Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for diatom DNA ekstraksjon ved hjelp av en modifisert felles DNA ekstraksjon kit.
Abstract
Diatometesting er et viktig hjelpemiddel i rettsmedisinsk praksis for å avgjøre om liket druknet i vann og å utlede drukningsstedet. Diatometesting er også et viktig forskningsinnhold innen miljø og plankton. Diatom molekylærbiologi testteknologi, som fokuserer på diatom DNA som det primære forskningsobjektet, er en ny metode for diatometesting. Diatom DNA ekstraksjon er grunnlaget for diatom molekylær testing. For tiden er settene som vanligvis brukes til diatom-DNA-ekstraksjon dyre, noe som øker kostnadene ved å utføre relatert forskning. Vårt laboratorium forbedret det generelle fullblodgenomiske DNA-hurtigekstraksjonssettet og oppnådde en tilfredsstillende diatom-DNA-ekstraksjonseffekt, og ga dermed en alternativ økonomisk og rimelig DNA-ekstraksjonsløsning basert på glassperler for relatert forskning. Diatom-DNA ekstrahert ved hjelp av denne protokollen kan tilfredsstille mange nedstrøms applikasjoner, for eksempel PCR og sekvensering.
Introduction
I rettsmedisinsk praksis er det avgjørende å avgjøre om et lik funnet i vannet druknet eller ble kastet i vannet etter døden for en forsvarlig løsning av saken1. Det er også et av de vanskelige spørsmålene som må løses raskt i rettsmedisinsk praksis2. Kiselalger er rikelig i det naturlige miljøet (spesielt i vann)3,4. I drukningsprosessen, på grunn av hypoksi og stressrespons, vil folk ha intense pustebevegelser og inhalere en stor mengde drukningsvæske. Derfor kommer diatomene i vannet inn i lungen med drukningsvæsken, og noen diatomer kan komme inn i blodsirkulasjonen gjennom alveolar-kapillærbarrieren og spre seg til indre organer med blodstrømmen 5,6. Påvisning av kiselalger i indre vev og organer som lunge, lever og benmarg er et sterkt bevis på drukning før døden 7,8. For tiden er rettsmedisinsk diatometesting hovedsakelig basert på morfologiske testmetoder. Etter en rekke forfordøyelse av vevet utføres de morfologiske kvalitative og kvantitative estimatene av ufordøyd diatomer under mikroskopet. I løpet av denne perioden må farlige og miljøvennlige reagenser som salpetersyre brukes. Denne prosessen er tidkrevende og krever at forskerne har solid taksonomisk kompetanse og lang erfaring. Alt dette gir kriminalteknikernevisse utfordringer 9. Diatom DNA testing teknologi er en ny teknologi for diatom testing utviklet de siste årene 10,11,12. Denne teknologien realiserer artsidentifikasjon av diatomer ved å analysere den spesifikke DNA-sekvenssammensetningen av kiselalger13,14. PCR-teknologi og sekvenseringsteknologi er ofte brukte tekniske metoder, men deres grunnlag er vellykket ekstraksjon av DNA fra kiselalger. Imidlertid har diatomer en spesiell struktur forskjellig fra andre organismer, noe som gjør deres DNA-ekstraksjonsteknikker også forskjellige.
Celleveggen av diatom har en høy grad av silikifisering, og hovedkomponenten er silisiumdioksyd 15,16,17. Den kiselholdige celleveggen er veldig hard, og den må ødelegges før du trekker ut DNA. Vanlige DNA-ekstraksjonssett er ofte vanskelige å bruke direkte for ekstraksjon av diatom-DNA fordi de ikke kan ødelegge kiselskallet av kiselalger18. Derfor er ødeleggelse av kiselskall av kiselalger et av de viktigste tekniske problemene som skal løses ved ekstrahering av diatome-DNA.
Samtidig, siden antall diatomer inneholdt i rettsmedisinske undersøkelsesprøver, enten vannprøver eller organer og vev av druknede kropper, ofte er begrenset, er det nødvendig å berike diatomer. Essensen av anrikning er separasjon av stoffer. Mens du prøver å samle diatomer sammen, minimer innholdet av andre materielle komponenter (forstyrrende komponenter). I rettsmedisinsk arbeid bruker laboratorier ofte sentrifugering eller membranfiltreringsberikelsesmetoder for å skille diatomceller19. Siden vakuumpumpeutstyr ikke er mye brukt, brukes membrananrikningsmetoden imidlertid ikke ofte i vanlige primære rettsmedisinske laboratorier. Så sentrifugeringsmetoden er fortsatt vanlig diatomeberikelse i rettsmedisinske laboratorier20.
