Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA דיאטומי באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.
Abstract
בדיקת דיאטום היא אמצעי עזר חיוני בפרקטיקה המשפטית כדי לקבוע אם הגופה טבעה במים ולהסיק את מקום הטביעה. בדיקות דיאטום הן גם תוכן מחקרי חשוב בתחום הסביבה והפלנקטון. טכנולוגיית בדיקת הביולוגיה המולקולרית הדיאטומית, המתמקדת בדנ"א דיאטומי כאובייקט המחקר העיקרי, היא שיטה חדשה לבדיקת דיאאטומים. מיצוי DNA דיאטומי הוא הבסיס לבדיקה מולקולרית דיאאטומית. כיום, הערכות הנפוצות למיצוי DNA דיאטום הן יקרות, מה שמגדיל את עלות ביצוע המחקר הנלווה. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת המיצוי המהירה הכללית של DNA גנומי בדם שלם והשיגה אפקט מיצוי DNA דיאטום משביע רצון, ובכך סיפקה פתרון חלופי, חסכוני ובמחיר סביר למיצוי DNA המבוסס על חרוזי זכוכית למחקר קשור. הדנ"א הדיאטום המופק באמצעות פרוטוקול זה יכול לספק יישומים רבים במורד הזרם, כגון PCR וריצוף.
Introduction
בפרקטיקה הפורנזית, הקביעה אם גופה שנמצאה במים טובעת או הושלכה למים לאחר המוות חיונית לפתרון הראוי של המקרה1. זהו גם אחד הנושאים הקשים שיש לפתור בדחיפות בפרקטיקה משפטית2. דיאטומים נמצאים בשפע בסביבה הטבעית (במיוחד במים)3,4. בתהליך של טביעה, עקב היפוקסיה ותגובת מתח, אנשים יהיו תנועות נשימה אינטנסיביות לשאוף כמות גדולה של נוזל טביעה. לכן, הדיאטומים במים נכנסים לריאה עם הנוזל הטובע, וחלק מהדיאטומים יכולים להיכנס למחזור הדם דרך מחסום הנאדיות-נימים ולהתפשט לאיברים פנימיים עם זרימת הדם 5,6. גילוי דיאטומים ברקמות ובאיברים פנימיים כגון ריאות, כבד ומח עצם הוא עדות חזקה לטביעה לפני המוות 7,8. כיום, בדיקות דיאטומיות פורנזיות מבוססות בעיקר על שיטות בדיקה מורפולוגיות. לאחר סדרה של עיכול מראש של הרקמה, הערכות מורפולוגיות איכותיות וכמותיות של דיאטומים לא מעוכלים מתבצעות תחת המיקרוסקופ. במהלך תקופה זו, ריאגנטים מסוכנים ולא ידידותיים לסביבה כגון חומצה חנקתית צריך לשמש. תהליך זה גוזל זמן רב ודורש מהחוקרים מומחיות טקסונומית מוצקה וניסיון רב. כל אלה מביאים אתגרים מסוימים לצוות הזיהוי הפלילי9. טכנולוגיית בדיקת DNA Diatom היא טכנולוגיה חדשה לבדיקות דיאטומיות שפותחה בשנים האחרונות 10,11,12. טכנולוגיה זו מממשת את זיהוי המינים של דיאטומים על ידי ניתוח הרכב רצף הדנ"א הספציפי של דיאטומים13,14. טכנולוגיית PCR וטכנולוגיית ריצוף הן שיטות טכניות נפוצות, אך הבסיס שלהן הוא מיצוי מוצלח של DNA מדיאטומים. עם זאת, לדיאטומים יש מבנה מיוחד שונה מאורגניזמים אחרים, מה שהופך את טכניקות מיצוי הדנ"א שלהם גם שונות.
דופן התא של diatom יש רמה גבוהה של סיליקציה, ואת המרכיב העיקרי שלה הוא דו תחמוצת הסיליקון 15,16,17. דופן התא הסיליקסי קשה מאוד, ויש להרוס אותה לפני מיצוי הדנ"א. ערכות מיצוי דנ"א רגילות הן לעתים קרובות קשות לשימוש ישיר להפקת דנ"א דיאטומי מכיוון שהן אינן יכולות להרוס את הקליפה הסיליקית של דיאטומים18. לכן, השמדת הקליפה הסיליקית של דיאטומים היא אחת הבעיות הטכניות העיקריות שיש לפתור בחילוץ דנ"א דיאטומי.
יחד עם זאת, מכיוון שמספר הדיאטומים הכלולים בדגימות מחקר פורנזי, בין אם דגימות מים או איברים ורקמות של גופות שטבעו, מוגבל לעתים קרובות, יש צורך להעשיר דיאאטומים. מהות ההעשרה היא הפרדת חומרים. בעת ניסיון לאסוף דיאטומים יחד, למזער את התוכן של רכיבי חומר אחרים (רכיבים מפריעים). בעבודה משפטית, מעבדות משתמשות לעתים קרובות בשיטות העשרת צנטריפוגה או סינון ממברנות כדי להפריד תאים דיאטומים19. עם זאת, מכיוון שציוד שאיבת ואקום אינו בשימוש נרחב, שיטת העשרת הממברנה אינה משמשת לעתים קרובות במעבדות משפטיות ראשוניות רגילות. לכן, שיטת הצנטריפוגה היא עדיין העשרת דיאטום נפוצה במעבדות פורנזיות20.
