Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die DNA-Extraktion von Kieselalgen unter Verwendung eines modifizierten gemeinsamen DNA-Extraktionskits.
Abstract
Die Untersuchung von Kieselalgen ist ein wesentliches Hilfsmittel in der forensischen Praxis, um festzustellen, ob die Leiche im Wasser ertrunken ist, und um auf den Ertrinkungsort zu schließen. Auch im Bereich Umwelt und Plankton ist die Untersuchung von Kieselalgen ein wichtiger Forschungsinhalt. Die molekularbiologische Testtechnologie für Kieselalgen, die sich auf die Kieselalgen-DNA als primäres Forschungsobjekt konzentriert, ist eine neue Methode der Kieselalgen-Testung. Die DNA-Extraktion von Kieselalgen ist die Grundlage für molekulare Tests von Kieselalgen. Derzeit sind die Kits, die üblicherweise für die DNA-Extraktion von Kieselalgen verwendet werden, teuer, was die Kosten für die Durchführung entsprechender Forschungen erhöht. Unser Labor hat das allgemeine Vollblut-Genom-DNA-Schnellextraktionskit verbessert und einen zufriedenstellenden DNA-Extraktionseffekt für Kieselalgen erzielt, wodurch eine alternative, wirtschaftliche und erschwingliche DNA-Extraktionslösung auf der Basis von Glasperlen für verwandte Forschungen bereitgestellt wird. Die mit diesem Protokoll extrahierte Diatomeen-DNA könnte viele nachgelagerte Anwendungen wie PCR und Sequenzierung erfüllen.
Introduction
In der forensischen Praxis ist die Feststellung, ob eine im Wasser gefundene Leiche ertrunken ist oder nach dem Tod ins Wasser geworfen wurde, für die ordnungsgemäße Lösung des Fallesunerlässlich 1. Es ist auch eines der schwierigen Themen, die in der forensischen Praxis dringend gelöst werden müssen2. Kieselalgen sind in der Natur (insbesondere im Wasser) reichlich vorhanden3,4. Während des Prozesses des Ertrinkens haben die Menschen aufgrund von Hypoxie und Stressreaktion intensive Atembewegungen und atmen eine große Menge Ertrinkungsflüssigkeit ein. Daher gelangen die Kieselalgen im Wasser mit der ertrinkenden Flüssigkeit in die Lunge, und einige Kieselalgen können durch die Alveolar-Kapillar-Barriere in den Blutkreislauf gelangen und sich mit dem Blutfluss auf innere Organe ausbreiten 5,6. Der Nachweis von Kieselalgen in inneren Geweben und Organen wie Lunge, Leber und Knochenmark ist ein starker Beweis für das Ertrinken vor dem Tod 7,8. Derzeit basiert die forensische Untersuchung von Kieselalgen hauptsächlich auf morphologischen Testmethoden. Nach einer Reihe von Vorverdauungen des Gewebes werden die morphologischen, qualitativen und quantitativen Schätzungen der unverdauten Kieselalgen unter dem Mikroskop durchgeführt. Während dieser Zeit müssen gefährliche und umweltschädliche Reagenzien wie Salpetersäure verwendet werden. Dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert von den Forschern ein solides taxonomisches Fachwissen und umfangreiche Erfahrung. All dies stellt das forensische Personal vor gewisse Herausforderungen9. Die Diatomeen-DNA-Testtechnologie ist eine neue Technologie für Diatomeentests, die in den letzten Jahren entwickelt wurde 10,11,12. Diese Technologie realisiert die Speziesidentifikation von Kieselalgen durch Analyse der spezifischen DNA-Sequenzzusammensetzung von Kieselalgen13,14. Die PCR-Technologie und die Sequenzierungstechnologie sind häufig verwendete technische Methoden, deren Grundlage jedoch die erfolgreiche Extraktion von DNA aus Kieselalgen ist. Kieselalgen haben jedoch eine spezielle Struktur, die sich von anderen Organismen unterscheidet, wodurch sich auch ihre DNA-Extraktionstechniken unterscheiden.
Die Zellwand der Kieselalge weist einen hohen Verkieselungsgrad auf, und ihr Hauptbestandteil ist Siliziumdioxid 15,16,17. Die kieselsäurehaltige Zellwand ist sehr hart und muss zerstört werden, bevor die DNA extrahiert werden kann. Gewöhnliche DNA-Extraktionskits sind oft schwierig direkt für die Extraktion von Kieselalgen-DNA zu verwenden, da sie die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht zerstören können18. Daher ist die Zerstörung der kieselsäurehaltigen Schale von Kieselalgen eines der wichtigsten technischen Probleme, die bei der Extraktion von Kieselalgen-DNA gelöst werden müssen.
Da die Anzahl der Kieselalgen, die in forensischen Forschungsproben enthalten sind, seien es Wasserproben oder Organe und Gewebe von ertrunkenen Körpern, oft begrenzt ist, ist es gleichzeitig notwendig, Kieselalgen anzureichern. Das Wesen der Anreicherung ist die Trennung von Substanzen. Wenn Sie versuchen, Kieselalgen zu sammeln, minimieren Sie den Gehalt an anderen Materialkomponenten (störende Komponenten). Bei forensischen Arbeiten verwenden Laboratorien häufig Zentrifugations- oder Membranfiltrationsanreicherungsmethoden, um Diatomeenzellen zu trennen19. Da Vakuumpumpen jedoch nicht weit verbreitet sind, wird die Methode der Membrananreicherung in gewöhnlichen forensischen Primärlabors nicht häufig eingesetzt. Daher ist die Zentrifugationsmethode immer noch üblicherweise die Anreicherung von Kieselalgen in forensischen Laboratorien20.
