Summary
Denne artikel beskriver en protokol til diatome-DNA-ekstraktion ved hjælp af et modificeret fælles DNA-ekstraktionssæt.
Abstract
Diatometest er et vigtigt hjælpemiddel i retsmedicinsk praksis for at afgøre, om liget druknede i vand og for at udlede druknestedet. Kiselalger er også et vigtigt forskningsindhold inden for miljø og plankton. Diatom molekylærbiologi testteknologi, der fokuserer på diatome DNA som det primære forskningsobjekt, er en ny metode til diatom testning. Diatome DNA-ekstraktion er grundlaget for diatome molekylær testning. På nuværende tidspunkt er de sæt, der almindeligvis anvendes til diatome-DNA-ekstraktion, dyre, hvilket øger omkostningerne ved at udføre relateret forskning. Vores laboratorium forbedrede det generelle fuldblods genomiske DNA-hurtigekstraktionssæt og opnåede en tilfredsstillende diatomisk DNA-ekstraktionseffekt, hvilket gav en alternativ økonomisk og overkommelig DNA-ekstraktionsløsning baseret på glasperler til relateret forskning. Diatome-DNA'et ekstraheret ved hjælp af denne protokol kunne tilfredsstille mange downstream-applikationer, såsom PCR og sekventering.
Introduction
I retsmedicinsk praksis er det afgørende for en korrekt løsning af sagen1. Det er også et af de vanskelige spørgsmål, der skal løses hurtigst muligt i retsmedicinsk praksis2. Kiselalger er rigelige i det naturlige miljø (især i vand)3,4. I drukningsprocessen på grund af hypoxi og stressrespons vil folk have intense vejrtrækningsbevægelser og indånde en stor mængde druknevæske. Derfor kommer kiselalger i vandet ind i lungen med druknevæsken, og nogle kiselalger kan komme ind i blodcirkulationen gennem den alveolære-kapillære barriere og sprede sig til indre organer med blodgennemstrømningen 5,6. Påvisning af kiselalger i indre væv og organer som lunge, lever og knoglemarv er et stærkt bevis på drukning før døden 7,8. I øjeblikket er retsmedicinsk diatometest hovedsageligt baseret på morfologiske testmetoder. Efter en række forfordøjelser af vævet udføres de morfologiske kvalitative og kvantitative estimater af ufordøjede diatomer under mikroskopet. I denne periode skal farlige og miljømæssigt uvenlige reagenser såsom salpetersyre anvendes. Denne proces er tidskrævende og kræver, at forskerne har solid taksonomisk ekspertise og omfattende erfaring. Disse bringer alle visse udfordringer for det retsmedicinske personale9. Diatom DNA-testteknologi er en ny teknologi til diatometest udviklet i de senere år 10,11,12. Denne teknologi realiserer artsidentifikation af kiselalger ved at analysere den specifikke DNA-sekvenssammensætning af kiselalger 13,14. PCR-teknologi og sekventeringsteknologi er almindeligt anvendte tekniske metoder, men deres grundlag er den vellykkede ekstraktion af DNA fra diatomer. Kiselalger har imidlertid en særlig struktur, der adskiller sig fra andre organismer, hvilket gør deres DNA-ekstraktionsteknikker også forskellige.
Diatomens cellevæg har en høj grad af silicificering, og dens hovedkomponent er siliciumdioxid 15,16,17. Den kiselholdige cellevæg er meget hård, og den skal ødelægges, før DNA'et ekstraheres. Almindelige DNA-ekstraktionssæt er ofte vanskelige at bruge direkte til ekstraktion af diatome-DNA, fordi de ikke kan ødelægge kiselholdig skal af kiselalger18. Derfor er ødelæggelse af kiselholdig skal af diatomer et af de vigtigste tekniske problemer, der skal løses ved ekstraktion af diatome-DNA.
På samme tid, da antallet af diatomer indeholdt i retsmedicinske forskningsprøver, hvad enten vandprøver eller organer og væv fra druknede kroppe, ofte er begrænset, er det nødvendigt at berige diatomer. Essensen af berigelse er adskillelsen af stoffer. Mens du forsøger at samle diatomer sammen, skal du minimere indholdet af andre materialekomponenter (forstyrrende komponenter). I retsmedicinsk arbejde bruger laboratorier ofte centrifugerings- eller membranfiltreringsberigelsesmetoder til at adskille diatomeceller19. Da vakuumpumpeudstyr imidlertid ikke anvendes i vid udstrækning, anvendes membranberigelsesmetoden ikke ofte i almindelige primære retsmedicinske laboratorier. Så centrifugeringsmetoden er stadig almindeligt diatomberigelse i retsmedicinske laboratorier20.
