Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولا لاستخراج الحمض النووي للدياتوم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الشائعة المعدلة.
Abstract
اختبار الدياتوم هو وسيلة مساعدة أساسية في ممارسة الطب الشرعي لتحديد ما إذا كانت الجثة قد غرقت في الماء واستنتاج موقع الغرق. اختبار الدياتوم هو أيضا محتوى بحثي مهم في مجال البيئة والعوالق. تعد تقنية اختبار البيولوجيا الجزيئية للدياتوم ، والتي تركز على الحمض النووي للدياتوم ككائن بحثي أساسي ، طريقة جديدة لاختبار الدياتوم. استخراج الحمض النووي للدياتوم هو أساس الاختبار الجزيئي للدياتوم. في الوقت الحاضر ، تعتبر المجموعات المستخدمة بشكل شائع لاستخراج الحمض النووي للدياتوم باهظة الثمن ، مما يزيد من تكلفة إجراء البحوث ذات الصلة. قام مختبرنا بتحسين مجموعة الاستخراج السريع للحمض النووي لجينوم الدم الكامل العام وحصل على تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم بشكل مرض ، وبالتالي توفير حل بديل اقتصادي وبأسعار معقولة لاستخراج الحمض النووي يعتمد على الخرز الزجاجي للأبحاث ذات الصلة. يمكن أن يلبي الحمض النووي للدياتوم المستخرج باستخدام هذا البروتوكول العديد من التطبيقات النهائية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل.
Introduction
في ممارسة الطب الشرعي ، يعد تحديد ما إذا كانت الجثة التي تم العثور عليها في الماء تغرق أو ألقيت في الماء بعد الوفاة أمرا ضروريا للحل المناسب للقضية1. كما أنها واحدة من القضايا الصعبة التي تحتاج إلى حل عاجل في ممارسة الطبالشرعي 2. الدياتومات وفيرة في البيئة الطبيعية (خاصة في الماء)3,4. في عملية الغرق ، بسبب نقص الأكسجة والاستجابة للإجهاد ، سيكون لدى الناس حركات تنفس مكثفة ويستنشقون كمية كبيرة من سائل الغرق. لذلك ، تدخل الدياتومات الموجودة في الماء إلى الرئة بسائل الغرق ، ويمكن لبعض الدياتومات أن تدخل الدورة الدموية من خلال الحاجز السنخي الشعري وتنتشر إلى الأعضاء الداخلية مع تدفق الدم 5,6. يعد اكتشاف الدياتومات في الأنسجة والأعضاء الداخلية مثل الرئة والكبد ونخاع العظام دليلا قويا على الغرق قبل الموت 7,8. حاليا ، يعتمد اختبار الدياتوم الشرعي بشكل أساسي على طرق الاختبار المورفولوجية. بعد سلسلة من الهضم المسبق للأنسجة ، يتم إجراء التقديرات النوعية والكمية المورفولوجية للدياتومات غير المهضومة تحت المجهر. خلال هذه الفترة ، يجب استخدام الكواشف الخطرة وغير الصديقة للبيئة مثل حمض النيتريك. تستغرق هذه العملية وقتا طويلا وتتطلب من الباحثين أن يكون لديهم خبرة تصنيفية قوية وتجربة واسعة. كل هذا يجلب بعض التحديات لموظفي الطب الشرعي9. تقنية اختبار الحمض النووي للدياتوم هي تقنية جديدة لاختبار المشطورات تم تطويرها في السنوات الأخيرة10،11،12. تحقق هذه التقنية تحديد الأنواع من الدياتومات من خلال تحليل تكوين تسلسل الحمض النووي المحدد للدياتومات13,14. تقنية PCR وتكنولوجيا التسلسل هي طرق تقنية شائعة الاستخدام ، ولكن أساسها هو الاستخراج الناجح للحمض النووي من الدياتومات. ومع ذلك ، فإن الدياتومات لها بنية خاصة مختلفة عن الكائنات الحية الأخرى ، مما يجعل تقنيات استخراج الحمض النووي مختلفة أيضا.
يحتوي جدار الخلية في المشطورة على درجة عالية من السيليكات ، ومكونه الرئيسي هو ثاني أكسيد السيليكون15،16،17. جدار الخلية السيليسية صعب للغاية ، ويجب تدميره قبل استخراج الحمض النووي. غالبا ما يصعب استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي العادية مباشرة لاستخراج الحمض النووي للدياتوم لأنها لا تستطيع تدمير القشرة السيليسية للدياتومات18. لذلك ، فإن تدمير القشرة السيليسية للدياتومات هو أحد المشكلات التقنية الرئيسية التي يجب حلها في استخراج الحمض النووي للدياتوم.
في الوقت نفسه ، نظرا لأن عدد الدياتومات الموجودة في عينات أبحاث الطب الشرعي ، سواء كانت عينات مياه أو أعضاء وأنسجة الجثث الغارقة ، غالبا ما يكون محدودا ، فمن الضروري إثراء الدياتومات. جوهر التخصيب هو فصل المواد. أثناء محاولة جمع الدياتومات معا ، قلل من محتوى مكونات المواد الأخرى (المكونات المتداخلة). في أعمال الطب الشرعي ، غالبا ما تستخدم المختبرات طرق الطرد المركزي أو الإثراء بالترشيح الغشائي لفصل خلايا المشطورة19. ومع ذلك ، نظرا لعدم استخدام معدات ضخ الفراغ على نطاق واسع ، فإن طريقة التخصيب الغشائي لا تستخدم غالبا في مختبرات الطب الشرعي الأولية العادية. لذلك ، لا تزال طريقة الطرد المركزي شائعة تخصيب الدياتوم في مختبرات الطب الشرعي20.