Die DNA-Extraktion aus Kieselalgen wird derzeit vor allem in der forensischen Praxis eingesetzt, und es gibt erhebliche Einschränkungen bei ihrer Anwendung. Derzeit gibt es auf dem Markt nur wenige DNA-Extraktionskits für Kieselalgen, die in der Forensik verwendet werden, und sie sind im Allgemeinen teuer21. In diesem Artikel wird eine verbesserte Methode zur Extraktion von Kieselalgen-DNA vorgestellt, die die Extraktion von Kieselalgen-DNA einfach, bequem und kostengünstig macht. Dies erhöht die Anwendung der anschließenden molekularbiologischen Untersuchung von Kieselalgen und kann Probleme im Zusammenhang mit dem Ertrinken in der Gerichtsmedizin durch Kieselalgentests besser lösen. Diese Methode bricht die kieselsäurehaltigen Zellwände von Kieselalgen auf, indem Glasperlen hinzugefügt und eine geeignete Zeit für den Wirbel festgelegt wird. Auf diese Weise lysieren die Proteinase K und die Bindungslösung die Zellen schnell und inaktivieren verschiedene Enzyme in den Zellen. Die genomische DNA wird in der Matrixmembran in der Adsorptionssäule absorbiert und schließlich durch den Elutionspuffer eluiert. Ein solches verbessertes Vollblut-Genextraktionskit verbessert den Diatomeen-DNA-Extraktionseffekt des Blutkits in forensischen Untersuchungsmaterialien, reduziert die Kosten für die Diatomeen-DNA-Extraktion in der forensischen Praxis und kann besser auf die forensische Forschung an der Basis angewendet werden.
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Protocol
Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Hainan Medical University genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Gewebeproben gelten nicht als Studien mit menschlichen Probanden. Diese Proben wurden für die forensische pathologische Diagnose gewonnen, der Rest wurde für die Extraktion von Kieselalgen-DNA in diesem Experiment verwendet. Forscher können nicht ohne weiteres Personen identifizieren, um die informierte Zustimmung der relevanten Interessengruppen einzuholen.
HINWEIS: Um die allgemeine Anwendbarkeit der in diesem Experiment berichteten Forschungsmethode zu gewährleisten, folgte dieses Experiment im Wesentlichen der Bedienungsanleitung des verwendeten Kits, und es wurden nur einige Schritte geändert. Die in diesem Experiment verwendeten Wasserproben wurden nach dem Zufallsprinzip aus Teichen in der Nähe des Labors entnommen (Ergänzende Abbildung 1A). In diesem Experiment wurde das Lungengewebe des ertrunkenen Körpers als Forschungsgewebe bestätigt, um das Extraktionsprotokoll zu demonstrieren (Ergänzende Abbildung 1B). In der forensischen Praxis ist es manchmal auch notwendig, andere Organe und Gewebe von ertrunkenen Körpern (wie Leber, Milz, Niere, Knochenmark usw.) zu verwenden, um die DNA von Kieselalgen zu extrahieren, was geringfügige entsprechende Verbesserungen dieser experimentellen Methode erfordert, die im entsprechenden Abschnitt des Experiments erläutert werden. Die in diesem Experiment verwendeten Lungengewebeproben stammten von Leichen, die eindeutig in forensischen Fällen ertrunken waren. Es wurden morphologische Tests durchgeführt, um nachzuweisen, dass das Lungengewebe Kieselalgen enthält (Ergänzende Abbildung 2).
1. Vorbehandlung der Proben
- Vorbehandlung von Wasserproben
- Nehmen Sie 10 ml Wasserprobe in das Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 13.400 x g . 9,8 ml Überstand vorsichtig mit einer Pipettenpistole entsorgen und etwa 200 μl angereicherte Kieselalgenwasserprobe, die am Boden verbleibt, in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
HINWEIS: Zuerst kann ein Vorexperiment durchgeführt werden, und die Anfangsmenge kann erhöht werden, wenn eine 10-ml-Wasserprobe für die Anreicherung nicht ausreicht.
- Nehmen Sie 10 ml Wasserprobe in das Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 13.400 x g . 9,8 ml Überstand vorsichtig mit einer Pipettenpistole entsorgen und etwa 200 μl angereicherte Kieselalgenwasserprobe, die am Boden verbleibt, in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
- Vorbehandlung von Gewebeproben
- Entnehmen Sie 0,5 g des Lungenrandgewebes aus dem ertrunkenen Körper, hacken oder zerkleinern Sie das Lungengewebe vollständig, bis es schlammig wird. Die Verhinderung der Kontamination von exogenen Kieselalgen ist der Kern dieses Schritts. Schneiden Sie das Gewebe wiederholt mit einer Schere in Stücke.
2. DNA-Extraktion
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Verwendung einer Tischzentrifuge mit einer Zentrifugalkraft von 14.500 x g; Vor Beginn des Experiments muss ein auf 70 °C vorgeheiztes Wasserbad (oder Metallbad) vorbereitet werden. Alle Schritte müssen streng nach den Grundsätzen des aseptischen Betriebs erfolgen.
