Summary
В данной статье описан протокол экстракции ДНК диатомовых водорослей с использованием модифицированного общего набора для экстракции ДНК.
Abstract
Диатомовые водоросли являются важным вспомогательным средством в судебно-медицинской практике для определения того, утонул ли труп в воде, и для определения места утопления. Тестирование диатомовых водорослей также является важным предметом исследований в области окружающей среды и планктона. Технология молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей, которая фокусируется на ДНК диатомовых водорослей в качестве основного объекта исследования, является новым методом тестирования диатомовых водорослей. Экстракция ДНК диатомовых водорослей является основой молекулярного тестирования диатомовых водорослей. В настоящее время наборы, обычно используемые для экстракции ДНК диатомовых водорослей, стоят дорого, что увеличивает стоимость проведения соответствующих исследований. Наша лаборатория усовершенствовала общий набор для быстрой экстракции геномной ДНК цельной крови и получила удовлетворительный эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей, тем самым предоставив альтернативное экономичное и доступное решение для экстракции ДНК на основе стеклянных шариков для соответствующих исследований. ДНК диатомовых водорослей, выделенная с помощью этого протокола, может удовлетворить многие последующие задачи, такие как ПЦР и секвенирование.
Introduction
В судебно-медицинской практике определение того, был ли труп, найденный в воде утонувшим или брошенным в воду после смерти, имеет важное значение для надлежащего разрешения дела1. Это также один из сложных вопросов, которые необходимо срочно решить в судебно-экспертной практике2. Диатомовые водоросли в изобилии встречаются в природной среде (особенно в воде)3,4. В процессе утопления, из-за гипоксии и реакции на стресс, люди будут иметь интенсивные дыхательные движения и вдыхать большое количество тонущей жидкости. Поэтому диатомовые водоросли, находящиеся в воде, попадают в легкие вместе с тонущей жидкостью, а некоторые диатомовые водоросли могут попадать в кровоток через альвеолярно-капиллярный барьер и распространяться по внутренним органам с током крови 5,6. Обнаружение диатомовых водорослей во внутренних тканях и органах, таких как легкие, печень и костный мозг, является убедительным доказательством утопления перед смертью 7,8. В настоящее время судебно-медицинская экспертиза диатомовых водорослей в основном основана на морфологических методах тестирования. После серии предварительных расщеплений ткани под микроскопом проводят морфологические качественные и количественные оценки непереваренных диатомовых водорослей. В этот период необходимо использовать опасные и экологически небезопасные реагенты, такие как азотная кислота. Этот процесс занимает много времени и требует от исследователей солидных таксономических знаний и большого опыта. Все это создает определенные трудности для судебно-медицинского персонала9. Технология тестирования ДНК диатомовых водорослей - это новая технология тестирования диатомовых водорослей, разработанная в последние годы 10,11,12. Эта технология реализует видовую идентификацию диатомовых водорослей путем анализа специфического состава последовательности ДНК диатомовых водорослей13,14. Технология ПЦР и технология секвенирования являются широко используемыми техническими методами, но их основой является успешное извлечение ДНК из диатомовых водорослей. Однако диатомовые водоросли имеют особую структуру, отличную от других организмов, что делает их методы экстракции ДНК также различными.
Клеточная стенка диатомовых водорослей имеет высокую степень силицификации, а основным ее компонентом является диоксид кремния 15,16,17. Кремнистая клеточная стенка очень твердая, и она должна быть разрушена перед извлечением ДНК. Обычные наборы для экстракции ДНК часто трудно использовать непосредственно для экстракции ДНК диатомовых водорослей, поскольку они не могут разрушить кремнистую оболочку диатомовых водорослей18. Поэтому разрушение кремнистой оболочки диатомовых водорослей является одной из ключевых технических задач, которые необходимо решить при извлечении ДНК диатомовых водорослей.
В то же время, поскольку количество диатомовых водорослей, содержащихся в образцах судебно-медицинской экспертизы, будь то пробы воды или органы и ткани утонувших тел, часто ограничено, необходимо обогащать диатомовые водоросли. Суть обогащения заключается в разделении веществ. Пытаясь собрать диатомовые водоросли вместе, минимизируйте содержание других материальных компонентов (мешающих компонентов). В судебно-медицинской экспертизе лаборатории часто используют методы центрифугирования или мембранной фильтрации для разделения клеток диатомовых водорослей19. Однако, поскольку вакуумное насосное оборудование не получило широкого распространения, метод мембранного обогащения не часто используется в обычных первичных криминалистических лабораториях. Таким образом, метод центрифугирования по-прежнему широко распространен в криминалистических лабораторияхобогащением диатомовыми водорослями 20.
Выделение ДНК из диатомовых водорослей в настоящее время используется в основном в судебно-медицинской практике, и существуют существенные ограничения для его применения. В настоящее время на рынке мало наборов для экстракции диатомовой ДНК, используемых в криминалистике, и они, как правило, дорогие. В этой статье представлен усовершенствованный метод экстракции ДНК диатомовых водорослей, делающий экстракцию ДНК диатомовых водорослей простым, удобным и экономичным. Это расширяет применение последующего молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей и может лучше решать проблемы, связанные с утоплением в судебной медицине, с помощью тестирования диатомовых водорослей. Этот метод разрушает кремнистые клеточные стенки диатомовых водорослей, добавляя стеклянные шарики и устанавливая подходящее время для вихря. Таким образом, протеиназа К и связывающий раствор быстро лизируют клетки и инактивируют различные ферменты в клетках. Геномная ДНК поглощается матричной мембраной в адсорбционной колонке и, наконец, элюируется элюирующим буфером. Такой улучшенный набор для экстракции генов цельной крови улучшает эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей в материалах судебно-медицинской экспертизы, снижает стоимость экстракции ДНК диатомовых водорослей в судебно-медицинской практике и может быть лучше применен для низовых судебно-медицинских исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Хайнаньского медицинского университета. Образцы тканей, использованные в этом исследовании, не считаются исследованиями с участием людей. Эти образцы были получены с целью судебно-медицинской патологоанатомической диагностики, а остальные были использованы для выделения ДНК диатомовых водорослей в данном эксперименте. Исследователи не могут легко идентифицировать людей, чтобы получить информированное согласие от соответствующих заинтересованных сторон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить общую применимость метода исследования, представленного в этом эксперименте, этот эксперимент в основном следовал инструкциям по эксплуатации используемого набора, и только некоторые шаги были изменены. Пробы воды, использованные в этом эксперименте, были случайным образом взяты из прудов, расположенных рядом с лабораторией (дополнительный рисунок 1А). В этом эксперименте легочная ткань утонувшего тела была подтверждена в качестве исследовательской ткани для демонстрации протокола экстракции (дополнительный рисунок 1B). В судебно-медицинской практике также иногда возникает необходимость использования других органов и тканей утонувших тел (таких как печень, селезенка, почки, костный мозг и т.д.) для извлечения ДНК диатомовых водорослей, что требует незначительных соответствующих доработок данного экспериментального метода, о чем будет рассказано в соответствующем разделе эксперимента. Образцы легочной ткани, использованные в этом эксперименте, были взяты из трупов, которые явно были утоплены в судебно-медицинских делах. Были проведены морфологические тесты, чтобы доказать, что легочная ткань содержит диатомовые водоросли (дополнительный рисунок 2).
1. Предварительная обработка образцов
- Предварительная обработка проб воды
- Возьмите 10 мл пробы воды в центрифужную пробирку и центрифугируйте при концентрации 13 400 x g в течение 5 минут. Осторожно слейте 9,8 мл надосадочной жидкости с помощью пистолета для пипетки и перелейте около 200 мкл обогащенной диатомовой воды, оставшуюся на дне, в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала может быть проведен предварительный эксперимент, а начальное количество может быть увеличено, если 10 мл пробы воды недостаточно для обогащения.
- Возьмите 10 мл пробы воды в центрифужную пробирку и центрифугируйте при концентрации 13 400 x g в течение 5 минут. Осторожно слейте 9,8 мл надосадочной жидкости с помощью пистолета для пипетки и перелейте около 200 мкл обогащенной диатомовой воды, оставшуюся на дне, в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
- Предварительная обработка образцов тканей
- Возьмите 0,5 г ткани края легких от утопленника, полностью измельчите или измельчите легочную ткань до тех пор, пока она не станет мутной. Предотвращение загрязнения экзогенными диатомовыми водорослями является ядром этого этапа. Разрежьте ткань на кусочки несколько раз с помощью ножниц.
2. Экстракция ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования выполняются при комнатной температуре. Использование настольной центрифуги с центробежной силой 14 500 x g; Перед началом эксперимента необходимо подготовить водяную баню (или металлическую ванну), разогретую до 70 °C. Все этапы должны строго соответствовать принципам асептической работы.