يستخدم استخراج الحمض النووي من الدياتومات حاليا في المقام الأول في ممارسة الطب الشرعي ، وهناك قيود كبيرة على تطبيقه. في الوقت الحاضر ، هناك عدد قليل من مجموعات استخراج الحمض النووي للدياتوم المستخدمة في علوم الطب الشرعي في السوق وهي باهظة الثمن بشكل عام21. توفر هذه المقالة طريقة محسنة لاستخراج الحمض النووي للدياتوم ، مما يجعل استخراج الحمض النووي للدياتوم بسيطا ومريحا وفعالا من حيث التكلفة. هذا يزيد من تطبيق اختبار البيولوجيا الجزيئية اللاحقة للدياتومات ويمكن أن يحل بشكل أفضل المشاكل المتعلقة بالغرق في الطب الشرعي من خلال اختبار الدياتوم. هذه الطريقة تكسر جدران الخلايا السيليسية للدياتومات عن طريق إضافة حبات زجاجية وتحديد وقت مناسب للدوامة. بهذه الطريقة ، يقوم البروتيناز K ومحلول الربط بتحليل الخلايا بسرعة وتعطيل الإنزيمات المختلفة في الخلايا. يتم امتصاص الحمض النووي الجينومي في غشاء المصفوفة في عمود الامتزاز وأخيرا يتم استخلاصه بواسطة محلول الشطف. تعمل مجموعة استخراج جينات الدم الكاملة المحسنة هذه على تحسين تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم لمجموعة الدم في مواد فحص الطب الشرعي ، وتقلل من تكلفة استخراج الحمض النووي للدياتوم في ممارسة الطب الشرعي ، ويمكن تطبيقها بشكل أفضل على أبحاث الطب الشرعي الشعبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة هاينان الطبية. لا تعتبر عينات الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة دراسات تشمل أشخاصا. تم الحصول على هذه العينات لغرض التشخيص المرضي الشرعي ، وتم استخدام الباقي لاستخراج الحمض النووي للدياتوم في هذه التجربة. لا يمكن للباحثين تحديد الأفراد بسهولة للحصول على موافقة مستنيرة من أصحاب المصلحة المعنيين.
ملاحظة: لضمان التطبيق العام لطريقة البحث المبلغ عنها في هذه التجربة ، اتبعت هذه التجربة بشكل أساسي تعليمات التشغيل الخاصة بالمجموعة المستخدمة ، وتم تعديل بعض الخطوات فقط. أخذت عينات المياه المستخدمة في هذه التجربة عشوائيا من البرك القريبة من المختبر (الشكل التكميلي 1 أ). في هذه التجربة ، تم تأكيد أنسجة الرئة في الجسم الغارق كنسيج بحثي لإثبات بروتوكول الاستخراج (الشكل التكميلي 1B). في ممارسة الطب الشرعي ، من الضروري أيضا في بعض الأحيان استخدام أعضاء وأنسجة أخرى من الأجسام الغارقة (مثل الكبد والطحال والكلى ونخاع العظام ، وما إلى ذلك) لاستخراج الحمض النووي للدياتومات ، الأمر الذي يتطلب تحسينات طفيفة مقابلة لهذه الطريقة التجريبية ، والتي سيتم شرحها في القسم المقابل من التجربة. جاءت عينات أنسجة الرئة المستخدمة في هذه التجربة من جثث غرقت بوضوح في قضايا الطب الشرعي. تم إجراء اختبارات مورفولوجية لإثبات أن أنسجة الرئة تحتوي على الدياتومات (الشكل التكميلي 2).
1. المعالجة المسبقة للعينات
- المعالجة المسبقة لعينات المياه
- خذ 10 مل من عينة الماء في أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 13400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص بعناية من 9.8 مل من المادة الطافية بمسدس ماصة ، وانقل حوالي 200 ميكرولتر من عينة ماء المشطورة المخصبة المتبقية في القاع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
ملاحظة: يمكن إجراء التجربة المسبقة أولا ، ويمكن زيادة الكمية الأولية إذا كانت عينة ماء 10 مل غير كافية للتخصيب.
- خذ 10 مل من عينة الماء في أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 13400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص بعناية من 9.8 مل من المادة الطافية بمسدس ماصة ، وانقل حوالي 200 ميكرولتر من عينة ماء المشطورة المخصبة المتبقية في القاع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
- المعالجة المسبقة لعينات الأنسجة
- خذ 0.5 غرام من أنسجة هامش الرئة من الجسم الغارق ، أو قم بقطع أنسجة الرئة أو طحنها بالكامل حتى تصبح موحلة. منع تلوث الدياتومات الخارجية هو جوهر هذه الخطوة. قطع الأنسجة إلى قطع بشكل متكرر باستخدام مقص.
2. استخراج الحمض النووي
ملاحظة: يتم الانتهاء من جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. استخدام جهاز طرد مركزي مكتبي بقوة طرد مركزي تبلغ 14500 × جم ؛ يجب تحضير حمام مائي (أو حمام معدني) مسخن مسبقا إلى 70 درجة مئوية قبل بدء التجربة. يجب أن تتبع جميع الخطوات بدقة مبادئ التشغيل التعقيم.
- تجميع عينات المياه والأنسجة
ملاحظة: عينة الماء وطريقة استخراج الحمض النووي للدياتوم هي نفسها.- أضف حبات زجاجية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على عينة المياه المعالجة مسبقا. اقلب 10x-15x لتخلط جيدا. تتكون الخرزات الزجاجية المضافة من خرز زجاجي كبير وصغير ممزوج بنسبة كتلة 1: 1. قطر الخرز الزجاجي الكبير 1.5-2.0 مم والخرز الزجاجي الصغير 0.4-0.6 مم.
- خذ 0.5 غرام من الأنسجة المفرومة ناعما ، أضف حبات زجاجية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على الأنسجة كما هو موضح أعلاه. اقلب 10x-15x للخلط.
- أضف 40 ميكرولتر من بروتيناز K (20 مجم / مل) إلى الأنابيب. ضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، خلال هذه الفترة ، اقلبه واخلطه 10 مرات كل 3 دقائق.
ملاحظة: إذا لم يتم هضم الأنسجة بالكامل ، يمكن زيادة كمية البروتين K بشكل مناسب حتى يصبح المحلول واضحا. - أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى أنابيب الطرد المركزي ، دوامة على الفور ، واخلطها لمدة 4 دقائق (تردد خلط التذبذب: 3000 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يجب التحكم بدقة في شدة الاهتزاز والوقت لضمان كثافة ووقت خلط كافيين. - ضع أنابيب الطرد المركزي في حمام مائي 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ويصبح الحل واضحا.
- أضف 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى أنابيب الطرد المركزي ، دوامة واخلطها لمدة 15 ثانية ، قد يظهر هطول الأمطار الندف في هذا الوقت.
ملاحظة: من المهم جدا الاختلاط جيدا مع القوة المناسبة في خطوات العملية المذكورة أعلاه ، ولكن يجب تجنب الاهتزاز القوي لمنع قص الحمض النووي. - ضع المحلول الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة مع راسب الندف في عمود الامتزاز (يتم وضع عمود الامتزاز في أنبوب التجميع). طول عمود الامتزاز 3.0 سم ، وقطره 1.0 سم ، ومصفوفة الامتزاز عبارة عن غشاء مصفوفة السيليكون.
- جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 30 ثانية ، تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع وأعد عمود الامتزاز إلى أنبوب التجميع.
- أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المانع إلى عمود الامتزاز. أجهزة طرد مركزي عند 13400 × جم لمدة 30 ثانية وتخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
- أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى عمود الامتزاز. أجهزة طرد مركزي عند 13400 × جم لمدة 30 ثانية وتخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
ملاحظة: أضف الكمية المحددة من الإيثانول المطلق إلى زجاجة الغسيل العازلة قبل الاستخدام لأول مرة. - أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى عمود الامتزاز. أجهزة طرد مركزي عند 13400 × جم لمدة 30 ثانية وتخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
- ضع عمود الامتزاز مرة أخرى في أنبوب التجميع الفارغ. أجهزة الطرد المركزي عند 14500 × جم لمدة 2 دقيقة ، وإزالة المخزن المؤقت للغسيل قدر الإمكان ، لتجنب الإيثانول المتبقي في مخزن الغسيل المؤقت من تثبيط تفاعلات المصب.
- أخرج عمود الامتزاز وضعه في أنبوب طرد مركزي نظيف. أضف 100 ميكرولتر من محلول الشطف إلى الجزء الأوسط من غشاء الامتزاز.
- ضع عمود الامتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 13400 × جم لمدة 1 دقيقة.
- أضف الحل الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة إلى عمود امتزاز الطرد المركزي مرة أخرى. ضع عمود الامتزاز بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 13400 × جم لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: يجب تسخين محلول الشطف مسبقا في حمام مائي بدرجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا. يجب ألا يقل حجم الشطف عن 50 ميكرولتر ؛ خلاف ذلك ، سيتم تقليل عائد الحمض النووي. - قم بتخزين الحمض النووي للدياتوم المستخرج في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. إذا كان سيتم تخزين محلول الحمض النووي لفترة طويلة ، فقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
3. اختبار PCR
ملاحظة: نظرا لأن محتوى الدياتومات في عينات الطب الشرعي غالبا ما يكون منخفضا ، فقد تحتوي مستخلصات عينات الأنسجة للجثث الغارقة أيضا على درجات متفاوتة من الأنسجة والأعضاء (مثل الرئتين في هذه التجربة) مع الحمض النووي الخاص بها. لذلك ، فإن الكشف المباشر عن إجمالي الحمض النووي في مستخلصات الحمض النووي لا يعكس حالة استخراج الحمض النووي للدياتوم. في هذه التجربة ، تم اختيار البادئات الخاصة بالدياتوم ، وتم استخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتقييم استخراج الحمض النووي للدياتوم في المستخلص. يمكن ملاحظة المنتجات وتحليلها عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ويمكن أيضا تحليلها بواسطة منحنى ذوبان PCR الكمي الفلوري في الوقت الفعلي ، والذي يتميز بحساسية أعلى.
- أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج من عينات المياه والأنسجة كقالب. اختر إحدى الطريقتين التاليتين للفحص.
- اختبار PCR التقليدي
- استخدم البادئات22 التي يمكنها تضخيم شظايا المشتراتوم 18S rDNA على وجه التحديد. لمزيد من التفاصيل، انظر الجدول 1.
- إنشاء نظام تفاعل PCR وظروف التضخيم وفقا لخصائص الاشعال. لمزيد من التفاصيل، انظر الجدول 2.
