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Medicine

पानी के नमूनों और ऊतकों से डायटम डीएनए का निष्कर्षण

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65792
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख एक संशोधित आम डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर डायटम डीएनए निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Abstract

डायटम परीक्षण फोरेंसिक अभ्यास में एक आवश्यक सहायक साधन है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि लाश पानी में डूब गई या नहीं और डूबने वाले स्थान का अनुमान लगाया जा सके। डायटम परीक्षण भी पर्यावरण और प्लवक के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण शोध सामग्री है। डायटम आणविक जीव विज्ञान परीक्षण तकनीक, जो प्राथमिक अनुसंधान वस्तु के रूप में डायटम डीएनए पर केंद्रित है, डायटम परीक्षण की एक नई विधि है। डायटम डीएनए निष्कर्षण डायटम आणविक परीक्षण का आधार है। वर्तमान में, आमतौर पर डायटम डीएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली किट महंगी हैं, जिससे संबंधित अनुसंधान करने की लागत बढ़ जाती है। हमारी प्रयोगशाला ने सामान्य संपूर्ण रक्त जीनोमिक डीएनए रैपिड निष्कर्षण किट में सुधार किया और एक संतोषजनक डायटम डीएनए निष्कर्षण प्रभाव प्राप्त किया, इस प्रकार संबंधित अनुसंधान के लिए ग्लास मोतियों के आधार पर एक वैकल्पिक किफायती और सस्ती डीएनए निष्कर्षण समाधान प्रदान किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके निकाले गए डायटम डीएनए पीसीआर और अनुक्रमण जैसे कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को संतुष्ट कर सकते हैं।

Introduction

फोरेंसिक अभ्यास में, यह निर्धारित करना कि क्या पानी में पाई गई लाश डूबती है या मृत्यु के बाद पानी में फेंक दी जाती है, मामले के उचित समाधान के लिए आवश्यक है1. यह उन कठिन मुद्दों में से एक है जिन्हें फोरेंसिक अभ्यास2 में तत्काल हल करने की आवश्यकता है। डायटम प्राकृतिक वातावरण (विशेष रूप से पानी में)3,4में प्रचुर मात्रा में हैं। डूबने की प्रक्रिया में, हाइपोक्सिया और तनाव प्रतिक्रिया के कारण, लोगों को तीव्र श्वास आंदोलन होंगे और बड़ी मात्रा में डूबने वाले तरल को श्वास लेंगे। इसलिए, पानी में डायटम डूबने वाले तरल के साथ फेफड़ों में प्रवेश करते हैं, और कुछ डायटम वायुकोशीय केशिका बाधा के माध्यम से रक्त परिसंचरण में प्रवेश कर सकते हैं और रक्त प्रवाह 5,6 के साथ आंतरिक अंगों में फैल सकते हैं। इस तरह के फेफड़े, यकृत, और अस्थि मज्जा के रूप में आंतरिक ऊतकों और अंगों में diatoms का पता लगाने 7,8 मौत से पहले डूबने का एक मजबूत सबूत है. वर्तमान में, फोरेंसिक डायटम परीक्षण मुख्य रूप से रूपात्मक परीक्षण विधियों पर आधारित है। ऊतक के पूर्व-पाचन की एक श्रृंखला के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत अपचित डायटम के रूपात्मक गुणात्मक और मात्रात्मक अनुमान किए जाते हैं। इस अवधि के दौरान, नाइट्रिक एसिड जैसे खतरनाक और पर्यावरण के अनुकूल अभिकर्मकों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया समय लेने वाली है और इसके लिए शोधकर्ताओं को ठोस वर्गीकरण विशेषज्ञता और व्यापक अनुभव की आवश्यकता होती है। ये सभी फोरेंसिक कर्मचारियों के लिए कुछ चुनौतियां लाते हैं9. डायटम डीएनए परीक्षण तकनीक हाल के वर्षों10,11,12 में विकसित डायटम परीक्षण के लिए एक नई तकनीक है। इस तकनीक डायटम13,14 के विशिष्ट डीएनए अनुक्रम संरचना का विश्लेषण करके diatoms की प्रजातियों की पहचान का एहसास करता है. पीसीआर तकनीक और अनुक्रमण तकनीक आमतौर पर तकनीकी तरीकों का उपयोग किया जाता है, लेकिन उनका आधार डायटम से डीएनए का सफल निष्कर्षण है। हालांकि, डायटम में अन्य जीवों से अलग एक विशेष संरचना होती है, जिससे उनकी डीएनए निष्कर्षण तकनीक भी अलग हो जाती है।

डायटम की कोशिका भित्ति में सिलिसिफिकेशन की उच्च डिग्री होती है, और इसका मुख्य घटक सिलिकॉन डाइऑक्साइड 15,16,17 है। सिलिसियस सेल की दीवार बहुत कठिन है, और डीएनए निकालने से पहले इसे नष्ट कर दिया जाना चाहिए। साधारण डीएनए निष्कर्षण किट अक्सर डायटम डीएनए के निष्कर्षण के लिए सीधे उपयोग करने के लिए मुश्किल होती है क्योंकि वे डायटम18 के सिलिसियस खोल को नष्ट नहीं कर सकते हैं। इसलिए, डायटम के सिलिसियस खोल को नष्ट करना डायटम डीएनए निकालने में हल की जाने वाली प्रमुख तकनीकी समस्याओं में से एक है।

इसी समय, चूंकि फोरेंसिक अनुसंधान नमूनों में निहित डायटम की संख्या, चाहे पानी के नमूने या अंगों और डूबे हुए निकायों के ऊतक, अक्सर सीमित होते हैं, डायटम को समृद्ध करना आवश्यक है। संवर्धन का सार पदार्थों का पृथक्करण है। डायटम को एक साथ इकट्ठा करने की कोशिश करते समय, अन्य भौतिक घटकों (हस्तक्षेप करने वाले घटकों) की सामग्री को कम करें। फोरेंसिक काम में, प्रयोगशालाओं अक्सर अपकेंद्रित्र या झिल्ली निस्पंदन संवर्धन विधियों का उपयोग डायटम कोशिकाओं19 अलग करने के लिए. हालांकि, चूंकि वैक्यूम पंपिंग उपकरण का व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है, इसलिए झिल्ली संवर्धन विधि का उपयोग अक्सर सामान्य प्राथमिक फोरेंसिक प्रयोगशालाओं में नहीं किया जाता है। तो, centrifugation विधि अभी भी आमतौर पर फोरेंसिक प्रयोगशालाओं20 में डायटम संवर्धन है.