מיצוי DNA מדיאטומים משמש כיום בעיקר בפרקטיקה משפטית, ויש מגבלות משמעותיות ליישומו. כיום, יש מעט ערכות מיצוי DNA דיאטומי המשמשות במדע פורנזי בשוק והן בדרך כלל יקרות21. מאמר זה מספק שיטת מיצוי DNA דיאטומית משופרת, מה שהופך את מיצוי ה- DNA של דיאטום לפשוט, נוח וחסכוני. זה מגביר את היישום של בדיקות ביולוגיה מולקולרית עוקבות של דיאטומים ויכול לפתור טוב יותר בעיות הקשורות לטביעה ברפואה משפטית באמצעות בדיקות דיאאטומים. שיטה זו שוברת את דפנות התאים הסיליקטיים של דיאטומים על ידי הוספת חרוזי זכוכית וקביעת זמן מתאים למערבולת. בדרך זו, פרוטאינאז K ותמיסת הקישור מפעילים במהירות את התאים ומשביתים אנזימים שונים בתאים. הדנ"א הגנומי נספג בקרום המטריקס בעמודת הספיחה ולבסוף נמהל על ידי חיץ האלוציה. ערכת מיצוי גנים משופרת כזו משפרת את אפקט מיצוי ה- DNA הדיאטום של ערכת הדם בחומרי בדיקה משפטית, מפחיתה את עלות מיצוי ה- DNA הדיאטום בפרקטיקה המשפטית, וניתן ליישם אותה טוב יותר במחקר פורנזי עממי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של היינאן. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה אינן נחשבות למחקרים המערבים נבדקים אנושיים. דגימות אלה הושגו לצורך אבחון פתולוגי פורנזי, והשאר שימשו להפקת DNA דיאטומי בניסוי זה. חוקרים אינם יכולים לזהות בקלות אנשים כדי לקבל הסכמה מדעת מבעלי עניין רלוונטיים.
הערה: כדי להבטיח את התחולה הכללית של שיטת המחקר שדווחה בניסוי זה, ניסוי זה פעל למעשה לפי הוראות ההפעלה של הערכה בה נעשה שימוש, ורק כמה שלבים שונו. דגימות המים ששימשו בניסוי הזה נלקחו באופן אקראי מבריכות ליד המעבדה (איור משלים 1A). בניסוי הזה, רקמת הריאה של הגוף הטבוע אושרה כרקמת המחקר כדי להדגים את פרוטוקול המיצוי (איור משלים 1B). בפרקטיקה המשפטית, לעיתים יש צורך להשתמש גם באיברים ורקמות אחרים של גופות שטבעו (כגון כבד, טחול, כליות, מח עצם וכו ') כדי לחלץ DNA דיאטומים, מה שדורש שיפורים מקבילים קלים לשיטת ניסוי זו, אשר יוסברו בחלק המתאים של הניסוי. דגימות רקמת הריאה ששימשו בניסוי זה הגיעו מגופות שטבעו בבירור במקרים פורנזיים. בדיקות מורפולוגיות נערכו כדי להוכיח שרקמת הריאה מכילה דיאטומים (איור משלים 2).
1. טיפול מקדים בדגימות
- טיפול מקדים בדגימות מים
- קח דגימת מים של 10 מ"ל לתוך צינור הצנטריפוגה והצנטריפוגה ב 13,400 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך בזהירות 9.8 מ"ל סופרנאטנט עם אקדח פיפטה, ולהעביר כ-200 מיקרוליטר של דגימת מים דיאטומית מועשרת שנותרה בתחתית לתוך צינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
הערה: ניתן לבצע תחילה קדם-ניסוי, וניתן להגדיל את הכמות הראשונית אם דגימת מים של 10 מ"ל אינה מספיקה להעשרה.
- קח דגימת מים של 10 מ"ל לתוך צינור הצנטריפוגה והצנטריפוגה ב 13,400 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך בזהירות 9.8 מ"ל סופרנאטנט עם אקדח פיפטה, ולהעביר כ-200 מיקרוליטר של דגימת מים דיאטומית מועשרת שנותרה בתחתית לתוך צינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
- טיפול מקדים בדגימות רקמה
- קח 0.5 גרם מרקמת שולי הריאה מהגוף הטבוע, קצץ או טחן לחלוטין את רקמת הריאה עד שהיא הופכת לבוצית. מניעת זיהום של דיאטומים אקסוגניים היא הליבה של צעד זה. חותכים את הרקמה לחתיכות שוב ושוב באמצעות מספריים.
2. מיצוי DNA
הערה: כל שלבי הצנטריפוגה מתבצעים בטמפרטורת החדר. שימוש בצנטריפוגה שולחנית בעלת כוח צנטריפוגלי של 14,500 x גרם; אמבט מים (או אמבט מתכת) שחומם מראש ל -70 מעלות צלזיוס צריך להיות מוכן לפני תחילת הניסוי. כל השלבים חייבים להקפיד על עקרונות הפעולה האספטית.
- הרכבה של דגימות מים ורקמות
הערה: דגימת מים ושיטת מיצוי DNA דיאטום רקמות זהות.- הוסף חרוזי זכוכית לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל את דגימת המים שטופלה מראש. הפוך 10x-15x כדי לערבב היטב. חרוזי הזכוכית שנוספו מורכבים מחרוזי זכוכית גדולים וקטנים מעורבבים ביחס מסה של 1:1. קוטר חרוזי הזכוכית הגדולים הוא 1.5-2.0 מ"מ וקוטר חרוזי הזכוכית הקטנים הוא 0.4-0.6 מ"מ.
- קח 0.5 גרם של רקמה קצוצה דק, להוסיף חרוזי זכוכית לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל המכיל את הרקמה כמתואר לעיל. הפוך 10x-15x כדי לערבב.
- הוסף 40 μL של proteinase K (20 מ"ג / מ"ל) לצינורות. מניחים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, במהלך תקופה זו, הופכים ומערבבים 10x כל 3 דקות.
הערה: אם הרקמה אינה מתעכלת במלואה, ניתן להגדיל כראוי את כמות הפרוטאינאז K עד שהתמיסה מתבהרת. - מוסיפים 200 μL של חיץ קשירה לצינורות הצנטריפוגה, מערבלים מיד, ומערבבים במשך 4 דקות (תדירות ערבוב תנודה: 3000 סל"ד).
הערה: בשלב זה, יש לשלוט בקפידה בעוצמת הרעידה ובזמן כדי להבטיח עוצמת ערבוב וזמן מספיקים. - שים את צינורות הצנטריפוגה באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והפתרון הופך ברור.
- הוסף 100 μL של isopropanol צינורות צנטריפוגה, מערבולת ומערבבים במשך 15 s, משקעים flocculent עשוי להופיע בשלב זה.
הערה: חשוב מאוד לערבב היטב עם חוזק מתאים בשלבי הפעולה הנ"ל, אך יש להימנע מטלטול נמרץ כדי למנוע גזירת DNA. - שים את הפתרון שהתקבל בשלב הקודם יחד עם המשקע flocculent לתוך עמודת ספיחה (עמודת ספיחה ממוקם בצינור האיסוף). אורך עמוד הספיחה הוא 3.0 ס"מ, הקוטר 1.0 ס"מ, ומטריצת הספיחה היא קרום מטריצת סיליקון.
- צנטריפוגה בעוצמה של 8,000 x גרם למשך 30 שניות, יש להשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף ולהחזיר את עמוד הספיחה לצינור האיסוף.
- הוסף 500 μL של מאגר להסרת מעכבים לעמודת הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
- הוסיפו 700 מיקרוליטר של חיץ כביסה לעמוד הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
הערה: יש להוסיף את הכמות שצוינה של אתנול מוחלט לבקבוק חיץ הכביסה לפני השימוש הראשון. - הוסף 500 μL של חיץ כביסה לעמוד הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
- החזירו את עמודת הספיחה לצינור האיסוף הריק. צנטריפוגה של 14,500 x גרם למשך 2 דקות, והסר את מאגר הכביסה ככל האפשר, כדי למנוע משאריות האתנול במאגר הכביסה לעכב תגובות במורד הזרם.
- מוציאים את עמוד הספיחה ומכניסים אותו לצינור צנטריפוגה נקי. הוסף 100 μL של חיץ elution לחלק האמצעי של קרום הספיחה.
- מניחים את עמוד הספיחה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות, ואת הצנטריפוגה על 13,400 x גרם למשך דקה אחת.
- הוסף שוב את התמיסה שהושגה בשלב הקודם לעמודת הספיחה הצנטריפוגלית. מניחים את עמוד הספיחה הצנטריפוגלי בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ואת הצנטריפוגה על 13,400 x גרם למשך דקה אחת.
הערה: יש לחמם מראש את חיץ האלוציה באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך כ-10 דקות. נפח elution לא צריך להיות פחות מ 50 μL; אחרת, תפוקת הדנ"א תפחת. - אחסן את ה- DNA הדיאטום שחולץ ב- 2-8 ° C לשימוש עתידי. אם תמיסת ה- DNA אמורה להיות מאוחסנת במשך זמן רב, אחסן אותה ב -20 מעלות צלזיוס.
3. בדיקת PCR
הערה: מאחר שתכולת הדיאטומים בדגימות פורנזיות היא לעתים קרובות נמוכה, תמציות דגימות הרקמה של הגופות הטבועות עשויות להכיל גם דרגות שונות של רקמות ואיברים (כגון הריאות בניסוי זה) עם דנ"א משלהם. לכן, זיהוי ישיר של סך כל הדנ"א בתמציות דנ"א אינו משקף את המצב של מיצוי דנ"א דיאטומי. בניסוי זה נבחרו פריימרים ספציפיים לדיאטומים, ומוצרי PCR שימשו להערכת מיצוי הדנ"א הדיאטום בתמצית. המוצרים ניתן לצפות ולנתח על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose והוא יכול גם להיות מנותח על ידי עקומת התכה PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת, אשר יש רגישות גבוהה יותר.
- הוסף 2 μL של ה- DNA המופק מדגימות מים ורקמות כתבנית. בחר אחת משתי השיטות הבאות לבדיקה.