- قم بتشغيل منتجات تضخيم PCR على هلام الأغاروز 2٪. مراقبة وتحليل التصوير باستخدام جهاز تصوير هلام.
- اختبار PCR الكمي الفلوري
- استخدم البادئات المذكورة أعلاه التي يمكنها على وجه التحديد تضخيم شظايا المشطورة 18S rDNA لإعداد نظام تفاعل PCR الكمي الفلوري في الوقت الفعلي. لمزيد من التفاصيل، انظر الجدول 3.
- قم بإجراء تضخيم PCR وتحليل منحنى التضخيم الذي تم الحصول عليه وقيم Ct. في الوقت نفسه ، قم بتعيين برنامج ، وقم بإذابة الخيوط المزدوجة للمنتجات المضخمة إلى خيوط مفردة تدريجيا من خلال تقنية منحنى ذوبان PCR الكمي الفلوري ، ثم قم بتحليل منحنيات الذوبان التي تم الحصول عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نظرا لأن محلول الحمض النووي المستخرج بواسطة طريقة استخراج الحمض النووي المستخدمة حاليا يحتوي على جميع مكونات الحمض النووي من مصادر مختلفة في العينة ، فإن الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بواسطة هذا البروتوكول لم يكن استثناء. لذلك ، لم يكن محلول الحمض النووي مجرد محلول للحمض النووي الجيني للدياتوم. تم اختيار الاشعال التي يمكنها تضخيم شظايا المشطورة 18S rDNA على وجه التحديد من خلال الرجوع إلى الأدبيات22،23،24. تم التحقق من البادئات بواسطة NCBI-Blast Primer ، وأظهرت النتائج أن التمهيدي الأمامي D512 والتمهيدي العكسي D978 من 18S rDNA كانا بادئات خاصة بالطحالب وغطت العديد من أنواع الدياتوم. لم تظهر نتائج التضخيم أي جينات بشرية. تم استخدام علامة حيوية موثوقة للحمض النووي لاختبار المشطورات ، لذلك تم اختيارهم للتحقق من نتائج هذه التجربة. باستخدام الحمض النووي المستخرج كقالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالدياتور ، أظهر منتج التضخيم بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز أن عينات المياه والأنسجة تحتوي على نطاقات الحمض النووي للدياتوم ، وكانت نطاقات الرحلان الكهربائي هذه بين 250-500 نقطة أساس (أقرب إلى 500 نقطة أساس) ، بما يتماشى مع حجم طول منتج التضخيم المستهدف التمهيدي (390 -410 نقطة أساس). أظهر هذا أن بروتوكول الاستخراج كان ناجحا في استخراج الحمض النووي للدياتوم (الشكل 1 أ ، ب).
تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الفعلي هي نوع من تكنولوجيا اختبار الجينات ذات الخصوصية الصارمة والحساسية العالية. من خلال إضافة مجموعات الفلورسنت في نظام تفاعل PCR ، يمكن أن يؤدي تراكم إشارات الفلورسنت إلى مراقبة عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بأكملها في الوقت الفعلي ، والحساسية عالية25,26. قد يكون من الصعب في بعض الأحيان ملاحظة المنتجات التي يتم تضخيمها على وجه التحديد بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي في الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز بسبب المحتوى المنخفض وأسباب أخرى27 (الشكل 1C). من خلال التضخيم المحدد لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الفعلي ، تم الحصول على منحنى تضخيم نموذجي بأربع مراحل مميزة (الشكل 2). في الوقت نفسه ، من خلال تقنية منحنى ذوبان PCR الكمي الفلوري في الوقت الفعلي ، تم صهر خيوط الحمض النووي المزدوجة للمنتج المضخم في خيوط مفردة عند درجة حرارة عالية ، وتم تحرير الصبغة من الخيوط المزدوجة ، وانخفضت قيمة التألق. من خلال الكشف عن التغير في قيمة التألق ، تم الحصول على منحنى الذوبان (الشكل 3). كان لمنحنيات الانصهار التي تم الحصول عليها قمم مميزة ، وكانت قيمة الذروة حوالي 85.5 درجة مئوية ، مما أثبت وجود تضخيم محدد للحمض النووي المستهدف ، مما يشير إلى وجود الحمض النووي للدياتوم في محلول الحمض النووي المستخرج. يمكن أيضا إضافة الصبغة مباشرة إلى منتج تضخيم PCR التقليدي ، ويمكن الحصول على منحنى الذوبان عن طريق تقنية منحنى ذوبان PCR الكمي الفلوري في الوقت الفعلي لإثبات ما إذا كان هناك تضخيم محدد. لذلك ، عندما لا يتمكن الرحلان الكهربائي التقليدي لهلام PCR-agarose من إثبات ما إذا كان هناك حمض نووي للدياتوم في محلول الحمض النووي المستخرج ، يمكن اختيار تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الفعلي ذات الحساسية العالية للتحقق والتقييم. في هذه التجربة ، تم استخدام تقنية منحنى ذوبان PCR الكمي الفلوري في الوقت الفعلي فقط للتحليل النوعي.
كما هو موضح في تقرير سابق21 ، كانت مجموعة استخراج الحمض النووي التقليدية للتربة ومجموعة استخراج الحمض النووي للدم المعدلة هي نفسها بشكل أساسي لاستخراج الحمض النووي للدياتوم من عينات المياه والأنسجة. كان فرق تكلفة استخراج الحمض النووي للدياتوم هو فرق السعر بين المجموعتين ، وكانت تكلفة المواد الاستهلاكية الأخرى هي نفسها بشكل أساسي. في هذه الدراسة ، يمكن أن يؤدي التحسين البسيط لمجموعة استخراج الحمض النووي في الدم المستخدمة بشكل شائع في تجارب البيولوجيا الجزيئية إلى الحصول على نتائج تجريبية أفضل ، والتي لم تزيد فقط من نطاق الباحثين لاختيار مجموعة الاختبار في الأنشطة البحثية المتعلقة باستخراج الحمض النووي للدياتوم ولكن أيضا خفضت تكلفة الاختبار.
تم نشر عملية تحسين هذا البروتوكول21. من خلال تصميم مزيج من نسب الكتلة المختلفة للخرز الزجاجي ووقت تذبذب الدوامة ، تمت إضافة ظروف استخراج الحمض النووي المثلى لتذبذب الخرز الزجاجي إلى المجموعة التقليدية ، وبالتالي ، يمكن للطريقة تحسين تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم في عينات الطب الشرعي ، وخاصة في عينات الأنسجة. تم الحصول على المزيج الأمثل لاستخراج الحمض النووي عندما كان تردد تذبذب الدوامة 3000 دورة في الدقيقة ؛ كان وقت تذبذب الدوامة 4 دقائق ، وكانت نسبة كتلة الخرز الزجاجي الكبير بقطر 1.5-2.0 مم والخرز الزجاجي الصغير بقطر 0.4-0.6 مم 1: 1. تم إجراء مقارنة بين الطريقة التقليدية للمجموعة والطريقة المحسنة. وقد تبين أن المجموعة المستخدمة يمكن أن تلبي احتياجات تضخيم الحمض النووي للدياتوم ، وكان سطوع النطاقات الكهربية بعد التضخيم الذي أجرته الطريقة المحسنة في عينات المياه مشابها لسطوع الطريقة التقليدية ، وكانت النطاقات الكهربائية بعد التضخيم الذي أجرته الطريقة المحسنة في عينات الأنسجة أكثر إشراقا (الشكل 4).
الشكل 1: نتائج الرحلان الكهربائي للحمض النووي المستخرج باستخدام البروتوكول بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم استخدام ما مجموعه 2 ميكرولتر من مستخلص الحمض النووي كقالب DNA للتضخيم الخاص ب PCR. تم تزويد منتجات تضخيم PCR بالكهرباء على محلول عازل 1x TAE من خلال هلام الأغاروز بنسبة 2٪ ، وتم تشغيلها بجهد ثابت يبلغ 100 فولت لمدة 25-30 دقيقة. تم استخدام سلم الحمض النووي D2000 لجميع المواد الهلامية. (أ) نتائج الرحلان الكهربائي للحمض النووي للدياتوم في عينات المياه بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الحارة 1 هي تحكم فارغ ؛ الممرات 2-7 هي عينات مياه من مواقع مختلفة في نفس المنطقة. ب: نتائج الرحلان الكهربي بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي للدياتوم في الأنسجة. الممرات 1-6 هي الأنسجة التي يتم استئصالها من مواضع مختلفة من نفس أنسجة الرئة. الحارة 7 هي عنصر التحكم الفارغ. (ج) في تجربة غير ناجحة، بعد تضخيم الحمض النووي للدياتوم، لم تظهر نتائج الرحلان الكهربي نطاقات الرحلان الكهربي في المواضع المقابلة، مما يشير إلى عدم وجود نواتج تضخيم أو عدد قليل جدا من نواتج التضخيم. في هذا الوقت ، لم تستطع نتائج الرحلان الكهربائي الإشارة إلى ما إذا كان هناك حمض نووي للدياتوم في محلول الحمض النووي المقترح ، والذي يجب تنفيذه بطرق أكثر حساسية (مثل منحنى ذوبان PCR). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منحنى تضخيم الحمض النووي للدياتوم qPCR. تم استخدام ما مجموعه 2 ميكرولتر من مستخلص محلول الحمض النووي الذي لم يظهر أي نطاقات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي والرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز كقالب لإعداد نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الفعلي وإعداد برنامج. أخيرا ، تم الحصول على منحنيات تضخيم نموذجية مع أربع مراحل مميزة لمرحلة خط الأساس الخطي ، وبداية المرحلة الأسية ، والمرحلة الأسية ، ومرحلة الهضبة. كما تم الحصول على قيمة Ct لكل منحنى من خلال التحليل ، مما يشير إلى أن استخراج الحمض النووي كان ناجحا. يمثل كل رقم قيمة Ct للمنحنى المقابل. العتبة هي 5.2. وحدة المحور ص هي Rn. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: منحنى انصهار الحمض النووي للدياتوم. باستخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الفعلي ، تم تعيين برنامج حيث ترتفع درجة الحرارة من 60-95 درجة مئوية. أدى ذلك إلى منحنى ذوبان وذاب الحمض النووي المزدوج المضخم على وجه التحديد في خيوط مفردة عند درجات حرارة عالية ، وكانت الصبغة خالية من الخيوط المزدوجة ، وانخفضت قيمة التألق حتى أصبحت 0. تم الحصول على الرسم البياني بأخذ المقلوب السلبي للرسم البياني الأصلي. يمثل الإحداثي درجة الحرارة ، والإحداثيات المقابلة لأعلى قيمة ذروة هي قيمة Tm ، وكانت قيمة Tm لمنحنى الانصهار في الرسم البياني 85.5 درجة مئوية. يتوافق ترقيم كل منحنى مع ترقيم كل حارة في الشكل 1C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نتائج الرحلان الكهربائي للعملية المحسنة. (أ) نتائج الرحلان الكهربي لمجموعات مختلفة من نسب حبيبات الزجاج وأوقات تذبذب الدوامة. الممرات 1 و 4 و 7 و 10 و 13 حيث نسبة الكتلة المختلطة للخرز الزجاجي الكبير والصغير هي 1: 2 ، الممرات 2 و 5 و 8 و 11 و 14 حيث نسبة الكتلة المختلطة للخرز الزجاجي الكبير والصغير هي 1: 1 ، الممرات 3 و 6 و 9 و 12 و 15 حيث نسبة الكتلة المختلطة للخرز الزجاجي الكبير والصغير هي 2: 1 وكانت أوقات التذبذب دقيقتين للممرات 1-3 ، و 3 دقائق للممرات 4-6 ، و 4 دقائق للممرات 7-9 ، و 5 دقائق للممرات 10-12 ، و 6 دقائق للممرات 13-15. الحارة 16 هي عنصر التحكم الفارغ. (ب) نتائج الرحلان الكهربائي بعد تضخيم PCR لمنتجات استخراج المجموعة قبل وبعد التحسين. الممرات 1-3 هي طرق تقليدية لاستخراج عينات المياه ، والممرات 4-6 هي طرق محسنة لاستخراج عينات المياه ، والممرات 7-9 هي طرق تقليدية لاستخراج الأنسجة ، والممرات 10-12 هي طرق محسنة لاستخراج الأنسجة ، والحارة 13 هي عنصر تحكم فارغ. تم تعديل النتائج من21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: عينات المياه وعينات الأنسجة. تم أخذ عينات المياه المستخدمة من بركة بالقرب من المختبر ، وتم تأكيد عينات الأنسجة المستخدمة على أنها أنسجة رئوية للجثة الغارقة. (أ) كان موقع جمع عينات المياه التجريبية عبارة عن بركة بالقرب من المختبر. ب: عينات الماء المخصب وعينات أنسجة الرئة الممزقة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: صورة مجهرية للدياتوم. تم التقاط الصورتين (أ) و (ب) تحت مجهر بصري 400x. يشير السهم إلى الدياتومات. التقطت الصورتان (ج) و(د) تحت المجهر الإلكتروني. توضح الصورتان (أ) و(ب) الدياتومات الموجودة في الماء في موقع الغرق. الدياتومات المسماة Fragilaria و Navicula. توضح الصورتان (ج) و(د) الدياتومات في الرئتين، وتسمى نيتششيا ونافيكولا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
| هدف | اسم التمهيدي | تسلسل |
| 18S الحمض النووي الريبي | فوروورد التمهيدي D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| التمهيدي العكسي D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
الجدول 1: قائمة الاشعال المستخدمة. يصف هذا الجدول التسلسلات والأسماء والمناطق المستهدفة لبادئات محددة مستخدمة في هذا البحث.
| نظام تفاعل PCR | |||
| 2x تاك ميكس برو | 10 ميكرولتر | ||
| فوروورد التمهيدي D512 | 0.5 ميكرولتر (10 ميكرومول / لتر) | ||
| التمهيدي العكسي D978 | 0.5 ميكرولتر (10 ميكرومول / لتر) | ||
| قالب الحمض النووي | 2 ميكرولتر | ||
| ماء خال من النيوكلياز | إلى 20 ميكرولتر | ||
| ملاحظة: يتم استبدال الحمض النووي لقالب التحكم الفارغ بنفس الكمية من الماء الخالي من النيوكلياز. | |||
| برنامج PCR | |||
| درجة الحرارة | الوقت | دورات | |
| 94 درجة مئوية | 10 دقائق | 1 | |
| 94 درجة مئوية | 45 ثانية | 40 | |
| 50 درجة مئوية | 45 ثانية | ||
| 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | ||
| 72 درجة مئوية | 10 دقائق | 1 | |
الجدول 2: مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يصف هذا الجدول تكوين نظام التفاعل لتفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي وإعدادات درجة حرارة التفاعل والوقت وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. كان الحجم الكلي لنظام التفاعل المستخدم 20 ميكرولتر.