डायटम से डीएनए निष्कर्षण वर्तमान में मुख्य रूप से फोरेंसिक अभ्यास में उपयोग किया जाता है, और इसके आवेदन के लिए महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। वर्तमान में, बाजार पर फोरेंसिक विज्ञान में उपयोग किए जाने वाले कुछ डायटम डीएनए निष्कर्षण किट हैं और वे आम तौर पर महंगेहैं 21. यह लेख एक बेहतर डायटम डीएनए निष्कर्षण विधि प्रदान करता है, जिससे डायटम डीएनए निष्कर्षण सरल, सुविधाजनक और लागत प्रभावी हो जाता है। यह डायटम के बाद के आणविक जीव विज्ञान परीक्षण के आवेदन को बढ़ाता है और डायटम परीक्षण के माध्यम से फोरेंसिक चिकित्सा में डूबने से संबंधित समस्याओं को बेहतर ढंग से हल कर सकता है। यह विधि कांच के मोतियों को जोड़कर और भंवर के लिए उपयुक्त समय निर्धारित करके डायटम की सिलिसियस सेल दीवारों को तोड़ती है। इस तरह, प्रोटीनेज K और बाध्यकारी समाधान तेजी से कोशिकाओं को लाइज़ करते हैं और कोशिकाओं में विभिन्न एंजाइमों को निष्क्रिय करते हैं। जीनोमिक डीएनए सोखना स्तंभ में मैट्रिक्स झिल्ली में अवशोषित होता है और अंत में क्षालन बफर द्वारा उत्सर्जित होता है। इस तरह के एक बेहतर पूरे रक्त जीन निष्कर्षण किट फोरेंसिक परीक्षा सामग्री में रक्त किट के डायटम डीएनए निष्कर्षण प्रभाव में सुधार करता है, फोरेंसिक अभ्यास में डायटम डीएनए निष्कर्षण की लागत को कम करता है, और जमीनी स्तर पर फोरेंसिक अनुसंधान के लिए बेहतर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन को हैनान मेडिकल यूनिवर्सिटी की एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी थी। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ऊतक के नमूनों को मानव विषयों से जुड़े अध्ययन नहीं माना जाता है। इन नमूनों को फोरेंसिक रोग निदान के उद्देश्य से प्राप्त किया गया था, और बाकी का उपयोग इस प्रयोग में डायटम डीएनए के निष्कर्षण के लिए किया गया था। शोधकर्ता संबंधित हितधारकों से सूचित सहमति प्राप्त करने के लिए व्यक्तियों की आसानी से पहचान नहीं कर सकते हैं।

नोट: इस प्रयोग में रिपोर्ट की गई अनुसंधान विधि की सामान्य प्रयोज्यता सुनिश्चित करने के लिए, इस प्रयोग ने मूल रूप से उपयोग की जाने वाली किट के ऑपरेटिंग निर्देशों का पालन किया, और केवल कुछ चरणों को संशोधित किया गया। इस प्रयोग में इस्तेमाल पानी के नमूने बेतरतीब ढंग से प्रयोगशाला (अनुपूरक चित्रा 1 ए) के पास तालाबों से लिया गया. इस प्रयोग में, डूब शरीर के फेफड़ों के ऊतकों निष्कर्षण प्रोटोकॉल (अनुपूरक चित्रा 1 बी) का प्रदर्शन करने के लिए अनुसंधान ऊतक के रूप में पुष्टि की गई थी. फोरेंसिक अभ्यास में, कभी-कभी डायटम डीएनए निकालने के लिए डूबे हुए शरीर (जैसे यकृत, प्लीहा, गुर्दे, अस्थि मज्जा, आदि) के अन्य अंगों और ऊतकों का उपयोग करना भी आवश्यक होता है, जिसके लिए इस प्रयोगात्मक विधि में मामूली सुधार की आवश्यकता होती है, जिसे समझाया जाएगा प्रयोग के संबंधित खंड में। इस प्रयोग में इस्तेमाल किए गए फेफड़ों के ऊतकों के नमूने लाशों से आए थे जो स्पष्ट रूप से फोरेंसिक मामलों में डूब गए थे। फेफड़े के ऊतकों में डायटम (अनुपूरक चित्रा 2) शामिल है कि यह साबित करने के लिए रूपात्मक परीक्षण किए गए हैं।

1. नमूनों का ढोंग

  1. पानी के नमूनों का प्रीट्रीटमेंट
    1. अपकेंद्रित्र ट्यूब में पानी के नमूने के 10 एमएल ले लो और 5 मिनट के लिए 13,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र. ध्यान से एक विंदुक बंदूक के साथ सतह पर तैरनेवाला के 9.8 एमएल त्यागें, और एक 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में तल पर शेष समृद्ध डायटम पानी के नमूने के बारे में 200 माइक्रोन हस्तांतरण.
      नोट: पूर्व प्रयोग पहले किया जा सकता है, और प्रारंभिक राशि बढ़ाया जा सकता है अगर एक 10 एमएल पानी का नमूना संवर्धन के लिए पर्याप्त नहीं है.
  2. ऊतक के नमूनों का प्रीट्रीटमेंट
    1. डूबे हुए शरीर से फेफड़े के मार्जिन ऊतक का 0.5 ग्राम लें, फेफड़े के ऊतकों को पूरी तरह से काट लें या पीस लें जब तक कि यह मैला न हो जाए। बहिर्जात डायटम के संदूषण को रोकना इस कदम का मूल है। कैंची का उपयोग करके बार-बार ऊतक को टुकड़ों में काटें।

2. डीएनए निष्कर्षण

नोट: सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरण कमरे के तापमान पर पूरे हो गए हैं। 14,500 x ग्राम के केन्द्रापसारक बल के साथ डेस्कटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करना; प्रयोग शुरू होने से पहले 70 डिग्री सेल्सियस से पहले एक पानी के स्नान (या धातु स्नान) को तैयार करने की आवश्यकता होती है। सभी चरणों को सड़न रोकनेवाला ऑपरेशन के सिद्धांतों का सख्ती से पालन करना चाहिए।

  1. पानी के नमूनों और ऊतकों की विधानसभा
    नोट: पानी का नमूना और ऊतक डायटम डीएनए निष्कर्षण विधि समान हैं।
    1. एक 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में कांच के मोती जोड़ें जिसमें पहले से इलाज किया गया पानी का नमूना होता है। अच्छी तरह मिलाने के लिए 10x-15x पलटें। जोड़ा ग्लास मोती 1: 1 के द्रव्यमान अनुपात में मिश्रित बड़े और छोटे कांच के मोतियों से बना होता है। बड़े कांच के मोतियों का व्यास 1.5-2.0 मिमी है और छोटे कांच के मोतियों का व्यास 0.4-0.6 मिमी है।
    2. बारीक कटा हुआ ऊतक के 0.5 ग्राम ले लो, ऊपर वर्णित के रूप में ऊतक युक्त एक 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए कांच मोती जोड़ें. मिश्रण करने के लिए 10x-15x पलटें।
  2. ट्यूबों में 40 माइक्रोन प्रोटीनेज के (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें, इस अवधि के दौरान, पलटना, और हर 3 मिनट में 10x मिश्रण.
    नोट: यदि ऊतक पूरी तरह से पच नहीं जाता है, तो समाधान स्पष्ट होने तक प्रोटीनेज K की मात्रा को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है।
  3. अपकेंद्रित्र ट्यूबों में बाध्यकारी बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें, तुरंत भंवर, और 4 मिन (दोलन मिश्रण आवृत्ति: 3000 आरपीएम) के लिए मिलाएं।
    नोट: इस चरण में, मिलाते हुए तीव्रता और समय को पर्याप्त मिश्रण तीव्रता और समय सुनिश्चित करने के लिए सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  4. अपकेंद्रित्र ट्यूबों को 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें, और समाधान स्पष्ट हो जाता है।
  5. अपकेंद्रित्र ट्यूबों, भंवर में आइसोप्रोपेनॉल के 100 माइक्रोन जोड़ें और 15 एस के लिए मिलाएं, इस समय फ्लोकुलेंट वर्षा दिखाई दे सकती है।
    नोट: उपरोक्त ऑपरेशन चरणों में उचित ताकत के साथ अच्छी तरह मिश्रण करना बहुत महत्वपूर्ण है, लेकिन डीएनए कतरनी को रोकने के लिए जोरदार झटकों से बचा जाना चाहिए।
  6. पिछले चरण में प्राप्त समाधान को सोखना कॉलम में फ्लोक्यूलेंट अवक्षेप के साथ रखें (सोखना कॉलम संग्रह ट्यूब में रखा गया है)। सोखना स्तंभ की लंबाई 3.0 सेमी है, व्यास 1.0 सेमी है, और सोखना मैट्रिक्स सिलिकॉन मैट्रिक्स झिल्ली है।
  7. 30 एस के लिए 8,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, संग्रह ट्यूब में अपशिष्ट तरल को त्यागें और सोखना स्तंभ को संग्रह ट्यूब में वापस डालें।
  8. सोखना स्तंभ के लिए अवरोधक हटाने बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें. 30 एस के लिए 13,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और संग्रह ट्यूब में अपशिष्ट तरल त्यागें।
  9. सोखना स्तंभ के लिए धोने बफर के 700 माइक्रोन जोड़ें. 30 एस के लिए 13,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और संग्रह ट्यूब में अपशिष्ट तरल त्यागें।
    नोट: पहले उपयोग से पहले वॉश बफर बोतल में पूर्ण इथेनॉल की निर्दिष्ट मात्रा जोड़ें।
  10. सोखना स्तंभ के लिए धोने बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें. 30 एस के लिए 13,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और संग्रह ट्यूब में अपशिष्ट तरल त्यागें।
  11. सोखना स्तंभ वापस खाली संग्रह ट्यूब में रखो. 2 मिन के लिए 14,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और वॉशिंग बफर में अवशिष्ट इथेनॉल से बचने के लिए जितना संभव हो सके वॉशिंग बफर को हटा दें।
  12. सोखना स्तंभ बाहर ले लो और यह एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में डाल दिया. सोखना झिल्ली के मध्य भाग में क्षालन बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  13. 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सोखना स्तंभ रखें, और 1 मिनट के लिए 13,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
  14. पिछले चरण में प्राप्त समाधान को केन्द्रापसारक सोखना कॉलम में फिर से जोड़ें। 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर केन्द्रापसारक सोखना स्तंभ रखें, और 1 मिनट के लिए 13,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
    नोट: क्षालन बफर के बारे में 10 मिनट के लिए एक 70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पहले से गरम किया जाना चाहिए. क्षालन मात्रा 50 माइक्रोन से कम नहीं होनी चाहिए; अन्यथा, डीएनए उपज कम हो जाएगी।
  15. भविष्य में उपयोग के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर निकाले गए डायटम डीएनए को स्टोर करें। यदि डीएनए समाधान को लंबे समय तक संग्रहीत किया जाना है, तो इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. पीसीआर परीक्षण

नोट: चूंकि फोरेंसिक नमूनों में डायटम की सामग्री अक्सर कम होती है, इसलिए डूबे हुए निकायों के ऊतक नमूना अर्क में अपने स्वयं के डीएनए के साथ ऊतक और अंगों (जैसे इस प्रयोग में फेफड़े) की अलग-अलग डिग्री भी हो सकती है। इसलिए, डीएनए अर्क में कुल डीएनए का प्रत्यक्ष पता डायटम डीएनए निष्कर्षण की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करता है। इस प्रयोग में, डायटम-विशिष्ट प्राइमरों का चयन किया गया था, और पीसीआर उत्पादों का उपयोग अर्क में डायटम डीएनए निष्कर्षण का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। उत्पादों को अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा देखा और विश्लेषण किया जा सकता है और वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर-पिघलने वक्र द्वारा भी विश्लेषण किया जा सकता है, जिसमें उच्च संवेदनशीलता होती है।