- Zusammenstellung von Wasserproben und Geweben
HINWEIS: Die DNA-Extraktionsmethode für Wasserproben und Gewebekieselalgen ist identisch.- Glasperlen in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen geben, das die vorbehandelte Wasserprobe enthält. 10x-15x invertieren, um gut zu mischen. Die zugesetzten Glasperlen setzen sich aus großen und kleinen Glasperlen zusammen, die in einem Massenverhältnis von 1:1 gemischt sind. Der Durchmesser der großen Glasperlen beträgt 1,5-2,0 mm und der der kleinen Glasperlen 0,4-0,6 mm.
- Nehmen Sie 0,5 g fein gehacktes Gewebe und geben Sie Glasperlen in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, das das Gewebe enthält, wie oben beschrieben. 10x-15x invertieren, um zu mischen.
- Geben Sie 40 μl Proteinase K (20 mg/ml) in die Röhrchen. 15 Minuten bei Raumtemperatur stellen, in dieser Zeit umdrehen und alle 3 Minuten 10x mischen.
HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut ist, kann die Menge an Proteinase K entsprechend erhöht werden, bis die Lösung klar wird. - 200 μl Bindepuffer in die Zentrifugenröhrchen geben, sofort vortexen und 4 min mischen (Oszillationsmischfrequenz: 3000 U/min).
HINWEIS: In diesem Schritt sollten die Schüttelintensität und -zeit streng kontrolliert werden, um eine ausreichende Mischintensität und -zeit zu gewährleisten. - Die Zentrifugenröhrchen für 10 min in ein 70 °C warmes Wasserbad geben, dann wird die Lösung klar.
- Geben Sie 100 μl Isopropanol in die Zentrifugenröhrchen, wirbeln Sie vor und mischen Sie 15 s lang, zu diesem Zeitpunkt kann es zu einer Ausfällung von Flockungsmitteln kommen.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, in den oben genannten Operationsschritten gut mit entsprechender Stärke zu mischen, aber starkes Schütteln sollte vermieden werden, um DNA-Scherungen zu vermeiden. - Die im vorherigen Schritt erhaltene Lösung wird zusammen mit dem Flockungsmittelniederschlag in die Adsorptionskolonne gegeben (die Adsorptionssäule wird in das Sammelröhrchen gestellt). Die Länge der Adsorptionssäule beträgt 3,0 cm, der Durchmesser 1,0 cm und die Adsorptionsmatrix ist eine Siliziummatrixmembran.
- Bei 8.000 x g 30 s zentrifugieren, die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen und die Adsorptionssäule wieder in das Sammelröhrchen einsetzen.
- 500 μl Inhibitorentfernungspuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.
- 700 μl Waschpuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.
HINWEIS: Geben Sie vor dem ersten Gebrauch die angegebene Menge an absolutem Ethanol in die Waschpufferflasche. - 500 μl Waschpuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.
- Setzen Sie die Adsorptionssäule wieder in das leere Sammelröhrchen ein. Bei 14.500 x g für 2 min zentrifugieren und den Waschpuffer so weit wie möglich entfernen, um zu vermeiden, dass das restliche Ethanol im Waschpuffer nachgeschaltete Reaktionen hemmt.
- Nehmen Sie die Adsorptionssäule heraus und geben Sie sie in ein sauberes Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 100 μl Elutionspuffer in den mittleren Teil der Adsorptionsmembran.
- Die Adsorptionssäule wird für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur platziert und 1 Minute lang bei 13.400 x g zentrifugiert.
- Die im vorherigen Schritt erhaltene Lösung wird wieder in die zentrifugale Adsorptionskolonne gegeben. Die Zentrifugaladsorptionssäule wird 2 min lang bei Raumtemperatur und 1 min bei 13.400 x g zentrifugiert.
HINWEIS: Der Elutionspuffer sollte in einem 70 °C warmen Wasserbad für ca. 10 min vorgewärmt werden. Das Elutionsvolumen sollte nicht weniger als 50 μl betragen; Andernfalls wird die DNA-Ausbeute reduziert. - Lagern Sie die extrahierte Kieselalgen-DNA für die zukünftige Verwendung bei 2-8 °C. Wenn die DNA-Lösung längere Zeit gelagert werden soll, lagern Sie sie bei -20 °C.
3. PCR-Test
HINWEIS: Da der Gehalt an Kieselalgen in forensischen Proben oft gering ist, können die Gewebeprobenextrakte der ertrunkenen Leichen auch unterschiedlich starke Gewebe und Organe (wie z.B. die Lunge in diesem Experiment) mit eigener DNA enthalten. Daher spiegelt der direkte Nachweis der Gesamt-DNA in DNA-Extrakten nicht die Situation der Kieselalgen-DNA-Extraktion wider. In diesem Experiment wurden Diatomeen-spezifische Primer ausgewählt und PCR-Produkte verwendet, um die Diatomeen-DNA-Extraktion im Extrakt zu bewerten. Die Produkte können durch Agarose-Gelelektrophorese beobachtet und analysiert werden und können auch durch eine quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Schmelzkurve analysiert werden, die eine höhere Empfindlichkeit aufweist.
- Fügen Sie 2 μl der extrahierten DNA aus Wasserproben und Geweben als Vorlage hinzu. Wählen Sie eine der beiden folgenden Inspektionsmethoden aus.
- Konventioneller PCR-Test
- Verwenden Sie Primer22 , die Kieselalgen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1.
- Legen Sie das PCR-Reaktionssystem und die Amplifikationsbedingungen entsprechend den Eigenschaften der Primer fest. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2.
- Führen Sie die Produkte der PCR-Amplifikation auf 2%igem Agarose-Gel aus. Beobachten und analysieren Sie die Bildgebung mit einem Gel-Imager.
- Fluoreszierender quantitativer PCR-Test
- Verwenden Sie die oben genannten Primer, die Diatomeen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können, um ein quantitatives Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Reaktionssystem herzustellen. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 3.
- Führen Sie eine PCR-Amplifikation durch und analysieren Sie die erhaltene Amplifikationskurve und die Ct-Werte. Stellen Sie gleichzeitig ein Programm ein, schmelzen Sie die Doppelstränge der amplifizierten Produkte schrittweise durch fluoreszierende quantitative PCR-Schmelzkurventechnologie in Einzelstränge und analysieren Sie dann die erhaltenen Schmelzkurven.
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Representative Results
Da die DNA-Lösung, die mit der derzeit verwendeten DNA-Extraktionsmethode extrahiert wird, alle DNA-Bestandteile aus verschiedenen Quellen in der Probe enthält, war die durch dieses Protokoll gewonnene DNA keine Ausnahme. Die DNA-Lösung war also nicht nur eine Lösung der genomischen DNA von Kieselalgen. Die Primer, die Diatomeen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können, wurden unter Konsultation der Literaturausgewählt 22,23,24. Die Primer wurden mit NCBI-Blast Primer verifiziert, und die Ergebnisse zeigten, dass der Forward Primer D512 und der Reverse Primer D978 von 18S rDNA algenspezifische Primer waren und viele Diatomeenarten abdeckten. Die Amplifikationsergebnisse zeigten keine menschlichen Gene. Sie wurden als zuverlässiger DNA-Biomarker für Diatomeentests verwendet, so dass sie für die Verifizierung der Ergebnisse dieses Experiments ausgewählt wurden. Unter Verwendung der extrahierten DNA als Vorlage für die Diatomeen-spezifische PCR-Amplifikation zeigte das Amplifikationsprodukt durch Agarose-Gelelektrophorese, dass Wasserproben und Gewebe Diatomeen-DNA-Banden aufwiesen, diese Elektrophoresebanden lagen zwischen 250 und 500 bp (näher an 500 bp), in Übereinstimmung mit der Größe des Primer-Target-Amplifikationsprodukts (390 -410 bp). Dies zeigte, dass das Extraktionsprotokoll bei der Extraktion von Diatomeen-DNA erfolgreich war (Abbildung 1A,B).
Die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Technologie ist eine Art Gentesttechnologie mit strenger Spezifität und hoher Sensitivität. Durch die Zugabe fluoreszierender Gruppen im PCR-Reaktionssystem kann die Akkumulation von Fluoreszenzsignalen dazu führen, dass der gesamte PCR-Prozess in Echtzeit überwacht wird, und die Empfindlichkeit ist hoch25,26. Produkte, die spezifisch durch konventionelle PCR amplifiziert werden, können in der Agarose-Gelelektrophorese aufgrund des geringen Gehalts und aus anderen Gründen manchmal schwer zu beobachtensein 27 (Abbildung 1C). Durch die spezifische Amplifikation der quantitativen Real-Time-Fluoreszenz-PCR wurde eine typische Amplifikationskurve mit vier charakteristischen Stadien erhalten (Abbildung 2). Gleichzeitig wurden durch die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Schmelzkurventechnologie die DNA-Doppelstränge des amplifizierten Produkts bei hoher Temperatur zu Einzelsträngen geschmolzen, der Farbstoff wurde von den Doppelsträngen befreit und der Fluoreszenzwert verringert. Durch die Detektion der Änderung des Fluoreszenzwertes wurde die Schmelzkurve erhalten (Abbildung 3). Die erhaltenen Schmelzkurven wiesen charakteristische Peaks auf, und der Peakwert lag bei etwa 85,5 °C, was bewies, dass es eine spezifische Amplifikation der Ziel-DNA gab, was darauf hindeutet, dass sich in der extrahierten DNA-Lösung Diatomeen-DNA befand. Der Farbstoff könnte auch direkt dem herkömmlichen PCR-Amplifikationsprodukt zugesetzt werden, und die Schmelzkurve könnte durch quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Schmelzkurventechnologie erhalten werden, um nachzuweisen, ob eine spezifische Amplifikation vorliegt. Wenn die konventionelle PCR-Agarose-Gelelektrophorese nicht nachweisen konnte, ob die extrahierte DNA-Lösung Kieselalgen-DNA enthielt, konnte daher die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Technologie mit höherer Empfindlichkeit für die Verifizierung und Bewertung ausgewählt werden. In diesem Experiment wurde die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Schmelzkurventechnologie nur für die qualitative Analyse verwendet.
Wie in einem früheren Bericht21 gezeigt, waren das traditionelle Boden-DNA-Extraktionskit und das modifizierte Blut-DNA-Extraktionskit für die Extraktion von Kieselalgen-DNA aus Wasserproben und Geweben im Wesentlichen gleich. Der Kostenunterschied bei der DNA-Extraktion aus Kieselalgen bestand hauptsächlich aus dem Preisunterschied der beiden Kits, und die Kosten für andere Verbrauchsmaterialien waren im Grunde gleich. In dieser Studie könnte eine einfache Verbesserung des Blut-DNA-Extraktionskits, das üblicherweise in molekularbiologischen Experimenten verwendet wird, bessere experimentelle Ergebnisse erzielen, was nicht nur den Spielraum für die Forscher bei der Auswahl des Testkits bei Forschungsaktivitäten im Zusammenhang mit der DNA-Extraktion von Kieselalgen erhöht, sondern auch die Kosten für Tests senkt.