DNA-ekstraksjon fra kiselalger brukes for tiden primært i rettsmedisinsk praksis, og det er betydelige begrensninger i anvendelsen. For tiden er det få diatom DNA-ekstraksjonssett som brukes i rettsmedisinske vitenskap på markedet, og de er generelt dyre21. Denne artikkelen gir en forbedret diatom DNA-ekstraksjonsmetode, noe som gjør diatom DNA-ekstraksjon enkel, praktisk og kostnadseffektiv. Dette øker anvendelsen av senere molekylærbiologisk testing av kiselalger og kan bedre løse problemer knyttet til drukning i rettsmedisin gjennom diatometesting. Denne metoden bryter kiselcelleveggene til diatomer ved å legge til glassperler og sette en passende tid for hvirvel. På denne måten lyser proteinase K og bindingsløsningen raskt cellene og inaktiverer forskjellige enzymer i cellene. Det genomiske DNA absorberes i matriksmembranen i adsorpsjonskolonnen og til slutt elueres av elueringsbufferen. Et slikt forbedret fullblodsgenekstraksjonssett forbedrer diatom-DNA-ekstraksjonseffekten av blodsettet i rettsmedisinske undersøkelsesmaterialer, reduserer kostnadene ved diatom-DNA-ekstraksjon i rettsmedisinsk praksis, og kan bedre brukes til rettsmedisinsk forskning på grasrota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen ved Hainan Medical University. Vevsprøvene som er brukt i denne studien regnes ikke som studier som involverer mennesker. Disse prøvene ble oppnådd med henblikk på rettspatologisk diagnose, og resten ble brukt til ekstraksjon av diatom-DNA i dette forsøket. Forskere kan ikke uten videre identifisere enkeltpersoner for å få informert samtykke fra relevante interessenter.
MERK: For å sikre den generelle anvendeligheten av forskningsmetoden som ble rapportert i dette eksperimentet, fulgte dette eksperimentet i utgangspunktet bruksanvisningen til settet som ble brukt, og bare noen trinn ble endret. Vannprøvene som ble brukt i dette forsøket ble tilfeldig tatt fra dammer i nærheten av laboratoriet (tilleggsfigur 1A). I dette eksperimentet ble lungevevet til den druknede kroppen bekreftet som forskningsvevet for å demonstrere ekstraksjonsprotokollen (tilleggsfigur 1B). I rettsmedisinsk praksis er det også noen ganger nødvendig å bruke andre organer og vev av druknede legemer (som lever, milt, nyre, benmarg, etc.) for å trekke ut diatomer DNA, noe som krever mindre tilsvarende forbedringer av denne eksperimentelle metoden, som vil bli forklart i den tilsvarende delen av forsøket. Lungevevsprøvene som ble brukt i dette forsøket kom fra lik som tydelig druknet i rettsmedisinske saker. Morfologiske undersøkelser er utført for å påvise at lungevevet inneholder kiselalger (tilleggsfigur 2).
1. Forbehandling av prøver
- Forbehandling av vannprøver
- Ta 10 ml vannprøve inn i sentrifugerøret og sentrifuge ved 13 400 x g i 5 minutter. Kast forsiktig 9,8 ml supernatant med en pipettepistol, og overfør ca. 200 μl anriket diatomevannprøve som er igjen i bunnen til et 2 ml sentrifugerør.
MERK: Pre-eksperiment kan utføres først, og startbeløpet kan økes hvis en 10 ml vannprøve ikke er nok til anrikning.
- Ta 10 ml vannprøve inn i sentrifugerøret og sentrifuge ved 13 400 x g i 5 minutter. Kast forsiktig 9,8 ml supernatant med en pipettepistol, og overfør ca. 200 μl anriket diatomevannprøve som er igjen i bunnen til et 2 ml sentrifugerør.
- Forbehandling av vevsprøver
- Ta 0,5 g av lungemarginvevet fra den druknede kroppen, hogg eller slip lungevevvet helt til det blir gjørmete. Forebygging av forurensning av eksogene diatomer er kjernen i dette trinnet. Klipp vevet i stykker gjentatte ganger ved hjelp av saks.
2. DNA-ekstraksjon
MERK: Alle sentrifugeringstrinn fullføres ved romtemperatur. Ved hjelp av en stasjonær sentrifuge med en sentrifugalkraft på 14 500 x g; Et vannbad (eller metallbad) forvarmet til 70 °C må forberedes før forsøket starter. Alle trinn må følge prinsippene for aseptisk drift nøye.
- Montering av vannprøver og vev
MERK: Vannprøve og vev diatom DNA ekstraksjon metoden er den samme.- Legg glassperler til et 2 ml sentrifugerør som inneholder den forbehandlede vannprøven. Inverter 10x-15x for å blande godt. De tilsatte glassperlene består av store og små glassperler blandet i et masseforhold på 1: 1. Diameteren på store glassperler er 1,5-2,0 mm og de små glassperlene er 0,4-0,6 mm.
- Ta 0,5 g finhakket vev, tilsett glassperler til et 2 ml sentrifugerør som inneholder vevet som beskrevet ovenfor. Inverter 10x-15x for å blande.
- Tilsett 40 μL proteinase K (20 mg / ml) til rørene. Plasser ved romtemperatur i 15 min, i løpet av denne perioden, snu og bland 10x hvert 3. minutt.
MERK: Hvis vevet ikke er fullstendig fordøyd, kan mengden proteinase K økes hensiktsmessig til løsningen blir klar. - Tilsett 200 μL bindingsbuffer til sentrifugerørene, umiddelbart virvel, og bland i 4 minutter (oscillasjonsblandingsfrekvens: 3000 o / min).
MERK: I dette trinnet bør risteintensiteten og tiden kontrolleres nøye for å sikre tilstrekkelig blandingsintensitet og tid. - Sett sentrifugerørene i et 70 °C vannbad i 10 minutter, og oppløsningen blir klar.
- Tilsett 100 μL isopropanol til sentrifugerørene, virvel og bland i 15 s, flokkulerende nedbør kan oppstå på dette tidspunktet.
MERK: Det er svært viktig å blande godt med passende styrke i operasjonstrinnene ovenfor, men kraftig risting bør unngås for å forhindre DNA-skjæring. - Sett løsningen oppnådd i forrige trinn sammen med det flokkulente bunnfallet i adsorpsjonskolonnen (adsorpsjonskolonnen er plassert i oppsamlingsrøret). Adsorbsjonskolonnelengden er 3,0 cm, diameteren er 1,0 cm, og adsorpsjonsmatrisen er silisiummatriksmembran.
- Sentrifuge ved 8000 x g i 30 s, kast avfallsvæsken i oppsamlingsrøret og sett adsorpsjonskolonnen tilbake i oppsamlingsrøret.
- Legg til 500 μL inhibitorfjerningsbuffer til adsorpsjonskolonnen. Sentrifuge ved 13 400 x g i 30 s og kast avfallsvæsken i oppsamlingsrøret.
- Tilsett 700 μL vaskebuffer i adsorpsjonskolonnen. Sentrifuge ved 13 400 x g i 30 s og kast avfallsvæsken i oppsamlingsrøret.
MERK: Tilsett den angitte mengden absolutt etanol i vaskebufferflasken før første gangs bruk. - Tilsett 500 μL vaskebuffer i adsorpsjonskolonnen. Sentrifuge ved 13 400 x g i 30 s og kast avfallsvæsken i oppsamlingsrøret.
- Sett adsorpsjonskolonnen tilbake i det tomme oppsamlingsrøret. Sentrifuge ved 14 500 x g i 2 min, og fjern vaskebufferen så mye som mulig for å unngå at gjenværende etanol i vaskebufferen hemmer reaksjoner nedstrøms.
- Ta ut adsorpsjonskolonnen og legg den i et rent sentrifugerør. Tilsett 100 μL elueringsbuffer til den midtre delen av adsorpsjonsmembranen.
- Plasser adsorpsjonskolonnen i romtemperatur i 3-5 min, og sentrifuge ved 13 400 x g i 1 min.
- Legg løsningen oppnådd i forrige trinn til sentrifugaladsorpsjonskolonnen igjen. Plasser sentrifugaladsorpsjonskolonnen ved romtemperatur i 2 min, og sentrifuge ved 13 400 x g i 1 min.
MERK: Eluionbufferen skal forvarmes i et vannbad på 70 °C i ca. 10 minutter. Eluionvolumet bør ikke være mindre enn 50 μL; ellers vil DNA-utbyttet bli redusert. - Oppbevar ekstrahert diatome-DNA ved 2-8 °C for fremtidig bruk. Hvis DNA-oppløsningen skal oppbevares over lang tid, oppbevares den ved -20 °C.
3. PCR-test
MERK: Siden innholdet av kiselalger i rettsmedisinske prøver ofte er lavt, kan vevsprøveekstraktene av de druknede kroppene også inneholde varierende grader av vev og organer (som lungene i dette eksperimentet) med eget DNA. Derfor gjenspeiler direkte deteksjon av totalt DNA i DNA-ekstrakter ikke situasjonen for diatom-DNA-ekstraksjon. I dette forsøket ble diatomespesifikke primere valgt, og PCR-produkter ble brukt til å evaluere diatom-DNA-ekstraksjonen i ekstraktet. Produktene kan observeres og analyseres ved agarosegelelektroforese og kan også analyseres ved sanntids fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurve, som har høyere følsomhet.
- Legg til 2 μL av det ekstraherte DNA fra vannprøver og vev som mal. Velg en av følgende to inspeksjonsmetoder.
- Konvensjonell PCR-test
- Bruk primere22 som spesifikt kan forsterke diatom 18S rDNA-fragmenter. For detaljer, se tabell 1.
- Etablere PCR-reaksjonssystemet og amplifikasjonsbetingelsene i henhold til primernes egenskaper. For detaljer, se tabell 2.
- Kjør produktene av PCR-amplifikasjon på 2% agarosegel. Observer og analyser avbildningen med et gelbildeapparat.
- Fluorescerende kvantitativ PCR-test
- Bruk de ovennevnte primerne som spesifikt kan forsterke diatom 18S rDNA-fragmenter for å forberede et sanntids fluorescerende kvantitativt PCR-reaksjonssystem. For detaljer, se tabell 3.
- Utfør PCR-amplifikasjon og analyser den oppnådde amplifikasjonskurven og Ct-verdiene. Sett samtidig et program, smelte dobbeltstrengene til de forsterkede produktene i enkelttråder gradvis gjennom fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurveteknologi, og analyser deretter de oppnådde smeltekurvene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden DNA-løsningen ekstrahert ved den for tiden brukte DNA-ekstraksjonsmetoden inneholder alle DNA-komponenter fra forskjellige kilder i prøven, var DNA oppnådd ved denne protokollen ikke noe unntak. Så DNA-løsningen var ikke bare en løsning av diatomegenomisk DNA. Primerne som spesifikt kan forsterke diatom 18S rDNA-fragmenter ble valgt ved å konsultere litteraturen 22,23,24. Primerne ble verifisert av NCBI-Blast Primer, og resultatene viste at den fremre primeren D512 og omvendt primer D978 av 18S rDNA var algespesifikke primere og dekket mange diatomearter. Amplifikasjonsresultatene viste ingen menneskelige gener. De ble brukt en pålitelig DNA-biomarkør for diatomtesting, så de ble valgt for verifisering av resultatene av dette eksperimentet. Ved å bruke det ekstraherte DNA som en mal for diatome-spesifikk PCR-amplifikasjon, viste amplifikasjonsproduktet ved agarosegelelektroforese at vannprøver og vev hadde diatom-DNA-bånd, disse elektroforesebåndene var mellom 250-500 bp (nærmere 500 bp), i tråd med primermålforsterkningsproduktlengden (390-410 bp). Dette viste at ekstraksjonsprotokollen var vellykket i å ekstrahere diatome-DNA (figur 1A,B).
Sanntids fluorescens kvantitativ PCR-teknologi er en slags gentestingsteknologi med streng spesifisitet og høy følsomhet. Ved å legge til fluorescerende grupper i PCR-reaksjonssystemet, kan akkumuleringen av fluorescerende signaler gjøre at hele PCR-prosessen overvåkes i sanntid, og følsomheten er høy25,26. Produkter spesifikt forsterket av konvensjonell PCR kan noen ganger være vanskelige å observere i agarosegelelektroforese på grunn av lavt innhold og andre årsaker27 (figur 1C). Gjennom spesifikk amplifisering av sanntids fluorescerende kvantitativ PCR fikk man en typisk amplifikasjonskurve med fire karakteristiske stadier (figur 2). Samtidig, gjennom sanntids fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurveteknologi, ble DNA-dobbeltstrengene til det forsterkede produktet smeltet til enkelttråder ved høy temperatur, fargestoffet ble frigjort fra dobbeltstrengene, og fluorescensverdien redusert. Ved å påvise endringen i fluorescensverdien ble smeltekurven oppnådd (figur 3). De oppnådde smeltekurvene hadde karakteristiske topper, og toppverdien var rundt 85, 5 ° C, noe som viste at det var en spesifikk amplifisering av mål-DNA, noe som indikerer at det var diatom-DNA i den ekstraherte DNA-løsningen. Fargestoffet kan også tilsettes direkte til det konvensjonelle PCR-amplifikasjonsproduktet, og smeltekurven kan oppnås ved sanntids fluorescenskvantitativ PCR-smeltekurveteknologi for å bevise om det var spesifikk amplifikasjon. Derfor, når konvensjonell PCR-agarosegelelektroforese ikke kunne bevise om det var diatom-DNA i den ekstraherte DNA-løsningen, kunne sanntids fluorescerende kvantitativ PCR-teknologi med høyere følsomhet velges for verifisering og evaluering. I dette eksperimentet ble sanntids fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurveteknologi bare brukt til kvalitativ analyse.
Som vist i en tidligere rapport21, var det tradisjonelle jord-DNA-ekstraksjonssettet og det modifiserte blod-DNA-ekstraksjonssettet i utgangspunktet det samme for diatom-DNA-ekstraksjon fra vannprøver og vev. Kostnadsforskjellen ved diatom-DNA-ekstraksjon var hovedsakelig prisforskjellen på de to settene, og kostnaden for andre forbruksvarer var i utgangspunktet den samme. I denne studien kunne en enkel forbedring av blod-DNA-ekstraksjonssettet som vanligvis brukes i molekylærbiologiske eksperimenter, oppnå bedre eksperimentelle resultater, noe som ikke bare økte muligheten for forskerne til å velge testsettet i forskningsaktiviteter relatert til diatom-DNA-ekstraksjon, men også reduserte kostnadene ved testing.
Forbedringsprosessen av denne protokollen er publisert21. Ved å designe kombinasjonen av forskjellige masseforhold mellom glassperler og virveloscillerende tid, ble de optimale DNA-ekstraksjonsbetingelsene for oscillasjon av glassperler lagt til i det konvensjonelle settet, derfor kan metoden forbedre ekstraksjonseffekten av diatom-DNA i rettsmedisinske prøver, spesielt i vevsprøver. Den optimale kombinasjonen av DNA-ekstraksjon ble oppnådd når hvirvelens oscillerende frekvens var 3000 o / min; Vortex oscillerende tid var 4 min, masseforholdet mellom store glassperler med diameter på 1,5-2,0 mm og små glassperler med diameter på 0,4-0,6 mm var 1:1. En sammenligning mellom den konvensjonelle metoden til settet og den forbedrede metoden ble utført. Det ble vist at det brukte settet kunne oppfylle behovene til amplifiserende diatom-DNA, og lysstyrken til elektroforetiske bånd etter amplifisering utført av den forbedrede metoden i vannprøver var lik lysstyrken til den konvensjonelle metoden, og de elektroforetiske båndene etter amplifisering utført ved den forbedrede metoden i vevsprøver var lysere (figur 4).
Figur 1: Elektroforeseresultater av DNA ekstrahert ved hjelp av protokollen etter PCR-amplifikasjon. Totalt 2 μL DNA-ekstrakt ble brukt som DNA-mal for PCR-spesifikk amplifikasjon. PCR-amplifikasjonsproduktene ble elektroforesert på 1x TAE-bufferløsning gjennom 2% agarosegel, og kjørt med en konstant spenning på 100V i 25-30 minutter. En D2000 DNA-stige ble brukt til alle geler. (A) Elektroforeseresultatene av diatome-DNA i vannprøver etter PCR-amplifikasjon, bane 1 er blank kontroll; Felt 2-7 er vannprøver fra forskjellige steder i samme område. (B) Resultatene av elektroforese etter PCR-amplifisering av diatome-DNA i vevet. Banene 1-6 er vevene skåret ut fra forskjellige posisjoner av samme lungevev; Bane 7 er den tomme kontrollen. (C) I et mislykket eksperiment, etter diatom DNA-amplifikasjon, viste elektroforeseresultatene ikke elektroforesebånd ved de tilsvarende posisjonene, noe som indikerte at det ikke var noen amplifikasjonsprodukter eller for få amplifikasjonsprodukter. På dette tidspunktet kunne elektroforeseresultatene ikke indikere om det var diatom-DNA i den foreslåtte DNA-løsningen, som måtte utføres ved mer følsomme metoder (for eksempel en PCR-smeltekurve). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Diatom DNA qPCR amplifikasjonskurve. Totalt 2 μL DNA-løsningsekstrakt som ikke viste noen bånd ved konvensjonell PCR og agarosegelelektroforese ble brukt som mal for å forberede et sanntids fluorescenskvantitativt PCR-system og sette opp et program. Til slutt ble typiske amplifikasjonskurver med fire karakteristiske stadier av lineær baselinefase, begynnelsen av eksponentiell fase, eksponentiell fase og platåfase oppnådd. Ct-verdien av hver kurve ble også oppnådd gjennom analyse, noe som indikerer at DNA-ekstraksjon var vellykket. Hvert tall representerer Ct-verdien til den tilsvarende kurven. Terskelen er 5,2. Enheten til y-aksen er