  1. टेम्पलेट के रूप में पानी के नमूनों और ऊतकों से निकाले गए डीएनए के 2 माइक्रोन जोड़ें। निरीक्षण के लिए निम्नलिखित दो विधियों में से एक चुनें।
  2. पारंपरिक पीसीआर परीक्षण
    1. प्राइमरों22 का उपयोग करें जो विशेष रूप से डायटम 18 एस आरडीएनए टुकड़ों को बढ़ा सकते हैं। विवरण के लिए, तालिका 1 देखें।
    2. प्राइमरों की विशेषताओं के अनुसार पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली और प्रवर्धन की स्थिति स्थापित करें। विवरण के लिए, तालिका 2 देखें।
    3. 2% agarose जेल पर पीसीआर प्रवर्धन के उत्पादों को चलाओ. निरीक्षण और एक जेल इमेजर के साथ इमेजिंग का विश्लेषण.
  3. फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर परीक्षण
    1. उपरोक्त प्राइमरों का उपयोग करें जो विशेष रूप से वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करने के लिए डायटम 18 एस आरडीएनए टुकड़ों को बढ़ा सकते हैं। विवरण के लिए, तालिका 3 देखें।
    2. पीसीआर प्रवर्धन करें और प्राप्त प्रवर्धन वक्र और सीटी मूल्यों का विश्लेषण करें। उसी समय, एक प्रोग्राम सेट करें, फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर-पिघलने वक्र प्रौद्योगिकी के माध्यम से धीरे-धीरे एकल-किस्में में प्रवर्धित उत्पादों के डबल-स्ट्रैंड को पिघलाएं, और फिर प्राप्त पिघलने वाले घटता का विश्लेषण करें।

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Representative Results

चूंकि वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले डीएनए निष्कर्षण विधि द्वारा निकाले गए डीएनए समाधान में नमूने में विभिन्न स्रोतों से सभी डीएनए घटक होते हैं, इसलिए इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त डीएनए कोई अपवाद नहीं था। इसलिए, डीएनए समाधान केवल डायटम जीनोमिक डीएनए का समाधान नहीं था। प्राइमरों कि विशेष रूप से डायटम 18S आरडीएनए टुकड़े बढ़ाना कर सकते हैं साहित्य22,23,24 परामर्श द्वारा चुना गया. प्राइमरों को NCBI-ब्लास्ट प्राइमर द्वारा सत्यापित किया गया था, और परिणामों से पता चला कि 18S rDNA के फॉरवर्ड प्राइमर D912 और रिवर्स प्राइमर D978 शैवाल-विशिष्ट प्राइमर थे और कई डायटम प्रजातियों को कवर करते थे। प्रवर्धन के परिणामों ने कोई मानव जीन नहीं दिखाया। उन्हें डायटम परीक्षण के लिए एक विश्वसनीय डीएनए बायोमार्कर का उपयोग किया गया था, इसलिए उन्हें इस प्रयोग के परिणामों के सत्यापन के लिए चुना गया था। डायटम-विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में निकाले गए डीएनए का उपयोग करते हुए, अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रवर्धन उत्पाद से पता चला कि पानी के नमूनों और ऊतकों में डायटम डीएनए बैंड थे, ये वैद्युतकणसंचलन बैंड 250- 500 बीपी (500 बीपी के करीब) के बीच थे, प्राइमर लक्ष्य प्रवर्धन उत्पाद लंबाई आकार (390 -410 बीपी) के अनुरूप। इससे पता चला कि निष्कर्षण प्रोटोकॉल डायटम डीएनए(चित्रा 1ए,बी)निकालने में सफल रहा।

वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर प्रौद्योगिकी कड़े विशिष्टता और उच्च संवेदनशीलता के साथ जीन परीक्षण तकनीक का एक प्रकार है। पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में फ्लोरोसेंट समूहों को जोड़कर, फ्लोरोसेंट संकेतों का संचय वास्तविक समय में पूरी पीसीआर प्रक्रिया की निगरानी कर सकता है, और संवेदनशीलता उच्च25,26 है। उत्पादों विशेष रूप से पारंपरिक पीसीआर द्वारा प्रवर्धित कभी कभी कम सामग्री और अन्य कारणों27 (चित्रा 1 सी) के कारण agarose जेल वैद्युतकणसंचलन में निरीक्षण करने के लिए मुश्किल हो सकता है. वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर के विशिष्ट प्रवर्धन के माध्यम से, चार विशेषता चरणों के साथ एक ठेठ प्रवर्धन वक्र (चित्रा 2) प्राप्त किया गया था। इसी समय, वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर-पिघलने वक्र प्रौद्योगिकी के माध्यम से, प्रवर्धित उत्पाद के डीएनए डबल स्ट्रैंड्स को उच्च तापमान पर एकल किस्में में पिघलाया गया था, डाई को डबल स्ट्रैंड से मुक्त किया गया था, और प्रतिदीप्ति मूल्य कम हो गया था। प्रतिदीप्ति मूल्य में परिवर्तन का पता लगाकर, पिघलने वक्र (चित्रा 3) प्राप्त किया गया था। प्राप्त पिघलने घटता विशेषता चोटियों था, और शिखर मूल्य 85.5 डिग्री सेल्सियस के आसपास था, जो साबित कर दिया कि वहाँ लक्ष्य डीएनए का एक विशिष्ट प्रवर्धन था, यह दर्शाता है कि निकाले गए डीएनए समाधान में डायटम डीएनए था. डाई को सीधे पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन उत्पाद में भी जोड़ा जा सकता है, और पिघलने की अवस्था वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर-पिघलने वक्र तकनीक द्वारा प्राप्त की जा सकती है ताकि यह साबित हो सके कि विशिष्ट प्रवर्धन था या नहीं। इसलिए, जब पारंपरिक पीसीआर-एगरोज जेल वैद्युतकणसंचलन यह साबित नहीं कर सका कि निकाले गए डीएनए समाधान में डायटम डीएनए था या नहीं, तो उच्च संवेदनशीलता वाले वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर तकनीक को सत्यापन और मूल्यांकन के लिए चुना जा सकता है। इस प्रयोग में, वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर-पिघलने वक्र प्रौद्योगिकी केवल गुणात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था.