Der Verbesserungsprozess dieses Protokolls wurde veröffentlicht21. Durch die Kombination verschiedener Massenverhältnisse von Glasperlen und Vortex-Oszillationszeit wurden die optimalen DNA-Extraktionsbedingungen für die Oszillation von Glasperlen in das konventionelle Kit aufgenommen, so dass die Methode den Extraktionseffekt von Diatomeen-DNA in forensischen Proben, insbesondere in Gewebeproben, verbessern konnte. Die optimale Kombination der DNA-Extraktion wurde erhalten, wenn die Wirbelschwingfrequenz 3000 U/min betrug; Die Vortex-Oszillationszeit betrug 4 min, das Massenverhältnis von großen Glasperlen mit einem Durchmesser von 1,5-2,0 mm und kleinen Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,4-0,6 mm war 1:1. Es wurde ein Vergleich zwischen der konventionellen Methode des Kits und der verbesserten Methode durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass das verwendete Kit die Anforderungen an die Amplifikation von Diatomeen-DNA erfüllen konnte, und die Helligkeit der elektrophoretischen Banden nach der Amplifikation, die mit der verbesserten Methode in Wasserproben durchgeführt wurde, war ähnlich der Helligkeit der herkömmlichen Methode, und die elektrophoretischen Banden nach der Amplifikation, die mit der verbesserten Methode in Gewebeproben durchgeführt wurde, waren heller (Abbildung 4).
Abbildung 1: Elektrophorese-Ergebnisse von DNA, die mit dem Protokoll nach PCR-Amplifikation extrahiert wurde. Insgesamt wurden 2 μL DNA-Extrakt als DNA-Template für die PCR-spezifische Amplifikation verwendet. Die PCR-Amplifikationsprodukte wurden auf 1x TAE-Pufferlösung durch 2%iges Agarose-Gel elektrophoresiert und bei einer konstanten Spannung von 100 V für 25-30 min betrieben. Für alle Gele wurde eine D2000 DNA-Leiter verwendet. (A) Die Elektrophoreseergebnisse von Kieselalgen-DNA in Wasserproben nach PCR-Amplifikation, Spur 1 ist eine Blindkontrolle; Bei den Bahnen 2-7 handelt es sich um Wasserproben von verschiedenen Orten im selben Gebiet. (B) Die Ergebnisse der Elektrophorese nach PCR-Amplifikation von Kieselalgen-DNA im Gewebe. Die Bahnen 1-6 sind die Gewebe, die aus verschiedenen Positionen desselben Lungengewebes herausgeschnitten wurden. Spur 7 ist das leere Steuerelement. (C) In einem erfolglosen Experiment zeigten die Elektrophoreseergebnisse nach der DNA-Amplifikation von Kieselalgen keine Elektrophoresebanden an den entsprechenden Positionen, was darauf hindeutet, dass keine oder zu wenige Amplifikationsprodukte vorhanden waren. Zu diesem Zeitpunkt konnten die Elektrophoreseergebnisse nicht anzeigen, ob sich in der vorgeschlagenen DNA-Lösung Kieselalgen-DNA befand, die mit empfindlicheren Methoden (z. B. einer PCR-Schmelzkurve) durchgeführt werden musste. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kieselalgen-DNA-qPCR-Amplifikationskurve. Insgesamt 2 μl DNA-Lösungsextrakt, der mittels konventioneller PCR und Agarose-Gelelektrophorese keine Banden aufwies, wurden als Vorlage verwendet, um ein quantitatives Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-System herzustellen und ein Programm einzurichten. Schließlich wurden typische Amplifikationskurven mit vier charakteristischen Stadien der linearen Basisphase, dem Beginn der exponentiellen Phase, der exponentiellen Phase und der Plateauphase erhalten. Der Ct-Wert jeder Kurve wurde ebenfalls durch Analyse ermittelt, was darauf hindeutet, dass die DNA-Extraktion erfolgreich war. Jede Zahl steht für den Ct-Wert der entsprechenden Kurve. Der Schwellenwert liegt bei 5,2. Die Einheit der y-Achse ist Rn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Schmelzkurve der Diatomeen-DNA. Mit Hilfe eines quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Systems wurde ein Programm eingestellt, bei dem die Temperatur von 60-95 °C ansteigt. Dies erzeugte eine Schmelzkurve und die spezifisch amplifizierte doppelsträngige DNA schmolz bei hohen Temperaturen in Einzelstränge, der Farbstoff war frei von den Doppelsträngen und der Fluoreszenzwert nahm ab, bis er 0 war. Das Diagramm wurde erhalten, indem der negative Kehrwert des ursprünglichen Diagramms genommen wurde. Die Abszisse repräsentierte die Temperatur, die Abszisse entsprach dem höchsten Spitzenwert war der Tm-Wert und der Tm-Wert der Schmelzkurve in der Grafik betrug 85,5 °C. Die Nummerierung der einzelnen