| نظام تفاعل PCR الكمي في الوقت الحقيقي | |||
| 2x مزيج qPCR | 10 ميكرولتر | ||
| فوروورد التمهيدي D512 | 0.45 ميكرولتر (10 ميكرومول / لتر) | ||
| التمهيدي العكسي D978 | 0.45 ميكرولتر (10 ميكرومول / لتر) | ||
| قالب الحمض النووي | 2 ميكرولتر | ||
| ماء خال من النيوكلياز | إلى 20 ميكرولتر | ||
| ملاحظة: يتم استبدال الحمض النووي لقالب التحكم الفارغ بنفس الكمية من الماء الخالي من النيوكلياز. | |||
| برنامج PCR الكمي في الوقت الحقيقي | |||
| درجة الحرارة | الوقت | دورات | |
| 94 درجة مئوية | 10 دقائق | 1 | |
| 94 درجة مئوية | 45 ثانية | 40 | |
| 50 درجة مئوية | 45 ثانية | ||
| 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | ||
الجدول 3: مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. يصف هذا الجدول تكوين نظام التفاعل لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي وإعدادات درجة حرارة التفاعل والوقت وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. كان الحجم الكلي لنظام التفاعل المستخدم 20 ميكرولتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلايا المشطورة محمية بجدران الخلايا السيليسية الصلبة17 ، ويجب تدمير هذا الهيكل لاستخراج الحمض النووي للدياتوم. المجموعات العادية لا تدمر بسهولة القشرة السيليسية للدياتومات ؛ وبالتالي من الصعب استخراج الحمض النووي للدياتوم21 بنجاح. قام مختبرنا بتحسين مجموعة استخراج الحمض النووي للدم الأكثر استخداما ، مضيفا حبات زجاجية بأقطار مختلفة ونسبة كتلة مختلفة في عملية استخراج الدياتوم. يتم تنفيذ تذبذب الدوامة في نفس الوقت ، والذي يمكن أن يكسر تماما قشرة المشطورة ويحسن تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم. وكما هو مبين في التقريرالسابق 21، فإن قطر الخرز الزجاجي وشدة التذبذب والوقت سيؤثران تأثيرا مباشرا على نوعية استخراج الحمض الخلوي الصبغي. يجب ألا يكون وقت تذبذب الدوامة طويلا جدا (لا يزيد عن 10 دقائق). إذا كان الوقت طويلا جدا ، فسوف ينكسر الحمض النووي بسبب الاهتزاز المفرط. في الوقت نفسه ، يجب ألا يكون الوقت قصيرا جدا. إذا كان الوقت قصيرا جدا (لا يقل عن 2 دقيقة) ، فلن تتم إزالة قشرة المشطورة بالكامل ، مما يجعل استخراج الحمض النووي غير فعال. أثناء اختيار الخرز الزجاجي ، اختر حبات بأقطار محيطية مختلفة ، تضمن الحبيبات الزجاجية الكبيرة قوة الاصطدام ، وتضمن الحبيبات الزجاجية الصغيرة عدم وجود تصادم ميت بين الخرز الزجاجي أثناء عملية تجزئة الاصطدام ، مما يحسن كفاءة كسر القشرة.
لاستخراج الحمض النووي للدياتوم من العينات ، من الضروري عموما إثراء الدياتومات. سيكون لهذه العملية تأثير كبير على استخراج الحمض النووي للدياتوم. والغرض من التخصيب هو زيادة تركيز المشطورة في العينات بحيث يمكن أن يكون تركيز الحمض النووي للدياتوم المستخرج في نطاق يمكن اكتشافه؛ لتطبيقات الخطوة التالية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الفعلي والتسلسل عالي الإنتاجية.
نظرا لأن الدياتومات موزعة على نطاق واسع في الطبيعة4 ، فإن منع التلوث المختبري يمثل أولوية قصوى28. سيؤدي التلوث أثناء عملية استخراج الحمض النووي إلى انحرافات عن النتائج الفعلية وفقدان قيمة الاستخدام. لذلك ، انتبه دائما إلى مبدأ التشغيل المعقم عند استخراج الحمض النووي للدياتوم واتخاذ جميع التدابير الممكنة لتقليل وتجنب تلوث الدياتومات الخارجية. عندما يتم استخراج الأنسجة من الجثة ، ينبغي اتخاذ تدابير لمنعها من التلوث بالدياتومات الخارجية. بعد استخراج الأنسجة ، يجب تخزينها في حاوية أو كيس عينة خال من تلوث الدياتوم. لا ينبغي أن تعامل الأنسجة مع الفورمالديهايد. يجب غسل معدات استخراج ومعالجة الأنسجة 2-3 مرات بالماء المقطر بشكل متكرر ، ثم تعقيمها بالأشعة فوق البنفسجية أو درجة حرارة عالية لضمان عدم تلوث الدياتومات من مصادر أخرى. يجب قطع الأنسجة قبل الاختبار من الأنسجة السطحية بأداة خالية من الديatom ، ثم يجب استبدال الأداة لانتقاء الأنسجة السفلية للفحص. في الوقت نفسه ، يمكن أن يؤدي توحيد عملية التشغيل أيضا إلى تجنب مشكلة تلوث المختبر بشكل فعال.
نظرا لأن الدياتومات هي غذاء العديد من الكائنات المائية ، فسوف تضيع أثناء التخزين طويل الأجل29. يمكن أن تنمو الدياتومات أيضا وتتكاثر في ظل ظروف الإضاءة. لذلك ، يجب أن تبدأ خطوة استخراج الحمض النووي في أقرب وقت ممكن بعد أخذ العينات ويجب إجراء معالجة سريعة للعينات لمنع فقدان الدياتومات في العينة. إذا تعذر إجراء استخراج الحمض النووي على الفور ، فيجب تجميد جميع العينات وحفظها في الظلام لمنع تقليل الدياتومات قدر الإمكان.
اختار بحثنا مجموعة استخراج الحمض النووي للدم الشائعة والرخيصة بناء على طريقة الهضم البروتيناز K ، والتي تم تحسينها لاستخراج الحمض النووي للدياتوم من عينات المياه والأنسجة مع نتائج جيدة30. يتم قطع الأنسجة بما فيه الكفاية لتكون على اتصال كامل مع البروتيناز K ويتم هضم الأنسجة بالكامل. المبدأ المحتمل للاستخراج الناجح هو كما يلي: أثناء خطوة الاهتزاز ، تتأثر القشرة الصلبة للدياتوم بشكل متكرر وتجزأ بين حبات زجاجية سريعة الحركة ، مما يعرض غشاء الخلية. يمكن لتكوين الخرز الزجاجي بأحجام مختلفة أن يملأ الفجوة بين تصادم الخرز الزجاجي أحادي الحجم ، وذلك لتغطية سطح ملامسة الاصطدام على أكمل وجه ممكن ؛ بعد فقدان قشرة السيليكون ، يساعد البروتيناز K على إطلاق الحمض النووي من الدياتوم. بالمقارنة مع مجموعة استخراج الحمض النووي للتربة المستخدمة حاليا ، يمكن لمجموعة استخراج الحمض النووي المحسنة في الدم أن تلبي متطلبات استخراج الحمض النووي للدياتوم ، وهو أكثر اقتصادا وأسهل في الحصول عليه. فهو لا يسهل فقط استخدام فحص المشطورات الشرعي ، ولكنه مناسب للتطبيق على التخصصات الأخرى المتعلقة بأبحاث المشطورات ويمكن استخدامه أيضا لاستخراج الحمض النووي للعوالق الأخرى. عند استخراج الحمض النووي للدياتوم من عينات الماء ، يجب تعديل كمية البروتين K المستخدمة وفقا لعدد العوالق في الماء. يمكن زيادة أو تقليل كمية البروتيناز K بناء على التجارب الأولية. عند استخراج الحمض النووي للدياتوم من الأنسجة، ستؤثر أنواع أنسجة الأعضاء المختلفة، وتلوث الأنسجة، وعوامل أخرى على كمية البروتين K اللازمة لعملية الهضم. في التجربة ، يجب تخزين البروتيناز K في المجموعة عند -20 درجة مئوية بعد الاستخدام ، وإلا فإن تعطيل البروتيناز K سيؤثر على عملية الاستخراج.
في الختام ، يجب إجراء استخراج الحمض النووي للدياتوم في أقرب وقت ممكن بعد أخذ العينات ومعالجة العينات ، وإلا يتم تخزينها في -20 درجة مئوية للحفظ. يجب أن تتم معالجة العينات وتخزينها وعملية الاستخراج بأكملها بعناية لمنع التلوث بالدياتومات الخارجية. خلاف ذلك ، لا يمكن تقييم أن الحمض النووي للدياتوم المستخرج كان في العينة أو التلوث الخارجي. عند استخدام البروتيناز K لهضم الأنسجة ، قد تكون جرعته مشكلة. هضم الأنسجة غير الكافي يمكن أن يزيد من كمية البروتيناز K. لذلك ، من المهم قص الأنسجة بشكل كاف. الهضم الكافي للأنسجة يمنع أيضا حطام الأنسجة من انسداد غشاء البلازما داخل عمود الامتزاز. بعد انسداد الغشاء ، لا يمكن استخدام طرف الماصة لالتقاط الانسداد أو أجهزة الطرد المركزي بشكل متكرر ، مما يؤدي إلى إتلاف الغشاء. يحتوي محلول الحمض النووي النهائي على العديد من الشوائب ، والتي ستؤثر على اكتشاف الحمض النووي للدياتوم. شدة التذبذب والوقت هي أيضا قضايا رئيسية. يتم التحكم في وقت تذبذب الدوامة الأول في 4-5 دقائق ، ويتم التحكم في تردد التذبذب عند 3000 دورة في الدقيقة ، وإلا فإن استخراج الحمض النووي سيتأثر. إذا كانت العصابات الكهربائية غير واضحة بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فقد يكون من الضروري زيادة كمية قالب الحمض النووي. الحمض النووي المستخرج في هذه الدراسة هو خليط من الحمض النووي ، بما في ذلك الحمض النووي للدياتوم والحمض النووي من الأنواع الأخرى ، لذلك لا يمكن تحديد تركيز الحمض النووي للدياتوم. لذلك ، فهي غير مناسبة للتطبيقات التي تتطلب نقاء عاليا لقوالب الحمض النووي.
أظهرت الدراسات أنه يمكن تضخيم أنواع الدياتوم المختلفة بواسطة مواد أولية مختلفة31,32. في هذه الدراسة ، تم استخدام البادئات الخاصة بالمشطورات D512 و D978 فقط على المشطورة 18S rDNA لاختبار ما إذا كان قد تم استخراج الحمض النووي للدياتوم بنجاح ، والذي لا يمكن أن يغطي جميع أنواع المشطورات 22,33. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن طول جزء منتج التضخيم لزوج البادئات هو 390-410 bp ، فإن الطريقة المحسنة تختار جميع أحجام شظايا الحمض النووي للدياتوم لاختبار ما إذا كان هناك تأثير على المعلمات التجريبية ، الأمر الذي يحتاج إلى مزيد من الدراسة. ستستخدم الدراسات اللاحقة أيضا مواد أولية من مناطق مختلفة وأطوال تضخيم مختلفة لاستكشاف تأثير الاستخراج.
بالمقارنة مع طريقة استخراج الحمض النووي للدياتوم التقليدية ، فإن هذه الطريقة لها المزايا الرئيسية لاستخراج الحمض النووي للدياتوم منخفض التكلفة وواسع النطاق. يمكن أن يكمل مزايا الأساليب المورفولوجية للدياتوم ويمكن أن يلبي احتياجات تشخيص الغرق في مختبرات الطب الشرعي الأولية. في الوقت نفسه ، فإنه يوسع أيضا نطاق اختيار مجموعات استخراج الحمض النووي للدياتوم ولديه احتمال تطبيق جيد. في المستقبل ، لن تقتصر هذه الطريقة على استخراج الحمض النووي للدياتوم فحسب ، بل ستستخدم لاستخراج الحمض النووي من الطحالب الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82060341،81560304) ومشروع البحث العلمي لمنصة الابتكار الأكاديمي في مقاطعة هاينان (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
