Drosophila ( Drosophila ) Analyse des terriers et des tunnels : une méthode pour évaluer l’hypoxie tissulaire chez les larves de mouches

Overview

Cette vidéo montre une méthode pour tester l’hypoxie chez les larves de Drosophila en évaluant leurs capacités de creusement et de creusement de tunnels. En utilisant cette technique, les chercheurs peuvent distinguer les larves qui connaissent une privation d’oxygène de celles qui ont des déficits de développement. Le protocole d’exemple montre la configuration de cet essai.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Qiang et coll.,A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Préparation des larves

1. Deux jours ou plus avant le début de l’analyse, mettre en place des croisements des combinaisons expérimentales et témoins souhaitées (au moins 20 femelles et 10 mâles chacune) dans des plats pondus d’oeufs comme décrit par Wieschaus et Nusslein-Volhard, mais en utilisant des bechers en polypropylène de 50 mL et des plats Petri jetables de 6,0 cm contenant de la gélose de raisin et barbouillés de pâte de levure juste avant utilisation. Gardez les mouches dans les plats pondant des œufs dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce que nécessaire.
2. Recette d’agar de raisin – combiner 100 mL congelés 100% concentré de jus de raisin, 350 mL d’eau déioinisée, 5 mL d’acétique glaciaire et 13 g d’agar D. melanogaster dans un bécher en verre de 1L. Cuire au micro-ondes en rafales de 1 à 2 minutes, en remuant entre les éclats, jusqu’à ce que l’agar soit complètement dissous. Refroidir la solution pendant quelques minutes, puis ajouter 10 mL de 10% (w/v) de Nipagen (méthyl-p-hydroxybenzoate) dans 95% d’éthanol. Mélanger, puis pipette 7 mL par assiette en boîtes jetables de 6,0 cm petri, laisser geler et sécher à température ambiante pendant 3-4 h. Conserver à 4 °C dans des sacs en plastique.
3. Recette de pâte de levure – 7 g de levure séchée, 10 mL d’eau déionisée, mélanger à l’aide d’une spatule jusqu’à consistance uniforme.
4. Collectes d’œufs à temps pour générer des larves expérimentales et de contrôle. À l’aide de nouvelles assiettes de raisins barbouillées de levure, recueillir les œufs à température ambiante pendant 4 h dans l’obscurité pendant les heures du matin. Retirez ces assiettes de collecte de 4 h et remplacez-les par des assiettes fraîches. Incuber les plaques de collecte de 4 h pendant la nuit à 25 °C jusqu’à l’après-midi du lendemain, lorsque la plupart des larves auront éclos. Recueillir ces premières larves de stade et les utiliser pour mettre en place l’expérience.

2. Mise en place de plaques d’essai

1. Préparation des assiettes d’analyse. Pour une seule course de l’analyse, préparer cinq plaques d’analyse chacune des 10 larves expérimentales et cinq plaques de 10 larves de contrôle. Utilisez un foreur de liège de 1,5 cm pour enlever un noyau central d’agar de chaque assiette créant un trou pour la nourriture. Mettre la pâte de levure (0,8 - 0,9 g) dans le trou et tapoter doucement à l’aide d’une spatule pour faire un monticule remplissant le trou.
2. Préparation de plaques d’agar – mélanger 700 mL d’eau déionisée avec 16 g d’agar D. melanogaster dans un bécher en verre de 2 L et cuire au micro-ondes pendant 5 min. Retirer du four à micro-ondes et remuer à l’aide d’une tige de verre pour apporter de l’agar non dissous dans la solution. Ajouter 17,5 mL de 10 % (w/v) Nipagen dans 95 % d’éthanol, mélanger, puis poursuivre le chauffage au micro-ondes en rafales de 30 s, puis en remuant, jusqu’à ce que toute l’agar soit complètement dissoute. Laisser refroidir pendant une minute ou deux, puis pipette 15 mL aliquots dans des boîtes de Pétri en plastique de 10 cm. Laisser geler l’agar, couvrir les assiettes de couvercles et les laisser sécher à température ambiante pendant quelques heures ou toute la nuit. Conserver les assiettes dans des sacs en plastique scellés à 18 °C.
   NOTE 1: Pour éviter la formation de cristaux Nipagen à la surface des plaques en raison de l’excès de dessiccation, utilisez des plaques dans les quelques jours suivant la préparation. Si nécessaire, les cristaux peuvent être dissous en y laissant tomber quelques microlitres de 95% d’alcool.
   NOTE 2 : Les lots d’agar peuvent avoir différentes propriétés gélissantes. Les plaques de gel sec doivent être fermes au toucher et suffisamment résistantes pour qu’un cercle propre et intact d’agar puisse être enlevé lors de l’utilisation de l’agrile du liège pour créer le trou de nourriture (voir ci-dessus).
3. Mise en place de larves dans des plaques d’analyse. Utilisez une pression mécanique pour courber la pointe d’une microspatule en plastique et tremper la pointe dans la pâte de levure pour fournir un « adhésif » pour ramasser les larves. Ramassez les premières larves de instar individuellement et placez-les sur la plaque d’agar près du monticule de nourriture. Préparer au moins cinq plaques de reproduction de 10 larves pour les génotypes expérimentaux et de contrôle. Une fois terminées, fixez et étiquetez chaque plaque et placez les plaques (côté couvercle vers le haut) dans un espace sombre à température ambiante (dans notre laboratoire, c’est 22 °C).

3. Surveillance des plaques d’analyse

1. Examinez les plaques quotidiennement au microscope disséquant et enregistrez le nombre de larves sur le dessus de la nourriture ou à la surface de l’agar. Notez toutes les larves mortes ou mourantes visibles. Notez quand, et si, tunneling dans le substrat d’agar est vu pendant que les larves se déplacent dans le troisième stade. Notez les dates auxquelles les pupes commencent à se former et notez toutes les anomalies pupales. Poursuivre les observations quotidiennes jusqu’à ce que toutes les larves soient mortes ou pupées.
2. Retirer soigneusement les pupes de l’assiette à l’aide d’une aiguille à taquiner pliée et transférer dans une assiette de raisin. Si désiré, continuez à surveiller les pupes pour déterminer combien d’entclusions à l’âge adulte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification