Overview
このビデオでは、ショ ウジョウバエ の幼虫の低酸素症を、穴あけやトンネリング能力を評価してテストする方法を示しています。この技術を使用して研究者は、発達障害を持つものから酸素欠乏を経験している幼虫を区別することができます.プロトコル例は、このアッセイのセットアップを示しています。
Protocol
このプロトコルは、ショウジョウバエメラノガスター ・ラルヴェ、J.Vis. Exp.(2018年)における低酸素症の検出のためのバローイング/トンネルアッセイであるQiangらからの抜粋です。
1. 幼虫の準備
- アッセイを開始する2日以上前に、ヴィーシャウとヌスレイン・ヴォルハルトが述べた卵産皿に、所望の実験と対照の組み合わせ(女性20名と男性10人を含む)の十字架を設置するが、50mLポリプロピレンビーカーと6.0cmの使い捨てペトリ皿を使用した。必要になるまで、ハエは室温で暗闇の中で卵子の皿に入れます。
- ブドウ寒天のレシピ - 1Lガラスビーカーに100 mL冷凍100%ブドウジュース濃縮物、350mL脱イオン水、5 mL氷酢酸、13グラム D.メラノガスター 寒天を組み合わせます。1〜2分バーストで電子レンジ,バースト間でかき混ぜ,寒天がすべて溶解するまで。溶液を数分間冷却し、ニパジン(メチル-p-ヒドロキシ安息香酸)の10 mLを95%エタノールに加えます。混合し、その後、使い捨ての6.0センチメートルペトリ皿にプレートあたりピペット7 mL、ゲル化し、3〜4時間室温で乾燥させます。4°Cでビニール袋に入って保管してください。
- 酵母ペーストのレシピ - 7 g 乾燥酵母, 10 mL脱イオン水, 均一な一貫性までへらと混合.
- 実験を生成し、幼虫を制御するために卵の収集を時間を取ります。新しい酵母塗抹プレートを使用して、朝の時間の間に暗闇の中で4時間室温で卵を収集します。これらの4つの時間のコレクションの版を取り除き、新鮮な版と交換しなさい。幼虫のほとんどが孵化する翌日の午後まで、25°Cで一晩4時間の収集プレートをインキュベートします。これらの最初のインスター幼虫を収集し、実験を設定するためにそれらを使用しています。
2. アッセイプレートの設定
- アッセイプレートの準備。アッセイを1回実行する場合は、実験用幼虫10匹と10個の対照幼虫のプレートを5枚ずつアッセイプレートを用意します。1.5cmのコルクボーラーを使用して、各プレートから寒天の中心コアを取り除き、食品の穴を作ります。イーストペースト(0.8-0.9g)を穴に入れ、ヘラで優しくパットして穴を埋めるマウンドを作ります。
- 寒天プレートの準備 - 700 mL脱イオン水と16 g D.メラノガスター 寒天を2Lガラスビーカーと電子レンジで5分間組み合わせます。電子レンジから取り出し、ガラス棒でかき混ぜて、溶かしていない寒天を溶液に入れます。10%(w/v)ニパジンの17.5mLを95%エタノールに加え、混合し、30sバーストでマイクロ波加熱を続け、続いて攪拌し、すべての寒天が完全に溶解するまで加熱します。1〜2分間冷やし、ピペット15 mLのアリコートを10cmのプラスチックペトリ皿に入れます。寒天をゲル化させ、蓋でプレートを覆い、室温で数時間または一晩乾燥させます。18°Cの密閉されたビニール袋にプレートを保管してください。
注1: 過剰な乾燥のためにプレートの表面にニパゼン結晶が形成されないように、調製の数日以内にプレートを使用してください。必要に応じて、結晶は、それらに95%のアルコールの数マイクロリットルをドロップすることによって再溶解することができます。
注2: 寒天のバッチは、異なるゲル化特性を有することができる。乾燥したゲルプレートは、コルクボーラーを使用して食品ホールを作成する際に、清潔で無傷の寒天の円を取り除くことができるように、触れるのにしっかりと、十分に弾力性を持つ必要があります(上記参照)。 - アッセイプレートに幼虫を設置する。プラスチック製のマイクロスパチュラの先端をカーブし、酵母ペーストに先端を浸して幼虫を拾うための「接着剤」を提供するために機械的圧力を使用してください。最初のインスターの幼虫を個別に拾い、食べ物のマウンドの近くの寒天プレートに置きます。実験と制御の両方の遺伝子型のために10匹の幼虫の少なくとも5つの複製プレートを準備する。完成したら、各プレートにキャップを付けてラベルを付け、室温の暗い空間にプレート(蓋側を上に)を設定します(私たちの研究室では22°Cです)。
3. アッセイプレートの監視
- 解剖顕微鏡で毎日プレートを調べ、食べ物の上または寒天表面に出る幼虫の数を記録します。目に見える死んだまたは死んでいる幼虫に注意してください。寒天の皮層へのトンネリングは、幼虫が第3の星に移動すると見なされる時期と場合に注意してください。子犬が形成し始める日付に注意し、任意の子犬の異常に注意してください。すべての幼虫が死ぬか、または子犬になるまで毎日の観察を続けます。
- 曲がったからかい針でプレートから慎重に子犬を取り出し、ブドウ板に移します。必要に応じて、子犬を監視し続け、成人と同じ数の近接を決定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