- בדיקת PCR קונבנציונלית
- השתמש פריימרים22 שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S. לקבלת פרטים, ראה טבלה 1.
- לקבוע את מערכת תגובת ה-PCR ואת תנאי ההגברה בהתאם למאפייני הפריימרים. לפרטים, ראו טבלה 2.
- הפעל את המוצרים של הגברת PCR על ג'ל אגרוז 2%. התבונן ונתח את ההדמיה עם imager ג'ל.
- בדיקת PCR כמותית פלואורסצנטית
- השתמש בפריימרים לעיל שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S כדי להכין מערכת תגובת PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת. לפרטים, ראו טבלה 3.
- בצע הגברה PCR ונתח את עקומת ההגברה המתקבלת ואת ערכי Ct. במקביל, הגדר תוכנית, התיך את הגדילים הכפולים של המוצרים המוגברים לגדילים בודדים בהדרגה באמצעות טכנולוגיית עקומת התכה PCR כמותית פלואורסצנטית, ולאחר מכן נתח את עקומות ההתכה המתקבלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכיוון שתמיסת הדנ"א המופקת בשיטת מיצוי הדנ"א הנהוגה כיום מכילה את כל רכיבי הדנ"א ממקורות שונים בדגימה, הדנ"א המתקבל בפרוטוקול זה לא היה יוצא מן הכלל. לכן, פתרון הדנ"א לא היה רק פתרון של דנ"א גנומי דיאטומי. הפריימרים שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S נבחרו על ידי עיון בספרות 22,23,24. הפריימרים אומתו על ידי NCBI-Blast Primer, והתוצאות הראו כי הפריימר הקדמי D512 והפריימר ההפוך D978 של 18S rDNA היו פריימרים ספציפיים לאצות וכיסו מינים רבים של דיאאטומים. תוצאות ההגברה לא הראו גנים אנושיים. הם שימשו סמן ביולוגי אמין DNA לבדיקת דיאאטומים, ולכן הם נבחרו לאימות תוצאות הניסוי הזה. תוך שימוש בדנ"א המופק כתבנית להגברה PCR ספציפית לדיאטומים, תוצר ההגברה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז הראה כי לדגימות מים ורקמות יש פסי DNA דיאטומיים, פסי אלקטרופורזה אלה היו בין 250-500 bp (קרוב יותר ל -500 bp), בהתאם לגודל המוצר של הגברה מטרת פריימר (390-410 bp). זה הראה שפרוטוקול המיצוי הצליח לחלץ דנ"א דיאטום (איור 1A,B).
טכנולוגיית PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת היא סוג של טכנולוגיית בדיקת גנים עם ספציפיות מחמירה ורגישות גבוהה. על ידי הוספת קבוצות פלואורסצנטיות במערכת תגובת ה- PCR, הצטברות אותות פלואורסצנטיים יכולה לגרום לכל תהליך ה- PCR להיות מנוטר בזמן אמת, והרגישות גבוהה25,26. מוצרים שהועצמו במיוחד על-ידי PCR קונבנציונלי יכולים לפעמים להיות קשים לצפייה באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז בגלל התוכן הנמוך וסיבות אחרות27 (איור 1C). באמצעות הגברה ספציפית של PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת, התקבלה עקומת הגברה טיפוסית עם ארבעה שלבים אופייניים (איור 2). במקביל, באמצעות טכנולוגיית עקומת ההתכה הפלואורסצנטית הכמותית PCR, הגדילים הכפולים של הדנ"א של המוצר המוגבר הותכו לגדילים בודדים בטמפרטורה גבוהה, הצבע שוחרר מהגדילים הכפולים, וערך הפלואורסצנטיות ירד. על-ידי זיהוי השינוי בערך הפלואורסצנטי, התקבלה עקומת ההתכה (איור 3). לעקומות ההתכה שהתקבלו היו פסגות אופייניות, וערך השיא היה סביב 85.5 מעלות צלזיוס, מה שהוכיח שיש הגברה ספציפית של דנ"א המטרה, מה שמצביע על כך שיש DNA דיאטום בתמיסת ה- DNA שחולצה. ניתן גם להוסיף את הצבע ישירות למוצר הגברה PCR קונבנציונאלי, ואת עקומת ההתכה ניתן להשיג על ידי טכנולוגיית עקומת התכה פלואורסצנטית כמותית PCR בזמן אמת כדי להוכיח אם הייתה הגברה ספציפית. לכן, כאשר אלקטרופורזה קונבנציונלית של ג'ל PCR-אגרוז לא הצליחה להוכיח אם יש DNA דיאטומי בתמיסת ה- DNA שחולצה, ניתן היה לבחור בטכנולוגיית PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת עם רגישות גבוהה יותר לאימות והערכה. בניסוי זה, טכנולוגיית עקומת ההתכה הפלואורסצנטית הכמותית בזמן אמת PCR שימשה רק לניתוח איכותני.
