelkarzinom der Harnblase, Hodenkarzinom, Nebennierenrindenkarzinom und Aderhautmelanom. (M) Korrelation zwischen Pan-Krebs-Immunsubgruppen und TMEM200A Expression. (N) Korrelation zwischen molekularen Untergruppen von Pankarzinomen und TMEM200A Expression. Abkürzungen: MHC = Major histocompatibility complex. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Analyse des immuntherapeutischen Ansprechens von TMEM200A bei Panzytopenie. (A) Korrelation der TMEM200A Expression bei verschiedenen Krebsarten mit TMB. (B) Korrelation zwischen MSI bei Pan-Krebs und TMEM200A Expression. (C) TMEM200A Potenzial als Biomarker für die Vorhersage der Immun-Checkpoint-Blockadereaktion. (D) Der gewichtete Mittelwert der Korrelation von TMEM200A mit dem ICB-Überlebensergebnis und die logarithmische Faltungsänderung (logFC) im CRISPR-Screening wurden verwendet, um es zu bewerten. Abkürzungen: TMB = Tumormutationslast; ICB = Immun-Checkpoint-Blockade; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: GSEA-Anreicherungsanalyse von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten. Die fünf wichtigsten Signalwege, in denen TMEM200A eine wichtige funktionelle Rolle bei der Regulierung von 32 Krebsarten spielten, wurden durch die GSEA-Anreicherungsanalyse identifiziert. Der linke Bereich zeigt die Ergebnisse der GSEA-Anreicherungsanalyse für TMEM200A in ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ und SARC. Das rechte Feld zeigt die Ergebnisse der GSEA-Anreicherungsanalyse für TMEM200A in SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS und UVM. Abkürzungen: GSEA = Gene Set Enrichment Analysis; ACC = Nebennierenrindenkarzinom; BLCA = Blasen-Urothelkarzinom; BRCA = Invasives Karzinom der Brust; CESC = Zervikales Plattenepithelkarzinom und endozervikales Adenokarzinom; CHOL =Cholangiokarzinom; COAD = Adenokarzinom des Dickdarms; ESCA = Ösophaguskarzinom; GBM = Glioblastoma multiforme; HNSC = Plattenepithelkarzinom Kopf und Hals; KICH = Nierenchromophobie; KIRC = Nieren-Nieren-Klarzellkarzinom; KIRP = Nieren-Nieren-Papillenzellkarzinom; LAML = Akute myeloische Leukämie; LGG = Niedriggradiges Gliom des Gehirns; LIHC = Leber-Hepatozelluläres Karzinom; LUAD = Lungen-Adenokarzinom; LUSC = Plattenepithelkarzinom der Lunge; MESO = Mesotheliom; OV = Seröses Zystadenokarzinom der Eierstöcke; PAAD =Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse; PCPG = Phäochromozytom und Paragangliom; PRAD = Adenokarzinom der Prostata; LESEN Rektum-Adenokarzinom; SARC=Sarkom; SKCM = Haut-Kutanmelanom; STAD = Adenokarzinom des Magens; TGCT =Hodenkeimzelltumoren; THCA = Schilddrüsenkarzinom; THYM = Thymom; UCEC = Endometriumkarzinom des Gebärmutterkörpers; UCS = Uteruskarzinom; UVM = Aderhautmelanom. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 11
Abbildung 11: TMEM200A in STAD. (A) Top 50 Gene, die von der LinkedOmics-Datenbank mit einer negativen Korrelation mit TMEM200A Expression in STAD gefunden wurden. (B) Top 50 Gene in STAD, die positiv mit TMEM200A verbunden waren. (C) Die fünf wichtigsten positiv und fünf negativ korrelierten Gene in STAD TMEM200A. (D) Heatmap der DEGs in STAD. (E-H) Untersuchung von angereicherten GO- und KEGG-Signalwegen unter Verwendung der gescreenten DEGs. Abkürzungen: STAD=Adenokarzinom des Magens; DEGs= Differentielle Expression von Genen; KEGG = Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome; GO = Gen-Ontologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 12
Abbildung 12: Korrelation zwischen den klinischen Merkmalen von STAD und TMEM200A Expressionsniveau. (A) Analyse der TMEM200A Expressionsniveaus und der klinischen STAD-Merkmale mittels logistischer Regression. (B,C) Cox-Analyse von STAD-Walddiagrammen für einzelne und mehrere Variablen. (D) Säulenliniendiagramme zur Vorhersage des Gesamtüberlebens bei Patienten mit STAD basierend auf Geschlecht, pathologischem Grad, Alter, pathologischem Stadium und TMEM200A Expression. (E) Kalibrierungsdiagramme, die die Kalibrierung des Säulenliniendiagrammmodells zeigen. Abkürzungen: STAD= Adenokarzinom des Magens; OS = Gesamtüberleben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 13
Abbildung 13: TMEM200A Expression ist bei STAD hochreguliert und fördert die Proliferation von Magenkrebszellen. (A) Nachweis TMEM200A Expression in Magenkrebszellen HGC-27 und Magenschleimhautepithelzellen GES-1 durch Western Blotting. (B) Nachweis der TMEM200A Expression in den GC-Zellen HGC-27 und SGC-7901 und den Magenschleimhautepithelzellen GES-1 mittels qRT-PCR. (C) Die Expressionseffizienz von TMEM200A war in der TMEM200A-Knockdown-Gruppe im Vergleich zur Nicht-Knockdown-Gruppe in GC-Zellen HGC-27 stark reduziert, wie durch qRT-PCR gezeigt wurde. (D) TMEM200A Knockdown hemmte signifikant die Proliferation von GC-Zellen, gemessen mit dem CCK8-Assay. (E) Der Knockdown von TMEM200A hemmte signifikant die verwandten Proteine in EMT und beeinflusste die Phosphorylierung von AKT im PI3K/AKT-Signalweg. Abkürzung: GC = Magenkrebs; qRT-PCR: Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion; EMT=epithelial-mesenchymaler Übergang; AKT=Proteinkinase B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TMEM200A gehört zu einer Familie von TMEMs, die für die Vermehrung von Krebszellen unerlässlich sind38. Die variable Expression von TMEM200A bei verschiedenen Malignomen hat weniger Aufmerksamkeit erhalten, und es fehlt an einer gründlichen Untersuchung von Krebserkrankungen. Es häufen sich jedoch weiterhin Hinweise darauf, dass die TMEM-Transmembranproteinfamilie wichtig sein kann, um Krebszellen durch Wechselwirkungen mit mehreren Proteinen bösartig zu halten, z. B. fördert die Aktivierung TMEM16A Ca2+-aktivierten Cl- -Kanäle durch ROCK1/Moesin die BRCA-Metastasierung39. Daher konzentrierten sich unsere Analysen in der aktuellen Arbeit darauf, die Machbarkeit von TMEM200A als therapeutisches Krebsziel und tumordiagnostischer Marker zu untersuchen. Insbesondere untersuchten wir die Expressionsniveaus von TMEM200A in 33 malignen Tumoren unter Verwendung von RNA-seq-Daten aus der UCSC Xena-Datenbank, und die Ergebnisse der TIMER2.0-Datenbank validierten die Analysen in der UCSC Xena-Datenbank erfolgreich.

