Summary
Bu makale, modifiye edilmiş bir ortak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak diatom DNA ekstraksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır.
Abstract
Diatom testi, adli tıp pratiğinde cesedin suda boğulup boğulmadığını belirlemek ve boğulma yerini belirlemek için önemli bir yardımcı araçtır. Diatom testi aynı zamanda çevre ve plankton alanında da önemli bir araştırma içeriğidir. Birincil araştırma nesnesi olarak diatom DNA'ya odaklanan diatom moleküler biyoloji test teknolojisi, yeni bir diatom testi yöntemidir. Diatom DNA ekstraksiyonu, diatom moleküler testinin temelidir. Şu anda, diatom DNA ekstraksiyonu için yaygın olarak kullanılan kitler pahalıdır ve bu da ilgili araştırmaları yürütme maliyetini artırmaktadır. Laboratuvarımız genel tam kan genomik DNA hızlı ekstraksiyon kitini geliştirdi ve tatmin edici bir diatom DNA ekstraksiyon etkisi elde etti, böylece ilgili araştırmalar için cam boncuklara dayalı alternatif, ekonomik ve uygun fiyatlı bir DNA ekstraksiyon çözümü sağladı. Bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen diatom DNA, PCR ve dizileme gibi birçok aşağı akış uygulamasını karşılayabilir.
Introduction
Adli tıp uygulamasında, suda bulunan bir cesedin boğularak mı yoksa öldükten sonra mı suya atıldığının belirlenmesi, davanın doğru çözümlenmesi için esastır1. Aynı zamanda adli tıp uygulamasında acilen çözülmesi gereken zor konulardan biridir2. Diatomlar doğal ortamda (özellikle suda) bol miktarda bulunur3,4. Boğulma sürecinde, hipoksi ve stres tepkisi nedeniyle, insanlar yoğun solunum hareketlerine sahip olacak ve çok miktarda boğulma sıvısını soluyacaklardır. Bu nedenle sudaki diatomlar boğulma sıvısı ile akciğere girer ve bazı diatomlar alveolar-kılcal damar bariyeri yoluyla kan dolaşımına girebilir ve kan akımı ile iç organlara yayılabilir 5,6. Akciğer, karaciğer ve kemik iliği gibi iç doku ve organlarda diatomların saptanması, ölümden önce boğulmanın güçlü bir kanıtıdır 7,8. Şu anda, adli diatom testi esas olarak morfolojik test yöntemlerine dayanmaktadır. Dokunun bir dizi ön sindiriminden sonra, sindirilmemiş diatomların morfolojik kalitatif ve kantitatif tahminleri mikroskop altında gerçekleştirilir. Bu süre zarfında, nitrik asit gibi tehlikeli ve çevre dostu olmayan reaktiflerin kullanılması gerekir. Bu süreç zaman alıcıdır ve araştırmacıların sağlam taksonomik uzmanlığa ve kapsamlı deneyime sahip olmasını gerektirir. Bunların hepsi adli tıp personeline bazı zorluklar getiriyor9. Diatom DNA test teknolojisi, son yıllarda geliştirilen diatom testi için yeni bir teknolojidir 10,11,12. Bu teknoloji, diatomların13,14 spesifik DNA dizisi bileşimini analiz ederek diatomların tür tanımlamasını gerçekleştirir. PCR teknolojisi ve dizileme teknolojisi yaygın olarak kullanılan teknik yöntemlerdir, ancak temelleri DNA'nın diatomlardan başarılı bir şekilde çıkarılmasıdır. Bununla birlikte, diatomların diğer organizmalardan farklı özel bir yapısı vardır, bu da DNA ekstraksiyon tekniklerini de farklı kılar.
Diatomun hücre duvarı yüksek derecede silisleşmeye sahiptir ve ana bileşeni silikon dioksit 15,16,17'dir. Silisli hücre duvarı çok serttir ve DNA'yı çıkarmadan önce yok edilmesi gerekir. Sıradan DNA ekstraksiyon kitlerinin, diatomların18 silisli kabuğunu yok edemedikleri için doğrudan diatom DNA'nın ekstraksiyonu için kullanılması genellikle zordur. Bu nedenle, diatomların silisli kabuğunun yok edilmesi, diatom DNA'sının çıkarılmasında çözülmesi gereken en önemli teknik sorunlardan biridir.
Aynı zamanda, adli araştırma örneklerinde bulunan diatomların sayısı, ister su örnekleri ister boğulmuş cesetlerin organ ve dokuları olsun, genellikle sınırlı olduğundan, diatomları zenginleştirmek gerekir. Zenginleştirmenin özü, maddelerin ayrılmasıdır. Diatomları bir araya getirmeye çalışırken, diğer malzeme bileşenlerinin (enterferans yapan bileşenler) içeriğini en aza indirin. Adli çalışmalarda, laboratuvarlar genellikle diatom hücrelerini ayırmak için santrifüjleme veya membran filtrasyon zenginleştirme yöntemlerini kullanır19. Bununla birlikte, vakum pompalama ekipmanı yaygın olarak kullanılmadığından, membran zenginleştirme yöntemi sıradan birincil adli tıp laboratuvarlarında sıklıkla kullanılmamaktadır. Bu nedenle, santrifüjleme yöntemi hala adli laboratuvarlarda yaygın olarak diatom zenginleştirmedir20.
Diatomlardan DNA ekstraksiyonu şu anda öncelikle adli tıp pratiğinde kullanılmaktadır ve uygulamasında önemli sınırlamalar vardır. Şu anda, piyasada adli bilimlerde kullanılan az sayıda diatom DNA ekstraksiyon kiti bulunmaktadır ve bunlar genellikle pahalıdır21. Bu makale, diatom DNA ekstraksiyonunu basit, kullanışlı ve uygun maliyetli hale getiren gelişmiş bir diatom DNA ekstraksiyon yöntemi sağlar. Bu, diatomların sonraki moleküler biyoloji testlerinin uygulanmasını artırır ve diatom testi yoluyla adli tıpta boğulma ile ilgili sorunları daha iyi çözebilir. Bu yöntem, cam boncuklar ekleyerek ve girdap için uygun bir zaman ayarlayarak diatomların silisli hücre duvarlarını kırar. Bu şekilde proteinaz K ve bağlayıcı çözelti hücreleri hızla parçalar ve hücrelerdeki çeşitli enzimleri etkisiz hale getirir. Genomik DNA, adsorpsiyon kolonundaki matris zarında emilir ve son olarak elüsyon tamponu tarafından ayrıştırılır. Böyle geliştirilmiş bir tam kan geni ekstraksiyon kiti, adli muayene materyallerinde kan kitinin diatom DNA ekstraksiyon etkisini iyileştirir, adli tıp uygulamasında diatom DNA ekstraksiyonunun maliyetini düşürür ve adli araştırmalara daha iyi uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Hainan Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan doku örnekleri, insan denekleri içeren çalışmalar olarak kabul edilmemektedir. Bu örnekler adli patolojik tanı amacıyla elde edildi ve geri kalanı bu deneyde diatom DNA'nın ekstraksiyonu için kullanıldı. Araştırmacılar, ilgili paydaşlardan bilgilendirilmiş onam almak için bireyleri kolayca tanımlayamazlar.
NOT: Bu deneyde bildirilen araştırma yönteminin genel uygulanabilirliğini sağlamak için, bu deney temel olarak kullanılan kitin kullanım talimatlarını takip etti ve sadece bazı adımlar değiştirildi. Bu deneyde kullanılan su örnekleri, laboratuvarın yakınındaki havuzlardan rastgele alınmıştır (Ek Şekil 1A). Bu deneyde, boğulan vücudun akciğer dokusu, ekstraksiyon protokolünü göstermek için araştırma dokusu olarak doğrulandı (Ek Şekil 1B). Adli uygulamada, bazen boğulan cesetlerin diğer organ ve dokularını (karaciğer, dalak, böbrek, kemik iliği vb.) diatom DNA'sını çıkarmak için kullanmak da gereklidir, bu da deneyin ilgili bölümünde açıklanacak olan bu deneysel yöntemde küçük karşılık gelen iyileştirmeler gerektirir. Bu deneyde kullanılan akciğer dokusu örnekleri, adli vakalarda açıkça boğulmuş cesetlerden geldi. Akciğer dokusunun diatom içerdiğini kanıtlamak için morfolojik testler yapılmıştır (Ek Şekil 2).
1. Numunelerin ön işlemi
- Su numunelerinin ön arıtımı
- Santrifüj tüpüne 10 mL su numunesi alın ve 5 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin. 9.8 mL süpernatantı bir pipet tabancasıyla dikkatlice atın ve altta kalan yaklaşık 200 μL zenginleştirilmiş diatom su örneğini 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Önce ön deney yapılabilir ve 10 mL'lik bir su numunesi zenginleştirme için yeterli değilse başlangıç miktarı artırılabilir.
- Santrifüj tüpüne 10 mL su numunesi alın ve 5 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin. 9.8 mL süpernatantı bir pipet tabancasıyla dikkatlice atın ve altta kalan yaklaşık 200 μL zenginleştirilmiş diatom su örneğini 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Doku örneklerinin ön işlemi
- Boğulan vücuttan 0.5 g akciğer kenar dokusu alın, akciğer dokusunu çamurlu hale gelene kadar tamamen doğrayın veya öğütün. Eksojen diatomların kontaminasyonunu önlemek bu adımın özüdür. Dokuyu makas kullanarak tekrar tekrar parçalara ayırın.
2. DNA ekstraksiyonu
NOT: Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında tamamlanır. 14.500 x g merkezkaç kuvvetine sahip bir masaüstü santrifüj kullanarak; deney başlamadan önce 70 °C'ye ısıtılmış bir su banyosu (veya metal banyosu) hazırlanmalıdır. Tüm adımlar kesinlikle aseptik çalışma ilkelerine uymalıdır.
- Su numunelerinin ve dokuların montajı
NOT: Su örneği ve doku diatom DNA ekstraksiyon yöntemi aynıdır.- Ön işlem görmüş su örneğini içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne cam boncuklar ekleyin. İyice karıştırmak için 10x-15x ters çevirin. Eklenen cam boncuklar, 1:1 kütle oranında karıştırılmış irili ufaklı cam boncuklardan oluşur. Büyük cam küreciklerin çapı 1.5-2.0 mm, küçük cam boncukların çapı ise 0.4-0.6 mm'dir.
- 0.5 g ince kıyılmış doku alın, yukarıda tarif edildiği gibi dokuyu içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne cam boncuklar ekleyin. Karıştırmak için 10x-15x ters çevirin.
- Tüplere 40 μL proteinaz K (20 mg/mL) ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında bekletin, bu süre zarfında ters çevirin ve her 3 dakikada bir 10 kez karıştırın.
NOT: Doku tamamen sindirilmemişse, proteinaz K miktarı, çözelti berraklaşana kadar uygun şekilde arttırılabilir. - Santrifüj tüplerine 200 μL bağlayıcı tampon ekleyin, hemen girdap yapın ve 4 dakika karıştırın (salınım karıştırma frekansı: 3000 rpm).
NOT: Bu adımda, yeterli karıştırma yoğunluğu ve süresini sağlamak için çalkalama yoğunluğu ve süresi sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. - Santrifüj tüplerini 10 dakika boyunca 70 ° C'lik bir su banyosuna koyun ve çözelti berraklaşır.
- Santrifüj tüplerine 100 μL izopropanol ekleyin, girdap yapın ve 15 saniye karıştırın, bu sırada topaklı çökelme görünebilir.
NOT: Yukarıdaki işlem adımlarında uygun güçle iyice karıştırmak çok önemlidir, ancak DNA kesilmesini önlemek için kuvvetli çalkalamadan kaçınılmalıdır. - Önceki adımda elde edilen çözeltiyi topaklaştırıcı çökelti ile birlikte adsorpsiyon kolonuna koyun (adsorpsiyon kolonu toplama tüpüne yerleştirilir). Adsorpsiyon kolonu uzunluğu 3.0 cm, çap 1.0 cm ve adsorpsiyon matrisi silikon matris membranıdır.
- 30 saniye boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin, atık sıvıyı toplama tüpüne atın ve adsorpsiyon kolonunu tekrar toplama tüpüne koyun.
- Adsorpsiyon kolonuna 500 μL inhibitör çıkarma tamponu ekleyin. 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve atık sıvıyı toplama tüpüne atın.
- Adsorpsiyon kolonuna 700 μL yıkama tamponu ekleyin. 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve atık sıvıyı toplama tüpüne atın.
NOT: İlk kullanımdan önce yıkama tamponu şişesine belirtilen miktarda mutlak etanol ekleyin. - Adsorpsiyon kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin. 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve atık sıvıyı toplama tüpüne atın.
- Adsorpsiyon kolonunu boş toplama tüpüne geri koyun. 2 dakika boyunca 14.500 x g'da santrifüjleyin ve yıkama tamponundaki artık etanolün aşağı akış reaksiyonlarını engellemesini önlemek için yıkama tamponunu mümkün olduğunca çıkarın.
- Adsorpsiyon kolonunu çıkarın ve temiz bir santrifüj tüpüne koyun. Adsorpsiyon membranının orta kısmına 100 μL elüsyon tamponu ekleyin.
- Adsorpsiyon kolonunu 3-5 dakika oda sıcaklığında tutun ve 1 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin.
- Önceki adımda elde edilen çözeltiyi tekrar santrifüj adsorpsiyon kolonuna ekleyin. Santrifüjlü adsorpsiyon kolonunu 2 dakika oda sıcaklığında yerleştirin ve 1 dakika boyunca 13.400 x g'de santrifüjleyin.
NOT: Elüsyon tamponu 70 °C'lik bir su banyosunda yaklaşık 10 dakika önceden ısıtılmalıdır. Elüsyon hacmi 50 μL'den az olmamalıdır; aksi takdirde DNA verimi azalacaktır. - Ekstrakte edilen diatom DNA'yı ileride kullanmak üzere 2-8 °C'de saklayın. DNA çözeltisi uzun süre saklanacaksa, -20 °C'de saklayın.
3. PCR testi
NOT: Adli örneklerdeki diatomların içeriği genellikle düşük olduğundan, boğulan cesetlerin doku örneği ekstraktları, kendi DNA'ları ile değişen derecelerde doku ve organlar (bu deneydeki akciğerler gibi) içerebilir. Bu nedenle, DNA ekstraktlarında toplam DNA'nın doğrudan tespiti, diatom DNA ekstraksiyonunun durumunu yansıtmaz. Bu deneyde, diatoma özgü primerler seçildi ve ekstrakttaki diatom DNA ekstraksiyonunu değerlendirmek için PCR ürünleri kullanıldı. Ürünler, agaroz jel elektroforezi ile gözlemlenebilir ve analiz edilebilir ve ayrıca daha yüksek hassasiyete sahip gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR erime eğrisi ile analiz edilebilir.
- Şablon olarak su örneklerinden ve dokulardan ekstrakte edilen DNA'nın 2 μL'sini ekleyin. İnceleme için aşağıdaki iki yöntemden birini seçin.
- Konvansiyonel PCR testi
- Diatom22S rDNA fragmanlarını spesifik olarak çoğaltabilen primerler 18 kullanın. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.
- Primerlerin özelliklerine göre PCR reaksiyon sistemini ve amplifikasyon koşullarını oluşturun. Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın.
- PCR amplifikasyon ürünlerini% 2 agaroz jel üzerinde çalıştırın. Görüntülemeyi bir jel görüntüleyici ile gözlemleyin ve analiz edin.
- Floresan kantitatif PCR testi
- Gerçek zamanlı bir floresan kantitatif PCR reaksiyon sistemi hazırlamak için diatom 18S rDNA fragmanlarını spesifik olarak çoğaltabilen yukarıdaki primerleri kullanın. Ayrıntılar için Tablo 3'e bakın.
- PCR amplifikasyonu gerçekleştirin ve elde edilen amplifikasyon eğrisini ve Ct değerlerini analiz edin. Aynı zamanda, bir program ayarlayın, amplifiye edilmiş ürünlerin çift iplikçiklerini floresan kantitatif PCR-eritme eğrisi teknolojisi ile kademeli olarak tek iplikçikler halinde eritin ve ardından elde edilen erime eğrilerini analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şu anda kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemiyle ekstrakte edilen DNA çözeltisi, numunedeki farklı kaynaklardan gelen tüm DNA bileşenlerini içerdiğinden, bu protokolle elde edilen DNA bir istisna değildi. Yani, DNA çözeltisi sadece diatom genomik DNA'nın bir çözeltisi değildi. Diatom 18S rDNA fragmanlarını spesifik olarak çoğaltabilen primerler, literatür 22,23,24'e danışılarak seçilmiştir. Primerler NCBI-Blast Primer tarafından doğrulandı ve sonuçlar, 18S rDNA'nın ileri primer D512 ve ters primer D978'in alglere özgü primerler olduğunu ve birçok diatom türünü kapsadığını gösterdi. Amplifikasyon sonuçları herhangi bir insan geni göstermedi. Diatom testi için güvenilir bir DNA biyobelirteci kullanıldılar, bu nedenle bu deneyin sonuçlarının doğrulanması için seçildiler. Ekstrakte edilen DNA'yı diatoma özgü PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanarak, agaroz jel elektroforezi ile amplifikasyon ürünü, su örneklerinin ve dokuların diatom DNA bantlarına sahip olduğunu, bu elektroforez bantlarının 250-500 bp arasında olduğunu gösterdi (500 bp'ye yakın), primer hedef amplifikasyon ürün uzunluğu boyutuna (390 -410 bp) uygun olarak. Bu, ekstraksiyon protokolünün diatom DNA'nın ekstraksiyonunda başarılı olduğunu gösterdi (Şekil 1A,B).
Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR teknolojisi, sıkı özgüllük ve yüksek hassasiyete sahip bir tür gen test teknolojisidir. PCR reaksiyon sistemine floresan grupları ekleyerek, floresan sinyallerin birikmesi, tüm PCR sürecinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayabilir ve hassasiyet yüksektir25,26. Konvansiyonel PCR ile spesifik olarak amplifiye edilen ürünlerin, düşük içerik ve diğer nedenlerdendolayı agaroz jel elektroforezinde gözlemlenmesi bazen zor olabilir 27 (Şekil 1C). Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR'nin spesifik amplifikasyonu yoluyla, dört karakteristik aşamaya sahip tipik bir amplifikasyon eğrisi elde edildi (Şekil 2). Aynı zamanda, gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR-eritme eğrisi teknolojisi sayesinde, amplifiye edilmiş ürünün DNA çift sarmalları yüksek sıcaklıkta tek sarmallar halinde eritildi, boya çift sarmallardan serbest bırakıldı ve floresan değeri azaldı. Floresan değerindeki değişim tespit edilerek erime eğrisi elde edilmiştir (Şekil 3). Elde edilen erime eğrileri karakteristik piklere sahipti ve pik değeri 85.5 °C civarındaydı, bu da hedef DNA'nın spesifik bir amplifikasyonu olduğunu kanıtladı, bu da ekstrakte edilen DNA çözeltisinde diatom DNA olduğunu gösterdi. Boya ayrıca doğrudan geleneksel PCR amplifikasyon ürününe eklenebilir ve erime eğrisi, spesifik amplifikasyon olup olmadığını kanıtlamak için gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR-eritme eğrisi teknolojisi ile elde edilebilir. Bu nedenle, konvansiyonel PCR-agaroz jel elektroforezi, ekstrakte edilen DNA çözeltisinde diatom DNA olup olmadığını kanıtlayamadığında, doğrulama ve değerlendirme için daha yüksek hassasiyete sahip gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR teknolojisi seçilebilir. Bu deneyde, gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR-erime eğrisi teknolojisi sadece kalitatif analiz için kullanılmıştır.
Önceki bir rapor21'de gösterildiği gibi, geleneksel toprak DNA ekstraksiyon kiti ve modifiye kan DNA ekstraksiyon kiti, su örneklerinden ve dokulardan diatom DNA ekstraksiyonu için temel olarak aynıydı. Diatom DNA ekstraksiyonunun maliyet farkı, esas olarak iki kitin fiyat farkıydı ve diğer sarf malzemelerinin maliyeti temelde aynıydı. Bu çalışmada, moleküler biyoloji deneylerinde yaygın olarak kullanılan kan DNA ekstraksiyon kitinin basit bir şekilde iyileştirilmesi, daha iyi deneysel sonuçlar elde edebilir, bu da araştırmacıların diatom DNA ekstraksiyonu ile ilgili araştırma faaliyetlerinde test kitini seçme kapsamını artırmakla kalmaz, aynı zamanda test maliyetini de düşürür.
Bu protokolün iyileştirme süreciyayınlanmıştır 21. Cam boncukların farklı kütle oranlarının ve girdap salınım süresinin kombinasyonunu tasarlayarak, cam boncukların salınımının optimal DNA ekstraksiyon koşulları geleneksel kite eklendi, bu nedenle yöntem, adli örneklerde, özellikle doku örneklerinde diatom DNA'nın ekstraksiyon etkisini iyileştirebilir. DNA ekstraksiyonunun optimal kombinasyonu, girdap salınım frekansı 3000 rpm olduğunda elde edildi; Girdap salınım süresi 4 dakika, 1.5-2.0 mm çapında büyük cam boncukların ve 0.4-0.6 mm çapında küçük cam boncukların kütle oranı 1: 1 idi. Kitin konvansiyonel yöntemi ile geliştirilmiş yöntem arasında bir karşılaştırma yapıldı. Kullanılan kitin diatom DNA'nın amplifiye edilmesi ihtiyacını karşılayabildiği, su örneklerinde geliştirilmiş yöntemle gerçekleştirilen amplifikasyon sonrası elektroforetik bantların parlaklığının konvansiyonel yöntemin parlaklığına benzer olduğu ve doku örneklerinde geliştirilmiş yöntemle gerçekleştirilen amplifikasyon sonrası elektroforetik bantların daha parlak olduğu gösterilmiştir (Şekil 4).
Şekil 1: PCR amplifikasyonundan sonra protokol kullanılarak ekstrakte edilen DNA'nın elektroforez sonuçları. PCR'ye özgü amplifikasyon için bir DNA şablonu olarak toplam 2 μL DNA özütü kullanıldı. PCR amplifikasyon ürünleri, %2 agaroz jel yoluyla 1x TAE tampon çözeltisi üzerinde elektroforez edildi ve 25-30 dakika boyunca 100V'luk sabit bir voltajda çalıştırıldı. Tüm jeller için bir D2000 DNA merdiveni kullanıldı. (A) PCR amplifikasyonundan sonra su örneklerinde diatom DNA'nın elektroforez sonuçları, şerit 1 boş kontroldür; Şerit 2-7, aynı bölgedeki farklı konumlardan alınan su örnekleridir. (B) Dokudaki diatom DNA'nın PCR amplifikasyonundan sonra elektroforez sonuçları. Şerit 1-6, aynı akciğer dokusunun farklı pozisyonlarından çıkarılan dokulardır; Şerit 7 boş kontroldür. (C) Başarısız bir deneyde, diatom DNA amplifikasyonundan sonra, elektroforez sonuçları, amplifikasyon ürünü veya çok az amplifikasyon ürünü olmadığını gösteren karşılık gelen konumlarda elektroforez bantları göstermedi. Şu anda, elektroforez sonuçları, önerilen DNA çözeltisinde daha hassas yöntemlerle (PCR erime eğrisi gibi) gerçekleştirilmesi gereken diatom DNA olup olmadığını gösteremedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Diatom DNA qPCR amplifikasyon eğrisi. Konvansiyonel PCR ve agaroz jel elektroforezi ile bant göstermeyen toplam 2 μL DNA solüsyonu ekstresi, gerçek zamanlı bir floresan kantitatif PCR sistemi hazırlamak ve bir program oluşturmak için şablon olarak kullanıldı. Son olarak, doğrusal temel fazın dört karakteristik aşaması, üstel fazın başlangıcı, üstel faz ve plato fazı ile tipik amplifikasyon eğrileri elde edildi. Her eğrinin Ct değeri de analiz yoluyla elde edildi, bu da DNA ekstraksiyonunun başarılı olduğunu gösteriyor. Her sayı, karşılık gelen eğrinin Ct değerini temsil eder. Eşik 5.2'dir. Y ekseninin birimi Rn'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Diatom DNA erime eğrisi. Gerçek zamanlı bir floresan kantitatif PCR sistemi kullanılarak, sıcaklığın 60-95 °C'den yükseldiği bir program ayarlandı. Bu, bir erime eğrisi oluşturdu ve özel olarak çoğaltılmış çift sarmallı DNA, yüksek sıcaklıklarda tek iplikçikler halinde eritildi, boya çift sarmallardan arındırıldı ve floresan değeri 0 olana kadar azaldı. Grafik, orijinal grafiğin negatif tersi alınarak elde edilmiştir. Apsis sıcaklığı temsil ediyordu, en yüksek tepe değerine karşılık gelen apsis Tm değeri ve grafikteki erime eğrisinin Tm değeri 85.5 °C idi. Her eğrinin numaralandırılması, Şekil 1C'deki her şeridin numaralandırılmasına karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İyileştirilmiş prosesin elektroforez sonuçları. (A) Cam kürecik oranlarının ve girdap salınım sürelerinin farklı kombinasyonları için elektroforez sonuçları. Büyük ve küçük cam boncukların karışık kütle oranının 1:2 olduğu 1, 4, 7, 10 ve 13 numaralı şeritler, büyük ve küçük cam boncukların karışık kütle oranının 1:1 olduğu 2, 5, 8, 11 ve 14 numaralı şeritler, büyük ve küçük cam boncukların karışık kütle oranının 2:1 olduğu 3, 6, 9, 12 ve 15 numaralı şeritler, salınım süreleri ise 1-3 şeritleri için 2 dakika, 4-6 şeritleri için 3 dakika, 7-9 şeritleri için 4 dakika, 10-12 şeritleri için 5 dakika ve 13-15 şeritleri için 6 dakika idi. Şerit 16 boş kontroldür. (B) İyileştirmeden önce ve sonra kit ekstraksiyon ürünlerinin PCR amplifikasyonundan sonra elektroforez sonuçları. Şerit 1-3 su numunelerinin çıkarılması için geleneksel yöntemlerdir, şerit 4-6 su örneklerinin çıkarılması için geliştirilmiş yöntemlerdir, şerit 7-9 dokuların çıkarılması için geleneksel yöntemlerdir, şerit 10-12 dokuların çıkarılması için geliştirilmiş yöntemlerdir, şerit 13 boş bir kontroldür. Sonuçlar21'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Su örnekleri ve doku örnekleri. Kullanılan su örnekleri laboratuvarın yakınındaki bir göletten alındı ve kullanılan doku örneklerinin boğulan cesedin akciğer dokusu olduğu doğrulandı. (A) Deneysel su numunesi toplama alanı, laboratuvarın yakınındaki bir göletti. (B) Zenginleştirilmiş su örnekleri ve parçalanmış akciğer dokusu örnekleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Diatomun mikrografı. (A) ve (B) görüntüleri 400x optik mikroskop altında çekildi. Ok, diatomları gösterir. (C) ve (D) görüntüleri elektron mikroskobu altında çekildi. Resimler (A) ve (B) boğulma yerindeki sudaki diatomları göstermektedir. Fragilaria ve Navcula adlı diatomlar. Görüntüler (C) ve (D), akciğerlerde Nitzschia ve Navcula adı verilen diatomları göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
| Hedef | Astar adı | Sıra |
| 18S rDNA | forword astarı D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| ters astar D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tablo 1: Kullanılan primerlerin listesi. Bu tablo, bu yazıda kullanılan belirli primerlerin dizilerini, adlarını ve hedef bölgelerini açıklamaktadır.
| PCR reaksiyon sistemi | |||
| 2x Taq Karışımı Pro | 10 μL | ||
| forword astarı D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| ters astar D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| şablon DNA'sı | 2 μL | ||
| Nükleaz içermeyen su | 20 μL'ye kadar | ||
| Not: Boş kontrol şablonu DNA'sı, aynı miktarda Nükleaz içermeyen su ile değiştirilir. | |||
| PCR programı | |||
| sıcaklık | Saat | Döngü | |
| 94 °C | 10 dk | 1 | |
| 94 °C | 45 saniye | 40 | |
| 50 °C | 45 saniye | ||
| 72 °C | 1 dk | ||
| 72 °C | 10 dk | 1 | |
Tablo 2: PCR bileşenleri. Bu tablo, konvansiyonel PCR için reaksiyon sisteminin konfigürasyonunu ve PCR için reaksiyon sıcaklığı, süresi ve döngü sayısı ayarlarını açıklar. Kullanılan reaksiyon sisteminin toplam hacmi 20 μL idi.