Rn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Diatom DNA smeltekurve. Ved hjelp av et sanntids fluorescenskvantitativt PCR-system ble det satt et program der temperaturen stiger fra 60-95 °C. Dette genererte en smeltekurve og det spesifikt forsterkede dobbeltstrengede DNA smeltet inn i enkelttråder ved høye temperaturer, fargestoffet var fritt for dobbeltstrengene, og fluorescensverdien ble redusert til den var 0. Grafen ble oppnådd ved å ta den negative gjensidige av den opprinnelige grafen. Abscissa representerte temperaturen, abscissa som svarte til høyeste toppverdi var Tm-verdien, og Tm-verdien til smeltekurven i grafen var 85,5 °C. Nummereringen av hver kurve tilsvarer nummereringen av hvert kjørefelt i figur 1C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Elektroforeseresultater av den forbedrede prosessen. (A) Elektroforeseresultater for forskjellige kombinasjoner av glassperleforhold og virveloscillasjonstider. Felt 1, 4, 7, 10 og 13 hvor det blandede masseforholdet mellom store og små glassperler er 1: 2, baner 2, 5, 8, 11 og 14 hvor det blandede masseforholdet mellom store og små glassperler er 1: 1, baner 3, 6, 9, 12 og 15 hvor det blandede masseforholdet mellom store og små glassperler er 2: 1, og svingetidene var 2 min for banene 1-3, 3 min for banene 4-6, 4 min for banene 7-9, 5 min for banene 10-12 og 6 min for banene 13-15. Felt 16 er den tomme kontrollen. (B) Elektroforeseresultater etter PCR-amplifisering av settekstraksjonsproduktene før og etter forbedring. Banene 1-3 er konvensjonelle metoder for å ta ut vannprøver, banene 4-6 er forbedrede metoder for å ta ut vannprøver, banene 7-9 er konvensjonelle metoder for å trekke ut vev, banene 10-12 er forbedrede metoder for å trekke ut vev, felt 13 er en blank kontroll. Resultatene er endret fra21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Vannprøver og vevsprøver. Vannprøvene som ble brukt ble tatt fra en dam i nærheten av laboratoriet, og vevsprøvene som ble brukt ble bekreftet som lungevev fra den druknede kroppen. (A) Det eksperimentelle vannprøveinnsamlingsstedet var en dam i nærheten av laboratoriet. (B) Berikede vannprøver og strimlede lungevevsprøver. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Mikrografi av diatome. Bildene (A) og (B) ble tatt under et 400x optisk mikroskop. Pilen peker på kiselalger. Bildene (C) og (D) ble tatt under et elektronmikroskop. Bilder (A) og (B) viser kiselalger i vannet på drukningsstedet. Diatomene heter Fragilaria og Navicula. Bilder (C) og (D) viser kiselalger i lungene, som kalles Nitzschia og Navicula. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Mål | Primer navn | Sekvens |
| 18S rDNA | forord primer D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| omvendt primer D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabell 1: Liste over primere som brukes. Denne tabellen beskriver sekvensene, navnene og målområdene for bestemte primere som brukes i denne artikkelen.
| PCR-reaksjonssystem | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| forord primer D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| omvendt primer D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| mal DNA | 2 μL | ||
| Nukleasefritt vann | til 20 μL | ||
| Merk: Den tomme kontrollmalens DNA erstattes av samme mengde nukleasefritt vann. | |||
| PCR-program | |||
| temperatur | Tid | Sykluser | |
| 94 °C | 10 min | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 10 min | 1 | |
Tabell 2: PCR-komponenter. Denne tabellen beskriver konfigurasjonen av reaksjonssystemet for konvensjonell PCR og innstillingene for reaksjonstemperatur, tid og antall sykluser for PCR. Det totale volumet av reaksjonssystemet som ble brukt var 20 μL.
| Kvantitativt PCR-reaksjonssystem i sanntid | |||
| 2x qPCR-blanding | 10 μL | ||
| forord primer D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| omvendt primer D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| mal DNA | 2 μL | ||
| Nukleasefritt vann | til 20 μL | ||
| Merk: Den tomme kontrollmalens DNA erstattes av samme mengde nukleasefritt vann. | |||
| Kvantitativt PCR-program i sanntid | |||
| temperatur | Tid | Sykluser | |
| 94 °C | 10 min | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min | ||
Tabell 3: Kvantitative PCR-komponenter i sanntid. Denne tabellen beskriver konfigurasjonen av reaksjonssystemet for sanntids kvantitativ PCR og innstillingene for reaksjonstemperatur, tid og antall sykluser for PCR. Det totale volumet av reaksjonssystemet som ble brukt var 20 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diatomeceller er beskyttet av harde kiselholdige cellevegger17, og denne strukturen må ødelegges for å trekke ut diatom-DNA. Vanlige sett ødelegger ikke lett det kiselholdige skallet av diatomer; Dermed er det vanskelig å lykkes med å trekke ut diatom DNA21. Vårt laboratorium forbedret det mest brukte blod-DNA-ekstraksjonssettet, og tilsatte glassperler med forskjellige diametre og forskjellig masseforhold i prosessen med diatomekstraksjon. Vortex oscillasjon utføres samtidig, noe som fullt ut kan bryte diatomeskallet og forbedre diatom DNA-ekstraksjonseffekten. Som vist i forrige rapport21, vil diameteren av glassperler, svingningsintensitet og tid direkte påvirke kvaliteten på DNA-ekstraksjon. Vortex oscillasjonstiden bør ikke være for lang (ikke mer enn 10 min). Hvis tiden er for lang, vil DNA bryte på grunn av overdreven vibrasjon. Samtidig bør tiden ikke være for kort. Hvis tiden er for kort (ikke mindre enn 2 minutter), vil diatomeskallet ikke fjernes helt, noe som vil gjøre DNA-ekstraksjonen ineffektiv. Mens du velger glassperler, velger du perler med forskjellige omkretsdiametre, de store glassperlene sikrer kollisjonsstyrken, og de små glassperlene sikrer at det ikke er død kollisjon mellom glasskulene under kollisjonsfragmenteringsprosessen, noe som forbedrer effektiviteten av skallbrudd.
For å trekke ut diatom-DNA fra prøver, er det generelt nødvendig å berike diatomer. Denne prosessen vil ha stor innvirkning på ekstraksjonen av diatom-DNA. Formålet med anrikning er å øke konsentrasjonen av diatomer i prøver slik at konsentrasjonen av diatom-DNA ekstrahert kan være i detekterbart område; for neste trinns applikasjoner som fluorescerende kvantitativ PCR i sanntid og sekvensering av høy gjennomstrømning.
Siden kiselalger er utbredt i naturen4, er forebygging av laboratorieforurensning en topp prioritet28. Forurensning under DNA-ekstraksjonsprosessen vil føre til avvik fra de faktiske resultatene og tap av bruksverdi. Vær derfor alltid oppmerksom på prinsippet om aseptisk drift ved ekstrahering av diatom-DNA og ta alle mulige tiltak for å redusere og unngå forurensning av eksogene diatomer. Når vevet ekstraheres fra den døde kroppen, bør det treffes tiltak for å forhindre at det blir forurenset av eksogene diatomer. Etter at vevet er ekstrahert, bør det oppbevares i en beholder eller prøvepose uten diatomforurensning. Vevet skal ikke behandles med formaldehyd. Utstyret for utvinning og behandling av vev skal vaskes 2-3 ganger med destillert vann gjentatte ganger, og deretter steriliseres med ultrafiolett lys eller høy temperatur for å sikre at det ikke er forurensning av diatomer fra andre kilder. Vevet før testen skal kuttes av fra overfladisk vev med et diatomefritt instrument, og deretter skal instrumentet byttes ut for å plukke ut det nedre vevet for undersøkelse. Samtidig kan standardisering av operasjonsprosessen også effektivt unngå problemet med laboratorieforurensning.
Siden kiselalger er maten til mange vannlevende organismer, vil de gå tapt under langvarig lagring29. Diatomer kan også vokse og reprodusere under lysforhold. Derfor bør DNA-ekstraksjonstrinnet initieres så snart som mulig etter prøvetaking, og rask prøvebehandling bør gjøres for å forhindre tap av kiselalger i prøven. Hvis DNA-ekstraksjonen ikke kan utføres umiddelbart, bør alle prøver fryses og holdes i mørket for å forhindre reduksjon av kiselalger så mye som mulig.
