Summary
Den här artikeln beskriver ett protokoll för DNA-extraktion av kiselalger med hjälp av ett modifierat vanligt DNA-extraktionskit.
Abstract
Kiselalgstest är ett viktigt hjälpmedel i kriminalteknisk praxis för att avgöra om liket drunknade i vatten och för att dra slutsatser om drunkningsplatsen. Kiselalgstestning är också ett viktigt forskningsinnehåll inom miljö- och planktonområdet. Kiselalgsmolekylärbiologisk testteknik, som fokuserar på kiselalgs-DNA som det primära forskningsobjektet, är en ny metod för kiselalgstestning. Kiselalgers DNA-extraktion är grunden för molekylär testning av kiselalger. För närvarande är de kit som vanligtvis används för kiselalgs-DNA-extraktion dyra, vilket ökar kostnaderna för att utföra relaterad forskning. Vårt laboratorium förbättrade den allmänna snabbextraktionssatsen för helblods-DNA och erhöll en tillfredsställande DNA-extraktionseffekt för kiselalger, vilket ger en alternativ ekonomisk och prisvärd DNA-extraktionslösning baserad på glaspärlor för relaterad forskning. Kiselalgs-DNA som extraheras med hjälp av detta protokoll kan tillfredsställa många nedströmsapplikationer, såsom PCR och sekvensering.
Introduction
I rättsmedicinsk praxis är det viktigt att fastställa om ett lik som hittats i vattnet drunknat eller kastats i vattnet efter döden föratt fallet ska kunna avgöras på ett korrekt sätt. Det är också en av de svåra frågor som måste lösas snarast i forensisk praxis2. Kiselalger är rikligt förekommande i den naturliga miljön (särskilt i vatten)3,4. Under drunkningsprocessen, på grund av hypoxi och stressreaktion, kommer människor att ha intensiva andningsrörelser och andas in en stor mängd drunkningsvätska. Därför kommer kiselalgerna i vattnet in i lungan med drunkningsvätskan, och vissa kiselalger kan komma in i blodcirkulationen genom den alveolära kapillärbarriären och sprida sig till inre organ med blodflödet 5,6. Detektion av kiselalger i inre vävnader och organ som lungor, lever och benmärg är ett starkt bevis på drunkning före döden 7,8. För närvarande är forensisk kiselalgstestning huvudsakligen baserad på morfologiska testmetoder. Efter en serie fördigestioner av vävnaden utförs de morfologiska kvalitativa och kvantitativa uppskattningarna av osmälta kiselalger under mikroskopet. Under denna period måste farliga och miljöovänliga reagenser som salpetersyra användas. Denna process är tidskrävande och kräver att forskarna har gedigen taxonomisk expertis och lång erfarenhet. Allt detta medför vissa utmaningar för den kriminaltekniska personalen9. Diatom DNA-testteknik är en ny teknik för kiselalgstestning som utvecklats under de senaste åren 10,11,12. Denna teknik realiserar artidentifieringen av kiselalger genom att analysera den specifika DNA-sekvenssammansättningen av kiselalger13,14. PCR-teknik och sekvenseringsteknik är vanligt förekommande tekniska metoder, men deras grund är framgångsrik extraktion av DNA från kiselalger. Kiselalger har dock en speciell struktur som skiljer sig från andra organismer, vilket gör att deras DNA-extraktionstekniker också skiljer sig åt.
Kiselalgens cellvägg har en hög grad av kiselifiering, och dess huvudkomponent är kiseldioxid 15,16,17. Den kiselhaltiga cellväggen är mycket hård och måste förstöras innan DNA:t extraheras. Vanliga DNA-extraktionssatser är ofta svåra att använda direkt för extraktion av kiselalgs-DNA eftersom de inte kan förstöra kiseldioxidskalet18. Att förstöra kiselalgernas kiselhaltiga skal är därför ett av de viktigaste tekniska problemen som måste lösas vid utvinning av kiselalgs-DNA.
Samtidigt, eftersom antalet kiselalger som finns i rättsmedicinska forskningsprover, oavsett om det är vattenprover eller organ och vävnader från drunknade kroppar, ofta är begränsat, är det nödvändigt att anrika kiselalger. Kärnan i berikning är separationen av ämnen. När du försöker samla ihop kiselalger, minimera innehållet av andra materialkomponenter (störande komponenter). I kriminaltekniskt arbete använder laboratorier ofta centrifugerings- eller membranfiltreringsanrikningsmetoder för att separera kiselalgsceller19. Men eftersom vakuumpumputrustning inte används i stor utsträckning används membrananrikningsmetoden inte ofta i vanliga primära kriminaltekniska laboratorier. Så centrifugeringsmetoden är fortfarande vanligt kiselalgsanrikning i kriminaltekniska laboratorier20.