DNA-ekstraktion fra kiselalger anvendes i øjeblikket primært i retsmedicinsk praksis, og der er betydelige begrænsninger for dens anvendelse. På nuværende tidspunkt er der få diatome DNA-ekstraktionssæt, der anvendes i retsmedicinsk videnskab på markedet, og de er generelt dyre21. Denne artikel giver en forbedret diatome DNA-ekstraktionsmetode, hvilket gør diatome DNA-ekstraktion enkel, praktisk og omkostningseffektiv. Dette øger anvendelsen af efterfølgende molekylærbiologiske test af kiselalger og kan bedre løse problemer relateret til drukning i retsmedicin gennem kiselgurtest. Denne metode bryder kiselholdige cellevægge i kiselalger ved at tilføje glasperler og indstille et passende tidspunkt for hvirvelstrøm. På denne måde lyser proteinasen K og bindingsopløsningen hurtigt cellerne og inaktiverer forskellige enzymer i cellerne. Det genomiske DNA absorberes i matrixmembranen i adsorptionskolonnen og elueres til sidst af elueringsbufferen. Et sådant forbedret fuldblodsgenekstraktionssæt forbedrer blodsættets diatome-DNA-ekstraktionseffekt i retsmedicinske undersøgelsesmaterialer, reducerer omkostningerne ved diatome-DNA-ekstraktion i retsmedicinsk praksis og kan bedre anvendes til retsmedicinsk græsrodsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Hainan Medical University. De vævsprøver, der anvendes i denne undersøgelse, anses ikke for at være undersøgelser, der involverer mennesker. Disse prøver blev opnået med henblik på retsmedicinsk patologisk diagnose, og resten blev anvendt til ekstraktion af diatome-DNA i dette eksperiment. Forskere kan ikke let identificere enkeltpersoner for at opnå informeret samtykke fra relevante interessenter.
BEMÆRK: For at sikre den generelle anvendelighed af den forskningsmetode, der blev rapporteret i dette eksperiment, fulgte dette eksperiment grundlæggende betjeningsvejledningen til det anvendte sæt, og kun nogle trin blev ændret. Vandprøverne, der blev brugt i dette eksperiment, blev tilfældigt taget fra damme nær laboratoriet (supplerende figur 1A). I dette eksperiment blev lungevævet i det druknede legeme bekræftet som forskningsvæv for at demonstrere ekstraktionsprotokollen (supplerende figur 1B). I retsmedicinsk praksis er det også undertiden nødvendigt at anvende andre organer og væv af druknede kroppe (såsom lever, milt, nyre, knoglemarv osv.) til at ekstrahere diatomer DNA, hvilket kræver mindre tilsvarende forbedringer af denne eksperimentelle metode, som vil blive forklaret i det tilsvarende afsnit af eksperimentet. De lungevævsprøver, der blev brugt i dette eksperiment, kom fra lig, der tydeligt var druknet i retsmedicinske tilfælde. Morfologiske tests er blevet udført for at bevise, at lungevævet indeholder kiselalger (supplerende figur 2).
1. Forbehandling af prøver
- Forbehandling af vandprøver
- Tag 10 ml vandprøve i centrifugeglasset og centrifuger ved 13.400 x g i 5 min. 9,8 ml supernatant kasseres forsigtigt med en pipettepistol, og ca. 200 μL beriget kiselgurvandprøve, der er tilbage i bunden, overføres til et 2 ml centrifugeglas.
BEMÆRK: Forforsøg kan udføres først, og den oprindelige mængde kan øges, hvis en 10 ml vandprøve ikke er nok til berigelse.
- Tag 10 ml vandprøve i centrifugeglasset og centrifuger ved 13.400 x g i 5 min. 9,8 ml supernatant kasseres forsigtigt med en pipettepistol, og ca. 200 μL beriget kiselgurvandprøve, der er tilbage i bunden, overføres til et 2 ml centrifugeglas.
- Forbehandling af vævsprøver
- Tag 0,5 g af lungemargenvævet fra den druknede krop, hak eller slib lungevævet helt, indtil det bliver mudret. Forebyggelse af forurening af eksogene kiselalger er kernen i dette trin. Skær vævet i stykker gentagne gange ved hjælp af en saks.
2. DNA-ekstraktion
BEMÆRK: Alle centrifugeringstrin udføres ved stuetemperatur. Brug af en skrivebordscentrifuge med en centrifugalkraft på 14.500 x g; Et vandbad (eller metalbad), der er forvarmet til 70 °C, skal forberedes, inden forsøget påbegyndes. Alle trin skal nøje følge principperne for aseptisk drift.