जैसा कि पिछली रिपोर्ट21 में दिखाया गया है, पारंपरिक मिट्टी डीएनए निष्कर्षण किट और संशोधित रक्त डीएनए निष्कर्षण किट मूल रूप से पानी के नमूनों और ऊतकों से डायटम डीएनए निष्कर्षण के लिए समान थे। डायटम डीएनए निष्कर्षण की लागत अंतर मुख्य रूप से दो किटों की कीमत का अंतर था, और अन्य उपभोग्य सामग्रियों की लागत मूल रूप से समान थी। इस अध्ययन में, आमतौर पर आणविक जीव विज्ञान प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले रक्त डीएनए निष्कर्षण किट का एक सरल सुधार बेहतर प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त कर सकता है, जिसने न केवल शोधकर्ताओं के लिए डायटम डीएनए निष्कर्षण से संबंधित अनुसंधान गतिविधियों में परीक्षण किट का चयन करने की गुंजाइश बढ़ाई बल्कि परीक्षण की लागत को भी कम किया।

इस प्रोटोकॉल की सुधार प्रक्रिया21 प्रकाशित किया गया है. ग्लास मोतियों और भंवर दोलन समय के विभिन्न द्रव्यमान अनुपात के संयोजन को डिजाइन करके, ग्लास मोतियों के दोलन के इष्टतम डीएनए निष्कर्षण की स्थिति को पारंपरिक किट में जोड़ा गया था, इसलिए, विधि फोरेंसिक नमूनों में डायटम डीएनए के निष्कर्षण प्रभाव में सुधार कर सकती है, विशेष रूप से ऊतक नमूनों में। डीएनए निष्कर्षण का इष्टतम संयोजन तब प्राप्त किया गया था जब भंवर दोलन आवृत्ति 3000 आरपीएम थी; भंवर दोलन समय 4 मिनट था, 1.5-2.0 मिमी के व्यास के साथ बड़े कांच के मोतियों का द्रव्यमान अनुपात और 0.4-0.6 मिमी के व्यास के साथ छोटे कांच के मोती 1: 1 था। किट की पारंपरिक विधि और बेहतर विधि के बीच तुलना की गई थी। यह दिखाया गया था कि प्रयुक्त किट डायटम डीएनए को बढ़ाने की जरूरतों को पूरा कर सकती है, और पानी के नमूनों में बेहतर विधि द्वारा किए गए प्रवर्धन के बाद इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड की चमक पारंपरिक विधि की चमक के समान थी, और ऊतक नमूनों में बेहतर विधि द्वारा किए गए प्रवर्धन के बाद इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड उज्जवल थे (चित्र 4)।

Figure 1
चित्रा 1: पीसीआर प्रवर्धन के बाद प्रोटोकॉल का उपयोग करके निकाले गए डीएनए के वैद्युतकणसंचलन परिणाम। डीएनए निकालने के कुल 2 माइक्रोन का उपयोग पीसीआर-विशिष्ट प्रवर्धन के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में किया गया था। पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों को 2% अगारोज जेल के माध्यम से 1x टीएई बफर समाधान पर electrophoresed किया गया था, और 25-30 मिनट के लिए 100V के निरंतर वोल्टेज पर चलाया गया था। सभी जैल के लिए एक D2000 डीएनए सीढ़ी का उपयोग किया गया था। (ए) पीसीआर प्रवर्धन के बाद पानी के नमूनों में डायटम डीएनए के वैद्युतकणसंचलन परिणाम, लेन 1 खाली नियंत्रण है; लेन 2-7 एक ही क्षेत्र में विभिन्न स्थानों से पानी के नमूने हैं। (बी) ऊतक में डायटम डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन के बाद वैद्युतकणसंचलन के परिणाम। लेन 1-6 एक ही फेफड़े के ऊतकों के विभिन्न पदों से निकाले गए ऊतक हैं; लेन 7 रिक्त नियंत्रण है। (सी) एक असफल प्रयोग में, डायटम डीएनए प्रवर्धन के बाद, वैद्युतकणसंचलन के परिणामों ने संबंधित पदों पर वैद्युतकणसंचलन बैंड नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि कोई प्रवर्धन उत्पाद या बहुत कम प्रवर्धन उत्पाद नहीं थे। इस समय, वैद्युतकणसंचलन के परिणाम यह संकेत नहीं दे सके कि प्रस्तावित डीएनए समाधान में डायटम डीएनए था या नहीं, जिसे अधिक संवेदनशील तरीकों (जैसे पीसीआर-पिघलने की वक्र) द्वारा किया जाना आवश्यक था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डायटम डीएनए qPCR प्रवर्धन वक्र। डीएनए समाधान निकालने के कुल 2 माइक्रोन जो पारंपरिक पीसीआर और अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा कोई बैंड नहीं दिखाते थे, का उपयोग वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर प्रणाली तैयार करने और एक कार्यक्रम स्थापित करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया गया था। अंत में, रैखिक आधारभूत चरण के चार विशिष्ट चरणों के साथ विशिष्ट प्रवर्धन घटता, घातीय चरण की शुरुआत, घातीय चरण और पठार चरण प्राप्त किए गए थे। प्रत्येक वक्र का सीटी मान भी विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त किया गया था, यह दर्शाता है कि डीएनए निष्कर्षण सफल रहा। प्रत्येक संख्या संबंधित वक्र के सीटी मान का प्रतिनिधित्व करती है। दहलीज 5.2 है। y-अक्ष का मात्रक Rn है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डायटम डीएनए पिघलने की वक्र। एक वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर प्रणाली का उपयोग करना, एक कार्यक्रम जहां तापमान 60-95 डिग्री सेल्सियस से बढ़ जाता है सेट किया गया था. इसने एक पिघलने की अवस्था उत्पन्न की और विशेष रूप से प्रवर्धित डबल-फंसे डीएनए उच्च तापमान पर एकल किस्में में पिघल गया, डाई डबल स्ट्रैंड से मुक्त थी, और प्रतिदीप्ति मूल्य 0 होने तक कम हो गया। ग्राफ को मूल ग्राफ के नकारात्मक व्युत्क्रम को लेकर प्राप्त किया गया था। एब्सिसा तापमान का प्रतिनिधित्व करता है, उच्चतम शिखर मूल्य के अनुरूप एब्सिसा टीएम मान था, और ग्राफ में पिघलने की वक्र का टीएम मूल्य 85.5 डिग्री सेल्सियस था। प्रत्येक वक्र की संख्या चित्रा 1 सी में प्रत्येक लेन की संख्या से मेल खाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वैद्युतकणसंचलन बेहतर प्रक्रिया के परिणाम। (ए) वैद्युतकणसंचलन ग्लास मनका अनुपात और भंवर दोलन समय के विभिन्न संयोजनों के लिए परिणाम। लेन 1, 4, 7, 10, और 13 जहां बड़े और छोटे कांच के मोतियों का मिश्रित द्रव्यमान अनुपात 1: 2, लेन 2, 5, 8, 11 और 14 है जहां बड़े और छोटे कांच के मोतियों का मिश्रित द्रव्यमान अनुपात 1: 1 है, लेन 3, 6, 9, 12, और 15 जहां बड़े और छोटे कांच के मोतियों का मिश्रित द्रव्यमान अनुपात 2: 1 है, और दोलन समय लेन 1-3 के लिए 2 मिनट, लेन 4-6 के लिए 3 मिनट, लेन 7-9 के लिए 4 मिनट, लेन 10-12 के लिए 5 मिनट और लेन 13-15 के लिए 6 मिनट थे। लेन 16 रिक्त नियंत्रण है। (बी) वैद्युतकणसंचलन सुधार से पहले और बाद में किट निष्कर्षण उत्पादों के पीसीआर प्रवर्धन के बाद परिणाम। लेन 1-3 पानी के नमूने निकालने के लिए पारंपरिक तरीके हैं, लेन 4-6 पानी के नमूने निकालने के लिए बेहतर तरीके हैं, लेन 7-9 ऊतकों को निकालने के लिए पारंपरिक तरीके हैं, लेन 10-12 ऊतकों को निकालने के लिए बेहतर तरीके हैं, लेन 13 एक खाली नियंत्रण है। परिणाम21 से संशोधित किए गए हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: पानी के नमूने और ऊतक के नमूने। उपयोग किए गए पानी के नमूने प्रयोगशाला के पास एक तालाब से लिए गए थे, और उपयोग किए गए ऊतक के नमूनों की पुष्टि डूबे हुए शरीर के फेफड़ों के ऊतक के रूप में हुई थी। (ए) प्रयोगात्मक जल नमूना संग्रह स्थल प्रयोगशाला के पास एक तालाब था। (बी) समृद्ध पानी के नमूने और कटा हुआ फेफड़े के ऊतकों के नमूने। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: डायटम का माइक्रोग्राफ। छवियाँ (ए) और (बी) एक 400x ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत लिया गया. तीर डायटम की ओर इशारा करता है। छवियाँ (C) और (D) एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत ली गई थीं। छवियाँ (ए) और (बी) डूबने वाली जगह पर पानी में डायटम दिखाती हैं। डायटम का नाम फ्रैगिलारिया और नेविकुला है। छवियाँ (सी) और (डी) फेफड़ों में डायटम दिखाती हैं, जिन्हें नित्ज़िया और नेविकुला कहा जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लक्ष्य प्राइमर का नाम अनुक्रम
18S आरडीएनए forword प्राइमर D512 ATTCCAGCTCCAATAGCG
रिवर्स प्राइमर D978 GACTACGATGGTATCTAATC

तालिका 1: उपयोग किए गए प्राइमरों की सूची। यह तालिका इस पेपर में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट प्राइमरों के अनुक्रमों, नामों और लक्ष्य क्षेत्रों का वर्णन करती है।

पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली
2x टैक मिक्स प्रो 10 माइक्रोन
forword प्राइमर D512 0.5 माइक्रोन (10 माइक्रोमोल/एल)
रिवर्स प्राइमर D978 0.5 माइक्रोन (10 माइक्रोमोल/एल)
टेम्पलेट डीएनए 2 माइक्रोन
न्यूक्लियस मुक्त पानी 20 माइक्रोन से
नोट: रिक्त नियंत्रण टेम्पलेट डीएनए न्यूक्लियस मुक्त पानी की एक ही राशि से बदल दिया है.
पीसीआर कार्यक्रम
तापमान समय चक्र
94 डिग्री सेल्सियस 10 मिण्ट 1
94 डिग्री सेल्सियस 45 है 40
50 डिग्री सेल्सियस 45 है
72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
72 डिग्री सेल्सियस 10 मिण्ट 1

तालिका 2: पीसीआर घटक। यह तालिका पारंपरिक पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया प्रणाली के विन्यास और पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया तापमान, समय और चक्रों की संख्या की सेटिंग्स का वर्णन करती है। उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रिया प्रणाली की कुल मात्रा 20 माइक्रोन थी।

वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली
2x qPCR मिश्रण 10 माइक्रोन
forword प्राइमर D512 0.45 माइक्रोन (10 माइक्रोमोल/एल)
रिवर्स प्राइमर D978 0.45 माइक्रोन (10 माइक्रोमोल/एल)
टेम्पलेट डीएनए 2 माइक्रोन
न्यूक्लियस मुक्त पानी 20 माइक्रोन से
नोट: रिक्त नियंत्रण टेम्पलेट डीएनए न्यूक्लियस मुक्त पानी की एक ही राशि से बदल दिया है.
वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर कार्यक्रम
तापमान समय चक्र
94 डिग्री सेल्सियस 10 मिण्ट 1
94 डिग्री सेल्सियस 45 है 40
50 डिग्री सेल्सियस 45 है
72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन

तालिका 3: वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर घटक। यह तालिका वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया प्रणाली के विन्यास और पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया तापमान, समय और चक्रों की संख्या की सेटिंग्स का वर्णन करती है। उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रिया प्रणाली की कुल मात्रा 20 माइक्रोन थी।