כפי שהוצג בדו"ח קודם21, ערכת מיצוי הדנ"א המסורתית של הקרקע וערכת מיצוי הדנ"א של הדם ששונה היו זהות ביסודו של דבר עבור מיצוי DNA דיאטומי מדגימות מים ורקמות. הפרש העלויות של מיצוי DNA דיאטומי היה בעיקר הפרש המחירים של שתי הערכות, והעלות של חומרים מתכלים אחרים הייתה בעצם זהה. במחקר זה, שיפור פשוט של ערכת מיצוי הדנ"א בדם המשמשת בדרך כלל בניסויים בביולוגיה מולקולרית יכול להשיג תוצאות ניסוי טובות יותר, אשר לא רק הגדילו את טווח הבחירה של החוקרים בערכת הבדיקה בפעילויות מחקר הקשורות למיצוי DNA דיאטום, אלא גם הפחיתו את עלות הבדיקה.
תהליך השיפור של פרוטוקול זה פורסם21. על ידי תכנון השילוב של יחסי מסה שונים של חרוזי זכוכית וזמן תנודה של מערבולת, תנאי מיצוי ה- DNA האופטימליים של תנודת חרוזי זכוכית נוספו לערכה הקונבנציונלית, ולכן השיטה יכולה לשפר את אפקט המיצוי של DNA דיאטומי בדגימות פורנזיות, במיוחד בדגימות רקמות. השילוב האופטימלי של מיצוי DNA התקבל כאשר תדירות התנודה של המערבולת הייתה 3000 סל"ד; זמן התנודה של המערבולת היה 4 דקות, יחס המסה של חרוזי זכוכית גדולים בקוטר של 1.5-2.0 מ"מ וחרוזי זכוכית קטנים בקוטר של 0.4-0.6 מ"מ היה 1:1. בוצעה השוואה בין השיטה הקונבנציונלית של הערכה לבין השיטה המשופרת. הוכח כי הערכה המשומשת יכולה לענות על הצרכים של הגברת DNA דיאטומי, והבהירות של פסים אלקטרופורטיים לאחר הגברה שבוצעה בשיטה המשופרת בדגימות מים הייתה דומה לבהירות של השיטה הקונבנציונלית, והפסים האלקטרופורטיים לאחר הגברה שבוצעה בשיטה המשופרת בדגימות רקמה היו בהירים יותר (איור 4).
איור 1: תוצאות אלקטרופורזה של דנ"א שחולצו באמצעות פרוטוקול לאחר הגברה של PCR. סך של 2 μL של תמצית DNA שימש כתבנית DNA עבור הגברה ספציפית PCR. מוצרי הגברה PCR עברו אלקטרופורזה בתמיסת חיץ TAE 1x באמצעות ג'ל אגרוז 2%, ופעלו במתח קבוע של 100V למשך 25-30 דקות. סולם DNA D2000 שימש לכל הג'לים. (א) תוצאות האלקטרופורזה של דנ"א דיאטומי בדגימות מים לאחר הגברה PCR, נתיב 1 הן בקרה ריקה; נתיבים 2-7 הם דגימות מים ממקומות שונים באותו אזור. (B) תוצאות אלקטרופורזה לאחר הגברה PCR של DNA דיאטום ברקמה. נתיבים 1-6 הם הרקמות שנכרתו ממיקומים שונים של אותה רקמת ריאה; נתיב 7 הוא השלט הריק. (C) בניסוי כושל, לאחר הגברה של דנ"א דיאטומי, תוצאות האלקטרופורזה לא הראו פסי אלקטרופורזה במיקומים המתאימים, מה שמצביע על כך שלא היו תוצרי הגברה או מעט מדי תוצרי הגברה. בשלב זה, תוצאות האלקטרופורזה לא יכלו להצביע אם יש DNA דיאטום בתמיסת הדנ"א המוצעת, אשר היה צריך להתבצע בשיטות רגישות יותר (כגון עקומת התכה PCR). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומת הגברה qPCR של Diatom DNA. סך של 2 μL של תמצית תמיסת DNA שלא הראתה פסים על ידי PCR קונבנציונאלי ואלקטרופורזה ג'ל אגרוז שימש כתבנית להכנת מערכת PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת והגדרת תוכנית. לבסוף, התקבלו עקומות הגברה אופייניות עם ארבעה שלבים אופייניים של שלב בסיס ליניארי, תחילת פאזה מעריכית, פאזה מעריכית ושלב מישורי. ערך ה-Ct של כל עקומה התקבל גם הוא באמצעות ניתוח, מה שמצביע על כך שמיצוי הדנ"א היה מוצלח. כל מספר מייצג את ערך Ct של העקומה המתאימה. אחוז החסימה הוא 5.2. היחידה של ציר y היא Rn. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומת התכה של דנ"א דיאטומי. באמצעות מערכת PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת, נקבעה תוכנית שבה הטמפרטורה עולה מ 60-95 מעלות צלזיוס. זה יצר עקומת התכה והדנ"א הדו-גדילי המוגבר במיוחד נמס לגדילים בודדים בטמפרטורות גבוהות, הצבע היה חופשי מהגדילים הכפולים, וערך הפלואורסצנטיות ירד עד שהגיע ל-0. הגרף התקבל על ידי לקיחת הגומלין השלילי של הגרף המקורי. האבסקיסה ייצגה את הטמפרטורה, האבסקיסה המתאימה לערך השיא הגבוה ביותר הייתה ערך ה-Tm, וערך ה-Tm של עקומת ההיתוך בגרף היה 85.5 מעלות צלזיוס. המספור של כל עקומה תואם למספור של כל נתיב באיור 1C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות אלקטרופורזה של התהליך המשופר. (A) תוצאות אלקטרופורזה עבור שילובים שונים של יחסי חרוזי זכוכית וזמני תנודות מערבולת. נתיבים 1, 4, 7, 10 ו-13 שבהם יחס המסה המעורבת של חרוזי זכוכית גדולים וקטנים הוא 1:2, נתיבים 2, 5, 8, 11 ו-14 שבהם יחס המסה המעורבת של חרוזי זכוכית גדולים וקטנים הוא 1:1, נתיבים 3, 6, 9, 12 ו-15 שבהם יחס המסה המעורבת של חרוזי זכוכית גדולים וקטנים הוא 2:1, וזמני התנודה היו 2 דקות לנתיבים 1-3, 3 דקות לנתיבים 4-6, 4 דקות לנתיבים 7-9, 5 דקות לנתיבים 10-12 ו-6 דקות לנתיבים 13-15. נתיב 16 הוא השלט הריק. (B) אלקטרופורזה נוצרת לאחר הגברה PCR של מוצרי מיצוי הערכה לפני ואחרי שיפור. נתיבים 1-3 הם שיטות קונבנציונליות לחילוץ דגימות מים, נתיבים 4-6 הם שיטות משופרות לחילוץ דגימות מים, נתיבים 7-9 הם שיטות קונבנציונליות לחילוץ רקמות, נתיבים 10-12 הם שיטות משופרות לחילוץ רקמות, נתיב 13 הוא בקרה ריקה. התוצאות שונומ-21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים משלים 1: דגימות מים ודגימות רקמות. דגימות המים בהן נעשה שימוש נלקחו מבריכה הסמוכה למעבדה, ודגימות הרקמה בהן נעשה שימוש אושרו כרקמת ריאה של הגופה שטבעה. (א) אתר איסוף דגימות המים הניסיוני היה בריכה ליד המעבדה. (B) דגימות מים מועשרות ודגימות רקמת ריאה גרוסות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: מיקרוגרף של דיאטום. תמונות (A) ו-(B) צולמו תחת מיקרוסקופ אופטי של 400x. החץ מצביע על דיאטומים. תמונות (C) ו-(D) צולמו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים. תמונות (A) ו-(B) מראות את הדיאטומים במים באתר הטביעה. הדיאטומים נקראו Fragilaria ו-Navicula. תמונות (C) ו-(D) מראות דיאטומים בריאות, שנקראים Nitzschia ו-Navicula. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| יעד | שם פריימר | רצף |
| 18S rDNA | פריימר Forword D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| פריימר הפוך D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
טבלה 1: רשימת הפריימרים שבהם נעשה שימוש. טבלה זו מתארת את הרצפים, השמות ואזורי היעד של פריימרים ספציפיים המשמשים במאמר זה.
| מערכת תגובת PCR | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 מיקרוליטר | ||
| פריימר Forword D512 | 0.5 מיקרוליטר (10 μmol/L) | ||
| פריימר הפוך D978 | 0.5 מיקרוליטר (10 μmol/L) | ||
| תבנית DNA | 2 μL | ||
| מים ללא Nuclease | עד 20 מיקרוליטר | ||
| הערה: הדנ"א של תבנית הבקרה הריקה מוחלף באותה כמות של מים נטולי Nuclease. | |||
| תוכנית PCR | |||
| טמפרטורה | זמן | מחזורים | |
| 94°C | 10 דק' | 1 | |
| 94°C | 45 שניות | 40 | |
| 50 °C | 45 שניות | ||
| 72 °C | 1 דקות | ||
| 72 °C | 10 דק' | 1 | |
טבלה 2: רכיבי PCR. טבלה זו מתארת את תצורת מערכת התגובה עבור PCR קונבנציונאלי ואת ההגדרות של טמפרטורת התגובה, הזמן ומספר המחזורים עבור PCR. הנפח הכולל של מערכת התגובה בשימוש היה 20 μL.