- Samling af vandprøver og væv
BEMÆRK: Vandprøve og vævsdiatome-DNA-ekstraktionsmetode er den samme.- Der tilsættes glasperler til et 2 ml centrifugeglas indeholdende den forbehandlede vandprøve. Inverter 10x-15x for at blande godt. De tilsatte glasperler består af store og små glasperler blandet i et masseforhold på 1:1. Diameteren på store glasperler er 1,5-2,0 mm og på de små glasperler er 0,4-0,6 mm.
- Tag 0,5 g finhakket væv, tilsæt glasperler til et 2 ml centrifugerør indeholdende vævet som beskrevet ovenfor. Inverter 10x-15x for at blande.
- Der tilsættes 40 μL proteinase K (20 mg/ml) til glassene. Anbring ved stuetemperatur i 15 min, i denne periode, vend om, og bland 10x hvert 3. minut.
BEMÆRK: Hvis vævet ikke fordøjes helt, kan mængden af proteinase K øges passende, indtil opløsningen bliver klar. - Der tilsættes 200 μL bindingsbuffer til centrifugeglassene, straks hvirvelstrømmen, og blandes i 4 minutter (svingningsblandingsfrekvens: 3000 omdr./min.).
BEMÆRK: I dette trin skal rysteintensiteten og -tiden kontrolleres strengt for at sikre tilstrækkelig blandingsintensitet og -tid. - Sæt centrifugeglassene i et 70 °C vandbad i 10 min, og opløsningen bliver klar.
- Tilsæt 100 μL isopropanol til centrifugerørene, hvirvelstrømmen og bland i 15 s, flokkulent nedbør kan forekomme på dette tidspunkt.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at blande godt med passende styrke i ovenstående betjeningstrin, men kraftig omrystning bør undgås for at forhindre DNA-klipning. - Den opløsning, der blev opnået i det foregående trin, anbringes sammen med det flokkulente bundfald i adsorptionskolonnen (adsorptionskolonnen anbringes i opsamlingsrøret). Adsorptionssøjlelængden er 3,0 cm, diameteren er 1,0 cm, og adsorptionsmatrixen er siliciummatrixmembran.
- Der centrifugeres ved 8.000 x g i 30 s, bortkastes affaldsvæsken i opsamlingsrøret, og adsorptionskolonnen sættes tilbage i opsamlingsrøret.
- Der tilsættes 500 μL buffer til fjernelse af inhibitorer til adsorptionskolonnen. Der centrifugeres ved 13.400 x g i 30 sek., og affaldsvæsken bortskaffes i opsamlingsrøret.
- Der tilsættes 700 μL vaskebuffer til adsorptionskolonnen. Der centrifugeres ved 13.400 x g i 30 sek., og affaldsvæsken bortskaffes i opsamlingsrøret.
BEMÆRK: Tilsæt den angivne mængde absolut ethanol til vaskebufferflasken før første brug. - Der tilsættes 500 μL vaskebuffer til adsorptionskolonnen. Der centrifugeres ved 13.400 x g i 30 sek., og affaldsvæsken bortskaffes i opsamlingsrøret.
- Adsorptionskolonnen sættes tilbage i det tomme opsamlingsrør. Der centrifugeres ved 14.500 x g i 2 minutter, og vaskebufferen fjernes så meget som muligt for at undgå, at den resterende ethanol i vaskebufferen hæmmer nedstrømsreaktionerne.
- Adsorptionskolonnen tages ud og anbringes i et rent centrifugerør. Der tilsættes 100 μL elueringsbuffer til den midterste del af adsorptionsmembranen.
- Adsorptionskolonnen anbringes ved stuetemperatur i 3-5 min, og centrifugeres ved 13.400 x g i 1 min.
- Den opløsning, der blev opnået i det foregående trin, tilsættes til centrifugaladsorptionskolonnen igen. Centrifugaladsorptionskolonnen anbringes ved stuetemperatur i 2 minutter og centrifugeres ved 13.400 x g i 1 min.
BEMÆRK: Elueringsbufferen skal forvarmes i et 70 °C vandbad i ca. 10 min. Elueringsvolumenet bør ikke være mindre end 50 μL; ellers reduceres DNA-udbyttet. - Opbevar det ekstraherede diatome-DNA ved 2-8 °C til fremtidig brug. Hvis DNA-opløsningen skal opbevares i lang tid, opbevares den ved -20 °C.
3. PCR-test
BEMÆRK: Da indholdet af kiselalger i retsmedicinske prøver ofte er lavt, kan vævsprøveekstrakterne fra de druknede kroppe også indeholde varierende grader af væv og organer (såsom lungerne i dette eksperiment) med deres eget DNA. Derfor afspejler direkte påvisning af total DNA i DNA-ekstrakter ikke situationen for diatome-DNA-ekstraktion. I dette eksperiment blev diatomspecifikke primere valgt, og PCR-produkter blev brugt til at evaluere diatome-DNA-ekstraktionen i ekstraktet. Produkterne kan observeres og analyseres ved agarosegelelektroforese og kan også analyseres ved fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurve i realtid, som har højere følsomhed.
- Tilsæt 2 μL af det ekstraherede DNA fra vandprøver og væv som skabelon. Vælg en af følgende to metoder til inspektion.
- Konventionel PCR-test
- Brug primere22 , der specifikt kan forstærke diatome 18S rDNA-fragmenter. Yderligere oplysninger findes i tabel 1.
- Fastlæg PCR-reaktionssystemet og amplifikationsbetingelserne i henhold til primernes egenskaber. Yderligere oplysninger findes i tabel 2.
- Kør produkterne af PCR-amplifikation på 2% agarosegel. Overhold og analyser billeddannelsen med et gelbilleddanner.
- Fluorescerende kvantitativ PCR-test
- Brug ovenstående primere, der specifikt kan amplificere diatome 18S rDNA-fragmenter til at forberede et fluorescerende kvantitativt PCR-reaktionssystem i realtid. Yderligere oplysninger findes i tabel 3.
- Udfør PCR-amplifikation og analyser den opnåede forstærkningskurve og Ct-værdier. På samme tid indstilles et program, smeltes dobbeltstrengene af de forstærkede produkter gradvist gennem fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurveteknologi og analyserer derefter de opnåede smeltekurver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da DNA-opløsningen ekstraheret ved den aktuelt anvendte DNA-ekstraktionsmetode indeholder alle DNA-komponenter fra forskellige kilder i prøven, var DNA'et opnået ved denne protokol ingen undtagelse. Så DNA-løsningen var ikke kun en opløsning af diatomisk genomisk DNA. De primere, der specifikt kan forstærke diatome 18S rDNA-fragmenter, blev valgt ved at konsultere litteraturen 22,23,24. Primere blev verificeret af NCBI-Blast Primer, og resultaterne viste, at den forreste primer D512 og den omvendte primer D978 af 18S rDNA var algespecifikke primere og dækkede mange kiselalger. Amplifikationsresultaterne viste ingen humane gener. De blev brugt en pålidelig DNA-biomarkør til diatomtestning, så de blev udvalgt til verifikation af resultaterne af dette eksperiment. Ved hjælp af det ekstraherede DNA som skabelon til diatomspecifik PCR-amplifikation viste amplifikationsproduktet ved agarosegelelektroforese, at vandprøver og væv havde diatome-DNA-bånd, disse elektroforesebånd var mellem 250- 500 bp (tættere på 500 bp) i overensstemmelse med primermålamplifikationsproduktets længdestørrelse (390-410 bp). Dette viste, at ekstraktionsprotokollen var vellykket til ekstraktion af diatome-DNA (figur 1A, B).
Real-time fluorescens kvantitativ PCR-teknologi er en slags gentestteknologi med streng specificitet og høj følsomhed. Ved at tilføje fluorescerende grupper i PCR-reaktionssystemet kan akkumuleringen af fluorescerende signaler få hele PCR-processen til at blive overvåget i realtid, og følsomheden er høj25,26. Produkter, der specifikt forstærkes ved konventionel PCR, kan undertiden være vanskelige at observere i agarosegelelektroforese på grund af det lave indhold og andre årsager27 (figur 1C). Gennem den specifikke amplifikation af fluorescerende kvantitativ PCR i realtid blev der opnået en typisk amplifikationskurve med fire karakteristiske trin (figur 2). Samtidig blev DNA-dobbeltstrengene i det amplificerede produkt gennem realtids fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurveteknologi smeltet til enkeltstrenge ved høj temperatur, farvestoffet blev frigjort fra dobbeltstrengene, og fluorescensværdien faldt. Ved at detektere ændringen i fluorescensværdien blev smeltekurven opnået (figur 3). De opnåede smeltekurver havde karakteristiske toppe, og topværdien var omkring 85,5 ° C, hvilket beviste, at der var en specifik amplifikation af mål-DNA'et, hvilket indikerer, at der var diatome-DNA i den ekstraherede DNA-opløsning. Farvestoffet kunne også tilsættes direkte til det konventionelle PCR-amplifikationsprodukt, og smeltekurven kunne opnås ved fluorescens kvantitativ PCR-smeltekurveteknologi i realtid for at bevise, om der var specifik amplifikation. Derfor, når konventionel PCR-agarosegelelektroforese ikke kunne bevise, om der var diatome-DNA i den ekstraherede DNA-opløsning, kunne realtids fluorescerende kvantitativ PCR-teknologi med højere følsomhed vælges til verifikation og evaluering. I dette eksperiment blev realtids fluorescerende kvantitativ PCR-smeltekurveteknologi kun brugt til kvalitativ analyse.