Anschließend wurden das Webtool des Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) und die CancerSEA-Datenbank verwendet, um die Expressionsniveaus von TMEM200A in verschiedenen Arten von Monozyten zu analysieren. Die Websites Sangerbox und TISIDB wurden verwendet, um zu verstehen , wie TMEM200A die Immuninfiltration beeinflusst. Wir identifizierten auch die Signalwege, in denen TMEM200A eine Schlüsselfunktion bei jeder Krebserkrankung spielt, durch eine GSEA-Anreicherungsanalyse, um die wichtigsten funktionellen Rollen von TMEM200A bei jeder Malignität zu verstehen.

TMEM200A kann als Adhäsionsmolekül fungieren, um die Immunumgebung von GC zu kontrollieren und die invasive Ausbreitung von GC-Zellen zu fördern. Daher identifizierten wir 483 differentiell exprimierte Gene (DEGs), die mit dem Expressionsniveau von TMEM200A assoziiert sind, über die TCGA-Datenbank und analysierten die GO- und KEGG-Anreicherung dieser 483 DEGs. Die Anreicherungsergebnisse zeigten, dass der PI3K/AKT-Signalweg eine Schlüsselrolle bei der Krebsentstehung spielt und der PI3K/AKT-Signalweg einer der treibenden Faktoren für Krebs sein könnte.

Darüber hinaus führten wir zelluläre und molekulare Tests durch, nachdem wir mehr über die entscheidende Funktion von TMEM200A bei der Krebsentwicklung erfahren hatten, um die Korrelation zwischen TMEM200A Expression und STAD-Zellaktivität zu bestätigen. Wie erwartet, entdeckten wir, dass die Herunterregulierung von TMEM200A in STAD-Zellen die Zellproliferation stark reduzierte und dass Krebszelllinien TMEM200A in deutlich höheren Mengen exprimierten als normale Zelllinien. Durch die Durchforstung der Literatur zur Transmembranproteinfamilie in den letzten Jahren fanden wir heraus, dass Transmembranproteine als Zelladhäsionsmoleküle37 eine regulatorische Rolle bei der EMT spielen.

Darüber hinaus haben wir nach den Ergebnissen der Anreicherungsanalyse von TMEM200A-verwandten Genen in der GC herausgefunden, dass TMEM200A eine regulatorische Rolle im PI3K/AKT-Signalweg in der GC spielen könnten. Western-Blotting-Experimente zeigten, dass TMEM200A Knockdown Vimentin-, N-Cadherin- und Snai-Proteine reduzieren und die AKT-Phosphorylierung hemmen könnte, was darauf hindeutet, dass TMEM200A die Tumormikroumgebung reguliert, indem es die EMT beeinflusst, und dass der PI3K/AKT-Signalweg an der TMEM200A-vermittelten Regulation der GC-Entwicklung beteiligt sein könnte. In den letzten Jahren haben einige Studien herausgefunden, dass EMT die Hauptursache für die Resistenz gegen Chemotherapeutika bei GC-Patienten ist. Die epithelial-mesenchymale Plastizität (EMP) und die Mikroumgebung des Tumors wurden als limitierende Faktoren für eine wirksame Behandlung bei vielen Krebsarten beschrieben40. Das Auftreten von EMT kann dazu führen, dass GC-Zellen ihre charakteristischen Eigenschaften verlieren und die Eigenschaften von mesenchymalen Zellenaufweisen 41. Diese Eigenschaft reduziert nicht nur die Empfindlichkeit von GC-Patienten gegenüber Chemotherapeutika, sondern verbessert auch die invasive und migratorische Fähigkeit von GC-Zellen, was zur Bildung von Tumormetastasen führt. Aus den oben genannten Gründen unterstützt unsere Studie daher die Erforschung und Entwicklung wichtiger regulatorischer Punkte in der EMT und die Entwicklung neuartiger zielgerichteter therapeutischer Ansätze, indem sie den spezifischen Wirkmechanismus der TMEM200A auf EMT untersucht.

Der Einsatz von Bioinformatik für die Forschung hat in den letzten Jahren zugenommen, und für diese Studie haben wir auf Daten aus mehreren Internetdatenbanken zurückgegriffen. Die Verwendung dieser Online-Datenbanken in der Bioinformatik hat die Krebsforschung rationalisiert und beschleunigt, und sie bieten Forschern auch eine erschwingliche Möglichkeit, ihre Ergebnisse zu validieren.

Die Technik der Bioinformatik hat jedoch gewisse Nachteile. Wenn wir diese Datenbanken für die Analyse verwenden, kann dieselbe Studie inkonsistente oder sogar widersprüchliche Ergebnisse in mehreren Datenbanken liefern, da viele Online-Datenbanken Daten aus mehreren Datensätzen enthalten. Darüber hinaus werden viele Datenbanken sehr lange nicht aktualisiert, und aufgrund von urheberrechtlichen Schwierigkeiten kann ihr Inhalt nie erweitert werden. Daher sind die analytischen Erkenntnisse, die Forscher aus diesen Datenbanken gewinnen, immer eingeschränkt. Daher haben wir in dieser Forschung verschiedene Datenbanken verwendet, um die Ergebnisse gemeinsam zu untersuchen, um diese Einschränkungen zu überwinden und die Richtigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Um sicher zu gehen, dass die gewonnenen Erkenntnisse nicht wesentlich verändert wurden, wiederholten wir das Vorgehen, indem wir verschiedene Datenbanken für die Analyse verwendeten. Die Ergebnisse von Western-Blot-Experimenten unterstützten unsere bioinformatische Vorhersage, dass TMEM200A die EMT in GC kontrollieren können, indem sie den PI3K/AKT-Signalweg regulieren, was dann die Proliferation von GC-Zellen beeinflussen würde. Wir haben den Wirkmechanismus von TMEM200A mit Hilfe von Bioinformatik in Verbindung mit verwandter Literatur vorhergesagt.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, wie bioinformatische Werkzeuge die Versuchsplanung erheblich erleichtern und für viele andere Arten von wissenschaftlichen Forschungsvorhersagen verwendet werden können. Zukünftige Krebsforscher werden wahrscheinlich das primäre Paradigma der Kombination von experimenteller Validierung und bioinformatischer Vorhersage übernehmen, und diese Arbeit dient als gutes Modell für dieses Ziel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82160550) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		 Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Tags

TMEM200A Multiomics-Analyse Pan-Krebs-Biomarker Transmembranprotein Immuninfiltration RNA-seq-Daten Diagnostischer Biomarker prognostischer Biomarker Magenkrebs (GC) In-vitro-Zellkulturen Knockdown quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Western Blotting malignes Verhalten Tumorbildung epithelial-mesenchymale Transition (EMT) PI3K/AKT-Signalweg Proliferationshemmung
Multiomics-Analyse von <em>TMEM200A</em> als Pan-Cancer-Biomarker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, … More

Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter