Summary
Cet article décrit un protocole d’extraction de l’ADN des diatomées à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commun modifié.
Abstract
Le test des diatomées est un moyen auxiliaire essentiel dans la pratique médico-légale pour déterminer si le cadavre s’est noyé dans l’eau et pour déduire le lieu de la noyade. L’analyse des diatomées est également un élément de recherche important dans le domaine de l’environnement et du plancton. La technologie de test de biologie moléculaire des diatomées, qui se concentre sur l’ADN des diatomées en tant qu’objet de recherche principal, est une nouvelle méthode de test des diatomées. L’extraction de l’ADN des diatomées est la base des tests moléculaires des diatomées. À l’heure actuelle, les kits couramment utilisés pour l’extraction de l’ADN des diatomées sont coûteux, ce qui augmente le coût de la recherche connexe. Notre laboratoire a amélioré le kit général d’extraction rapide d’ADN génomique du sang total et a obtenu un effet d’extraction d’ADN de diatomée satisfaisant, fournissant ainsi une solution d’extraction d’ADN alternative économique et abordable à base de billes de verre pour la recherche connexe. L’ADN des diatomées extrait à l’aide de ce protocole pourrait satisfaire de nombreuses applications en aval, telles que la PCR et le séquençage.
Introduction
Dans la pratique médico-légale, il est essentiel de déterminer si un cadavre retrouvé dans l’eau en train de se noyer ou s’il a été jeté à l’eau après la mort est essentiel pour la bonne résolution de l’affaire1. C’est aussi l’une des questions difficiles qui doivent être résolues de toute urgence dans la pratique médico-légale2. Les diatomées sont abondantes dans le milieu naturel (en particulier dans l’eau)3,4. Au cours du processus de noyade, en raison de l’hypoxie et de la réponse au stress, les gens auront des mouvements respiratoires intenses et inhaleront une grande quantité de liquide de noyade. Par conséquent, les diatomées dans l’eau pénètrent dans les poumons avec le liquide de noyade, et certaines diatomées peuvent pénétrer dans la circulation sanguine à travers la barrière alvéolaire-capillaire et se propager aux organes internes avec le flux sanguin 5,6. La détection de diatomées dans les tissus internes et les organes tels que les poumons, le foie et la moelle osseuse est une preuve solide de noyade avant la mort 7,8. À l’heure actuelle, les tests médico-légaux des diatomées sont principalement basés sur des méthodes de tests morphologiques. Après une série de pré-digestion des tissus, les estimations morphologiques qualitatives et quantitatives des diatomées non digérées sont effectuées au microscope. Pendant cette période, des réactifs dangereux et peu respectueux de l’environnement tels que l’acide nitrique doivent être utilisés. Ce processus prend beaucoup de temps et exige des chercheurs qu’ils disposent d’une solide expertise taxonomique et d’une vaste expérience. Tout cela pose certains défis au personnel médico-légal9. La technologie de test d’ADN des diatomées est une nouvelle technologie de test des diatomées développée ces dernières années 10,11,12. Cette technologie permet d’identifier les espèces de diatomées en analysant la composition spécifique des séquences d’ADN des diatomées13,14. La technologie PCR et la technologie de séquençage sont des méthodes techniques couramment utilisées, mais leur base est l’extraction réussie de l’ADN des diatomées. Cependant, les diatomées ont une structure spéciale différente des autres organismes, ce qui rend leurs techniques d’extraction de l’ADN également différentes.
La paroi cellulaire de la diatomée a un degré élevé de silicification et son composant principal est le dioxyde de silicium 15,16,17. La paroi cellulaire siliceuse est très dure et doit être détruite avant d’extraire l’ADN. Les kits d’extraction d’ADN ordinaires sont souvent difficiles à utiliser directement pour l’extraction de l’ADN des diatomées car ils ne peuvent pas détruire la coquille siliceuse des diatomées18. Par conséquent, la destruction de la coquille siliceuse des diatomées est l’un des principaux problèmes techniques à résoudre dans l’extraction de l’ADN des diatomées.
Dans le même temps, étant donné que le nombre de diatomées contenues dans les échantillons de recherche médico-légale, qu’il s’agisse d’échantillons d’eau ou d’organes et de tissus de corps noyés, est souvent limité, il est nécessaire d’enrichir les diatomées. L’essence de l’enrichissement est la séparation des substances. Lorsque vous essayez de rassembler les diatomées, minimisez le contenu des autres composants matériels (composants interférents). Dans le domaine de la médecine légale, les laboratoires utilisent souvent des méthodes de centrifugation ou d’enrichissement par filtration membranaire pour séparer les cellules de diatomées19. Cependant, étant donné que l’équipement de pompage sous vide n’est pas largement utilisé, la méthode d’enrichissement membranaire n’est pas souvent utilisée dans les laboratoires médico-légaux primaires ordinaires. Ainsi, la méthode de centrifugation est encore couramment l’enrichissement en diatomées dans les laboratoires médico-légaux20.
L’extraction de l’ADN à partir de diatomées est actuellement utilisée principalement dans la pratique médico-légale, et son application présente des limites importantes. À l’heure actuelle, il existe peu de kits d’extraction d’ADN de diatomées utilisés en médecine légale sur le marché et ils sont généralement coûteux21. Cet article fournit une méthode améliorée d’extraction de l’ADN des diatomées, rendant l’extraction de l’ADN des diatomées simple, pratique et rentable. Cela augmente l’application des tests de biologie moléculaire ultérieurs des diatomées et peut mieux résoudre les problèmes liés à la noyade en médecine légale grâce aux tests de diatomées. Cette méthode brise les parois cellulaires siliceuses des diatomées en ajoutant des billes de verre et en fixant un moment approprié pour le vortex. De cette façon, la protéinase K et la solution de liaison lysent rapidement les cellules et inactivent diverses enzymes dans les cellules. L’ADN génomique est absorbé dans la membrane matricielle de la colonne d’adsorption et finalement élué par le tampon d’élution. Un tel kit amélioré d’extraction de gènes de sang total améliore l’effet d’extraction de l’ADN des diatomées du kit de sang dans les matériaux d’examen médico-légal, réduit le coût de l’extraction de l’ADN des diatomées dans la pratique médico-légale et peut être mieux appliqué à la recherche médico-légale de base.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Hainan. Les échantillons de tissus utilisés dans cette étude ne sont pas considérés comme des études impliquant des sujets humains. Ces spécimens ont été obtenus à des fins de diagnostic de médecine légale, et le reste a été utilisé pour l’extraction de l’ADN des diatomées dans cette expérience. Les chercheurs ne peuvent pas facilement identifier les personnes pour obtenir le consentement éclairé des parties prenantes concernées.
REMARQUE : Pour assurer l’applicabilité générale de la méthode de recherche rapportée dans cette expérience, cette expérience a essentiellement suivi les instructions d’utilisation de la trousse utilisée, et seules certaines étapes ont été modifiées. Les échantillons d’eau utilisés dans cette expérience ont été prélevés au hasard dans des étangs situés à proximité du laboratoire (figure supplémentaire 1A). Dans cette expérience, il a été confirmé que le tissu pulmonaire du corps noyé était le tissu de recherche pour démontrer le protocole d’extraction (figure supplémentaire 1B). Dans la pratique médico-légale, il est parfois nécessaire d’utiliser d’autres organes et tissus de corps noyés (tels que le foie, la rate, les reins, la moelle osseuse, etc.) pour extraire l’ADN des diatomées, ce qui nécessite des améliorations mineures correspondantes de cette méthode expérimentale, qui seront expliquées dans la section correspondante de l’expérience. Les échantillons de tissus pulmonaires utilisés dans cette expérience provenaient de cadavres qui étaient clairement noyés dans des cas médico-légaux. Des tests morphologiques ont été effectués pour prouver que le tissu pulmonaire contient des diatomées (figure supplémentaire 2).
1. Prétraitement des échantillons
- Prétraitement des échantillons d’eau
- Prélever 10 mL d’échantillon d’eau dans le tube à centrifuger et centrifuger à 13 400 x g pendant 5 min. Jeter délicatement 9,8 mL de surnageant à l’aide d’un pistolet à pipette et transférer environ 200 μL d’échantillon d’eau de diatomée enrichie restant au fond dans un tube à centrifuger de 2 mL.
REMARQUE : Une expérience préliminaire peut être effectuée en premier, et la quantité initiale peut être augmentée si un échantillon d’eau de 10 ml n’est pas suffisant pour l’enrichissement.
- Prélever 10 mL d’échantillon d’eau dans le tube à centrifuger et centrifuger à 13 400 x g pendant 5 min. Jeter délicatement 9,8 mL de surnageant à l’aide d’un pistolet à pipette et transférer environ 200 μL d’échantillon d’eau de diatomée enrichie restant au fond dans un tube à centrifuger de 2 mL.
- Prétraitement d’échantillons de tissus
- Prélevez 0,5 g de tissu de bord pulmonaire du corps noyé, hachez ou broyez complètement le tissu pulmonaire jusqu’à ce qu’il devienne boueux. La prévention de la contamination des diatomées exogènes est au cœur de cette étape. Coupez le tissu en morceaux à plusieurs reprises à l’aide de ciseaux.