DNA-extraktion från kiselalger används för närvarande främst i kriminalteknisk praxis, och det finns betydande begränsningar för dess tillämpning. För närvarande finns det få kiselalgs-DNA-extraktionssatser som används inom kriminalteknik på marknaden och de är i allmänhet dyra21. Den här artikeln ger en förbättrad DNA-extraktionsmetod för kiselalger, vilket gör DNA-extraktion av kiselalger enkel, bekväm och kostnadseffektiv. Detta ökar tillämpningen av efterföljande molekylärbiologisk testning av kiselalger och kan bättre lösa problem relaterade till drunkning inom rättsmedicin genom kiselalgstestning. Denna metod bryter kiseldioxidcellväggarna hos kiselalger genom att tillsätta glaspärlor och ställa in en lämplig tid för virveln. På så sätt lyserar proteinas K och bindningslösningen snabbt cellerna och inaktiverar olika enzymer i cellerna. Det genomiska DNA:t absorberas i matrismembranet i adsorptionskolonnen och elueras slutligen av elueringsbufferten. Ett sådant förbättrat kit för extraktion av helblodsgener förbättrar kiselalgens DNA-extraktionseffekt av blodsatsen i rättsmedicinska undersökningsmaterial, minskar kostnaden för kiselalgs-DNA-extraktion i kriminalteknisk praxis och kan bättre tillämpas på kriminalteknisk forskning på gräsrotsnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den etiska kommittén vid Hainan Medical University. De vävnadsprover som används i denna studie anses inte vara studier som involverar människor. Dessa prover erhölls för rättsmedicinsk diagnos, och resten användes för extraktion av kiselalgs-DNA i detta experiment. Forskare kan inte enkelt identifiera individer för att få informerat samtycke från relevanta intressenter.
OBS: För att säkerställa den allmänna tillämpligheten av den forskningsmetod som rapporterats i detta experiment, följde detta experiment i princip bruksanvisningen för det kit som användes, och endast vissa steg modifierades. Vattenproverna som användes i detta experiment togs slumpmässigt från dammar nära laboratoriet (tilläggsfigur 1A). I detta experiment bekräftades lungvävnaden i den drunknade kroppen som forskningsvävnad för att demonstrera extraktionsprotokollet (tilläggsfigur 1B). I rättsmedicinsk praxis är det också ibland nödvändigt att använda andra organ och vävnader från drunknade kroppar (såsom lever, mjälte, njure, benmärg, etc.) för att extrahera kiselalgers DNA, vilket kräver mindre motsvarande förbättringar av denna experimentella metod, vilket kommer att förklaras i motsvarande avsnitt av experimentet. Lungvävnadsproverna som användes i detta experiment kom från lik som tydligt drunknat i rättsmedicinska fall. Morfologiska tester har utförts för att bevisa att lungvävnaden innehåller kiselalger (tilläggsfigur 2).
1. Förbehandling av prover
- Förbehandling av vattenprover
- Ta 10 ml vattenprov i centrifugröret och centrifugera med 13 400 x g i 5 minuter. Kassera försiktigt 9,8 ml supernatant med en pipettpistol och överför cirka 200 μL anrikat kiselalgsvattenprov som finns kvar i botten till ett 2 ml centrifugrör.
OBS: Förexperiment kan utföras först, och den initiala mängden kan ökas om ett 10 ml vattenprov inte räcker för anrikning.
- Ta 10 ml vattenprov i centrifugröret och centrifugera med 13 400 x g i 5 minuter. Kassera försiktigt 9,8 ml supernatant med en pipettpistol och överför cirka 200 μL anrikat kiselalgsvattenprov som finns kvar i botten till ett 2 ml centrifugrör.
- Förbehandling av vävnadsprover
- Ta 0,5 g av lungmarginalvävnaden från den drunknade kroppen, hacka eller mal lungvävnaden helt tills den blir lerig. Att förhindra kontaminering av exogena kiselalger är kärnan i detta steg. Klipp vävnaden i bitar upprepade gånger med en sax.
2. DNA-extraktion
OBS: Alla centrifugeringssteg slutförs vid rumstemperatur. Användning av en skrivbordscentrifug med en centrifugalkraft på 14 500 x g; Ett vattenbad (eller metallbad) som förvärmts till 70 °C måste förberedas innan försöket inleds. Alla steg måste strikt följa principerna för aseptisk drift.