Som vist i en tidligere rapport21 var det traditionelle jord-DNA-ekstraktionssæt og det modificerede blod-DNA-ekstraktionssæt stort set det samme for diatome-DNA-ekstraktion fra vandprøver og væv. Omkostningsforskellen ved diatome-DNA-ekstraktion var hovedsageligt prisforskellen på de to sæt, og prisen på andre forbrugsvarer var stort set den samme. I denne undersøgelse kunne en simpel forbedring af blod-DNA-ekstraktionssættet, der almindeligvis anvendes i molekylærbiologiske eksperimenter, opnå bedre eksperimentelle resultater, hvilket ikke kun øgede forskernes muligheder for at vælge testkittet i forskningsaktiviteter relateret til diatome-DNA-ekstraktion, men også reducerede omkostningerne ved testning.
Forbedringsprocessen for denne protokol er blevet offentliggjort21. Ved at designe kombinationen af forskellige masseforhold mellem glasperler og hvirveloscillerende tid blev de optimale DNA-ekstraktionsbetingelser for oscillation af glasperler tilføjet til det konventionelle kit, derfor kunne metoden forbedre ekstraktionseffekten af diatome-DNA i retsmedicinske prøver, især i vævsprøver. Den optimale kombination af DNA-ekstraktion blev opnået, når hvirveloscillerende frekvens var 3000 o / min; Hvirvelens oscillerende tid var 4 min, masseforholdet mellem store glasperler med diameter på 1,5-2,0 mm og små glasperler med diameter på 0,4-0,6 mm var 1: 1. En sammenligning mellem den konventionelle metode i kittet og den forbedrede metode blev udført. Det blev vist, at det anvendte kit kunne imødekomme behovene for forstærkning af diatome-DNA, og lysstyrken af elektroforetiske bånd efter amplifikation udført ved den forbedrede metode i vandprøver svarede til lysstyrken af den konventionelle metode, og de elektroforetiske bånd efter amplifikation udført ved den forbedrede metode i vævsprøver var lysere (figur 4).
Figur 1: Elektroforeseresultater af DNA ekstraheret ved anvendelse af protokollen efter PCR-amplifikation. I alt 2 μL DNA-ekstrakt blev anvendt som DNA-skabelon til PCR-specifik amplifikation. PCR-forstærkningsprodukterne blev elektroforeseret på 1x TAE-bufferopløsning gennem 2% agarosegel og kørte ved en konstant spænding på 100V i 25-30 minutter. En D2000 DNA-stige blev brugt til alle geler. (A) Elektroforeseresultaterne af diatome-DNA i vandprøver efter PCR-amplifikation, bane 1 er blindprøvekontrol; Spor 2-7 er vandprøver fra forskellige steder i samme område. (B) Resultaterne af elektroforese efter PCR-amplifikation af diatome-DNA i vævet. Baner 1-6 er vævene udskåret fra forskellige positioner af det samme lungevæv; Bane 7 er den tomme kontrol. (C) I et mislykket eksperiment efter diatome DNA-amplifikation viste elektroforeseresultaterne ikke elektroforesebånd på de tilsvarende positioner, hvilket tyder på, at der ikke var nogen amplifikationsprodukter eller for få amplifikationsprodukter. På dette tidspunkt kunne elektroforeseresultaterne ikke indikere, om der var diatome-DNA i den foreslåede DNA-opløsning, som skulle udføres ved mere følsomme metoder (såsom en PCR-smeltekurve). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Diatome DNA qPCR-amplifikationskurve. I alt 2 μL DNA-opløsningsekstrakt, der ikke viste bånd ved konventionel PCR- og agarosegelelektroforese, blev brugt som skabelon til at forberede et kvantitativt PCR-system i realtid og oprette et program. Endelig blev typiske forstærkningskurver med fire karakteristiske stadier af lineær baselinefase, begyndelsen af eksponentiel fase, eksponentiel fase og plateaufase opnået. Ct-værdien af hver kurve blev også opnået gennem analyse, hvilket indikerer, at DNA-ekstraktion var vellykket. Hvert tal repræsenterer Ct-værdien af den tilsvarende kurve. Tærsklen er 5,2. Y-aksens enhed er Rn. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Diatome DNA-smeltekurve. Ved hjælp af et kvantitativt PCR-system i realtid blev der indstillet et program, hvor temperaturen stiger fra 60-95 °C. Dette genererede en smeltekurve, og det specifikt amplificerede dobbeltstrengede DNA smeltede til enkeltstrenge ved høje temperaturer, farvestoffet var fri for dobbeltstrengene, og fluorescensværdien faldt, indtil den var 0. Grafen blev opnået ved at tage den negative gensidige af den oprindelige graf. Abscissen repræsenterede temperaturen, abscissen svarende til den højeste topværdi var Tm-værdien, og Tm-værdien af smeltekurven i grafen var 85,5 °C. Nummereringen af hver kurve svarer til nummereringen af hver vognbane i figur 1C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Elektroforese resultater af den forbedrede proces. (A) Elektroforeseresultater for forskellige kombinationer af glasperleforhold og hvirvelsvingningstider. Bane 1, 4, 7, 10 og 13, hvor blandingsmasseforholdet mellem store og små glasperler er 1:2, bane 2, 5, 8, 11 og 14, hvor det blandede masseforhold mellem store og små glasperler er 1:1, bane 3, 6, 9, 12 og 15, hvor det blandede masseforhold mellem store og små glasperler er 2:1, Og svingningstiderne var 2 minutter for baner 1-3, 3 minutter for baner 4-6, 4 minutter for baner 7-9, 5 minutter for baner 10-12 og 6 minutter for baner 13-15. Bane 16 er den tomme kontrol. (B) Elektroforeseresultater efter PCR-amplifikation af kitekstraktionsprodukterne før og efter forbedring. Bane 1-3 er konventionelle metoder til ekstraktion af vandprøver, bane 4-6 er forbedrede metoder til ekstraktion af vandprøver, bane 7-9 er konventionelle metoder til ekstraktion af væv, bane 10-12 er forbedrede metoder til ekstraktion af væv, bane 13 er en tom kontrol. Resultaterne er ændret fra21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Vandprøver og vævsprøver. De anvendte vandprøver blev taget fra en dam nær laboratoriet, og de anvendte vævsprøver blev bekræftet som lungevæv fra den druknede krop. (A) Det eksperimentelle vandprøveopsamlingssted var en dam nær laboratoriet. B) Berigede vandprøver og strimlede lungevævsprøver. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Mikrograf af kiselalger. Billeder (A) og (B) blev taget under et 400x optisk mikroskop. Pilen peger på kiselalger. Billeder (C) og (D) blev taget under et elektronmikroskop. Billeder (A) og (B) viser kiselalger i vandet på druknestedet. Kiselalger hedder Fragilaria og Navicula. Billeder (C) og (D) viser kiselalger i lungerne, som kaldes Nitzschia og Navicula. Klik her for at downloade denne fil.
| Mål | Primer navn | Sekvens |
| 18S rDNA | forord primer D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| omvendt primer D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabel 1: Liste over anvendte primere. Denne tabel beskriver sekvenser, navne og målområder for specifikke primere, der bruges i dette papir.
| PCR-reaktionssystem | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| forord primer D512 | 0,5 μL (10 μmol/l) | ||
| omvendt primer D978 | 0,5 μL (10 μmol/l) | ||
| skabelon DNA | 2 μL | ||
| Nukleasefrit vand | til 20 μL | ||
| Bemærk: Den tomme kontrolskabelon-DNA erstattes af den samme mængde nukleasefrit vand. | |||
| PCR-program | |||
| temperatur | Tidspunkt | Cykler | |
| 94 °C | 10 minutter | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 10 minutter | 1 | |
Tabel 2: PCR-komponenter. Denne tabel beskriver konfigurationen af reaktionssystemet for konventionel PCR og indstillingerne for reaktionstemperatur, tid og antal cyklusser for PCR. Det totale volumen af det anvendte reaktionssystem var 20 μL.