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Discussion

डायटम कोशिकाओं को कठोर सिलिसियस सेलदीवारों 17 द्वारा संरक्षित किया जाता है, और डायटम डीएनए निकालने के लिए इस संरचना को नष्ट किया जाना चाहिए। साधारण किट आसानी से डायटम के सिलिसियस खोल को नष्ट नहीं करते हैं; इस प्रकार डायटम डीएनए21 को सफलतापूर्वक निकालना मुश्किल है। हमारी प्रयोगशाला ने सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले रक्त डीएनए निष्कर्षण किट में सुधार किया, डायटम निष्कर्षण की प्रक्रिया में विभिन्न व्यास और विभिन्न द्रव्यमान अनुपात के ग्लास मोतियों को जोड़ा। भंवर दोलन एक ही समय में किया जाता है, जो डायटम खोल को पूरी तरह से तोड़ सकता है और डायटम डीएनए निष्कर्षण प्रभाव में सुधार कर सकता है। जैसा कि पिछली रिपोर्ट21 में दिखाया गया है, कांच के मोतियों का व्यास, दोलन तीव्रता और समय सीधे डीएनए निष्कर्षण की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा। भंवर दोलन समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए (10 मिनट से अधिक नहीं)। यदि समय बहुत लंबा है, तो अत्यधिक कंपन के कारण डीएनए टूट जाएगा। इसी समय, समय बहुत कम नहीं होना चाहिए। यदि समय बहुत कम है (2 मिनट से कम नहीं), तो डायटम खोल पूरी तरह से हटाया नहीं जाएगा, जो डीएनए निष्कर्षण अक्षम कर देगा। ग्लास मोतियों का चयन करते समय विभिन्न परिधीय व्यास के साथ मोतियों का चयन करते हैं, बड़े ग्लास मोती टकराव की ताकत सुनिश्चित करते हैं, और छोटे ग्लास मोती यह सुनिश्चित करते हैं कि टकराव विखंडन प्रक्रिया के दौरान ग्लास मोतियों के बीच कोई मृत टकराव नहीं है, जो शेल ब्रेकिंग की दक्षता में सुधार करता है।

नमूनों से डायटम डीएनए निकालने के लिए, आमतौर पर डायटम को समृद्ध करना आवश्यक होता है। इस प्रक्रिया का डायटम डीएनए के निष्कर्षण पर बहुत प्रभाव पड़ेगा। संवर्धन का उद्देश्य नमूनों में डायटम की एकाग्रता को बढ़ाना है ताकि निकाले गए डायटम डीएनए की एकाग्रता पता लगाने योग्य सीमा में हो सके; वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर और उच्च throughput अनुक्रमण के रूप में अगले चरण अनुप्रयोगों के लिए.

चूंकि डायटम व्यापक रूप से प्रकृति4 में वितरित किए जाते हैं, प्रयोगशाला संदूषण को रोकना सर्वोच्च प्राथमिकता28 है। डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान संदूषण वास्तविक परिणामों और उपयोग मूल्य के नुकसान से विचलन का कारण बनेगा। इसलिए, डायटम डीएनए निकालते समय हमेशा सड़न रोकनेवाला ऑपरेशन के सिद्धांत पर ध्यान दें और बहिर्जात डायटम के संदूषण को कम करने और उससे बचने के लिए सभी संभव उपाय करें। जब ऊतक को मृत शरीर से निकाला जाता है, तो इसे बहिर्जात डायटम द्वारा दूषित होने से रोकने के लिए उपाय किए जाने चाहिए। ऊतक निकाले जाने के बाद, इसे डायटम संदूषण से मुक्त एक कंटेनर या नमूना बैग में संग्रहित किया जाना चाहिए। ऊतक को फॉर्मलाडेहाइड के साथ इलाज नहीं किया जाना चाहिए। ऊतकों को निकालने और प्रसंस्करण के लिए उपकरण को बार-बार आसुत जल के साथ 2-3 बार धोया जाना चाहिए, और फिर पराबैंगनी प्रकाश या उच्च तापमान द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अन्य स्रोतों से डायटम का कोई संदूषण नहीं है। परीक्षण से पहले ऊतक को डायटम-मुक्त उपकरण के साथ सतही ऊतक से काट दिया जाना चाहिए, और फिर परीक्षा के लिए निचले ऊतक को चुनने के लिए उपकरण को प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। इसी समय, ऑपरेशन प्रक्रिया को मानकीकृत करने से प्रयोगशाला संदूषण की समस्या से भी प्रभावी ढंग से बचा जा सकता है।

चूंकि डायटम कई जलीय जीवों का भोजन हैं, इसलिए वे दीर्घकालिक भंडारण29 के दौरान खो जाएंगे। डायटम प्रकाश की स्थिति में भी बढ़ सकते हैं और प्रजनन कर सकते हैं। इसलिए, नमूना लेने के बाद जितनी जल्दी हो सके डीएनए निष्कर्षण कदम शुरू किया जाना चाहिए और नमूने में डायटम के नुकसान को रोकने के लिए त्वरित नमूना प्रसंस्करण किया जाना चाहिए। यदि डीएनए निष्कर्षण तुरंत नहीं किया जा सकता है, तो सभी नमूनों को जमे हुए और अंधेरे में रखा जाना चाहिए ताकि डायटम की कमी को जितना संभव हो सके रोका जा सके।

हमारे शोध ने प्रोटीनेज के पाचन विधि के आधार पर एक आम और सस्ते रक्त डीएनए निष्कर्षण किट का चयन किया, जिसेअच्छे परिणामों के साथ पानी के नमूनों और ऊतकों से डायटम डीएनए निकालने के लिए सुधार किया गया है। ऊतक को प्रोटीनेज K के पूर्ण संपर्क में रहने के लिए पर्याप्त रूप से काटा जाता है और ऊतक पूरी तरह से पच जाता है। सफल निष्कर्षण का संभावित सिद्धांत इस प्रकार है: झटकों के चरण के दौरान, डायटम का कठोर खोल बार-बार प्रभावित होता है और तेजी से चलने वाले कांच के मोतियों के बीच खंडित होता है, कोशिका झिल्ली को उजागर करता है; विभिन्न आकारों के ग्लास मोतियों का विन्यास एकल आकार के ग्लास मोतियों की टक्कर के बीच की खाई को भर सकता है, ताकि टकराव संपर्क सतह को यथासंभव पूरी तरह से कवर किया जा सके; सिलिकॉन शेल खोने के बाद, प्रोटीनेज K डायटम से डीएनए को मुक्त करने में मदद करता है। वर्तमान में उपयोग की जाने वाली मिट्टी डीएनए निष्कर्षण किट की तुलना में, बेहतर रक्त डीएनए निष्कर्षण किट डायटम डीएनए निष्कर्षण की आवश्यकताओं को पूरा कर सकती है, जो अधिक किफायती और प्राप्त करने में आसान है। यह न केवल फोरेंसिक डायटम निरीक्षण के उपयोग की सुविधा प्रदान करता है, बल्कि अन्य डायटम अनुसंधान से संबंधित विषयों के लिए आवेदन के लिए उपयुक्त है और इसका उपयोग अन्य प्लवक डीएनए निष्कर्षण के लिए भी किया जा सकता है। पानी के नमूनों से डायटम डीएनए निकालते समय, उपयोग किए जाने वाले प्रोटीनेज K की मात्रा को पानी में प्लवक की संख्या के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होती है। प्रारंभिक प्रयोगों के आधार पर प्रोटीनेज K की मात्रा को बढ़ाया या घटाया जा सकता है। ऊतकों से डायटम डीएनए निकालते समय, विभिन्न अंग ऊतक प्रकार, ऊतक संदूषण और अन्य कारक पाचन के लिए आवश्यक प्रोटीनेज K की मात्रा को प्रभावित करेंगे। प्रयोग में, किट में प्रोटीनेज K को उपयोग के बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए, अन्यथा, प्रोटीनेज K की निष्क्रियता निष्कर्षण प्रक्रिया को प्रभावित करेगी।