| מערכת תגובת PCR כמותית בזמן אמת | |||
| תערובת qPCR 2x | 10 מיקרוליטר | ||
| פריימר Forword D512 | 0.45 מיקרוליטר (10 מיקרומול/ליטר) | ||
| פריימר הפוך D978 | 0.45 מיקרוליטר (10 מיקרומול/ליטר) | ||
| תבנית DNA | 2 μL | ||
| מים ללא Nuclease | עד 20 מיקרוליטר | ||
| הערה: הדנ"א של תבנית הבקרה הריקה מוחלף באותה כמות של מים נטולי Nuclease. | |||
| תוכנית PCR כמותית בזמן אמת | |||
| טמפרטורה | זמן | מחזורים | |
| 94°C | 10 דק' | 1 | |
| 94°C | 45 שניות | 40 | |
| 50 °C | 45 שניות | ||
| 72 °C | 1 דקות | ||
טבלה 3: רכיבי PCR כמותיים בזמן אמת. טבלה זו מתארת את תצורת מערכת התגובה עבור PCR כמותי בזמן אמת ואת ההגדרות של טמפרטורת התגובה, הזמן ומספר המחזורים עבור PCR. הנפח הכולל של מערכת התגובה בשימוש היה 20 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי דיאטום מוגנים על ידי דפנות תאים סיליקיות קשות17, ויש להרוס מבנה זה כדי לחלץ דנ"א דיאטומי. ערכות רגילות אינן הורסות בקלות את הקליפה הסיליקית של דיאטומים; לכן קשה לחלץ בהצלחה DNA דיאטום21. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת מיצוי הדנ"א בדם הנפוצה ביותר, והוסיפה חרוזי זכוכית בקטרים שונים ויחס מסה שונה בתהליך מיצוי הדיאטומים. תנודת מערבולת מתבצעת בו זמנית, אשר יכול לשבור באופן מלא את קליפת diatom ולשפר את אפקט מיצוי DNA diatom. כפי שהוצג בדו"ח הקודם21, קוטר חרוזי הזכוכית, עוצמת התנודה והזמן ישפיעו ישירות על איכות מיצוי הדנ"א. זמן תנודת המערבולת לא צריך להיות ארוך מדי (לא יותר מ -10 דקות). אם הזמן ארוך מדי, הדנ"א יישבר עקב רטט מוגזם. יחד עם זאת, הזמן לא צריך להיות קצר מדי. אם הזמן קצר מדי (לא פחות מ -2 דקות), מעטפת הדיאטום לא תוסר לחלוטין, מה שיהפוך את מיצוי ה- DNA ללא יעיל. בעת בחירת חרוזי זכוכית בוחרים חרוזים בקטרים היקפיים שונים, חרוזי הזכוכית הגדולים מבטיחים את חוזק ההתנגשות, וחרוזי הזכוכית הקטנים מבטיחים שלא תהיה התנגשות מתה בין חרוזי הזכוכית במהלך תהליך פיצול ההתנגשות, מה שמשפר את יעילות שבירת המעטפת.
כדי לחלץ DNA diatom מדגימות, יש צורך בדרך כלל להעשיר diatoms. תהליך זה ישפיע רבות על מיצוי ה- DNA הדיאטומי. מטרת ההעשרה היא להגדיל את ריכוז הדיאטום בדגימות כך שריכוז הדנ"א הדיאטום המופק יוכל להיות בטווח הניתן לזיהוי; עבור יישומי השלב הבא כגון PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת וריצוף בתפוקה גבוהה.
מכיוון שדיאטומים מופצים באופן נרחב בטבע4, מניעת זיהום מעבדה היא בעדיפות עליונה28. זיהום בתהליך מיצוי ה- DNA יוביל לסטיות מהתוצאות בפועל ולאובדן ערך השימוש. לכן, תמיד לשים לב לעיקרון של פעולה אספטית בעת חילוץ DNA diatom ולנקוט את כל האמצעים האפשריים כדי להפחית ולמנוע זיהום של diatoms אקסוגניים. כאשר הרקמה מופקת מהגוף המת, יש לנקוט צעדים כדי למנוע ממנו להיות מזוהם על ידי diatoms אקסוגניים. לאחר חילוץ הרקמה, יש לאחסן אותה במיכל או בשקית דגימה ללא זיהום דיאטומי. הרקמה לא צריכה להיות מטופלת עם פורמלין. יש לשטוף את הציוד לחילוץ ועיבוד רקמות 2-3 פעמים במים מזוקקים שוב ושוב, ולאחר מכן לעקר על ידי אור אולטרה סגול או טמפרטורה גבוהה כדי להבטיח שאין זיהום של דיאטומים ממקורות אחרים. יש לנתק את הרקמה לפני הבדיקה מהרקמה השטחית במכשיר נטול דיאטומים, ולאחר מכן להחליף את המכשיר כדי לבחור את הרקמה התחתונה לבדיקה. יחד עם זאת, סטנדרטיזציה של תהליך הפעולה יכולה גם למנוע ביעילות את הבעיה של זיהום במעבדה.
מאחר שדיאטומים הם מזונם של אורגניזמים ימיים רבים, הם יאבדו במהלך אחסון ארוך טווח29. דיאטומים יכולים גם לגדול ולהתרבות בתנאי אור. לכן, יש להתחיל את שלב מיצוי ה- DNA בהקדם האפשרי לאחר הדגימה ועיבוד דגימה מהיר כדי למנוע אובדן של דיאטומים בדגימה. אם לא ניתן לבצע את מיצוי ה- DNA באופן מיידי, יש להקפיא את כל הדגימות ולשמור אותן בחושך כדי למנוע הפחתה של דיאטומים ככל האפשר.