- Sammanställning av vattenprover och vävnader
OBS: Vattenprov och DNA-extraktionsmetod för vävnadsdiatom är desamma.- Tillsätt glaspärlor till ett 2 ml centrifugrör som innehåller det förbehandlade vattenprovet. Invertera 10x-15x för att blanda väl. De tillsatta glaspärlorna består av stora och små glaspärlor blandade i ett massförhållande på 1:1. Diametern på de stora glaspärlorna är 1,5-2,0 mm och på de små glaspärlorna 0,4-0,6 mm.
- Ta 0,5 g finhackad vävnad, tillsätt glaspärlor till ett 2 ml centrifugrör som innehåller vävnaden enligt beskrivningen ovan. Invertera 10x-15x för att blanda.
- Tillsätt 40 μl proteinas K (20 mg/ml) till rören. Placera i rumstemperatur i 15 minuter, vänd och vänd under denna period och blanda 10 gånger var 3:e minut.
OBS: Om vävnaden inte är helt smält kan mängden proteinas K ökas på lämpligt sätt tills lösningen blir klar. - Tillsätt 200 μL bindningsbuffert till centrifugrören, virvla omedelbart och blanda i 4 minuter (oscillerande blandningsfrekvens: 3000 rpm).
OBS: I detta steg bör skakningsintensiteten och tiden kontrolleras strikt för att säkerställa tillräcklig blandningsintensitet och tid. - Sätt centrifugrören i ett 70 °C vattenbad i 10 minuter och lösningen blir klar.
- Tillsätt 100 μL isopropanol till centrifugrören, virvla och blanda i 15 s, flockig utfällning kan förekomma vid denna tidpunkt.
OBS: Det är mycket viktigt att blanda väl med lämplig styrka i ovanstående operationssteg, men kraftig skakning bör undvikas för att förhindra DNA-skjuvning. - Sätt den lösning som erhölls i föregående steg tillsammans med fällningsutfällningen i adsorptionskolonnen (adsorptionskolonnen placeras i uppsamlingsröret). Adsorptionskolonnens längd är 3,0 cm, diametern är 1,0 cm och adsorptionsmatrisen är kiselmatrismembran.
- Centrifugera vid 8 000 x g i 30 s, kassera avfallsvätskan i uppsamlingsröret och sätt tillbaka adsorptionskolonnen i uppsamlingsröret.
- Tillsätt 500 μl buffert för avlägsnande av inhibitorer till adsorptionskolonnen. Centrifugera vid 13 400 x g i 30 s och kassera avfallsvätskan i uppsamlingsröret.
- Tillsätt 700 μl tvättbuffert till adsorptionskolonnen. Centrifugera vid 13 400 x g i 30 s och kassera avfallsvätskan i uppsamlingsröret.
OBS: Tillsätt den angivna mängden absolut etanol i tvättbuffertflaskan före första användningen. - Tillsätt 500 μl tvättbuffert till adsorptionskolonnen. Centrifugera vid 13 400 x g i 30 s och kassera avfallsvätskan i uppsamlingsröret.
- Sätt tillbaka adsorptionskolonnen i det tomma uppsamlingsröret. Centrifugera vid 14 500 x g i 2 minuter och ta bort tvättbufferten så mycket som möjligt för att undvika att kvarvarande etanol i tvättbufferten hämmar nedströmsreaktioner.
- Ta ut adsorptionskolonnen och lägg den i ett rent centrifugrör. Tillsätt 100 μl elueringsbuffert till den mellersta delen av adsorptionsmembranet.
- Placera adsorptionskolonnen i rumstemperatur i 3-5 minuter och centrifugera vid 13 400 x g i 1 minut.
- Tillsätt lösningen från föregående steg till centrifugaladsorptionskolonnen igen. Placera den centrifugala adsorptionskolonnen i rumstemperatur i 2 minuter och centrifugera vid 13 400 x g i 1 minut.
OBS: Elueringsbufferten bör förvärmas i ett 70 °C vattenbad i cirka 10 minuter. Elueringsvolymen bör inte vara mindre än 50 μL. annars kommer DNA-utbytet att minska. - Förvara det extraherade kiselalgs-DNA:t vid 2-8 °C för framtida bruk. Om DNA-lösningen ska förvaras under en längre tid, förvara den vid -20 °C.
3. PCR-test
OBS: Eftersom halten av kiselalger i rättsmedicinska prover ofta är låg, kan vävnadsprovsextrakten från de drunknade kropparna också innehålla olika grader av vävnad och organ (som lungorna i detta experiment) med eget DNA. Därför återspeglar inte direkt detektion av totalt DNA i DNA-extrakt situationen för kiselalgs-DNA-extraktion. I detta experiment valdes kiselalgsspecifika primrar och PCR-produkter användes för att utvärdera kiselalgs-DNA-extraktionen i extraktet. Produkterna kan observeras och analyseras med agarosgelelektrofores och kan också analyseras med fluorescerande kvantitativ PCR-smältningskurva i realtid, som har högre känslighet.
- Tillsätt 2 μl extraherat DNA från vattenprover och vävnader som mall. Välj en av följande två metoder för inspektion.
- Konventionellt PCR-test
- Använd primers22 som specifikt kan amplifiera kiselalg 18S rDNA-fragment. Mer information finns i tabell 1.
- Fastställ PCR-reaktionssystemet och amplifieringsförhållandena i enlighet med primerns egenskaper. Mer information finns i tabell 2.
- Kör produkterna för PCR-amplifiering på 2% agarosgel. Observera och analysera avbildningen med en gelkamera.
- Fluorescerande kvantitativt PCR-test
- Använd ovanstående primers som specifikt kan amplifiera kiselalger 18S rDNA-fragment för att förbereda ett fluorescerande kvantitativt PCR-reaktionssystem i realtid. Mer information finns i tabell 3.
- Utföra PCR-amplifiering och analysera erhållen förstärkningskurva och Ct-värden. Ställ samtidigt in ett program, smält dubbelsträngarna av de amplifierade produkterna till enkelsträngar gradvis genom fluorescerande kvantitativ PCR-smältkurveteknik och analysera sedan de erhållna smältkurvorna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom den DNA-lösning som extraheras med den DNA-extraktionsmetod som för närvarande används innehåller alla DNA-komponenter från olika källor i provet, var det DNA som erhölls genom detta protokoll inget undantag. Så DNA-lösningen var inte bara en lösning av kiselalgers genomiska DNA. De primers som specifikt kan amplifiera kiselalg 18S rDNA-fragment valdes ut genom att konsultera litteraturen 22,23,24. Primern verifierades av NCBI-Blast Primer, och resultaten visade att den främre primern D512 och den omvända primern D978 av 18S rDNA var algspecifika primers och täckte många kiselalgsarter. Amplifieringsresultaten visade inga mänskliga gener. De använde en tillförlitlig DNA-biomarkör för kiselalgstestning, så de valdes ut för verifiering av resultaten av detta experiment. Genom att använda det extraherade DNA:t som en mall för kiselalgspecifik PCR-amplifiering, visade amplifieringsprodukten med agarosgelelektrofores att vattenprover och vävnader hade kiselalgs-DNA-band, dessa elektroforesband var mellan 250-500 bp (närmare 500 bp), i linje med primer-målamplifieringsproduktens längdstorlek (390-410 bp). Detta visade att extraktionsprotokollet var framgångsrikt när det gällde att extrahera kiselalgs-DNA (Figur 1A,B).
Kvantitativ PCR-teknik för fluorescens i realtid är en slags gentestteknik med strikt specificitet och hög känslighet. Genom att lägga till fluorescerande grupper i PCR-reaktionssystemet kan ackumuleringen av fluorescerande signaler göra att hela PCR-processen övervakas i realtid, och känsligheten är hög25,26. Produkter som är specifikt amplifierade med konventionell PCR kan ibland vara svåra att observera vid agarosgelelektrofores på grund av den låga halten och andra orsaker27 (Figur 1C). Genom den specifika amplifieringen av fluorescerande kvantitativ PCR i realtid erhölls en typisk amplifieringskurva med fyra karakteristiska steg (figur 2). Samtidigt, genom den fluorescerande kvantitativa PCR-smältkurvetekniken i realtid, smältes DNA-dubbelsträngarna i den amplifierade produkten till enkelsträngar vid hög temperatur, färgämnet befriades från dubbelsträngarna och fluorescensvärdet minskade. Genom att detektera förändringen i fluorescensvärdet erhölls smältkurvan (figur 3). De erhållna smältkurvorna hade karakteristiska toppar, och toppvärdet var cirka 85,5 °C, vilket bevisade att det fanns en specifik amplifiering av mål-DNA:t, vilket indikerar att det fanns kiselalgs-DNA i den extraherade DNA-lösningen. Färgämnet kunde också tillsättas direkt till den konventionella PCR-amplifieringsprodukten, och smältkurvan kunde erhållas genom fluorescenskvantitativ PCR-smältkurveteknik i realtid för att bevisa om det fanns specifik amplifiering. Därför, när konventionell PCR-agarosgelelektrofores inte kunde bevisa om det fanns kiselalgs-DNA i den extraherade DNA-lösningen, kunde den fluorescerande kvantitativa PCR-tekniken i realtid med högre känslighet väljas för verifiering och utvärdering. I detta experiment användes den fluorescerande kvantitativa PCR-smältkurvetekniken i realtid endast för kvalitativ analys.
Som framgår av en tidigare rapport21 var den traditionella jord-DNA-extraktionssatsen och den modifierade blod-DNA-extraktionssatsen i princip desamma för kiselalgs-DNA-extraktion från vattenprover och vävnader. Kostnadsskillnaden för kiselalgs-DNA-extraktion var huvudsakligen prisskillnaden mellan de två kiten, och kostnaden för andra förbrukningsvaror var i princip densamma. I denna studie kunde en enkel förbättring av det blod-DNA-extraktionskit som vanligtvis används i molekylärbiologiska experiment ge bättre experimentella resultat, vilket inte bara ökade möjligheterna för forskarna att välja testkit i forskningsaktiviteter relaterade till kiselalgs-DNA-extraktion utan också minskade kostnaden för testning.
Förbättringsprocessen för detta protokoll har offentliggjorts21. Genom att designa kombinationen av olika massförhållanden av glaspärlor och virveloscillerande tid, lades de optimala DNA-extraktionsförhållandena för oscillationen av glaspärlor till i det konventionella kitet, därför kunde metoden förbättra extraktionseffekten av kiselalgs-DNA i kriminaltekniska prover, särskilt i vävnadsprover. Den optimala kombinationen av DNA-extraktion erhölls när virvelns oscillerande frekvens var 3000 rpm; Virvelns oscillerande tid var 4 min, massförhållandet mellan stora glaspärlor med en diameter på 1,5-2,0 mm och små glaspärlor med en diameter på 0,4-0,6 mm var 1:1. En jämförelse mellan den konventionella metoden för satsen och den förbättrade metoden utfördes. Det visade sig att det använda kitet kunde möta behoven av att förstärka kiselalgs-DNA, och ljusstyrkan hos elektroforetiska band efter amplifiering utförd med den förbättrade metoden i vattenprover liknade ljusstyrkan hos den konventionella metoden, och elektroforetiska band efter amplifiering utförd med den förbättrade metoden i vävnadsprover var ljusare (Figur 4).
Figur 1: Elektroforesresultat av DNA extraherat med hjälp av protokollet efter PCR-amplifiering. Totalt 2 μL DNA-extrakt användes som DNA-mall för PCR-specifik amplifiering. PCR-amplifieringsprodukterna elektroforeserades på 1x TAE-buffertlösning genom 2% agarosgel och kördes med en konstant spänning på 100V i 25-30 minuter. En D2000 DNA-stege användes för alla geler. (A) Elektroforesresultaten av kiselalgs-DNA i vattenprover efter PCR-amplifiering, körfält 1 är blankkontroll; Bana 2-7 är vattenprover från olika platser i samma område. (B) Resultaten av elektrofores efter PCR-amplifiering av kiselalgs-DNA i vävnaden. Körfält 1-6 är de vävnader som skärs ut från olika positioner i samma lungvävnad; Körfält 7 är den tomma kontrollen. (C) I ett misslyckat experiment, efter kiselalgs-DNA-amplifiering, visade elektroforesresultaten inte elektroforesband vid motsvarande positioner, vilket tyder på att det inte fanns några amplifieringsprodukter eller för få amplifieringsprodukter. Vid denna tidpunkt kunde elektroforesresultaten inte indikera om det fanns kiselalgs-DNA i den föreslagna DNA-lösningen, vilket behövde utföras med känsligare metoder (såsom en PCR-smältkurva). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förstärkningskurva för kiselalgs DNA qPCR. Totalt 2 μL DNA-lösningsextrakt som inte visade några band med konventionell PCR- och agarosgelelektrofores användes som mall för att förbereda ett kvantitativt PCR-system för fluorescens i realtid och sätta upp ett program. Slutligen erhölls typiska förstärkningskurvor med fyra karakteristiska stadier av linjär baslinjefas, början av exponentiell fas, exponentiell fas och platåfas. Ct-värdet för varje kurva erhölls också genom analys, vilket indikerar att DNA-extraktionen lyckades. Varje tal representerar Ct-värdet för motsvarande kurva. Tröskelvärdet är 5,2. Enheten för y-axeln är Rn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Smältkurva för kiselalgs-DNA. Med hjälp av ett kvantitativt PCR-system för fluorescens i realtid ställdes ett program in där temperaturen stiger från 60-95 °C. Detta genererade en smältkurva och det specifikt amplifierade dubbelsträngade DNA:t smälte till enkelsträngar vid höga temperaturer, färgämnet var fritt från dubbelsträngarna och fluorescensvärdet minskade tills det var 0. Grafen erhölls genom att ta den negativa reciproken av den ursprungliga grafen. Abskissan representerade temperaturen, abskissan som motsvarade det högsta toppvärdet var Tm-värdet och Tm-värdet för smältkurvan i grafen var 85,5 °C. Numreringen av varje kurva motsvarar numreringen av varje körfält i figur 1C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Elektroforesresultat av den förbättrade processen. (A) Elektroforesresultat för olika kombinationer av glaskuleförhållanden och virvelsvängningstider. Körfälten 1, 4, 7, 10 och 13 där blandningsförhållandet för stora och små glaspärlor är 1:2, banorna 2, 5, 8, 11 och 14 där blandningsmassförhållandet för stora och små glaspärlor är 1:1, banorna 3, 6, 9, 12 och 15 där blandningsmassförhållandet för stora och små glaspärlor är 2:1. och svängningstiderna var 2 min för banorna 1-3, 3 min för banorna 4-6, 4 min för banorna 7-9, 5 min för banorna 10-12 och 6 min för banorna 13-15. Körfält 16 är den tomma kontrollen. (B) Elektroforesresultat efter PCR-amplifiering av satsextraktionsprodukterna före och efter förbättring. Körfält 1-3 är konventionella metoder för att extrahera vattenprover, körfält 4-6 är förbättrade metoder för att extrahera vattenprover, körfält 7-9 är konventionella metoder för att extrahera vävnader, körfält 10-12 är förbättrade metoder för att extrahera vävnader, körfält 13 är en tom kontroll. Resultaten har modifierats från21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Vattenprover och vävnadsprover. Vattenproverna som användes togs från en damm i närheten av laboratoriet, och vävnadsproverna som användes bekräftades vara lungvävnad från den drunknade kroppen. (A) Platsen för insamling av försöksvatten var en damm i närheten av laboratoriet. B) Berikade vattenprover och strimlade lungvävnadsprover. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur 2: Mikrobild av kiselalger. Bilderna (A) och (B) togs i ett 400x optiskt mikroskop. Pilen pekar på kiselalger. Bilderna (C) och (D) togs i elektronmikroskop. Bilderna (A) och (B) visar kiselalgerna i vattnet vid drunkningsplatsen. Kiselalgerna heter Fragilaria och Navicula. Bilderna (C) och (D) visar kiselalger i lungorna, som kallas Nitzschia och Navicula. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| Mål | Primerns namn | Sekvens |
| 18S rDNA | forword primer D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| omvänd primer D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabell 1: Förteckning över använda primers. Denna tabell beskriver sekvenser, namn och målområden för specifika primers som används i detta dokument.
| PCR-reaktionssystem | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| forword primer D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| omvänd primer D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| mall DNA | 2 μL | ||
| Nukleasfritt vatten | till 20 μL | ||
| Notera: Den tomma kontrollmallen DNA ersätts med samma mängd Nuclease-fritt vatten. | |||
| PCR-program | |||
| temperatur | Tid | Cykler | |
| 94 °C | 10 minuter | 1 | |
| 94 °C | 45 sek | 40 | |
| 50 °C | 45 sek | ||
| 72 °C | 1 minut | ||
| 72 °C | 10 minuter | 1 | |
Tabell 2: PCR-komponenter. Denna tabell beskriver konfigurationen av reaktionssystemet för konventionell PCR och inställningarna för reaktionstemperatur, tid och antal cykler för PCR. Den totala volymen av reaktionssystemet som användes var 20 μL.