| Gerçek zamanlı kantitatif PCR reaksiyon sistemi | |||
| 2x qPCR karışımı | 10 μL | ||
| forword astarı D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| ters astar D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| şablon DNA'sı | 2 μL | ||
| Nükleaz içermeyen su | 20 μL'ye kadar | ||
| Not: Boş kontrol şablonu DNA'sı, aynı miktarda Nükleaz içermeyen su ile değiştirilir. | |||
| Gerçek zamanlı kantitatif PCR programı | |||
| sıcaklık | Saat | Döngü | |
| 94 °C | 10 dk | 1 | |
| 94 °C | 45 saniye | 40 | |
| 50 °C | 45 saniye | ||
| 72 °C | 1 dk | ||
Tablo 3: Gerçek zamanlı kantitatif PCR bileşenleri. Bu tablo, gerçek zamanlı kantitatif PCR için reaksiyon sisteminin konfigürasyonunu ve PCR için reaksiyon sıcaklığı, süresi ve döngü sayısı ayarlarını açıklar. Kullanılan reaksiyon sisteminin toplam hacmi 20 μL idi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diatom hücreleri, sert silisli hücre duvarları17 tarafından korunur ve diatom DNA'sını çıkarmak için bu yapının yok edilmesi gerekir. Sıradan kitler, diatomların silisli kabuğunu kolayca tahrip etmez; bu nedenle diatom DNA21'i başarılı bir şekilde çıkarmak zordur. Laboratuvarımız, diatom ekstraksiyonu işleminde farklı çaplarda ve farklı kütle oranlarında cam boncuklar ekleyerek en sık kullanılan kan DNA ekstraksiyon kitini geliştirdi. Vorteks salınımı aynı anda gerçekleştirilir, bu da diatom kabuğunu tamamen kırabilir ve diatom DNA ekstraksiyon etkisini iyileştirebilir. Önceki rapor21'de gösterildiği gibi, cam boncukların çapı, salınım yoğunluğu ve süresi, DNA ekstraksiyonunun kalitesini doğrudan etkileyecektir. Girdap salınım süresi çok uzun olmamalıdır (en fazla 10 dakika). Süre çok uzunsa, aşırı titreşim nedeniyle DNA parçalanır. Aynı zamanda, zaman çok kısa olmamalıdır. Süre çok kısaysa (2 dakikadan az değil), diatom kabuğu tamamen çıkarılmayacak ve bu da DNA ekstraksiyonunu verimsiz hale getirecektir. Cam boncukları seçerken, farklı çevresel çaplara sahip boncukları seçerken, büyük cam boncuklar çarpışma mukavemetini sağlar ve küçük cam boncuklar, çarpışma parçalanma işlemi sırasında cam boncuklar arasında ölü çarpışma olmamasını sağlar, bu da kabuk kırma verimliliğini artırır.
Numunelerden diatom DNA'yı çıkarmak için genellikle diatomları zenginleştirmek gerekir. Bu işlemin diatom DNA'nın ekstraksiyonu üzerinde büyük etkisi olacaktır. Zenginleştirmenin amacı, ekstrakte edilen diatom DNA konsantrasyonunun tespit edilebilir aralıkta olabilmesi için numunelerdeki diatom konsantrasyonunu arttırmaktır; gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR ve yüksek verimli dizileme gibi bir sonraki adım uygulamaları için.
Diatomlar doğada yaygın olarak dağıldığından4, laboratuvar kontaminasyonunu önlemek en önemli önceliktir28. DNA ekstraksiyon işlemi sırasında kontaminasyon, gerçek sonuçlardan sapmalara ve kullanım değeri kaybına yol açacaktır. Bu nedenle, diatom DNA'yı çıkarırken her zaman aseptik çalışma prensibine dikkat edin ve eksojen diatomların kontaminasyonunu azaltmak ve önlemek için mümkün olan tüm önlemleri alın. Doku ölü vücuttan çıkarıldığında, eksojen diatomlar tarafından kontamine olmasını önlemek için önlemler alınmalıdır. Doku çıkarıldıktan sonra, diatom kontaminasyonu olmayan bir kapta veya numune torbasında saklanmalıdır. Doku formaldehit ile tedavi edilmemelidir. Dokuların çıkarılması ve işlenmesi için kullanılan ekipman, tekrar tekrar damıtılmış su ile 2-3 kez yıkanmalı ve daha sonra diğer kaynaklardan diatomların kirlenmemesini sağlamak için ultraviyole ışık veya yüksek sıcaklık ile sterilize edilmelidir. Testten önceki doku, diatom içermeyen bir aletle yüzeysel dokudan kesilmeli ve daha sonra inceleme için alt dokuyu seçmek için alet değiştirilmelidir. Aynı zamanda, operasyon sürecinin standartlaştırılması, laboratuvar kontaminasyonu sorununu da etkili bir şekilde önleyebilir.
Diatomlar birçok suda yaşayan organizmanın besini olduğundan, uzun süreli depolama sırasında kaybolacaklardır29. Diatomlar ayrıca ışık koşulları altında büyüyebilir ve çoğalabilir. Bu nedenle, numune alımından sonra mümkün olan en kısa sürede DNA ekstraksiyon adımı başlatılmalı ve numunedeki diatom kaybını önlemek için hızlı numune işleme yapılmalıdır. DNA ekstraksiyonu hemen gerçekleştirilemezse, diatomların mümkün olduğunca azalmasını önlemek için tüm numuneler dondurulmalı ve karanlıkta tutulmalıdır.