Kurven entspricht der Nummerierung der einzelnen Fahrspuren in Abbildung 1C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Elektrophorese-Ergebnisse des verbesserten Prozesses. (A) Elektrophorese-Ergebnisse für verschiedene Kombinationen von Glasperlenverhältnissen und Vortex-Oszillationszeiten. Bahnen 1, 4, 7, 10 und 13, wobei das Mischmassenverhältnis von großen und kleinen Glasperlen 1:2 beträgt, Bahnen 2, 5, 8, 11 und 14, wobei das Mischmassenverhältnis von großen und kleinen Glasperlen 1:1 beträgt, Bahnen 3, 6, 9, 12 und 15, wobei das Mischmassenverhältnis von großen und kleinen Glasperlen 2:1 beträgt, Die Oszillationszeiten betrugen 2 min für die Bahnen 1-3, 3 min für die Bahnen 4-6, 4 min für die Bahnen 7-9, 5 min für die Bahnen 10-12 und 6 min für die Bahnen 13-15. Spur 16 ist das leere Steuerelement. (B) Elektrophoreseergebnisse nach PCR-Amplifikation der Kit-Extraktionsprodukte vor und nach der Verbesserung. Die Bahnen 1 bis 3 sind herkömmliche Verfahren zur Extraktion von Wasserproben, die Bahnen 4 bis 6 sind verbesserte Verfahren zur Extraktion von Wasserproben, die Bahnen 7 bis 9 sind konventionelle Verfahren zur Extraktion von Geweben, die Bahnen 10 bis 12 sind verbesserte Verfahren zur Extraktion von Geweben, die Spur 13 ist eine Blindsteuerung. Die Ergebnisse wurden von21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Wasserproben und Gewebeproben. Die verwendeten Wasserproben wurden aus einem Teich in der Nähe des Labors entnommen, und die verwendeten Gewebeproben wurden als Lungengewebe des ertrunkenen Körpers bestätigt. (A) Die Versuchsstelle für die Entnahme von Wasserproben war ein Teich in der Nähe des Labors. (B) Angereicherte Wasserproben und geschredderte Lungengewebeproben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahme der Kieselalge. Die Bilder (A) und (B) wurden unter einem 400-fachen Lichtmikroskop aufgenommen. Der Pfeil zeigt auf Kieselalgen. Die Bilder (C) und (D) wurden unter dem Elektronenmikroskop aufgenommen. Die Bilder (A) und (B) zeigen die Kieselalgen im Wasser an der Ertrinkungsstelle. Die Kieselalgen mit den Namen Fragilaria und Navicula. Die Bilder (C) und (D) zeigen Kieselalgen in der Lunge, die Nitzschia und Navicula genannt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
| Ziel | Name der Fibel | Reihenfolge |
| 18S rDNA | forword Fibel D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| Umkehr-Primer D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabelle 1: Liste der verwendeten Primer. In dieser Tabelle werden die Sequenzen, Namen und Zielregionen bestimmter Primer beschrieben, die in diesem Artikel verwendet werden.
| PCR-Reaktionssystem | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μl | ||
| forword Fibel D512 | 0,5 μl (10 μmol/l) | ||
| Umkehr-Primer D978 | 0,5 μl (10 μmol/l) | ||
| Template DNA | 2 μl | ||
| Nuklease-freies Wasser | bis 20 μL | ||
| Hinweis: Die DNA der leeren Kontrollschablone wird durch die gleiche Menge Nuklease-freies Wasser ersetzt. | |||
| PCR-Programm | |||
| Temperatur | Zeit | Zyklen | |
| 94 °C | 10 min | 1 | |
| 94 °C | 45 Sek. | 40 | |
| 50 °C | 45 Sek. | ||
| 72 °C | 1 Minute | ||
| 72 °C | 10 min | 1 | |
Tabelle 2: PCR-Komponenten. Diese Tabelle beschreibt die Konfiguration des Reaktionssystems für die konventionelle PCR und die Einstellungen der Reaktionstemperatur, der Zeit und der Anzahl der Zyklen für die PCR. Das Gesamtvolumen des verwendeten Reaktionssystems betrug 20 μL.
| Quantitatives Echtzeit-PCR-Reaktionssystem | |||
| 2x qPCR-Mischung | 10 μl | ||
| forword Fibel D512 | 0,45 μl (10 μmol/l) | ||
| Umkehr-Primer D978 | 0,45 μl (10 μmol/l) | ||
| Template DNA | 2 μl | ||
| Nuklease-freies Wasser | bis 20 μL | ||
| Hinweis: Die DNA der leeren Kontrollschablone wird durch die gleiche Menge Nuklease-freies Wasser ersetzt. | |||
| Quantitatives Echtzeit-PCR-Programm | |||
| Temperatur | Zeit | Zyklen | |
| 94 °C | 10 min | 1 | |
| 94 °C | 45 Sek. | 40 | |
| 50 °C | 45 Sek. | ||
| 72 °C | 1 Minute | ||
Tabelle 3: Quantitative Echtzeit-PCR-Komponenten. In dieser Tabelle werden die Konfiguration des Reaktionssystems für die quantitative Echtzeit-PCR und die Einstellungen der Reaktionstemperatur, der Reaktionszeit und der Anzahl der Zyklen für die PCR beschrieben. Das Gesamtvolumen des verwendeten Reaktionssystems betrug 20 μL.