| Kvantitativt PCR-reaktionssystem i realtid | |||
| 2x qPCR-blandning | 10 μL | ||
| forword primer D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| omvänd primer D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| mall DNA | 2 μL | ||
| Nukleasfritt vatten | till 20 μL | ||
| Notera: Den tomma kontrollmallen DNA ersätts med samma mängd Nuclease-fritt vatten. | |||
| Kvantitativt PCR-program i realtid | |||
| temperatur | Tid | Cykler | |
| 94 °C | 10 minuter | 1 | |
| 94 °C | 45 sek | 40 | |
| 50 °C | 45 sek | ||
| 72 °C | 1 minut | ||
Tabell 3: Kvantitativa PCR-komponenter i realtid. Denna tabell beskriver konfigurationen av reaktionssystemet för kvantitativ PCR i realtid och inställningarna för reaktionstemperatur, tid och antal cykler för PCR. Den totala volymen av reaktionssystemet som användes var 20 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kiselalgsceller skyddas av hårda kiselhaltiga cellväggar17, och denna struktur måste förstöras för att extrahera kiselalgs-DNA. Vanliga kit förstör inte lätt kiseldioxidskalet; därför är det svårt att framgångsrikt extrahera kiselalgs-DNA21. Vårt laboratorium förbättrade det vanligaste blod-DNA-extraktionskitet genom att lägga till glaspärlor med olika diametrar och olika massförhållanden i processen för kiselalgsextraktion. Vortex-oscillation utförs samtidigt, vilket helt kan bryta kiselalgsskalet och förbättra kiselalgens DNA-extraktionseffekt. Som visades i den tidigare rapporten21 skulle glaskulornas diameter, svängningsintensitet och tid direkt påverka kvaliteten på DNA-extraktionen. Virvelsvängningstiden bör inte vara för lång (högst 10 min). Om tiden är för lång kommer DNA:t att gå sönder på grund av överdriven vibration. Samtidigt bör tiden inte vara för kort. Om tiden är för kort (inte mindre än 2 min) kommer kiselalgsskalet inte att tas bort helt, vilket gör DNA-extraktionen ineffektiv. När du väljer glaspärlor väljer du pärlor med olika omkretsdiametrar, de stora glaspärlorna säkerställer kollisionsstyrkan och de små glaspärlorna säkerställer att det inte sker någon död kollision mellan glaspärlorna under kollisionsfragmenteringsprocessen, vilket förbättrar effektiviteten för skalbrott.
För att extrahera kiselalgs-DNA från prover är det i allmänhet nödvändigt att anrika kiselalger. Denna process kommer att ha stor inverkan på extraktionen av kiselalgs-DNA. Syftet med anrikning är att öka koncentrationen av kiselalger i prover så att koncentrationen av extraherat kiselalgs-DNA kan ligga inom detekterbart område. för nästa steg-applikationer som fluorescerande kvantitativ PCR i realtid och sekvensering med hög genomströmning.
Eftersom kiselalger har stor utbredning i naturen4 är det av högsta prioritet att förhindra laboratoriekontaminering28. Kontaminering under DNA-extraktionsprocessen kommer att leda till avvikelser från de faktiska resultaten och förlust av användningsvärde. Var därför alltid uppmärksam på principen om aseptisk drift vid extraktion av kiselalgs-DNA och vidta alla möjliga åtgärder för att minska och undvika kontaminering av exogena kiselalger. När vävnaden extraheras från den döda kroppen bör åtgärder vidtas för att förhindra att den kontamineras av exogena kiselalger. Efter att vävnaden har extraherats ska den förvaras i en behållare eller provpåse som är fri från kiselalgskontaminering. Vävnaden ska inte behandlas med formaldehyd. Utrustningen för extraktion och bearbetning av vävnader bör tvättas 2-3 gånger med destillerat vatten upprepade gånger och sedan steriliseras med ultraviolett ljus eller hög temperatur för att säkerställa att det inte finns någon kontaminering av kiselalger från andra källor. Vävnaden före testet ska skäras av från den ytliga vävnaden med ett kiselalgsfritt instrument, och sedan ska instrumentet bytas ut för att plocka ut den nedre vävnaden för undersökning. Samtidigt kan standardisering av driftprocessen också effektivt undvika problemet med laboratoriekontaminering.
Eftersom kiselalger är föda för många vattenlevande organismer kommer de att gå förlorade under långtidslagring29. Kiselalger kan också växa och föröka sig under ljusförhållanden. Därför bör DNA-extraktionssteget påbörjas så snart som möjligt efter provtagning och snabb provbearbetning bör göras för att förhindra förlust av kiselalger i provet. Om DNA-extraktionen inte kan utföras omedelbart bör alla prover frysas och förvaras i mörker för att förhindra reduktion av kiselalger så mycket som möjligt.
Vår forskning valde ett vanligt och billigt blod-DNA-extraktionskit baserat på proteinas K-digestionsmetoden, som har förbättrats för att extrahera kiselalgs-DNA från vattenprover och vävnader med goda resultat30. Vävnaden är tillräckligt skuren för att vara i full kontakt med proteinas K och vävnaden blir helt nedsmält. Den möjliga principen för framgångsrik extraktion är följande: under skakningssteget påverkas kiselalgens hårda skal upprepade gånger och fragmenteras mellan snabbrörliga glaspärlor, vilket exponerar cellmembranet; Konfigurationen av glaspärlor av olika storlekar kan fylla gapet mellan kollisionen mellan glaspärlor av en enda storlek, för att täcka kollisionskontaktytan så fullständigt som möjligt. efter att ha förlorat kiselskalet hjälper proteinas K till att frigöra DNA från kiselalgen. Jämfört med den för närvarande använda jord-DNA-extraktionssatsen kan den förbättrade blod-DNA-extraktionssatsen uppfylla kraven för kiselalg-DNA-extraktion, vilket är mer ekonomiskt och lättare att erhålla. Det underlättar inte bara användningen av kriminalteknisk kiselalgsinspektion, utan är också lämpligt för tillämpning på andra kiselalgsforskningsrelaterade discipliner och kan också användas för annan extraktion av plankton-DNA. Vid extraktion av kiselalgs-DNA från vattenprover behöver mängden proteinas K som används anpassas efter antalet plankton i vattnet. Mängden proteinas K kan ökas eller minskas baserat på preliminära experiment. Vid extraktion av kiselalgs-DNA från vävnader kommer olika typer av organvävnad, vävnadskontaminering och andra faktorer att påverka mängden proteinas K som krävs för matsmältningen. I experimentet ska proteinas K i satsen förvaras vid -20 °C efter användning, annars kommer inaktiveringen av proteinas K att påverka extraktionsprocessen.
Sammanfattningsvis bör DNA-extraktion av kiselalger utföras så snart som möjligt efter provtagning och provbehandling, i annat fall förvaras vid -20 °C för konservering. Provhantering, lagring och hela extraktionsprocessen bör göras noggrant för att förhindra kontaminering av exogena kiselalger. I annat fall kan det inte bedömas att det extraherade kiselalgs-DNA:t fanns i provet eller exogen kontamination. När man använder proteinas K för att smälta vävnad kan doseringen vara ett problem. Otillräcklig vävnadsnedbrytning kan öka mängden proteinas K. Därför är det viktigt att skjuva vävnaden tillräckligt. Tillräcklig nedbrytning av vävnaden förhindrar också att vävnadsresterna täpper till plasmamembranet inuti adsorptionskolonnen. Efter att membranet är blockerat är det inte möjligt att använda pipettspetsen för att plocka ut blockeringen eller att centrifugera upprepade gånger, vilket kommer att skada membranet. Den slutliga DNA-lösningen innehåller många föroreningar, vilket kommer att påverka detektionen av kiselalgs-DNA. Oscillationsintensitet och tid är också viktiga frågor. Den första virvelsvängningstiden styrs vid 4-5 min, och svängningsfrekvensen styrs vid 3000 rpm, annars kommer DNA-extraktionen att påverkas. Om de elektroforetiska banden inte är klara efter PCR kan det vara nödvändigt att ytterligare öka mängden DNA-mall. Det DNA som extraherats i denna studie är en blandning av DNA, inklusive kiselalgs-DNA och DNA från andra arter, så koncentrationen av kiselalgs-DNA kan inte bestämmas. Därför är den inte lämplig för applikationer som kräver hög renhet hos DNA-mallar.
Studier har visat att olika kiselalgsarter kan förstärkas av olika primers31,32. I denna studie användes endast de kiselalgsspecifika primrarna D512 och D978 på kiselalgen 18S rDNA för att testa om kiselalgs-DNA:t extraherades framgångsrikt, vilket inte kunde täcka alla kiselalgsarter22,33. Dessutom, eftersom längden på amplifieringsproduktfragmentet i paret av primers är 390-410 bp, väljer den förbättrade metoden alla fragmentstorlekar av kiselalgs-DNA för att testa om det finns en inverkan på de experimentella parametrarna, vilket behöver studeras ytterligare. Efterföljande studier kommer också att använda primers från olika regioner och olika förstärkningslängder för att utforska effekten av extraktion.
Jämfört med den traditionella DNA-extraktionsmetoden för kiselalger har denna metod de främsta fördelarna med billig och storskalig DNA-extraktion av kiselalger. Det kan komplettera fördelarna med kiselalgsmorfologiska metoder och kan möta behoven av drunkningsdiagnostik i primära rättsmedicinska laboratorier. Samtidigt utökar det också urvalsområdet för kiselalgs-DNA-extraktionssatser och har goda tillämpningsmöjligheter. I framtiden kommer denna metod inte bara att begränsas till extraktion av kiselalgs-DNA utan även användas för extraktion av DNA från andra alger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) och av Academician Innovation Platform Scientific Research Project of Hainan Province (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