- Сбор проб воды и тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод извлечения ДНК из образца воды и диатомовых водорослей тканей одинаков.- Добавьте стеклянные шарики в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую предварительно обработанный образец воды. Переверните 10x-15x, чтобы хорошо перемешать. Добавленные стеклянные шарики состоят из больших и маленьких стеклянных шариков, смешанных в массовом соотношении 1:1. Диаметр крупных стеклянных бусин составляет 1,5-2,0 мм, а мелких - 0,4-0,6 мм.
- Возьмите 0,5 г мелко нарезанной ткани, добавьте стеклянные шарики в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую ткань, как описано выше. Переверните 10-15 раз, чтобы перемешать.
- Добавьте 40 мкл протеиназы К (20 мг/мл) в пробирки. Поместите при комнатной температуре на 15 минут, в течение этого периода переверните и перемешайте 10 раз каждые 3 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не полностью переваривается, количество протеиназы К может быть соответствующим образом увеличено до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. - Добавьте 200 мкл связующего буфера в центрифужные пробирки, немедленно встряхните и перемешайте в течение 4 минут (частота колебаний смешивания: 3000 об/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе интенсивность и время встряхивания должны строго контролироваться, чтобы обеспечить достаточную интенсивность и время смешивания. - Поместите центрифужные пробирки на водяную баню с температурой 70 °C на 10 минут, и раствор станет прозрачным.
- Добавьте в центрифужные пробирки 100 мкл изопропанола, перемешайте и перемешайте в течение 15 с, в это время может появиться осадок флокулянта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно хорошо перемешать с соответствующей силой на вышеуказанных этапах операции, но следует избегать энергичного встряхивания, чтобы предотвратить сдвиг ДНК. - Раствор, полученный на предыдущем этапе, вместе с осадком флокулянта помещают в адсорбционную колонну (адсорбционная колонна помещается в сборную трубку). Длина адсорбционной колонки составляет 3,0 см, диаметр - 1,0 см, а адсорбционная матрица представляет собой кремниевую матричную мембрану.
- Центрифугу при 8 000 x g в течение 30 с, выбросьте отработанную жидкость в сборную трубку и поместите адсорбционную колонну обратно в сборную трубку.
- Добавьте 500 мкл буфера для удаления ингибитора в адсорбционную колонну. Центрифугу при 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте отработанную жидкость в сборную пробирку.
- Добавьте 700 мкл промывочного буфера в адсорбционную колонну. Центрифугу при 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте отработанную жидкость в сборную пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте указанное количество абсолютного этанола в буферную бутылку для промывки перед первым использованием. - Добавьте 500 мкл промывочного буфера в адсорбционную колонну. Центрифугу при 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте отработанную жидкость в сборную пробирку.
- Поместите адсорбционную колонку обратно в пустую сборную трубку. Центрифугу при 14 500 x g в течение 2 мин и максимально удалите промывочный буфер, чтобы остаточный этанол в промывочном буфере не ингибировал последующие реакции.
- Выньте адсорбционную колонку и поместите ее в чистую центрифужную пробирку. Добавьте 100 мкл элюирующего буфера в среднюю часть адсорбционной мембраны.
- Поместите адсорбционную колонку при комнатной температуре на 3-5 минут и центрифугу при 13 400 x g в течение 1 минуты.
- Раствор, полученный на предыдущем этапе, снова добавьте в центробежную адсорбционную колонну. Поместите центробежную адсорбционную колонну при комнатной температуре на 2 минуты и центрифугу при давлении 13 400 x g на 1 минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Элюирующий буфер следует предварительно нагреть на водяной бане с температурой 70 °C в течение примерно 10 минут. Объем элюирования должен быть не менее 50 мкл; в противном случае выход ДНК будет снижен. - Извлеченную ДНК диатомовых водорослей хранят при температуре 2-8 °C для дальнейшего использования. Если раствор ДНК будет храниться в течение длительного времени, храните его при температуре -20 °C.
3. ПЦР-тест
Примечание: Поскольку содержание диатомовых водорослей в образцах судебно-медицинской экспертизы часто бывает низким, экстракты образцов тканей утонувших тел могут также содержать различную степень тканей и органов (например, легких в этом эксперименте) с их собственной ДНК. Таким образом, прямое обнаружение общей ДНК в экстрактах ДНК не отражает ситуацию с экстракцией ДНК диатомовых водорослей. В этом эксперименте были выбраны диатомовые праймеры, специфичные для диатомовых водорослей, и для оценки экстракции ДНК диатомовых водорослей в экстракте использовались продукты ПЦР. Продукты можно наблюдать и анализировать с помощью электрофореза в агарозном геле, а также можно анализировать с помощью флуоресцентной количественной кривой плавления ПЦР в режиме реального времени, которая имеет более высокую чувствительность.