Vår forskning valgte et vanlig og billig blod-DNA-ekstraksjonssett basert på proteinase K-fordøyelsesmetoden, som har blitt forbedret for å trekke ut diatom-DNA fra vannprøver og vev med gode resultater30. Vevet er tilstrekkelig kuttet til å være i full kontakt med proteinase K og vevet blir fullstendig fordøyd. Det mulige prinsippet om vellykket ekstraksjon er som følger: Under ristetrinnet blir det harde skallet av diatom gjentatte ganger påvirket og fragmentert mellom raskt bevegelige glassperler, og utsetter cellemembranen; konfigurasjonen av glassperler i forskjellige størrelser kan fylle gapet mellom kollisjonen av glassperler i én størrelse, for å dekke kollisjonskontaktflaten så fullstendig som mulig; etter å ha mistet silisiumskallet, bidrar proteinase K til å frigjøre DNA fra diatomet. Sammenlignet med det for tiden brukte jord-DNA-ekstraksjonssettet, kan det forbedrede blod-DNA-ekstraksjonssettet oppfylle kravene til diatom-DNA-ekstraksjon, noe som er mer økonomisk og lettere å oppnå. Det letter ikke bare bruken av rettsmedisinsk diatomeinspeksjon, men er egnet for anvendelse på andre diatomforskningsrelaterte disipliner og kan også brukes til annen plankton-DNA-ekstraksjon. Ved ekstrahering av diatome-DNA fra vannprøver, må mengden proteinase K som brukes justeres i henhold til antall plankton i vannet. Mengden proteinase K kan økes eller reduseres basert på foreløpige eksperimenter. Ved ekstrahering av diatome-DNA fra vev, vil forskjellige organvevstyper, vevsforurensning og andre faktorer påvirke mengden proteinase K som kreves for fordøyelsen. I forsøket skal proteinase K i settet lagres ved -20 ° C etter bruk, ellers vil inaktiveringen av proteinase K påvirke ekstraksjonsprosessen.
Avslutningsvis bør diatome-DNA-ekstraksjon utføres så snart som mulig etter prøvetaking og prøvebehandling, ellers lagret ved -20 °C for bevaring. Prøvehåndtering, lagring og hele ekstraksjonsprosessen bør gjøres nøye for å forhindre forurensning av eksogene kiselalger. Ellers kan det ikke vurderes at det ekstraherte diatome-DNA var i prøven eller eksogen forurensning. Når du bruker proteinase K til å fordøye vev, kan doseringen være et problem. Utilstrekkelig vevsfordøyelse kan øke mengden proteinase K. Derfor er det viktig å skjære vevet tilstrekkelig. Tilstrekkelig fordøyelse av vevet forhindrer også vevsrestene i å tette plasmamembranen inne i adsorpsjonskolonnen. Etter at membranen er blokkert, er det ikke mulig å bruke pipettespissen til å plukke ut blokkeringen eller sentrifugere gjentatte ganger, noe som vil skade membranen. Den endelige DNA-løsningen inneholder mange urenheter, noe som vil påvirke påvisningen av diatom-DNA. Svingningsintensitet og tid er også sentrale spørsmål. Den første virveloscillasjonstiden styres ved 4-5 minutter, og svingningsfrekvensen styres ved 3000 o / min, ellers vil DNA-ekstraksjonen bli påvirket. Hvis de elektroforetiske båndene ikke er klare etter PCR, kan det være nødvendig å øke mengden DNA-mal ytterligere. DNA ekstrahert i denne studien er en blanding av DNA, inkludert diatom DNA og DNA fra andre arter, slik at konsentrasjonen av diatom DNA ikke kan bestemmes. Derfor er den ikke egnet for applikasjoner som krever høy renhet av DNA-maler.
Studier har vist at forskjellige diatomearter kan forsterkes av forskjellige primere31,32. I denne studien ble bare de diatomespesifikke primerne D512 og D978 på diatom 18S rDNA brukt til å teste om diatome-DNA ble ekstrahert, noe som ikke kunne dekke alle diatomearter22,33. I tillegg, siden lengden på amplifikasjonsproduktfragmentet av primerparet er 390-410 bp, velger den forbedrede metoden alle fragmentstørrelser av diatom-DNA for å teste om det er innvirkning på eksperimentelle parametere, som trenger videre studier. Etterfølgende studier vil også bruke primere fra forskjellige regioner og forskjellige forsterkningslengder for å utforske effekten av ekstraksjon.
Sammenlignet med den tradisjonelle diatom-DNA-ekstraksjonsmetoden har denne metoden de viktigste fordelene ved lavkost og storskala diatom-DNA-ekstraksjon. Det kan utfylle fordelene ved diatom morfologiske metoder og kan møte behovene til drukningsdiagnose i primære rettsmedisinske laboratorier. Samtidig utvider det også utvalgsområdet for diatom DNA-ekstraksjonssett og har et godt applikasjonsprospekt. I fremtiden vil denne metoden ikke bare være begrenset til ekstraksjon av diatom-DNA, men brukes til ekstraksjon av DNA fra andre alger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) og av Academician Innovation Platform Scientific Research Project of Hainan-provinsen (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