2. Extraction de l’ADN
REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante. Utilisation d’une centrifugeuse de bureau avec une force centrifuge de 14 500 x g ; un bain-marie (ou bain métallique) préchauffé à 70 °C doit être préparé avant le début de l’expérience. Toutes les étapes doivent suivre strictement les principes d’un fonctionnement aseptique.
- Assemblage d’échantillons d’eau et de tissus
REMARQUE : La méthode d’extraction de l’ADN des diatomées de l’échantillon d’eau et des tissus est la même.- Ajouter les billes de verre dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant l’échantillon d’eau prétraitée. Inversez 10x-15x pour bien mélanger. Les billes de verre ajoutées sont composées de grosses et de petites billes de verre mélangées dans un rapport de masse de 1 :1. Le diamètre des grosses perles de verre est de 1,5 à 2,0 mm et celui des petites perles de verre est de 0,4 à 0,6 mm.
- Prenez 0,5 g de tissu finement haché, ajoutez des billes de verre dans un tube à centrifuger de 2 ml contenant le tissu comme décrit ci-dessus. Inversez 10x-15x pour mélanger.
- Ajouter 40 μL de protéinase K (20 mg/mL) dans les tubes. Placez à température ambiante pendant 15 min, pendant cette période, inversez et mélangez 10x toutes les 3 min.
REMARQUE : Si le tissu n’est pas complètement digéré, la quantité de protéinase K peut être augmentée de manière appropriée jusqu’à ce que la solution devienne claire. - Ajouter 200 μL de tampon de liaison dans les tubes à centrifuger, immédiatement vortex, et mélanger pendant 4 min (fréquence de mélange d’oscillation : 3000 tr/min).
REMARQUE : Dans cette étape, l’intensité et le temps d’agitation doivent être strictement contrôlés pour assurer une intensité et un temps de mélange suffisants. - Mettez les tubes à centrifuger dans un bain-marie à 70 °C pendant 10 min et la solution devient claire.
- Ajouter 100 μL d’isopropanol dans les tubes à centrifuger, vortex et mélanger pendant 15 s, une précipitation floculante peut apparaître à ce moment-là.
REMARQUE : Il est très important de bien mélanger avec une force appropriée dans les étapes d’opération ci-dessus, mais une agitation vigoureuse doit être évitée pour éviter le cisaillement de l’ADN. - Mettez la solution obtenue à l’étape précédente avec le précipité floculant dans la colonne d’adsorption (la colonne d’adsorption est placée dans le tube de collecte). La longueur de la colonne d’adsorption est de 3,0 cm, le diamètre est de 1,0 cm et la matrice d’adsorption est une membrane à matrice de silicium.
- Centrifuger à 8 000 x g pendant 30 s, jeter le liquide usé dans le tube de collecte et remettre la colonne d’adsorption dans le tube de collecte.
- Ajouter 500 μL de tampon d’élimination de l’inhibiteur dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.
- Ajouter 700 μL de tampon de lavage dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.
REMARQUE : Ajoutez la quantité spécifiée d’éthanol absolu dans la bouteille tampon de lavage avant la première utilisation. - Ajouter 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.
- Remettez la colonne d’adsorption dans le tube de collecte vide. Centrifuger à 14 500 x g pendant 2 min et retirer autant que possible le tampon de lavage pour éviter que l’éthanol résiduel contenu dans le tampon de lavage n’inhibe les réactions en aval.
- Retirez la colonne d’adsorption et placez-la dans un tube de centrifugation propre. Ajouter 100 μL de tampon d’élution dans la partie centrale de la membrane d’adsorption.
- Placez la colonne d’adsorption à température ambiante pendant 3 à 5 minutes et centrifugez à 13 400 x g pendant 1 minute.
- Ajouter à nouveau la solution obtenue à l’étape précédente dans la colonne d’adsorption centrifuge. Placez la colonne d’adsorption centrifuge à température ambiante pendant 2 min et la centrifugeuse à 13 400 x g pendant 1 min.
REMARQUE : Le tampon d’élution doit être préchauffé dans un bain-marie à 70 °C pendant environ 10 minutes. Le volume d’élution ne doit pas être inférieur à 50 μL ; sinon, le rendement en ADN sera réduit. - Conservez l’ADN de la diatomée extrait à une température comprise entre 2 et 8 °C pour une utilisation ultérieure. Si la solution d’ADN doit être conservée pendant une longue période, conservez-la à -20 °C.