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Discussion
Kieselalgenzellen sind durch harte kieselsäurehaltige Zellwände17 geschützt, und diese Struktur muss zerstört werden, um Kieselalgen-DNA zu extrahieren. Gewöhnliche Kits zerstören die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht leicht; Daher ist es schwierig, Diatomeen-DNA erfolgreich zu extrahieren21. Unser Labor hat das am häufigsten verwendete Blut-DNA-Extraktionskit verbessert, indem es Glasperlen mit unterschiedlichen Durchmessern und unterschiedlichen Massenverhältnissen bei der Extraktion von Kieselalgen hinzugefügt hat. Gleichzeitig wird eine Vortex-Oszillation durchgeführt, die die Kieselalgenhülle vollständig aufbrechen und den Extraktionseffekt der Kieselalgen-DNA verbessern kann. Wie im vorherigen Bericht21 gezeigt, würden der Durchmesser der Glasperlen, die Schwingungsintensität und die Zeit die Qualität der DNA-Extraktion direkt beeinflussen. Die Vortex-Oszillationszeit sollte nicht zu lang sein (nicht mehr als 10 min). Wenn die Zeit zu lang ist, bricht die DNA aufgrund übermäßiger Vibrationen. Gleichzeitig sollte die Zeit nicht zu kurz sein. Wenn die Zeit zu kurz ist (nicht weniger als 2 Minuten), wird die Kieselalgenhülle nicht vollständig entfernt, was die DNA-Extraktion ineffizient macht. Bei der Auswahl von Glasperlen werden Perlen mit unterschiedlichen Umfangsdurchmessern ausgewählt, die großen Glasperlen sorgen für die Kollisionsfestigkeit, und die kleinen Glasperlen sorgen dafür, dass es während des Kollisionsfragmentierungsprozesses zu keiner toten Kollision zwischen den Glasperlen kommt, was die Effizienz des Schalenbruchs verbessert.
Um Kieselalgen-DNA aus Proben zu extrahieren, ist es in der Regel notwendig, Kieselalgen anzureichern. Dieser Prozess wird einen großen Einfluss auf die Extraktion von Kieselalgen-DNA haben. Der Zweck der Anreicherung besteht darin, die Konzentration von Kieselalgen in Proben zu erhöhen, so dass die Konzentration der extrahierten Kieselalgen-DNA im nachweisbaren Bereich liegen kann. für die nächsten Anwendungen wie die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR und die Hochdurchsatz-Sequenzierung.
Da Kieselalgen in der Natur weit verbreitet sind4, hat die Vermeidung von Laborkontaminationen oberste Priorität28. Eine Kontamination während des DNA-Extraktionsprozesses führt zu Abweichungen von den tatsächlichen Ergebnissen und zu einem Verlust des Gebrauchswerts. Achten Sie daher bei der Extraktion von Diatomeen-DNA immer auf das Prinzip des aseptischen Betriebs und ergreifen Sie alle möglichen Maßnahmen, um die Kontamination von exogenen Kieselalgen zu reduzieren und zu vermeiden. Wenn das Gewebe aus dem toten Körper entnommen wird, sollten Maßnahmen ergriffen werden, um zu verhindern, dass es durch exogene Kieselalgen kontaminiert wird. Nachdem das Gewebe entnommen wurde, sollte es in einem Behälter oder Probenbeutel aufbewahrt werden, der frei von Diatomeenverunreinigungen ist. Das Gewebe sollte nicht mit Formaldehyd behandelt werden. Die Geräte zum Extrahieren und Verarbeiten von Geweben sollten wiederholt 2-3 Mal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann mit ultraviolettem Licht oder hoher Temperatur sterilisiert werden, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination von Kieselalgen aus anderen Quellen gibt. Das Gewebe vor dem Test sollte mit einem Diatomeen-freien Instrument vom oberflächlichen Gewebe abgeschnitten werden, und dann sollte das Instrument ausgetauscht werden, um das untere Gewebe für die Untersuchung herauszupicken. Gleichzeitig kann durch die Standardisierung des Betriebsprozesses auch das Problem der Laborkontamination effektiv vermieden werden.
Da Kieselalgen die Nahrung vieler Wasserorganismen sind, gehen sie bei längerer Lagerung verloren29. Kieselalgen können auch unter Lichtbedingungen wachsen und sich vermehren. Daher sollte der DNA-Extraktionsschritt so schnell wie möglich nach der Probenahme eingeleitet und eine schnelle Probenverarbeitung durchgeführt werden, um den Verlust von Kieselalgen in der Probe zu verhindern. Wenn die DNA-Extraktion nicht sofort durchgeführt werden kann, sollten alle Proben eingefroren und im Dunkeln aufbewahrt werden, um die Reduzierung von Kieselalgen so weit wie möglich zu verhindern.