Araştırmamız, su örneklerinden ve dokulardan diatom DNA'yı iyi sonuçlarla çıkarmak için geliştirilmiş proteinaz K sindirim yöntemine dayanan yaygın ve ucuz bir kan DNA ekstraksiyon kiti seçti30. Doku, proteinaz K ile tam temas halinde olacak şekilde yeterince kesilir ve doku tamamen sindirilir. Başarılı ekstraksiyonun olası prensibi şu şekildedir: çalkalama aşaması sırasında, diatomun sert kabuğu tekrar tekrar çarpılır ve hızlı hareket eden cam boncuklar arasında parçalanarak hücre zarını açığa çıkarır; Farklı boyutlardaki cam boncukların konfigürasyonu, çarpışma temas yüzeyini mümkün olduğunca tam olarak kaplamak için tek boyutlu cam boncukların çarpışması arasındaki boşluğu doldurabilir; silikon kabuğunu kaybettikten sonra, proteinaz K, DNA'nın diatomdan salınmasına yardımcı olur. Halihazırda kullanılan toprak DNA ekstraksiyon kiti ile karşılaştırıldığında, geliştirilmiş kan DNA ekstraksiyon kiti, daha ekonomik ve elde edilmesi daha kolay olan diatom DNA ekstraksiyonunun gereksinimlerini karşılayabilir. Sadece adli diatom incelemesinin kullanımını kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda diatom araştırmalarıyla ilgili diğer disiplinlere uygulama için uygundur ve diğer plankton DNA ekstraksiyonu için de kullanılabilir. Su örneklerinden diatom DNA çıkarılırken, kullanılan proteinaz K miktarının sudaki plankton sayısına göre ayarlanması gerekir. Proteinaz K miktarı, ön deneylere dayanarak arttırılabilir veya azaltılabilir. Dokulardan diatom DNA çıkarılırken, farklı organ dokusu tipleri, doku kontaminasyonu ve diğer faktörler sindirim için gereken proteinaz K miktarını etkileyecektir. Deneyde, kit içindeki proteinaz K, kullanımdan sonra -20 °C'de saklanmalıdır, aksi takdirde proteinaz K'nin inaktivasyonu ekstraksiyon işlemini etkileyecektir.
Sonuç olarak, diatom DNA ekstraksiyonu, numune alma ve numune işlemeden sonra mümkün olan en kısa sürede yapılmalı, aksi takdirde muhafaza için -20 °C'de saklanmalıdır. Eksojen diatomların neden olduğu kontaminasyonu önlemek için numune işleme, saklama ve tüm ekstraksiyon işlemi dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Aksi takdirde, ekstrakte edilen diatom DNA'nın numunede veya eksojen kontaminasyonda olduğu değerlendirilemez. Dokuyu sindirmek için proteinaz K kullanıldığında, dozu bir sorun olabilir. Yetersiz doku sindirimi proteinaz K miktarını artırabilir. Bu nedenle, dokunun yeterince kesilmesi önemlidir. Dokunun yeterli sindirimi, doku artıklarının adsorpsiyon kolonu içindeki plazma zarını tıkamasını da önler. Membran tıkandıktan sonra, tıkanıklığı gidermek veya tekrar tekrar santrifüj yapmak için pipet ucunu kullanmak mümkün değildir, bu da membrana zarar verir. Nihai DNA çözeltisi, diatom DNA'nın tespitini etkileyecek birçok safsızlık içerir. Salınım yoğunluğu ve süresi de önemli konulardır. İlk girdap salınım süresi 4-5 dakikada kontrol edilir ve salınım frekansı 3000 rpm'de kontrol edilir, aksi takdirde DNA ekstraksiyonu etkilenir. PCR'den sonra elektroforetik bantlar net değilse, DNA şablonu miktarını daha da artırmak gerekebilir. Bu çalışmada ekstrakte edilen DNA, diatom DNA ve diğer türlerden DNA dahil olmak üzere bir DNA karışımıdır, bu nedenle diatom DNA konsantrasyonu belirlenemez. Bu nedenle, yüksek saflıkta DNA şablonları gerektiren uygulamalar için uygun değildir.
Çalışmalar, farklı diatom türlerinin farklı primerler tarafından amplifiye edilebileceğini göstermiştir31,32. Bu çalışmada, diatom DNA'nın başarılı bir şekilde ekstrakte edilip edilmediğini test etmek için yalnızca diatom 18S rDNA üzerindeki diatoma özgü primerler D512 ve D978 kullanıldı, bu da tüm diatom türlerini kapsayamadı22,33. Ek olarak, primer çiftinin amplifikasyon ürünü fragmanının uzunluğu 390-410 bp olduğundan, geliştirilmiş yöntem, daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyan deneysel parametreler üzerinde bir etki olup olmadığını test etmek için diatom DNA'nın tüm fragman boyutlarını seçer. Sonraki çalışmalar, ekstraksiyonun etkisini araştırmak için farklı bölgelerin primerlerini ve farklı amplifikasyon uzunluklarını da kullanacaktır.
Geleneksel diatom DNA ekstraksiyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu yöntem, düşük maliyetli ve büyük ölçekli diatom DNA ekstraksiyonunun ana avantajlarına sahiptir. Diatom morfolojik yöntemlerinin avantajlarını tamamlayabilir ve birincil adli tıp laboratuvarlarında boğulma teşhisi ihtiyaçlarını karşılayabilir. Aynı zamanda, diatom DNA ekstraksiyon kitlerinin seçim aralığını da genişletir ve iyi bir uygulama beklentisine sahiptir. Gelecekte, bu yöntem sadece diatom DNA'nın ekstraksiyonu ile sınırlı kalmayacak, aynı zamanda diğer alglerden DNA'nın ekstraksiyonu için de kullanılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82060341,81560304) ve Hainan Eyaleti Akademisyen İnovasyon Platformu Bilimsel Araştırma Projesi (YSPTZX202134) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
