Overview
וידאו זה מראה שיטה לבדיקת היפוקסיה בזחלים Drosophila על ידי הערכת יכולות החפירה והמנהור שלהם. באמצעות טכניקה זו החוקרים יכולים להבחין זחלים חווים מחסור בחמצן מאלה עם ליקויים התפתחותיים. פרוטוקול הדוגמה מדגים את ההתקנה עבור פעולה זו.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Qiang et al., מחילה / מינהור Assay לגילוי היפוקסיה ב Drosophila מלנוגסטר זחלים, J. Vis. Exp. (2018).
1. הכנת זחלים
- יומיים או יותר לפני תחילת ההסמכה, הקימו צלבים של שילובי הניסוי והבקרה הרצויים (מינימום 20 נקבות ו -10 זכרים כל אחד) במנות מטילי ביצה כפי שתואר על ידי וישאוס ו Nusslein-Volhard אבל באמצעות 50 כוסות פוליפרופילן 50 מ"ל ו 6.0 ס"מ מנות פטרי חד פעמיות המכילות אגר ענבים ומרוחים במשחה שמרים ממש לפני השימוש. שמור זבובים במנות מטיל ביצה בחושך בטמפרטורת החדר עד הצורך.
- מתכון אגר ענבים – לשלב 100 מל קפוא 100% תרכיז מיץ ענבים, 350 מל מים deioinized, 5 מל קרחונים אצטית ו 13 גרם D. מלנוגאסטר אגר 1L זכוכית. מיקרוגל ב 1-2 דקות התפרצויות, ערבוב בין צרורות, עד אגר הוא כל מומס. מצננים את הפתרון לכמה דקות ואז מוסיפים 10 מ"ל של 10% (w/v) של Nipagen (מתיל-p-hydroxybenzoate) ב 95% אתנול. מערבבים, ואז פיפטה 7 מ"ל לכל צלחת לתוך מנות פטרי חד פעמיות 6.0 ס"מ, מאפשרים ג'ל ויבש בטמפרטורת החדר במשך 3-4 שעות. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס בשקיות ניילון.
- שמרים להדביק מתכון – 7 גרם שמרים מיובשים, 10 מ"ל מים deionized, לערבב עם מרית עד עקביות אחידה.
- אוספי ביצים בזמן כדי ליצור זחלים ניסיוניים ושליטה. באמצעות חדש, שמרים מרוחים, צלחות ענבים, לאסוף ביצים בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות בחושך בשעות הבוקר. הסר אלה 4 שעות צלחות אוסף ולהחליף עם צלחות טריות. דגירה את צלחות איסוף 4 שעות לילה ב 25 מעלות צלזיוס עד אחר הצהריים של היום הבא, כאשר רוב הזחלים יהיה בקע. לאסוף זחלים כוכב הראשון ולהשתמש בהם כדי להגדיר את הניסוי.
2. הגדרת צלחות מבחנים
- הכנת צלחות מבחנים. לריצה אחת של ההסמכה, הכינו חמישה לוחות מבחנים לכל אחד מעשרה זחלים ניסיוניים וחמש צלחות של 10 זחלי בקרה. השתמש borer פקק 1.5 ס"מ כדי להסיר ליבה מרכזית של אגר מכל צלחת יצירת חור עבור האוכל. שים משחת שמרים (0.8 - 0.9 גרם) לתוך החור ולטפוח בעדינות עם מרית לעשות תל מילוי החור.
- הכנת צלחת אגר – לשלב 700 מל מים deionized עם 16 גרם D. מלנוגאסטר אגר זכוכית 2L ומיקרוגל במשך 5 דקות. מוציאים מהמיקרוגל ומערבבים עם מוט זכוכית כדי להכניס אגר לא פתור לפתרון. הוסף 17.5 מ"ל של 10% (w / v) Nipagen ב 95% אתנול, לערבב, ולאחר מכן להמשיך חימום מיקרוגל ב 30 התפרצויות ואחריו ערבוב, עד כל אגר מומס לחלוטין. מצננים לדקה או שתיים, ואז פיפטה 15 מ"ל aliquots לתוך 10 ס"מ פלסטיק פטרי מנות. אפשר אגר ג'ל, לכסות צלחות עם מכסים ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות או לילה. יש לאחסן צלחות בשקיות ניילון אטומות ב-18 מעלות צלזיוס.
הערה 1: כדי למנוע היווצרות של גבישי Nipagen על פני השטח של הצלחות עקב התייבשות עודפת, להשתמש בצלחות בתוך כמה ימים של הכנה. במידת הצורך, ניתן להמיס מחדש גבישים על ידי הטלת כמה מיקרוליטרים של 95% אלכוהול עליהם.
הערה 2: קבוצות של אגר יכול להיות תכונות gelling שונים. צלחות ג'ל יבש צריך להיות מוצק למגע מספיק גמיש כי נקי, מעגל שלם של אגר ניתן להסיר בעת שימוש borer הפקק כדי ליצור את חור המזון (ראה לעיל). - הגדרת זחלים בצלחות מבחנה. השתמש בלחץ מכני כדי לעקם את קצה microspatula פלסטיק לטבול את הקצה משחת שמרים כדי לספק "דבק" להרים זחלים. הרימו את הזחלים הראשונים בנפרד והניחו אותם על צלחת האגר קרוב לתל האוכל. הכינו לפחות חמישה לוחות משכפלים של 10 זחלים לגנוטיפים ניסיוניים ושליטה. לאחר השלמת, כובע לסמן כל צלחת ולהגדיר את הצלחות (בצד המכסה למעלה) בחלל חשוך בטמפרטורת החדר (במעבדה שלנו זה 22 מעלות צלזיוס).
3. ניטור צלחות מבחנים
- יש לבדוק צלחות מדי יום תחת מיקרוסקופ מנתח ולתעד את מספר הזחלים על גבי המזון או על פני השטח של אגר. שים לב לכל זחלים מתים או גוססים גלויים. שים לב מתי, ואם, מנהור לתוך תתי-אינטרטום אגר נתפס כזחלים לעבור לכוכב שלישי. הערה תאריכים שבהם גולם מתחילים להיווצר ולשים לב כל חריגות pupal. המשיכו בתצפיות היומיות עד שכל הזחלים ימותו או יתפזרו.
- מוציאים את הגומי בזהירות מהצלחת עם מחט מתגרה מכופפת ומעבירים לצלחת ענבים. אם תרצה, להמשיך ניטור גולם כדי לקבוע כמה eclose כמבוגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