Unsere Forschung wählte ein gängiges und kostengünstiges Blut-DNA-Extraktionskit aus, das auf der Proteinase-K-Verdausmethode basiert, die verbessert wurde, um Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben mit guten Ergebnissen zu extrahieren30. Das Gewebe wird ausreichend geschnitten, um in vollem Kontakt mit der Proteinase K zu stehen, und das Gewebe wird vollständig verdaut. Das mögliche Prinzip einer erfolgreichen Extraktion ist folgendes: Während des Schüttelns wird die harte Schale der Kieselalge wiederholt getroffen und zwischen sich schnell bewegenden Glasperlen fragmentiert, wodurch die Zellmembran freigelegt wird; Die Konfiguration von Glasperlen unterschiedlicher Größe kann die Lücke zwischen der Kollision von Glasperlen einzelner Größe füllen, um die Kollisionskontaktfläche so vollständig wie möglich abzudecken; Nach dem Verlust der Siliziumhülle hilft die Proteinase K, DNA aus der Kieselalge freizusetzen. Im Vergleich zum derzeit verwendeten Boden-DNA-Extraktionskit kann das verbesserte Blut-DNA-Extraktionskit die Anforderungen der Diatomeen-DNA-Extraktion erfüllen, die wirtschaftlicher und einfacher zu erhalten ist. Es erleichtert nicht nur den Einsatz der forensischen Diatomeen-Inspektion, sondern eignet sich auch für die Anwendung in anderen Disziplinen der Diatomeen-Forschung und kann auch für die Extraktion anderer Plankton-DNA verwendet werden. Bei der Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben muss die Menge der verwendeten Proteinase K entsprechend der Anzahl des Planktons im Wasser angepasst werden. Die Menge an Proteinase K kann auf der Grundlage von vorläufigen Experimenten erhöht oder verringert werden. Bei der Extraktion von Kieselalgen-DNA aus Geweben beeinflussen verschiedene Organgewebetypen, Gewebekontamination und andere Faktoren die Menge an Proteinase K, die für die Verdauung erforderlich ist. Im Experiment sollte die Proteinase K im Kit nach der Verwendung bei -20 °C gelagert werden, da sonst die Inaktivierung der Proteinase K den Extraktionsprozess beeinträchtigt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die DNA-Extraktion von Kieselalgen so schnell wie möglich nach der Probenahme und der Probenverarbeitung durchgeführt werden sollte, andernfalls zur Konservierung bei -20 °C gelagert. Die Handhabung, Lagerung der Probe und der gesamte Extraktionsprozess sollten sorgfältig durchgeführt werden, um eine Kontamination durch exogene Kieselalgen zu vermeiden. Andernfalls kann nicht festgestellt werden, ob sich die extrahierte Kieselalgen-DNA in der Probe befand oder eine exogene Kontamination vorlag. Bei der Verwendung von Proteinase K zur Verdauung von Gewebe kann ihre Dosierung ein Problem darstellen. Eine unzureichende Gewebeverdauung kann die Menge an Proteinase K erhöhen. Daher ist es wichtig, das Gewebe ausreichend zu scheren. Eine ausreichende Verdauung des Gewebes verhindert auch, dass die Gewebetrümmer die Plasmamembran in der Adsorptionssäule verstopfen. Nachdem die Membran blockiert ist, ist es nicht mehr möglich, die Pipettenspitze zu verwenden, um die Verstopfung zu erkennen oder wiederholt zu zentrifugieren, wodurch die Membran beschädigt wird. Die endgültige DNA-Lösung enthält viele Verunreinigungen, die den Nachweis von Kieselalgen-DNA beeinträchtigen. Schwingungsintensität und -zeit sind ebenfalls wichtige Themen. Die erste Vortex-Oszillationszeit wird auf 4-5 min und die Oszillationsfrequenz auf 3000 U/min gesteuert, da sonst die DNA-Extraktion beeinträchtigt wird. Wenn die elektrophoretischen Banden nach der PCR nicht klar sind, kann es notwendig sein, die Menge des DNA-Templates weiter zu erhöhen. Die in dieser Studie extrahierte DNA ist eine Mischung aus DNA, einschließlich Kieselalgen-DNA und DNA anderer Spezies, so dass die Konzentration der Kieselalgen-DNA nicht bestimmt werden kann. Daher ist es nicht für Anwendungen geeignet, die eine hohe Reinheit der DNA-Matrizen erfordern.
Studien haben gezeigt, dass verschiedene Kieselalgenarten durch unterschiedliche Primer amplifiziert werdenkönnen 31,32. In dieser Studie wurden nur die Diatomeen-spezifischen Primer D512 und D978 auf der Diatomeen-18S-rDNA verwendet, um zu testen, ob die Diatomeen-DNA erfolgreich extrahiert wurde, was nicht alle Diatomeenarten abdecken konnte22,33. Da die Länge des Amplifikationsproduktfragments des Primerpaars 390-410 bp beträgt, wählt die verbesserte Methode außerdem alle Fragmentgrößen der Kieselalgen-DNA aus, um zu testen, ob es einen Einfluss auf die experimentellen Parameter gibt, was weiter untersucht werden muss. Nachfolgende Studien werden auch Primer verschiedener Regionen und unterschiedlicher Amplifikationslängen verwenden, um die Wirkung der Extraktion zu untersuchen.
Im Vergleich zur herkömmlichen Kieselalgen-DNA-Extraktionsmethode hat diese Methode die Hauptvorteile einer kostengünstigen und groß angelegten Kieselalgen-DNA-Extraktion. Es kann die Vorteile der morphologischen Methoden der Kieselalgenanalyse ergänzen und die Anforderungen der Ertrinkungsdiagnostik in primären forensischen Labors erfüllen. Gleichzeitig erweitert es auch das Auswahlspektrum an Diatomeen-DNA-Extraktionskits und hat gute Anwendungsaussichten. In Zukunft wird sich diese Methode nicht nur auf die Extraktion von Kieselalgen-DNA beschränken, sondern auch für die Extraktion von DNA aus anderen Algen eingesetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) und dem Academician Innovation Platform Scientific Research Project der Provinz Hainan (YSPTZX202134) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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