| Kvantitativt PCR-reaktionssystem i realtid | |||
| 2x qPCR-blanding | 10 μL | ||
| forord primer D512 | 0,45 μL (10 μmol/l) | ||
| omvendt primer D978 | 0,45 μL (10 μmol/l) | ||
| skabelon DNA | 2 μL | ||
| Nukleasefrit vand | til 20 μL | ||
| Bemærk: Den tomme kontrolskabelon-DNA erstattes af den samme mængde nukleasefrit vand. | |||
| Kvantitativt PCR-program i realtid | |||
| temperatur | Tidspunkt | Cykler | |
| 94 °C | 10 minutter | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min | ||
Tabel 3: Kvantitative PCR-komponenter i realtid. Denne tabel beskriver konfigurationen af reaktionssystemet til kvantitativ PCR i realtid og indstillingerne for reaktionstemperatur, tid og antal cyklusser for PCR. Det totale volumen af det anvendte reaktionssystem var 20 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kiselalger er beskyttet af hårde kiselholdige cellevægge17, og denne struktur skal ødelægges for at ekstrahere diatome-DNA. Almindelige sæt ødelægger ikke let kiselholdig skal af kiselalger; Det er således vanskeligt at ekstrahere diatome-DNA21 med succes. Vores laboratorium forbedrede det mest almindeligt anvendte blod-DNA-ekstraktionssæt og tilføjede glasperler med forskellige diametre og forskellige masseforhold i processen med diatomekstraktion. Vortexoscillation udføres på samme tid, hvilket fuldt ud kan bryde diatomskallen og forbedre diatome-DNA-ekstraktionseffekten. Som det fremgår af den foregående rapport21, vil glasperlernes diameter, svingningsintensitet og tid direkte påvirke kvaliteten af DNA-ekstraktionen. Hvirvelsvingningstiden bør ikke være for lang (højst 10 min). Hvis tiden er for lang, vil DNA'et gå i stykker på grund af overdreven vibration. Samtidig bør tiden ikke være for kort. Hvis tiden er for kort (ikke mindre end 2 min), fjernes diatomeskallen ikke helt, hvilket vil gøre DNA-ekstraktionen ineffektiv. Mens du vælger glasperler, vælger du perler med forskellige omkredsdiametre, de store glasperler sikrer kollisionsstyrken, og de små glasperler sikrer, at der ikke er nogen død kollision mellem glasperlerne under kollisionsfragmenteringsprocessen, hvilket forbedrer effektiviteten af skalbrydning.
For at ekstrahere diatome-DNA fra prøver er det generelt nødvendigt at berige kiselalger. Denne proces vil have stor indflydelse på ekstraktionen af diatome-DNA. Formålet med berigelse er at øge koncentrationen af diatome i prøver, således at koncentrationen af ekstraheret diatome-DNA kan være i detekterbart område; til næste trin, såsom fluorescerende kvantitativ PCR i realtid og high-throughput sekventering.
Da kiselalger er vidt udbredt i naturen4, er forebyggelse af laboratoriekontaminering en topprioritet28. Kontaminering under DNA-ekstraktionsprocessen vil føre til afvigelser fra de faktiske resultater og tab af brugsværdi. Vær derfor altid opmærksom på princippet om aseptisk drift ved ekstraktion af diatome-DNA og træffe alle mulige foranstaltninger for at reducere og undgå forurening af eksogene diatomer. Når vævet ekstraheres fra den døde krop, skal der træffes foranstaltninger for at forhindre, at det bliver forurenet af eksogene kiselalger. Når vævet er ekstraheret, skal det opbevares i en beholder eller prøvepose uden kiselalger. Vævet bør ikke behandles med formaldehyd. Udstyret til ekstraktion og behandling af væv skal vaskes 2-3 gange med destilleret vand gentagne gange og derefter steriliseres med ultraviolet lys eller høj temperatur for at sikre, at der ikke er forurening af diatomer fra andre kilder. Vævet før testen skal afskæres fra det overfladiske væv med et diatomefrit instrument, og derefter skal instrumentet udskiftes for at udvælge det nedre væv til undersøgelse. Samtidig kan standardisering af driftsprocessen også effektivt undgå problemet med laboratoriekontaminering.
Da kiselalger er føde for mange vandorganismer, vil de gå tabt under langtidsopbevaring29. Kiselalger kan også vokse og reproducere under lysforhold. DNA-ekstraktionstrinnet bør derfor påbegyndes hurtigst muligt efter prøveudtagningen, og der bør foretages hurtig prøvebehandling for at forhindre tab af kiselalger i prøven. Hvis DNA-ekstraktionen ikke kan udføres straks, skal alle prøver fryses og opbevares i mørke for at forhindre reduktion af kiselalger så meget som muligt.