अंत में, डायटम डीएनए निष्कर्षण नमूना और नमूना प्रसंस्करण के बाद जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए, अन्यथा संरक्षण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. नमूना हैंडलिंग, भंडारण, और पूरी निष्कर्षण प्रक्रिया को बहिर्जात डायटम द्वारा संदूषण को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। अन्यथा, यह मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है कि निकाले गए डायटम डीएनए नमूने या बहिर्जात संदूषण में थे। ऊतक को पचाने के लिए प्रोटीनेज के का उपयोग करते समय, इसकी खुराक एक समस्या हो सकती है। अपर्याप्त ऊतक पाचन प्रोटीन के की मात्रा को बढ़ा सकता है। इसलिए, ऊतक को पर्याप्त रूप से कतरनी करना महत्वपूर्ण है। ऊतक का पर्याप्त पाचन भी ऊतक मलबे को सोखना स्तंभ के अंदर प्लाज्मा झिल्ली को बंद करने से रोकता है। झिल्ली अवरुद्ध होने के बाद, रुकावट को बाहर निकालने या बार-बार अपकेंद्रित्र करने के लिए विंदुक टिप का उपयोग करना संभव नहीं है, जो झिल्ली को नुकसान पहुंचाएगा। अंतिम डीएनए समाधान में कई अशुद्धियां होती हैं, जो डायटम डीएनए का पता लगाने को प्रभावित करेंगी। दोलन तीव्रता और समय भी प्रमुख मुद्दे हैं। पहले भंवर दोलन समय 4-5 मिनट पर नियंत्रित किया जाता है, और दोलन आवृत्ति 3000 rpm पर नियंत्रित किया जाता है, अन्यथा, डीएनए निष्कर्षण प्रभावित हो जाएगा. यदि पीसीआर के बाद इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड स्पष्ट नहीं हैं, तो डीएनए टेम्पलेट की मात्रा को और बढ़ाना आवश्यक हो सकता है। इस अध्ययन में निकाला गया डीएनए डीएनए का मिश्रण है, जिसमें डायटम डीएनए और अन्य प्रजातियों के डीएनए शामिल हैं, इसलिए डायटम डीएनए की एकाग्रता निर्धारित नहीं की जा सकती है। इसलिए, यह डीएनए टेम्पलेट्स की उच्च शुद्धता की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है।

अध्ययनों से पता चला है कि विभिन्न डायटम प्रजातियों को विभिन्न प्राइमरों 31,32द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, डायटम 512S आरडीएनए पर केवल डायटम-विशिष्ट प्राइमर D978 और D18 का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या डायटम डीएनए सफलतापूर्वक निकाला गया था, जो सभी डायटम प्रजातियोंको 22,33 को कवर नहीं कर सका। इसके अलावा, चूंकि प्राइमरों की जोड़ी के प्रवर्धन उत्पाद टुकड़े की लंबाई 390-410 बीपी है, इसलिए बेहतर विधि डायटम डीएनए के सभी टुकड़े आकारों का चयन करती है ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि प्रयोगात्मक मापदंडों पर प्रभाव पड़ता है या नहीं, जिसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। बाद के अध्ययन भी निष्कर्षण के प्रभाव का पता लगाने के लिए विभिन्न क्षेत्रों और विभिन्न प्रवर्धन लंबाई के प्राइमरों का उपयोग करेंगे।

पारंपरिक डायटम डीएनए निष्कर्षण विधि की तुलना में, इस विधि में कम लागत और बड़े पैमाने पर डायटम डीएनए निष्कर्षण के मुख्य लाभ हैं। यह डायटम रूपात्मक तरीकों के फायदों को पूरक कर सकता है और प्राथमिक फोरेंसिक प्रयोगशालाओं में डूबने के निदान की जरूरतों को पूरा कर सकता है। साथ ही, यह डायटम डीएनए निष्कर्षण किट की चयन सीमा का भी विस्तार करता है और इसमें एक अच्छी अनुप्रयोग संभावना है। भविष्य में, यह विधि न केवल डायटम डीएनए के निष्कर्षण तक सीमित होगी, बल्कि अन्य शैवाल से डीएनए के निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाएगी।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82060341,81560304) और हैनान प्रांत (YSPTZX202134) के शिक्षाविद इनोवेशन प्लेटफॉर्म वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binding Buffer BioTeke B010006022 rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix Monad 00007547-120506 qPCR Mix
D2000 DNA ladder Real-Times(Beijing) Biotechnology RTM415 Measure the position of electrophoretic bands
D512 Taihe Biotechnology TW21109196 forword primer
D978 Taihe Biotechnology TW21109197 reverse primer
Elution buffer BioTeke B010006022 A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)  70181000 Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column BioTeke B2008006022 Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer BioTeke B010006022 Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol BioTeke B010006022 Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer Miulab MUC881206 oscillatory action
Proteinase K BioTeke B010006022 Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM Qiagen R1116175 real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge Scilogex 9013001121 centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager Tanon 16T5553R-455 gel imaging
Taq Mix Pro Monad 00007808-140534 PCR Mix
Thermo Cycler Zhuhai Hema VRB020A ordinary PCR
Wash Buffer BioTeke B010006022 Remove impurities such as cell metabolites

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