- Добавьте 2 мкл выделенной ДНК из образцов воды и тканей в качестве шаблона. Выберите один из следующих двух методов проверки.
- Обычный ПЦР-тест
- Используйте праймеры22 , которые могут специфически амплифицировать фрагменты рДНК диатомовых водорослей 18S. Подробнее см. в таблице 1.
- Установить систему реакции ПЦР и условия амплификации в соответствии с характеристиками праймеров. Подробнее см. в таблице 2.
- Запускают продукты ПЦР-амплификации на 2% агарозном геле. Наблюдайте и анализируйте изображение с помощью гелевого тепловизора.
- Флуоресцентный количественный ПЦР-тест
- Используйте вышеуказанные праймеры, которые могут специфически амплифицировать фрагменты рДНК диатомовых водорослей 18S, для приготовления флуоресцентной реакционной системы количественной ПЦР в реальном времени. Подробнее см. в таблице 3.
- Провести ПЦР-амплификацию и проанализировать полученную кривую амплификации и значения Ct. В то же время задайте программу, постепенно расплавляйте двухцепочечные продукты в одноцепочечные с помощью технологии флуоресцентной количественной кривой плавления ПЦР, а затем анализируйте полученные кривые плавления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поскольку раствор ДНК, выделенный используемым в настоящее время методом экстракции ДНК, содержит в образце все компоненты ДНК из разных источников, ДНК, полученная по этому протоколу, не стала исключением. Таким образом, раствор ДНК был не просто раствором геномной ДНК диатомовых водорослей. Праймеры, которые могут специфически амплифицировать фрагменты рДНК диатомовых водорослей 18S, были выбраны путем обращения к литературе 22,23,24. Праймеры были проверены NCBI-Blast Primer, и результаты показали, что прямой праймер D512 и обратный праймер D978 18S рДНК были специфичными для водорослей праймерами и охватывали многие виды диатомовых водорослей. Результаты амплификации не выявили каких-либо человеческих генов. Они были использованы в качестве надежного биомаркера ДНК для тестирования диатомовых водорослей, поэтому были отобраны для верификации результатов этого эксперимента. Используя выделенную ДНК в качестве матрицы для диатомовой специфической ПЦР-амплификации, продукт амплификации методом электрофореза в агарозном геле показал, что образцы воды и ткани имели диатомовые полосы ДНК, эти полосы электрофореза были в пределах 250-500.о. (ближе к 500.о.), что соответствовало размеру длины продукта амплификации мишени праймера (390-410.о.). Это показало, что протокол экстракции был успешным в извлечении ДНК диатомовых водорослей (рис. 1A, B).
Технология флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени является разновидностью технологии генного тестирования со строгой специфичностью и высокой чувствительностью. Добавляя флуоресцентные группы в реакционную систему ПЦР, накопление флуоресцентных сигналов позволяет контролировать весь процесс ПЦР в режиме реального времени, а чувствительность высока25,26. Продукты, специфически амплифицированные с помощью обычной ПЦР, иногда может быть трудно обнаружить при электрофорезе в агарозном геле из-за низкого содержания и других причин27 (рисунок 1C). Путем специфической амплификации флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени была получена типичная кривая амплификации с четырьмя характерными стадиями (рис. 2). При этом с помощью технологии кривой плавления флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени двойные нити ДНК амплифицированного продукта при высокой температуре расплавлялись в одиночные нити, краситель освобождался от двойных нитей, а значение флуоресценции снижалось. Детектируя изменение величины флуоресценции, была получена кривая плавления (рис. 3). Полученные кривые плавления имели характерные пики, а пиковое значение составляло около 85,5 °C, что доказывало наличие специфической амплификации ДНК-мишени, что указывало на наличие ДНК диатомовых водорослей в экстрагированном растворе ДНК. Краситель также может быть непосредственно добавлен к обычному продукту для амплификации ПЦР, а кривая плавления может быть получена с помощью технологии количественной кривой плавления ПЦР в режиме реального времени, чтобы доказать, имеет ли место специфическая амплификация. Поэтому, когда обычный электрофорез ПЦР-агарозного геля не мог доказать, есть ли ДНК диатомовых водорослей в экстрагированном растворе ДНК, для верификации и оценки можно было выбрать технологию флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени с более высокой чувствительностью. В этом эксперименте технология флуоресцентной количественной кривой плавления ПЦР в реальном времени использовалась только для качественного анализа.
Как было показано в предыдущем отчете21, традиционный набор для экстракции ДНК из почвы и модифицированный набор для экстракции ДНК крови были в основном одинаковыми для экстракции ДНК диатомовых водорослей из образцов воды и тканей. Разница в стоимости экстракции ДНК диатомовых водорослей была в основном разницей в цене двух наборов, а стоимость других расходных материалов была в основном одинаковой. В этом исследовании простое усовершенствование набора для экстракции ДНК крови, обычно используемого в экспериментах по молекулярной биологии, может привести к лучшим экспериментальным результатам, что не только расширило возможности для исследователей по выбору набора для тестирования в исследовательской деятельности, связанной с экстракцией ДНК диатомовых водорослей, но и снизило стоимость тестирования.
Процесс совершенствования этого протокола был опубликован21. Разработав комбинацию различных массовых соотношений стеклянных шариков и времени вихревых колебаний, в обычный набор были добавлены оптимальные условия экстракции ДНК осцилляции стеклянных шариков, следовательно, метод может улучшить эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей в судебно-медицинских образцах, особенно в образцах тканей. Оптимальная комбинация экстракции ДНК была получена при частоте колебаний вихря 3000 об/мин; Время колебаний вихря составляло 4 мин, массовое соотношение крупных стеклянных шариков диаметром 1,5-2,0 мм и мелких стеклянных шариков диаметром 0,4-0,6 мм составляло 1:1. Проведено сравнение традиционного метода комплекта и усовершенствованного метода. Показано, что использованный набор может удовлетворить потребности амплифицирующей ДНК диатомовых водорослей, а яркость электрофоретических полос после амплификации, выполненной усовершенствованным методом в пробах воды, была аналогична яркости традиционного метода, а электрофоретические полосы после амплификации, выполненной усовершенствованным методом в образцах тканей, были ярче (рис. 4).
Рисунок 1: Результаты электрофореза ДНК, выделенной по протоколу после ПЦР-амплификации. В общей сложности 2 мкл экстракта ДНК использовали в качестве матрицы ДНК для ПЦР-специфической амплификации. Продукты ПЦР-амплификации электрофорезировали на 1х буферном растворе ТАЕ через 2% агарозный гель и запускали при постоянном напряжении 100 В в течение 25-30 мин. Для всех гелей использовалась ДНК-лестница D2000. (А) Результаты электрофореза ДНК диатомовых водорослей в пробах воды после амплификации ПЦР, дорожка 1 – холостой контроль; Полосы 2-7 представляют собой пробы воды из разных мест в одном и том же районе. (Б) Результаты электрофореза после ПЦР-амплификации ДНК диатомовых водорослей в ткани. Дорожки 1-6 – это ткани, иссеченные из разных позиций одной и той же легочной ткани; Полоса 7 - это пустой контроль. (C) В неудачном эксперименте после амплификации диатомовой ДНК результаты электрофореза не показали полос электрофореза в соответствующих положениях, что указывает на отсутствие продуктов амплификации или их слишком мало. В то время результаты электрофореза не могли указать, есть ли ДНК диатомовых водорослей в предложенном растворе ДНК, что необходимо было проводить более чувствительными методами (такими как кривая плавления ПЦР). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Кривая амплификации кПЦР ДНК диатомовых водорослей. В общей сложности 2 мкл экстракта раствора ДНК, который не показал полос с помощью обычной ПЦР и электрофореза в агарозном геле, использовали в качестве шаблона для приготовления системы количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени и настройки программы. Наконец, были получены типичные кривые усиления с четырьмя характерными стадиями: линейной базовой фазой, началом экспоненциальной фазы, экспоненциальной фазой и фазой плато. Значение Ct каждой кривой также было получено с помощью анализа, что указывает на то, что экстракция ДНК прошла успешно. Каждое число представляет собой значение Ct соответствующей кривой. Пороговое значение составляет 5,2. Единицей измерения оси Y является Rn. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Кривая плавления ДНК диатомовых водорослей. С помощью системы флуоресцентной количественной ПЦР в режиме реального времени была задана программа, при которой температура повышается от 60-95 °C. Это создавало кривую плавления, и специально амплифицированная двухцепочечная ДНК расплавлялась на одиночные нити при высоких температурах, краситель освобождался от двойных нитей, а значение флуоресценции уменьшалось до 0. Граф был получен путем взятия отрицательной обратной величины исходного графа. Абсцисса представляла температуру, абсцисса, соответствующая наибольшему пиковому значению, была значением Tm, а значение Tm кривой плавления на графике было 85,5 °C. Нумерация каждой кривой соответствует нумерации каждой полосы движения на рисунке 1С. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Результаты электрофореза усовершенствованного процесса. (A) Результаты электрофореза для различных комбинаций соотношений стеклянных шариков и времен вихревых колебаний. Дорожки 1, 4, 7, 10 и 13, где смешанная массовая доля больших и маленьких стеклянных бусин составляет 1:2, дорожки 2, 5, 8, 11 и 14, где смешанная массовая доля больших и маленьких стеклянных бусин составляет 1:1, дорожки 3, 6, 9, 12 и 15, где смешанная массовая доля больших и маленьких стеклянных бусин составляет 2:1. Время колебания составило 2 минуты для дорожек 1-3, 3 минуты для дорожек 4-6, 4 минуты для дорожек 7-9, 5 минут для дорожек 10-12 и 6 минут для дорожек 13-15. Полоса 16 - это холостой контроль. (B) Результаты электрофореза после ПЦР-амплификации продуктов экстракции набора до и после улучшения. Дорожки 1-3 - это обычные методы извлечения проб воды, дорожки 4-6 - улучшенные методы извлечения проб воды, дорожки 7-9 - обычные методы извлечения тканей, дорожки 10-12 - улучшенные методы извлечения тканей, дорожка 13 - холостой контроль. Результаты были изменены по сравнению с21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Пробы воды и ткани .Использованные пробы воды были взяты из пруда рядом с лабораторией, и было подтверждено, что использованные образцы тканей являются легочной тканью утонувшего тела. (А) Местом отбора проб экспериментальной воды был пруд рядом с лабораторией. (B) Пробы обогащенной воды и измельченные образцы легочной ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Микрофотография диатомовых водорослей. Изображения (А) и (Б) были получены под 400-кратным оптическим микроскопом. Стрелка указывает на диатомовые водоросли. Изображения (C) и (D) были получены под электронным микроскопом. На изображениях (А) и (Б) показаны диатомовые водоросли в воде на месте утопления. Диатомовые водоросли названы Fragilaria и Navicula. На изображениях (C) и (D) показаны диатомовые водоросли в легких, которые называются Nitzschia и Navicula. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
| Цель | Название праймера | Последовательность |
| 18S рДНК | Грунтовка forword D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| грунтовка реверсивная D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Таблица 1: Перечень используемых грунтовок. В этой таблице описаны последовательности, названия и целевые области конкретных праймеров, используемых в данной статье.
| Реакционная система ПЦР | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 мкл | ||
| Грунтовка forword D512 | 0,5 мкл (10 мкмоль/л) | ||
| грунтовка реверсивная D978 | 0,5 мкл (10 мкмоль/л) | ||
| шаблонная ДНК | 2 мкл | ||
| Вода, не содержащая нуклеаз | до 20 мкл | ||
| Примечание: ДНК пустого контрольного шаблона заменяется таким же количеством воды, не содержащей нуклеазы. | |||
| Программа ПЦР | |||
| температура | Время | Циклов | |
| 94 °С | 10 мин | 1 | |
| 94 °С | 45 с | 40 | |
| 50 °С | 45 с | ||
| 72 °С | 1 мин. | ||
| 72 °С | 10 мин | 1 | |
Таблица 2: Компоненты ПЦР. В этой таблице описана конфигурация реакционной системы для обычной ПЦР и настройки температуры реакции, времени и количества циклов для ПЦР. Общий объем использованной реакционной системы составил 20 мкл.
| Система количественной ПЦР-реакции в режиме реального времени | |||
| 2x кПЦР-микс | 10 мкл | ||
| Грунтовка forword D512 | 0,45 мкл (10 мкмоль/л) | ||
| грунтовка реверсивная D978 | 0,45 мкл (10 мкмоль/л) | ||
| шаблонная ДНК | 2 мкл | ||
| Вода, не содержащая нуклеаз | до 20 мкл | ||
| Примечание: ДНК пустого контрольного шаблона заменяется таким же количеством воды, не содержащей нуклеазы. | |||
| Программа количественной ПЦР в режиме реального времени | |||
| температура | Время | Циклов | |
| 94 °С | 10 мин | 1 | |
| 94 °С | 45 с | 40 | |
| 50 °С | 45 с | ||
| 72 °С | 1 мин. | ||
Таблица 3: Компоненты количественной ПЦР в реальном времени. В этой таблице описана конфигурация реакционной системы для количественной ПЦР в реальном времени, а также настройки температуры реакции, времени и количества циклов для ПЦР. Общий объем использованной реакционной системы составил 20 мкл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клетки диатомовых водорослей защищены твердыми кремнеземистыми клеточными стенками17, и эта структура должна быть разрушена для извлечения ДНК диатомовых водорослей. Обычные наборы не так легко разрушают кремнистую оболочку диатомовых водорослей; таким образом, трудно успешно извлечь ДНК диатомовых водорослей21. Наша лаборатория усовершенствовала наиболее часто используемый набор для экстракции ДНК крови, добавив в процесс экстракции диатомовых водорослей стеклянные шарики разного диаметра и разного массового соотношения. Одновременно осуществляется вихревая осцилляция, которая может полностью разрушить оболочку диатомовых водорослей и улучшить эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей. Как было показано в предыдущем отчете21, диаметр стеклянных шариков, интенсивность и время колебаний напрямую влияют на качество экстракции ДНК. Время вихревых колебаний не должно быть слишком большим (не более 10 мин). Если время будет слишком большим, ДНК сломается из-за чрезмерной вибрации. При этом время не должно быть слишком коротким. Если время будет слишком коротким (не менее 2 мин), оболочка диатомовых водорослей не будет удалена полностью, что сделает выделение ДНК неэффективным. При выборе стеклянных шариков выбирайте бусины с разным окружным диаметром, большие стеклянные шарики обеспечивают прочность на столкновение, а маленькие стеклянные бусины гарантируют, что между стеклянными шариками не будет мертвого столкновения во время процесса фрагментации при столкновении, что повышает эффективность разрушения оболочки.
Чтобы извлечь ДНК диатомовых водорослей из образцов, как правило, необходимо обогатить диатомовые водоросли. Этот процесс окажет большое влияние на экстракцию ДНК диатомовых водорослей. Целью обогащения является увеличение концентрации диатомовых водорослей в образцах таким образом, чтобы концентрация экстрагированной ДНК диатомовых водорослей могла быть в обнаруживаемом диапазоне; для следующих областей применения, таких как флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времени и высокопроизводительное секвенирование.
Поскольку диатомовые водоросли широко распространены в природе4, предотвращение лабораторного загрязнения является первоочередной задачей28. Загрязнение в процессе экстракции ДНК приведет к отклонениям от фактических результатов и потере потребительской ценности. Поэтому всегда обращайте внимание на принцип асептической работы при экстракции ДНК диатомовых водорослей и принимайте все возможные меры для уменьшения и предотвращения контаминации экзогенных диатомовых водорослей. При извлечении ткани из мертвого тела должны быть приняты меры по предотвращению ее загрязнения экзогенными диатомовыми водорослями. После извлечения ткани ее следует хранить в контейнере или пакете для образцов, свободном от загрязнения диатомовыми водорослями. Ткань не следует обрабатывать формальдегидом. Оборудование для извлечения и обработки тканей следует промыть 2-3 раза дистиллированной водой неоднократно, а затем стерилизовать ультрафиолетом или высокой температурой, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения диатомовых водорослей из других источников. Ткань перед исследованием следует отрезать от поверхностной ткани с помощью инструмента, не содержащего диатомовых водорослей, а затем инструмент следует заменить, чтобы выбрать нижнюю ткань для исследования. В то же время стандартизация рабочего процесса также может эффективно избежать проблемы лабораторного загрязнения.
Поскольку диатомовые водоросли являются пищей многих гидробионтов, они теряются при длительном хранении29. Диатомовые водоросли также могут расти и размножаться при свете. Поэтому этап экстракции ДНК должен быть начат как можно скорее после отбора проб и должна быть проведена быстрая обработка образца, чтобы предотвратить потерю диатомовых водорослей в образце. Если экстракция ДНК не может быть проведена немедленно, все образцы следует заморозить и хранить в темноте, чтобы максимально предотвратить восстановление диатомовых водорослей.