Vores forskning valgte et almindeligt og billigt blod-DNA-ekstraktionssæt baseret på proteinase K-fordøjelsesmetoden, som er blevet forbedret til at ekstrahere diatome-DNA fra vandprøver og væv med gode resultater30. Vævet er tilstrækkeligt skåret til at være i fuld kontakt med proteinase K, og vævet bliver fuldt fordøjet. Det mulige princip for vellykket ekstraktion er som følger: under rystetrinnet påvirkes diatomens hårde skal gentagne gange og fragmenteres mellem hurtige glasperler, der udsætter cellemembranen; konfigurationen af glasperler i forskellige størrelser kan udfylde mellemrummet mellem kollisionen af glasperler i én størrelse for at dække kollisionskontaktfladen så fuldstændigt som muligt; efter at have mistet siliciumskallen hjælper proteinase K med at frigive DNA fra diatomen. Sammenlignet med det aktuelt anvendte jord-DNA-ekstraktionssæt kan det forbedrede blod-DNA-ekstraktionssæt opfylde kravene til diatome-DNA-ekstraktion, hvilket er mere økonomisk og lettere at opnå. Det letter ikke kun brugen af retsmedicinsk diatominspektion, men er velegnet til anvendelse på andre diatomforskningsrelaterede discipliner og kan også bruges til anden plankton-DNA-ekstraktion. Ved ekstraktion af diatome-DNA fra vandprøver skal mængden af proteinase K, der anvendes, justeres i henhold til antallet af plankton i vandet. Mængden af proteinase K kan øges eller formindskes baseret på foreløbige forsøg. Ved ekstraktion af diatome-DNA fra væv vil forskellige organvævstyper, vævsforurening og andre faktorer påvirke mængden af proteinase K, der kræves til fordøjelsen. I forsøget skal proteinasen K i kittet opbevares ved -20 °C efter brug, ellers vil inaktiveringen af proteinase K påvirke ekstraktionsprocessen.
Det kan konkluderes, at diatome-DNA-ekstraktion bør udføres så hurtigt som muligt efter prøveudtagning og prøvebehandling, ellers opbevares ved -20 °C til konservering. Prøvehåndtering, opbevaring og hele ekstraktionsprocessen skal udføres omhyggeligt for at forhindre forurening med eksogene kiselalger. Ellers kan det ikke vurderes, at det ekstraherede diatome-DNA var i prøven eller eksogen forurening. Når du bruger proteinase K til at fordøje væv, kan doseringen være et problem. Utilstrækkelig vævsfordøjelse kan øge mængden af proteinase K. Derfor er det vigtigt at skære vævet tilstrækkeligt. Tilstrækkelig fordøjelse af vævet forhindrer også vævsrester i at tilstoppe plasmamembranen inde i adsorptionskolonnen. Når membranen er blokeret, er det ikke muligt at bruge pipettespidsen til at udvælge blokeringen eller centrifugere gentagne gange, hvilket vil beskadige membranen. Den endelige DNA-opløsning indeholder mange urenheder, hvilket vil påvirke påvisningen af diatome-DNA. Oscillationsintensitet og tid er også nøglespørgsmål. Den første hvirvelsvingningstid styres ved 4-5 min, og svingningsfrekvensen styres ved 3000 o / min, ellers vil DNA-ekstraktionen blive påvirket. Hvis de elektroforetiske bånd ikke er klare efter PCR, kan det være nødvendigt at øge mængden af DNA-skabelon yderligere. DNA'et ekstraheret i denne undersøgelse er en blanding af DNA, herunder diatome-DNA og DNA fra andre arter, så koncentrationen af diatome-DNA kan ikke bestemmes. Derfor er det ikke egnet til applikationer, der kræver høj renhed af DNA-skabeloner.
Undersøgelser har vist, at forskellige kiselalger kan forstærkes af forskellige primere31,32. I denne undersøgelse blev kun de diatomspecifikke primere D512 og D978 på diatome 18S rDNA brugt til at teste, om diatome-DNA'et blev ekstraheret med succes, hvilket ikke kunne dække alle diatomearter22,33. Da længden af amplifikationsproduktfragmentet af primerparret er 390-410 bp, vælger den forbedrede metode desuden alle fragmentstørrelser af diatome-DNA for at teste, om der er en indvirkning på de eksperimentelle parametre, som kræver yderligere undersøgelse. Efterfølgende undersøgelser vil også bruge primere fra forskellige regioner og forskellige forstærkningslængder til at undersøge effekten af ekstraktion.
Sammenlignet med den traditionelle diatome DNA-ekstraktionsmetode har denne metode de vigtigste fordele ved billig og storskala diatome DNA-ekstraktion. Det kan supplere fordelene ved diatomiske morfologiske metoder og kan imødekomme behovene ved druknediagnose i primære retsmedicinske laboratorier. Samtidig udvider det også udvælgelsesområdet for diatome DNA-ekstraktionssæt og har en god anvendelsesudsigt. I fremtiden vil denne metode ikke kun være begrænset til udvinding af kiselalger, men blive brugt til udvinding af DNA fra andre alger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) og af Academician Innovation Platform Scientific Research Project of Hainan Province (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
