Drosophila Gravende og tunnelerende analyse: En metode for å vurdere vevshypoksi i fly larver

Overview

Denne videoen viser en metode for å teste hypoksi i Drosophila larver ved å vurdere deres gravende og tunnelerende evner. Ved hjelp av denne teknikken kan forskere skille larver som opplever oksygenmangel fra de med utviklingsunderskudd. Eksempelprotokollen demonstrerer oppsettet for denne analysen.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Qiang et al.,A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Forberedelse av larver

1. To eller flere dager før du begynner analysen, sett opp kryss av de ønskede eksperimentelle og kontrollkombinasjonene (minimum 20 kvinner og 10 menn hver) i egg-lay retter som beskrevet av Wieschaus og Nusslein-Volhard, men bruker 50 ml polypropylen beger og 6,0 cm engangs Petri retter som inneholder drue agar og smurt med gjærpasta like før bruk. Hold fluer i egg-lay retter i mørket ved romtemperatur til nødvendig.
2. Grape agar oppskrift – kombinere 100 ml frossen 100% drue juice konsentrat, 350 ml deioinisert vann, 5 ml isbre eddik og 13 g D. melanogaster agar i en 1L glassbeger. Mikrobølgeovn i 1-2 min brister, rører mellom brister, til agaren er oppløst. Avkjøl oppløsningen i noen minutter og tilsett deretter 10 ml 10 % (m/v) Nipagen (metyl-p-hydroksybenzoat) i 95 % etanol. Bland, og rør deretter 7 ml per plate i engangs 6,0 cm Petri-retter, la det gele og tørke ved romtemperatur i 3-4 timer. Oppbevars ved 4 °C i plastposer.
3. Gjærpastaoppskrift - 7 g tørket gjær, 10 ml deionisert vann, bland med en spatel til jevn konsistens.
4. Tidsbedagede eggsamlinger for å generere eksperimentelle og kontrollere larver. Ved hjelp av nye, gjærsmurte drueplater samler egg ved romtemperatur i 4 timer i mørke i morgentimene. Fjern disse 4 h oppsamlingsplatene og erstatt dem med ferske plater. Inkuber 4 h oppsamlingsplater over natten ved 25 °C til ettermiddagen neste dag, når de fleste larvene har klekket ut. Samle disse første instar larver og bruk dem til å sette opp eksperimentet.

2. Sette opp analyseplater

1. Forberedelse av analyseplater. For en enkelt kjøring av analysen, lag fem analyseplater hver av 10 eksperimentelle larver og fem plater med 10 kontrolllarver. Bruk en 1,5 cm korkborer for å fjerne en sentral kjerne av agar fra hver tallerken og skape et hull for maten. Sett gjærpasta (0,8 - 0,9 g) inn i hullet og klapp forsiktig med en spatel for å få en høyde til å fylle hullet.
2. Agar plate forberedelse – kombinere 700 ml deionisert vann med 16 g D. melanogaster agar i en 2L glassbeger og mikrobølgeovn i 5 min. Fjern fra mikrobølgeovn og rør med en glassstang for å bringe uløst agar inn i løsningen. Tilsett 17,5 ml 10 % (w/v) Nipagen i 95 % etanol, bland, og fortsett deretter mikrobølgeoppvarmingen i 30 s eksplosjoner etterfulgt av omrøring, til all agar er helt oppløst. Avkjøl i et minutt eller to, og rør deretter 15 ml aliquots i 10 cm plast Petri-retter. La agar gele, dekkplater med lokk og la dem tørke ved romtemperatur i noen timer eller over natten. Oppbevar plater i forseglede plastposer ved 18 °C.
   MERKNAD 1: For å unngå dannelse av nipagenkrystaller på overflaten av platene på grunn av overflødig uttørking, bruk plater innen få dager etter tilberedning. Om nødvendig kan krystaller oppløses ved å slippe noen mikroliter på 95% alkohol på dem.
   MERK 2: Agarbunker kan ha forskjellige gellingegenskaper. De tørre gelplatene skal være faste mot berøring og tilstrekkelig motstandsdyktige til at en ren, intakt sirkel av agar kan fjernes når du bruker korkboreren til å lage mathullet (se ovenfor).
3. Sette opp larver i analyseplater. Bruk mekanisk trykk for å bøye spissen av en plastmikrospatula og dypp spissen i gjærpasta for å gi "lim" for å plukke opp larver. Plukk opp første instar larver individuelt og legg dem på agarplaten nær mathaugen. Forbered minst fem replikeringsplater på 10 larver for både eksperimentelle og kontrollgenotyper. Når du er ferdig, hette og merk hver plate og sett platene (lokksiden opp) i et mørkt rom ved romtemperatur (i vårt laboratorium er dette 22 °C).

3. Overvåking av analyseplater

1. Undersøk plater daglig under et dissekerende mikroskop og registrer antall larver på toppen av maten eller ut på agaroverflaten. Legg merke til synlige døde eller døende larver. Legg merke til når, og hvis, tunnelering inn i agar substratet blir sett på som larver beveger seg inn i tredje instar. Legg merke til datoer som pupper begynner å danne og notere eventuelle pupal abnormiteter. Fortsett daglige observasjoner til alle larver har dødd eller pupert.
2. Fjern pupper forsiktig fra tallerkenen med en bøyd ertende nål og overfør til en drueplate. Hvis ønskelig, fortsett å overvåke pupper for å bestemme hvor mange eclose som voksne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification