Summary
Este artigo descreve um protocolo para extração de DNA de diatomáceas usando um kit de extração de DNA comum modificado.
Abstract
O teste de diatomáceas é um meio auxiliar essencial na prática forense para determinar se o cadáver se afogou na água e inferir o local do afogamento. O teste de diatomáceas também é um importante conteúdo de pesquisa no campo do meio ambiente e do plâncton. A tecnologia de teste de biologia molecular de diatomáceas, que se concentra no DNA de diatomáceas como objeto de pesquisa primário, é um novo método de teste de diatomáceas. A extração de DNA de diatomáceas é a base do teste molecular de diatomáceas. Atualmente, os kits comumente usados para extração de DNA de diatomáceas são caros, o que aumenta o custo de realização de pesquisas relacionadas. Nosso laboratório melhorou o kit geral de extração rápida de DNA genômico de sangue total e obteve um efeito satisfatório de extração de DNA de diatomáceas, fornecendo assim uma solução alternativa econômica e acessível de extração de DNA baseada em esferas de vidro para pesquisas relacionadas. O DNA da diatomácea extraído usando este protocolo poderia satisfazer muitas aplicações a jusante, tais como PCR e sequenciamento.
Introduction
Na prática forense, determinar se um cadáver encontrado na água se afogou ou foi jogado na água após a morte é essencial para a resolução adequada do caso1. É também uma das questões difíceis que precisam ser resolvidas urgentemente na prática forense2. Diatomáceas são abundantes no ambiente natural (especialmente na água)3,4. No processo de afogamento, devido à hipóxia e resposta ao estresse, as pessoas terão movimentos respiratórios intensos e inalarão uma grande quantidade de líquido de afogamento. Assim, as diatomáceas presentes na água entram no pulmão com o líquido de afogamento, e algumas diatomáceas podem entrar na circulação sanguínea pela barreira alvéolo-capilar e se espalhar para órgãos internos com o fluxo sanguíneo 5,6. A detecção de diatomáceas em tecidos internos e órgãos como pulmão, fígado e medula óssea é uma forte evidência de afogamento antes da morte 7,8. Atualmente, o teste forense de diatomáceas baseia-se principalmente em métodos de testes morfológicos. Após uma série de pré-digestão do tecido, as estimativas qualitativas e quantitativas morfológicas das diatomáceas não digeridas são realizadas ao microscópio. Durante este período, é necessário utilizar reagentes perigosos e prejudiciais ao ambiente, como o ácido nítrico. Esse processo é demorado e exige dos pesquisadores sólidos conhecimentos taxonômicos e ampla experiência. Tudo isso traz alguns desafios para a equipe forense9. A tecnologia de teste de DNA de diatomáceas é uma nova tecnologia para testes de diatomáceas desenvolvida nos últimos anos 10,11,12. Esta tecnologia realiza a identificação de espécies de diatomáceas através da análise da composição de sequências específicas de DNA de diatomáceas13,14. A tecnologia de PCR e a tecnologia de sequenciamento são métodos técnicos comumente usados, mas sua base é a extração bem-sucedida de DNA de diatomáceas. No entanto, as diatomáceas têm uma estrutura especial diferente de outros organismos, tornando suas técnicas de extração de DNA também diferentes.
A parede celular das diatomáceas apresenta alto grau de silicificação, e seu principal componente é o dióxido de silício 15,16,17. A parede celular siliciosa é muito dura, e deve ser destruída antes de extrair o DNA. Kits comuns de extração de DNA são muitas vezes difíceis de usar diretamente para a extração de DNA de diatomáceas, porque não podem destruir a casca siliciosa das diatomáceas18. Portanto, destruir a casca siliciosa das diatomáceas é um dos principais problemas técnicos a serem resolvidos na extração do DNA das diatomáceas.
Ao mesmo tempo, como o número de diatomáceas contidas em amostras de pesquisa forense, sejam amostras de água ou órgãos e tecidos de corpos afogados, é muitas vezes limitado, é necessário enriquecer diatomáceas. A essência do enriquecimento é a separação das substâncias. Ao tentar reunir diatomáceas, minimize o conteúdo de outros componentes do material (componentes interferentes). Em trabalhos forenses, os laboratórios frequentemente usam métodos de centrifugação ou enriquecimento por filtração de membrana para separar as células das diatomáceas19. No entanto, como o equipamento de bombeamento a vácuo não é amplamente utilizado, o método de enriquecimento de membrana não é frequentemente usado em laboratórios forenses primários comuns. Assim, o método de centrifugação ainda é comumente enriquecido por diatomáceas em laboratóriosforenses 20.
A extração de DNA de diatomáceas é atualmente usada principalmente na prática forense, e há limitações significativas para sua aplicação. Atualmente, existem poucos kits de extração de DNA de diatomáceas utilizados em ciências forenses no mercado e geralmente são caros21. Este artigo fornece um método melhorado de extração de DNA de diatomáceas, tornando a extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômica. Isso aumenta a aplicação de testes subsequentes de biologia molecular de diatomáceas e pode resolver melhor problemas relacionados ao afogamento em medicina legal por meio de testes de diatomáceas. Este método quebra as paredes celulares siliciosas das diatomáceas adicionando contas de vidro e definindo um momento apropriado para o vórtice. Desta forma, a proteinase K e a solução de ligação lisam rapidamente as células e inativam várias enzimas nas células. O DNA genômico é absorvido na membrana da matriz na coluna de adsorção e finalmente eluído pelo tampão de eluição. Esse kit de extração de genes de sangue total melhorado melhora o efeito de extração de DNA de diatomáceas do kit de sangue em materiais de exame forense, reduz o custo da extração de DNA de diatomáceas na prática forense e pode ser melhor aplicado à pesquisa forense de base.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Hainan Medical University. As amostras de tecido utilizadas neste estudo não são consideradas estudos envolvendo seres humanos. Esses espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico patológico forense, e o restante foi usado para a extração de DNA de diatomáceas neste experimento. Os pesquisadores não podem identificar prontamente os indivíduos para obter o consentimento informado das partes interessadas relevantes.
OBS: Para garantir a aplicabilidade geral do método de pesquisa relatado neste experimento, este experimento seguiu basicamente as instruções de operação do kit utilizado, sendo que apenas algumas etapas foram modificadas. As amostras de água utilizadas neste experimento foram retiradas aleatoriamente de lagoas próximas ao laboratório (Figura 1A Suplementar). Neste experimento, o tecido pulmonar do corpo afogado foi confirmado como tecido de pesquisa para demonstrar o protocolo de extração (Figura 1B Suplementar). Na prática forense, às vezes também é necessário usar outros órgãos e tecidos de corpos afogados (como fígado, baço, rim, medula óssea, etc.) para extrair o DNA das diatomáceas, o que requer pequenas melhorias correspondentes a este método experimental, que serão explicadas na seção correspondente do experimento. As amostras de tecido pulmonar utilizadas neste experimento foram provenientes de cadáveres claramente afogados em casos forenses. Testes morfológicos têm sido realizados para comprovar que o tecido pulmonar contém diatomáceas (Figura 2 Suplementar).
1. Pré-tratamento das amostras
- Pré-tratamento de amostras de água
- Levar 10 mL de amostra de água para o tubo da centrífuga e centrifugar a 13.400 x g por 5 min. Descarte cuidadosamente 9,8 mL de sobrenadante com uma pistola de pipeta e transfira cerca de 200 μL de amostra de água de diatomácea enriquecida restante no fundo para um tubo de centrífuga de 2 mL.
NOTA: O pré-experimento pode ser realizado primeiro, e a quantidade inicial pode ser aumentada se uma amostra de água de 10 mL não for suficiente para o enriquecimento.
- Levar 10 mL de amostra de água para o tubo da centrífuga e centrifugar a 13.400 x g por 5 min. Descarte cuidadosamente 9,8 mL de sobrenadante com uma pistola de pipeta e transfira cerca de 200 μL de amostra de água de diatomácea enriquecida restante no fundo para um tubo de centrífuga de 2 mL.
- Pré-tratamento de amostras de tecido
- Tome 0,5 g do tecido da margem pulmonar do corpo afogado, pique totalmente ou triture o tecido pulmonar até que fique lamacento. Prevenir a contaminação de diatomáceas exógenas é o cerne desta etapa. Corte o tecido em pedaços repetidamente usando uma tesoura.
2. Extração de DNA
NOTA: Todas as etapas de centrifugação são concluídas à temperatura ambiente. Usando uma centrífuga de mesa com uma força centrífuga de 14.500 x g; um banho-maria (ou banho metálico) pré-aquecido a 70 °C precisa ser preparado antes do início do experimento. Todas as etapas devem seguir rigorosamente os princípios de operação asséptica.
- Montagem de amostras de água e tecidos
NOTA: A amostra de água e o método de extração de DNA de diatomáceas de tecido são os mesmos.- Adicionar esferas de vidro a um tubo de centrifugação de 2 mL contendo a amostra de água pré-tratada. Inverta 10x-15x para misturar bem. As contas de vidro adicionadas são compostas de contas de vidro grandes e pequenas misturadas em uma proporção de massa de 1:1. O diâmetro das contas de vidro grandes é de 1,5-2,0 mm e das contas de vidro pequenas é de 0,4-0,6 mm.
- Tome 0,5 g de tecido finamente picado, adicione contas de vidro a um tubo de centrífuga de 2 mL contendo o tecido, conforme descrito acima. Inverta 10x-15x para misturar.
- Adicionar 40 μL de proteinase K (20 mg/mL) aos tubos. Coloque em temperatura ambiente por 15 min, durante esse período, inverta e misture 10x a cada 3 min.
NOTA: Se o tecido não for totalmente digerido, a quantidade de proteinase K pode ser adequadamente aumentada até que a solução se torne clara. - Adicionar 200 μL de tampão de ligação aos tubos da centrífuga, imediatamente vórtice, e misturar durante 4 min (frequência de mistura de oscilação: 3000 rpm).
NOTA: Nesta etapa, a intensidade e o tempo de agitação devem ser rigorosamente controlados para garantir intensidade e tempo de mistura suficientes. - Coloque os tubos de centrifugação em banho-maria a 70 °C por 10 minutos e a solução fica límpida.
- Adicionar 100 μL de isopropanol aos tubos da centrífuga, vórtice e misturar por 15 s, precipitação floculenta pode aparecer neste momento.
NOTA: É muito importante misturar bem com a força adequada nas etapas de operação acima, mas o tremor vigoroso deve ser evitado para evitar o cisalhamento do DNA. - Colocar a solução obtida na etapa anterior juntamente com o precipitado floculante na coluna de adsorção (a coluna de adsorção é colocada no tubo de coleta). O comprimento da coluna de adsorção é de 3,0 cm, o diâmetro é de 1,0 cm e a matriz de adsorção é a membrana da matriz de silício.
- Centrifugar a 8.000 x g por 30 s, descartar o líquido residual no tubo de coleta e colocar a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta.
- Adicionar 500 μL de tampão de remoção do inibidor à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.
- Adicionar 700 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.
NOTA: Adicione a quantidade especificada de etanol absoluto ao frasco tampão de lavagem antes da primeira utilização. - Adicionar 500 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.
- Coloque a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta vazio. Centrifugar a 14.500 x g por 2 min e remover o tampão de lavagem o máximo possível, para evitar que o etanol residual no tampão de lavagem iniba as reações a jusante.
- Retire a coluna de adsorção e coloque-a em um tubo de centrífuga limpo. Adicionar 100 μL de tampão de eluição à parte média da membrana de adsorção.
- Colocar a coluna de adsorção à temperatura ambiente durante 3-5 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 minuto.
- Adicionar novamente a solução obtida na etapa anterior à coluna de adsorção centrífuga. Colocar a coluna de adsorção centrífuga à temperatura ambiente durante 2 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 min.
NOTA: O tampão de eluição deve ser pré-aquecido em banho-maria a 70 °C durante cerca de 10 minutos. O volume de eluição não deve ser inferior a 50 μL; caso contrário, o rendimento de DNA será reduzido. - Armazenar o DNA da diatomácea extraído a 2-8 °C para uso futuro. Se a solução de ADN for conservada durante muito tempo, armazene-a a -20 °C.
3. Teste PCR
NOTA: Como o conteúdo de diatomáceas em amostras forenses é frequentemente baixo, os extratos de amostras de tecido dos corpos afogados também podem conter diferentes graus de tecido e órgãos (como os pulmões neste experimento) com seu próprio DNA. Portanto, a detecção direta de DNA total em extratos de DNA não reflete a situação da extração de DNA de diatomáceas. Neste experimento, primers diatomáceas específicos foram selecionados, e produtos de PCR foram usados para avaliar a extração de DNA de diatomáceas no extrato. Os produtos podem ser observados e analisados por eletroforese em gel de agarose e também podem ser analisados por curva quantitativa de fusão por PCR fluorescente em tempo real, que apresenta maior sensibilidade.
- Adicione 2 μL do DNA extraído de amostras de água e tecidos como modelo. Escolha um dos dois métodos a seguir para inspeção.
- Teste PCR convencional
- Use primers22 que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S. Para obter detalhes, consulte a Tabela 1.
- Estabelecer o sistema de reação de PCR e as condições de amplificação de acordo com as características dos primers. Para obter detalhes, consulte a Tabela 2.
- Executar os produtos de amplificação de PCR em gel de agarose a 2%. Observe e analise as imagens com um imageador em gel.
- Teste de PCR quantitativo fluorescente
- Use os primers acima que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA de diatomácea 18S para preparar um sistema de reação quantitativa de PCR fluorescente em tempo real. Para obter detalhes, consulte a Tabela 3.
- Realizar a amplificação por PCR e analisar a curva de amplificação obtida e os valores de Ct. Ao mesmo tempo, defina um programa, derreta as fitas duplas dos produtos amplificados em fitas simples gradualmente através da tecnologia de curva de fusão quantitativa fluorescente por PCR e, em seguida, analise as curvas de fusão obtidas.
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Representative Results
Uma vez que a solução de DNA extraída pelo método de extração de DNA atualmente utilizado contém todos os componentes de DNA de diferentes fontes na amostra, o DNA obtido por este protocolo não foi exceção. Assim, a solução de DNA não era apenas uma solução de DNA genômico de diatomáceas. Os primers capazes de amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S foram selecionados por meio de consulta à literatura22,23,24. Os primers foram verificados pelo NCBI-Blast Primer, e os resultados mostraram que o primer forward D512 e o primer reverse D978 do 18S rDNA foram primers algae-specific e cobriram muitas espécies de diatomáceas. Os resultados da amplificação não mostraram genes humanos. Foi utilizado um biomarcador de DNA confiável para testes de diatomáceas, por isso foram selecionados para verificação dos resultados deste experimento. Usando o DNA extraído como molde para amplificação por PCR específico para diatomáceas, o produto de amplificação por eletroforese em gel de agarose mostrou que amostras de água e tecidos tinham bandas de DNA de diatomáceas, essas bandas de eletroforese estavam entre 250-500 pb (mais próximas de 500 pb), de acordo com o tamanho do produto de amplificação alvo do primer (390 -410 pb). Isso mostrou que o protocolo de extração foi bem sucedido na extração de DNA de diatomáceas (Figura 1A,B).
A tecnologia de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real é um tipo de tecnologia de teste genético com especificidade rigorosa e alta sensibilidade. Ao adicionar grupos fluorescentes no sistema de reação de PCR, o acúmulo de sinais fluorescentes pode fazer com que todo o processo de PCR seja monitorado em tempo real, e a sensibilidade é alta25,26. Produtos especificamente amplificados pela PCR convencional às vezes podem ser difíceis de observar na eletroforese em gel de agarose devido ao baixo conteúdo e outras razões27 (Figura 1C). Através da amplificação específica da PCR quantitativa fluorescente em tempo real, obteve-se uma curva de amplificação típica com quatro estágios característicos (Figura 2). Ao mesmo tempo, através da tecnologia de curva de fusão quantitativa fluorescente por PCR em tempo real, as fitas duplas de DNA do produto amplificado foram fundidas em fitas simples em alta temperatura, o corante foi liberado das fitas duplas e o valor de fluorescência diminuiu. Detectando-se a mudança no valor de fluorescência, obteve-se a curva de fusão (Figura 3). As curvas de fusão obtidas apresentaram picos característicos, e o valor de pico foi em torno de 85,5 °C, o que comprovou que houve amplificação específica do DNA alvo, indicando que havia DNA de diatomáceas na solução de DNA extraída. O corante também poderia ser adicionado diretamente ao produto de amplificação de PCR convencional, e a curva de fusão poderia ser obtida pela tecnologia de curva de fusão quantitativa de PCR por fluorescência em tempo real para provar se havia amplificação específica. Portanto, quando a eletroforese convencional em gel de PCR-agarose não pôde provar se havia DNA de diatomácea na solução de DNA extraída, a tecnologia de PCR quantitativa fluorescente em tempo real com maior sensibilidade pôde ser selecionada para verificação e avaliação. Neste experimento, a tecnologia de curva de fusão quantitativa fluorescente por PCR em tempo real foi usada apenas para análise qualitativa.
Como mostrado em um relatório anterior21, o kit tradicional de extração de DNA do solo e o kit de extração de DNA de sangue modificado foram basicamente os mesmos para a extração de DNA de diatomáceas de amostras de água e tecidos. A diferença de custo da extração de DNA de diatomáceas foi principalmente a diferença de preço dos dois kits, e o custo de outros consumíveis foi basicamente o mesmo. Neste estudo, um simples aprimoramento do kit de extração de DNA sanguíneo comumente utilizado em experimentos de biologia molecular poderia obter melhores resultados experimentais, o que não só aumentou o escopo para os pesquisadores selecionarem o kit teste em atividades de pesquisa relacionadas à extração de DNA de diatomáceas, mas também reduziu o custo dos testes.
O processo de aprimoramento desse protocolo foi publicado21. Ao projetar a combinação de diferentes proporções de massa de contas de vidro e tempo de oscilação de vórtices, as condições ótimas de extração de DNA da oscilação de esferas de vidro foram adicionadas ao kit convencional, portanto, o método poderia melhorar o efeito de extração de DNA de diatomáceas em amostras forenses, especialmente em amostras de tecido. A combinação ótima de extração de DNA foi obtida quando a frequência oscilante do vórtice foi de 3000 rpm; O tempo de oscilação do vórtice foi de 4 min, a relação de massa de grandes esferas de vidro com diâmetro de 1,5-2,0 mm e pequenas esferas de vidro com diâmetro de 0,4-0,6 mm foi de 1:1. Foi realizada uma comparação entre o método convencional do kit e o método aprimorado. Demonstrou-se que o kit utilizado poderia suprir as necessidades de amplificação do DNA das diatomáceas, sendo que o brilho das bandas eletroforéticas após a amplificação realizada pelo método melhorado em amostras de água foi semelhante ao brilho do método convencional, e as bandas eletroforéticas após a amplificação realizada pelo método aprimorado em amostras de tecido foram mais brilhantes (Figura 4).
Figura 1: Resultados da eletroforese do DNA extraído utilizando o protocolo após amplificação por PCR. Um total de 2 μL de extrato de DNA foi usado como molde de DNA para amplificação específica por PCR. Os produtos de amplificação da PCR foram eletroforesados, em solução tampão TAE 1x, em gel de agarose a 2%, e operados a uma tensão constante de 100V por 25-30 min. Uma escada de DNA D2000 foi usada para todos os géis. (A) Os resultados da eletroforese do DNA das diatomáceas em amostras de água após amplificação por PCR, faixa 1 é controle em branco; As pistas 2-7 são amostras de água de diferentes locais na mesma área. (B) Os resultados da eletroforese após amplificação por PCR do DNA das diatomáceas no tecido. As faixas 1-6 são os tecidos excisados de diferentes posições de um mesmo tecido pulmonar; A faixa 7 é o controle em branco. (C) Em um experimento malsucedido, após a amplificação do DNA das diatomáceas, os resultados da eletroforese não mostraram bandas de eletroforese nas posições correspondentes, indicando que não havia produtos de amplificação ou poucos produtos de amplificação. Neste momento, os resultados da eletroforese não puderam indicar se havia DNA de diatomácea na solução de DNA proposta, que precisava ser realizada por métodos mais sensíveis (como uma curva de fusão por PCR). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva de amplificação da qPCR do DNA da diatomácea. Um total de 2 μL de extrato de solução de DNA que não apresentou bandas por PCR convencional e eletroforese em gel de agarose foi usado como molde para preparar um sistema de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real e montar um programa. Finalmente, foram obtidas curvas de amplificação típicas com quatro estágios característicos de fase basal linear, início de fase exponencial, fase exponencial e fase de platô. O valor de Ct de cada curva também foi obtido através da análise, indicando que a extração de DNA foi bem sucedida. Cada número representa o valor Ct da curva correspondente. O limite é de 5,2. A unidade do eixo y é Rn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curva de fusão do DNA da diatomácea. Usando um sistema de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real, um programa foi definido onde a temperatura sobe de 60-95 °C. Isso gerou uma curva de fusão e o DNA de fita dupla especificamente amplificado derreteu em fitas simples em altas temperaturas, o corante ficou livre das fitas duplas e o valor de fluorescência diminuiu até ficar 0. O gráfico foi obtido tomando-se a recíproca negativa do gráfico original. A abscissa representou a temperatura, a abscissa correspondente ao maior valor de pico foi o valor de Tm e o valor de Tm da curva de fusão no gráfico foi de 85,5 °C. A numeração de cada curva corresponde à numeração de cada faixa na Figura 1C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados da eletroforese do processo melhorado. (A) Resultados da eletroforese para diferentes combinações de razões de esferas de vidro e tempos de oscilação de vórtices. Faixas 1, 4, 7, 10 e 13 onde a relação de massa mista de contas de vidro grandes e pequenas é de 1:2, faixas 2, 5, 8, 11 e 14 onde a relação de massa mista de contas de vidro grandes e pequenas é de 1:1, pistas 3, 6, 9, 12 e 15 onde a relação de massa mista de contas de vidro grandes e pequenas é de 2:1, e os tempos de oscilação foram de 2 min para as faixas 1-3, 3 min para as faixas 4-6, 4 min para as faixas 7-9, 5 min para as faixas 10-12 e 6 min para as faixas 13-15. A faixa 16 é o controle em branco. (B) Resultados da eletroforese após amplificação por PCR dos produtos de extração do kit antes e após a melhoria. As faixas 1-3 são métodos convencionais para extrair amostras de água, as pistas 4-6 são métodos melhorados para extrair amostras de água, as pistas 7-9 são métodos convencionais para extrair tecidos, as pistas 10-12 são métodos melhorados para extrair tecidos, a faixa 13 é um controle em branco. Os resultados foram modificados de21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Amostras de água e amostras de tecido. As amostras de água utilizadas foram retiradas de uma lagoa próxima ao laboratório, e as amostras de tecido utilizadas foram confirmadas como tecido pulmonar do corpo afogado. (A) O local de coleta da amostra de água experimental foi uma lagoa próxima ao laboratório. (B) Amostras de água enriquecida e amostras de tecido pulmonar triturado. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Micrografia da diatomácea. As imagens (A) e (B) foram realizadas em microscópio óptico de 400x. A seta aponta para diatomáceas. As imagens (C) e (D) foram obtidas em microscópio eletrônico. As imagens (A) e (B) mostram as diatomáceas na água no local do afogamento. As diatomáceas denominadas Fragilaria e Navicula. As imagens (C) e (D) mostram diatomáceas nos pulmões, que são chamadas de Nitzschia e Navicula. Clique aqui para baixar este arquivo.
| Alvo | Nome da cartilha | Seqüenciar |
| 18S rDNA | primer forword D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| primer reverso D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabela 1: Lista dos primers utilizados. Esta tabela descreve as sequências, nomes e regiões de destino de primers específicos usados neste artigo.
| Sistema de reação de PCR | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| primer forword D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| primer reverso D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| DNA do modelo | 2 μL | ||
| Água livre de nucleases | até 20 μL | ||
| Nota: O DNA do modelo de controle em branco é substituído pela mesma quantidade de água livre de nuclease. | |||
| Programa de PCR | |||
| temperatura | Hora | Ciclos | |
| 94 °C | 10 minutos | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 10 minutos | 1 | |
Tabela 2: Componentes da PCR. Esta tabela descreve a configuração do sistema de reação para PCR convencional e as configurações de temperatura, tempo e número de ciclos de reação para PCR. O volume total do sistema reacional utilizado foi de 20 μL.
| Sistema de reação de PCR quantitativo em tempo real | |||
| 2x qPCR mistura | 10 μL | ||
| primer forword D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| primer reverso D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| DNA do modelo | 2 μL | ||
| Água livre de nucleases | até 20 μL | ||
| Nota: O DNA do modelo de controle em branco é substituído pela mesma quantidade de água livre de nuclease. | |||
| Programa de PCR quantitativo em tempo real | |||
| temperatura | Hora | Ciclos | |
| 94 °C | 10 minutos | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min | ||
Tabela 3: Componentes quantitativos da PCR em tempo real. Esta tabela descreve a configuração do sistema de reação para PCR quantitativo em tempo real e as configurações de temperatura, tempo e número de ciclos de reação para PCR. O volume total do sistema reacional utilizado foi de 20 μL.
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Discussion
As células das diatomáceas são protegidas por paredes celulares siliciosas duras17, e essa estrutura deve ser destruída para extrair o DNA das diatomáceas. Os kits comuns não destroem facilmente a casca siliciosa das diatomáceas; portanto, é difícil extrair com sucesso o DNA das diatomáceas21. Nosso laboratório aprimorou o kit de extração de DNA sanguíneo mais comumente usado, adicionando esferas de vidro de diferentes diâmetros e diferentes proporções de massa no processo de extração de diatomáceas. A oscilação do vórtice é realizada ao mesmo tempo, o que pode quebrar totalmente a casca da diatomácea e melhorar o efeito de extração de DNA da diatomácea. Como mostrado no relatório anterior21, o diâmetro das esferas de vidro, a intensidade da oscilação e o tempo afetariam diretamente a qualidade da extração de DNA. O tempo de oscilação do vórtice não deve ser muito longo (não mais do que 10 min). Se o tempo for muito longo, o DNA quebrará devido à vibração excessiva. Ao mesmo tempo, o tempo não deve ser muito curto. Se o tempo for muito curto (não menos de 2 min), a casca da diatomácea não será completamente removida, o que tornará a extração de DNA ineficiente. Ao selecionar contas de vidro escolha contas com diâmetros circunferenciais diferentes, as contas de vidro grandes garantem a força de colisão, e as pequenas contas de vidro garantem que não haja colisão morta entre as contas de vidro durante o processo de fragmentação de colisão, o que melhora a eficiência da quebra da casca.
Para extrair DNA de diatomáceas de amostras, geralmente é necessário enriquecer diatomáceas. Este processo terá um grande impacto na extração do DNA das diatomáceas. O objetivo do enriquecimento é aumentar a concentração de diatomáceas nas amostras para que a concentração de DNA de diatomáceas extraídas possa estar na faixa detectável; para as aplicações da próxima etapa, como PCR quantitativo fluorescente em tempo real e sequenciamento de alto rendimento.
Como as diatomáceas são amplamente distribuídas na natureza4, a prevenção da contaminação laboratorial é uma prioridademáxima 28. A contaminação durante o processo de extração de DNA levará a desvios dos resultados reais e perda de valor de uso. Portanto, sempre preste atenção ao princípio de operação asséptica ao extrair o DNA das diatomáceas e tome todas as medidas possíveis para reduzir e evitar a contaminação das diatomáceas exógenas. Quando o tecido é extraído do corpo morto, medidas devem ser tomadas para evitar que ele seja contaminado por diatomáceas exógenas. Depois que o tecido é extraído, ele deve ser armazenado em um recipiente ou saco de amostra livre de contaminação por diatomáceas. O tecido não deve ser tratado com formaldeído. O equipamento para extração e processamento de tecidos deve ser lavado 2-3 vezes com água destilada repetidamente e, em seguida, esterilizado por luz ultravioleta ou alta temperatura para garantir que não haja contaminação de diatomáceas de outras fontes. O tecido antes do teste deve ser cortado do tecido superficial com um instrumento livre de diatomáceas e, em seguida, o instrumento deve ser substituído para selecionar o tecido inferior para exame. Ao mesmo tempo, padronizar o processo de operação também pode efetivamente evitar o problema de contaminação laboratorial.
Como as diatomáceas são o alimento de muitos organismos aquáticos, elas serão perdidas durante o armazenamento a longo prazo29. Diatomáceas também podem crescer e se reproduzir sob condições de luz. Portanto, a etapa de extração de DNA deve ser iniciada o mais rápido possível após a amostragem e o processamento rápido da amostra deve ser feito para evitar a perda de diatomáceas na amostra. Se a extração de DNA não puder ser realizada imediatamente, todas as amostras devem ser congeladas e mantidas no escuro para evitar ao máximo a redução das diatomáceas.
Nossa pesquisa selecionou um kit comum e barato de extração de DNA sanguíneo baseado no método de digestão de proteinase K, que foi aprimorado para extrair DNA de diatomáceas de amostras de água e tecidos com bons resultados30. O tecido é suficientemente cortado para estar em pleno contato com a proteinase K e o tecido é totalmente digerido. O princípio possível de extração bem-sucedida é o seguinte: durante a etapa de agitação, a casca dura da diatomácea é repetidamente impactada e fragmentada entre esferas de vidro em movimento rápido, expondo a membrana celular; a configuração de contas de vidro de diferentes tamanhos pode preencher a lacuna entre a colisão de contas de vidro de tamanho único, de modo a cobrir a superfície de contato de colisão o mais completamente possível; depois de perder a casca de silício, a proteinase K ajuda a liberar DNA da diatomácea. Em comparação com o kit de extração de DNA de solo usado atualmente, o kit de extração de DNA de sangue aprimorado pode atender aos requisitos de extração de DNA de diatomáceas, que é mais econômico e fácil de obter. Ele não só facilita o uso da inspeção forense de diatomáceas, mas é adequado para aplicação em outras disciplinas relacionadas à pesquisa de diatomáceas e também pode ser usado para outras extrações de DNA de plâncton. Ao extrair DNA de diatomáceas de amostras de água, a quantidade de proteinase K usada precisa ser ajustada de acordo com o número de plâncton na água. A quantidade de proteinase K pode ser aumentada ou diminuída com base em experimentos preliminares. Ao extrair o DNA das diatomáceas dos tecidos, diferentes tipos de tecidos de órgãos, contaminação tecidual e outros fatores afetarão a quantidade de proteinase K necessária para a digestão. No experimento, a proteinase K do kit deve ser armazenada a -20 °C após o uso, caso contrário, a inativação da proteinase K afetará o processo de extração.
Em conclusão, a extração de DNA de diatomáceas deve ser realizada o mais rápido possível após a amostragem e processamento da amostra, caso contrário, armazenada a -20 °C para preservação. O manuseio da amostra, o armazenamento e todo o processo de extração devem ser feitos com cuidado para evitar a contaminação por diatomáceas exógenas. Caso contrário, não se pode avaliar se o DNA da diatomácea extraído estava na amostra ou contaminação exógena. Ao usar proteinase K para digerir tecido, sua dosagem pode ser um problema. A digestão insuficiente dos tecidos pode aumentar a quantidade de proteinase K. Portanto, é importante cisalhar o tecido adequadamente. A digestão suficiente do tecido também impede que os detritos do tecido obstruam a membrana plasmática dentro da coluna de adsorção. Depois que a membrana é bloqueada, não é possível usar a ponta da pipeta para escolher o bloqueio ou centrifugar repetidamente, o que danificará a membrana. A solução final de DNA contém muitas impurezas, o que afetará a detecção de DNA de diatomáceas. A intensidade da oscilação e o tempo também são questões fundamentais. O primeiro tempo de oscilação do vórtice é controlado em 4-5 min, e a frequência de oscilação é controlada em 3000 rpm, caso contrário, a extração de DNA será afetada. Se as bandas eletroforéticas não estiverem claras após a PCR, pode ser necessário aumentar ainda mais a quantidade de molde de DNA. O DNA extraído neste estudo é uma mistura de DNA, incluindo DNA de diatomáceas e DNA de outras espécies, de modo que a concentração de DNA de diatomáceas não pode ser determinada. Portanto, não é adequado para aplicações que exigem alta pureza de modelos de DNA.
Estudos têm demonstrado que diferentes espécies de diatomáceas podem ser amplificadas por diferentes primers31,32. Neste estudo, apenas os primers diatomáceas específicos D512 e D978 no rDNA da diatomácea 18S foram usados para testar se o DNA da diatomácea foi extraído com sucesso, o que não pôde cobrir todas as espécies de diatomáceas22,33. Além disso, como o comprimento do fragmento do produto de amplificação do par de primers é de 390-410 pb, o método aprimorado seleciona todos os tamanhos de fragmentos de DNA de diatomáceas para testar se há impacto nos parâmetros experimentais, o que precisa de mais estudos. Estudos subsequentes também utilizarão primers de diferentes regiões e diferentes comprimentos de amplificação para explorar o efeito da extração.
Comparado com o método tradicional de extração de DNA de diatomáceas, este método tem as principais vantagens da extração de DNA de diatomáceas de baixo custo e em larga escala. Pode complementar as vantagens dos métodos morfológicos de diatomáceas e pode atender às necessidades de diagnóstico de afogamento em laboratórios forenses primários. Ao mesmo tempo, também expande a gama de seleção de kits de extração de DNA de diatomáceas e tem uma boa perspectiva de aplicação. No futuro, este método não se limitará apenas à extração de DNA de diatomáceas, mas será usado para a extração de DNA de outras algas.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82060341,81560304) e pelo Projeto de Pesquisa Científica da Plataforma de Inovação Acadêmica da Província de Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