В нашем исследовании был выбран распространенный и дешевый набор для экстракции ДНК крови, основанный на методе расщепления протеиназы К, который был усовершенствован для извлечения ДНК диатомовых водорослей из образцов воды и тканей с хорошими результатами30. Ткань достаточно разрезается, чтобы находиться в полном контакте с протеиназой К, и ткань полностью переваривается. Возможный принцип успешной экстракции заключается в следующем: на этапе встряхивания твердая оболочка диатомовых водорослей многократно ударяется и фрагментируется между быстро движущимися стеклянными шариками, обнажая клеточную мембрану; конфигурация стеклянных шариков разных размеров может заполнить зазор между столкновениями стеклянных шариков одного размера, чтобы максимально полно покрыть контактную поверхность столкновения; после потери кремниевой оболочки протеиназа К помогает высвобождать ДНК из диатомовых водорослей. По сравнению с используемым в настоящее время набором для экстракции почвенной ДНК, улучшенный набор для экстракции ДНК крови может удовлетворить требования экстракции ДНК диатомовых водорослей, который более экономичен и прост в получении. Он не только облегчает использование судебно-медицинской экспертизы диатомовых водорослей, но и подходит для применения в других дисциплинах, связанных с исследованиями диатомовых водорослей, а также может быть использован для извлечения ДНК другого планктона. При извлечении ДНК диатомовых водорослей из проб воды количество используемой протеиназы К должно быть скорректировано в соответствии с количеством планктона в воде. Количество протеиназы К может быть увеличено или уменьшено в зависимости от предварительных экспериментов. При извлечении ДНК диатомовых водорослей из тканей различные типы тканей органов, загрязнение тканей и другие факторы будут влиять на количество протеиназы К, необходимой для пищеварения. В эксперименте протеиназа К в наборе должна храниться при -20 °C после использования, в противном случае инактивация протеиназы К повлияет на процесс экстракции.
В заключение, экстракцию ДНК диатомовых водорослей следует проводить как можно скорее после отбора проб и обработки образцов, в противном случае хранить при -20 °C для сохранения. Обработка, хранение и весь процесс экстракции должны осуществляться осторожно, чтобы предотвратить загрязнение экзогенными диатомовыми водорослями. В противном случае нельзя оценить, была ли в образце выделенная ДНК диатомовых водорослей или экзогенное загрязнение. При использовании протеиназы К для переваривания тканей ее дозировка может стать проблемой. Недостаточное переваривание тканей может привести к увеличению количества протеиназы К. Поэтому важно правильно стричь ткань. Достаточное переваривание ткани также предотвращает закупорку плазматической мембраны внутри адсорбционной колонки тканевыми отходами. После блокировки мембраны невозможно использовать наконечник пипетки для обнаружения засора или многократной центрифуги, что может привести к повреждению мембраны. Конечный раствор ДНК содержит много примесей, которые повлияют на обнаружение ДНК диатомовых водорослей. Интенсивность и время колебаний также являются ключевыми вопросами. Время первых вихревых колебаний контролируется на 4-5 мин, а частота колебаний регулируется при 3000 об/мин, в противном случае это повлияет на экстракцию ДНК. Если электрофоретические полосы после ПЦР не прозрачны, может потребоваться дальнейшее увеличение количества матрицы ДНК. ДНК, извлеченная в этом исследовании, представляет собой смесь ДНК, включая ДНК диатомовых водорослей и ДНК других видов, поэтому концентрация ДНК диатомовых водорослей не может быть определена. Поэтому он не подходит для применений, требующих высокой чистоты шаблонов ДНК.
Исследования показали, что разные виды диатомовых водорослей могут быть усилены разными праймерами31,32. В этом исследовании для проверки того, была ли успешно экстрагирована ДНК диатомовых водорослей, использовались только диатомовые праймеры D512 и D978 на рДНК диатомовых водорослей 18S, что не могло охватить все виды диатомовых водорослей22,33. Кроме того, поскольку длина фрагмента продукта амплификации пары праймеров составляет 390-410.н., усовершенствованный метод отбирает все размеры фрагментов ДНК диатомовых водорослей для проверки влияния на экспериментальные параметры, что требует дальнейшего изучения. В последующих исследованиях также будут использоваться праймеры из разных областей и разной длины амплификации для изучения эффекта экстракции.
По сравнению с традиционным методом экстракции ДНК диатомовых водорослей, этот метод имеет основные преимущества недорогой и крупномасштабной экстракции ДНК диатомовых водорослей. Он может дополнить преимущества морфологических методов диатомовых водорослей и может удовлетворить потребности диагностики утоплений в первичных судебно-медицинских лабораториях. В то же время он также расширяет ассортимент наборов для экстракции диатомовой ДНК и имеет хорошую перспективу применения. В будущем этот метод будет использоваться не только для экстракции ДНК диатомовых водорослей, но и для извлечения ДНК из других водорослей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82060341,81560304) и Научно-исследовательского проекта «Инновационная платформа академика» провинции Хайнань (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