המחקר שלנו בחר ערכת מיצוי DNA נפוצה וזולה בדם המבוססת על שיטת העיכול proteinase K, אשר שופרה כדי לחלץ DNA דיאטומי מדגימות מים ורקמות עם תוצאות טובות30. הרקמה חתוכה מספיק כדי להיות במגע מלא עם פרוטאינאז K והרקמה מתעכלת במלואה. העיקרון האפשרי של מיצוי מוצלח הוא כדלקמן: במהלך שלב הרעידה, הקליפה הקשה של דיאטום מושפעת שוב ושוב ומקוטעת בין חרוזי זכוכית הנעים במהירות, חושפת את קרום התא; תצורה של חרוזי זכוכית בגדלים שונים יכולה למלא את הפער בין התנגשות של חרוזי זכוכית בגודל יחיד, כדי לכסות את משטח מגע ההתנגשות באופן מלא ככל האפשר; לאחר אובדן מעטפת הסיליקון, פרוטאינאז K עוזר לשחרר DNA מהדיאטום. בהשוואה לערכת מיצוי DNA הקרקע המשמשת כיום, ערכת מיצוי ה- DNA המשופרת בדם יכולה לענות על הדרישות של מיצוי DNA דיאטומי, שהוא חסכוני יותר וקל יותר להשגה. זה לא רק מקל על השימוש בבדיקת דיאטום משפטית, אלא מתאים ליישום לדיסציפלינות אחרות הקשורות למחקר דיאטומי וניתן להשתמש בו גם למיצוי DNA פלנקטון אחר. בעת חילוץ DNA דיאטום מדגימות מים, כמות פרוטאינאז K בשימוש צריך להיות מותאם על פי מספר הפלנקטון במים. ניתן להגדיל או להקטין את כמות הפרוטאינאז K בהתבסס על ניסויים מקדימים. בעת חילוץ DNA דיאטומי מרקמות, סוגים שונים של רקמות איברים, זיהום רקמות וגורמים אחרים ישפיעו על כמות פרוטאינאז K הנדרשת לעיכול. בניסוי, יש לאחסן את הפרוטאינאז K בערכה בטמפרטורה של -20°C לאחר השימוש, אחרת השבתת פרוטאינאז K תשפיע על תהליך המיצוי.
לסיכום, מיצוי DNA דיאטומי צריך להתבצע בהקדם האפשרי לאחר הדגימה ועיבוד הדגימה, אחרת מאוחסן ב -20 ° C לשימור. טיפול דגימה, אחסון, ואת כל תהליך החילוץ צריך להיעשות בזהירות כדי למנוע זיהום על ידי diatoms אקסוגניים. אחרת, לא ניתן להעריך כי הדנ"א הדיאטום שחולץ היה בדגימה או זיהום אקסוגני. בעת שימוש proteinase K כדי לעכל רקמות, המינון שלה עשוי להיות בעיה. עיכול רקמות לא מספיק יכול להגדיל את כמות פרוטאינאז K. לכן, חשוב לגזור את הרקמה כראוי. עיכול מספיק של הרקמה גם מונע מפסולת הרקמה לסתום את קרום הפלזמה בתוך עמוד הספיחה. לאחר חסימת הממברנה, לא ניתן להשתמש בקצה פיפטה כדי לבחור את החסימה או לצנטריפוגה שוב ושוב, מה שיפגע בקרום. פתרון ה- DNA הסופי מכיל זיהומים רבים, אשר ישפיעו על זיהוי של DNA diatom. עוצמת התנודה והזמן הם גם נושאים מרכזיים. זמן תנודת המערבולת הראשונה נשלט ב 4-5 דקות, ותדירות התנודה נשלטת ב 3000 סל"ד, אחרת, מיצוי ה- DNA יושפע. אם הפסים האלקטרופורטיים אינם ברורים לאחר PCR, ייתכן שיהיה צורך להגדיל עוד יותר את כמות תבנית ה- DNA. הדנ"א המופק במחקר זה הוא תערובת של דנ"א, כולל דנ"א דיאטום ודנ"א ממינים אחרים, כך שלא ניתן לקבוע את ריכוז הדנ"א הדיאטומי. לכן, הוא אינו מתאים ליישומים הדורשים טוהר גבוה של תבניות DNA.
מחקרים הראו כי מיני דיאטומים שונים יכולים להיות מוגברים על ידי פריימרים שונים31,32. במחקר זה, רק הפריימרים הספציפיים לדיאטום D512 ו-D978 על rDNA 18S של הדיאטום שימשו כדי לבדוק אם הדנ"א הדיאטום חולץ בהצלחה, מה שלא יכול היה לכסות את כל מיני הדיאטומים22,33. בנוסף, מכיוון שאורך מקטע מוצר ההגברה של זוג הפריימרים הוא 390-410 bp, השיטה המשופרת בוחרת את כל גדלי המקטעים של DNA דיאטומי כדי לבדוק אם יש השפעה על הפרמטרים הניסיוניים, דבר הדורש מחקר נוסף. מחקרים מאוחרים יותר ישתמשו גם בפריימרים של אזורים שונים ובאורכי הגברה שונים כדי לחקור את השפעת המיצוי.
בהשוואה לשיטת מיצוי ה- DNA הדיאטומית המסורתית, לשיטה זו יש את היתרונות העיקריים של מיצוי DNA דיאטומי בעלות נמוכה ובקנה מידה גדול. זה יכול להשלים את היתרונות של שיטות מורפולוגיות diatom והוא יכול לענות על הצרכים של אבחון טביעה במעבדות משפטיות ראשוניות. במקביל, הוא גם מרחיב את טווח הבחירה של ערכות מיצוי DNA דיאטומי ויש לו סיכוי יישום טוב. בעתיד, שיטה זו לא תהיה מוגבלת רק להפקת דנ"א דיאטומי אלא תשמש להפקת דנ"א מאצות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82060341,81560304) ועל ידי פרויקט המחקר המדעי של פלטפורמת החדשנות האקדמית של מחוז האינאן (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