3. Test PCR
REMARQUE : Étant donné que la teneur en diatomées dans les échantillons médico-légaux est souvent faible, les extraits d’échantillons de tissus des corps noyés peuvent également contenir divers degrés de tissus et d’organes (tels que les poumons dans cette expérience) avec leur propre ADN. Par conséquent, la détection directe de l’ADN total dans les extraits d’ADN ne reflète pas la situation de l’extraction de l’ADN des diatomées. Dans cette expérience, des amorces spécifiques aux diatomées ont été sélectionnées et des produits de PCR ont été utilisés pour évaluer l’extraction de l’ADN des diatomées dans l’extrait. Les produits peuvent être observés et analysés par électrophorèse sur gel d’agarose et peuvent également être analysés par une courbe de fusion PCR quantitative fluorescente en temps réel, qui a une sensibilité plus élevée.
- Ajouter 2 μL de l’ADN extrait d’échantillons d’eau et de tissus comme modèle. Choisissez l’une des deux méthodes d’inspection suivantes.
- Test PCR conventionnel
- Utilisez des amorces22 qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S. Pour plus de détails, voir le tableau 1.
- Etablir le système de réaction PCR et les conditions d’amplification en fonction des caractéristiques des amorces. Pour plus de détails, voir le tableau 2.
- Exécuter les produits d’amplification PCR sur du gel d’agarose à 2%. Observez et analysez l’imagerie à l’aide d’un imageur à gel.
- Test PCR quantitatif fluorescent
- Utilisez les amorces ci-dessus qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S pour préparer un système de réaction PCR quantitative fluorescente en temps réel. Pour plus de détails, voir le tableau 3.
- Effectuer l’amplification PCR et analyser la courbe d’amplification obtenue et les valeurs Ct. Dans le même temps, définissez un programme, faites fondre progressivement les doubles brins des produits amplifiés en monobrins grâce à la technologie de courbe de fusion PCR quantitative fluorescente, puis analysez les courbes de fusion obtenues.
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Representative Results
Étant donné que la solution d’ADN extraite par la méthode d’extraction d’ADN actuellement utilisée contient tous les composants de l’ADN provenant de différentes sources dans l’échantillon, l’ADN obtenu par ce protocole n’a pas fait exception. Ainsi, la solution d’ADN n’était pas seulement une solution d’ADN génomique de diatomées. Les amorces qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S ont été sélectionnées en consultant la littérature 22,23,24. Les amorces ont été vérifiées par NCBI-Blast Primer, et les résultats ont montré que l’amorce directe D512 et l’amorce inverse D978 de l’ADNr 18S étaient des amorces spécifiques aux algues et couvraient de nombreuses espèces de diatomées. Les résultats de l’amplification n’ont montré aucun gène humain. Ils ont été utilisés comme biomarqueur d’ADN fiable pour les tests de diatomées, ils ont donc été sélectionnés pour vérifier les résultats de cette expérience. En utilisant l’ADN extrait comme modèle pour l’amplification par PCR spécifique aux diatomées, le produit d’amplification par électrophorèse sur gel d’agarose a montré que les échantillons d’eau et les tissus avaient des bandes d’ADN de diatomées, ces bandes d’électrophorèse étaient comprises entre 250 et 500 pb (plus près de 500 pb), conformément à la taille de la longueur du produit d’amplification de la cible d’amorce (390 -410 pb). Cela a montré que le protocole d’extraction a réussi à extraire l’ADN des diatomées (Figure 1A,B).
La technologie de PCR quantitative par fluorescence en temps réel est une sorte de technologie de test génétique avec une spécificité stricte et une sensibilité élevée. En ajoutant des groupes fluorescents dans le système de réaction PCR, l’accumulation de signaux fluorescents peut permettre de surveiller l’ensemble du processus PCR en temps réel, et la sensibilité est élevée25,26. Les produits spécifiquement amplifiés par PCR conventionnelle peuvent parfois être difficiles à observer dans l’électrophorèse sur gel d’agarose en raison de leur faible teneur et d’autres raisons27 (Figure 1C). Grâce à l’amplification spécifique de la PCR quantitative fluorescente en temps réel, une courbe d’amplification typique avec quatre étages caractéristiques a été obtenue (Figure 2). Dans le même temps, grâce à la technologie de courbe de fusion quantitative par PCR fluorescente en temps réel, les doubles brins d’ADN du produit amplifié ont été fondus en brins simples à haute température, le colorant a été libéré des brins doubles et la valeur de fluorescence a diminué. En détectant le changement de la valeur de fluorescence, la courbe de fusion a été obtenue (Figure 3). Les courbes de fusion obtenues présentaient des pics caractéristiques et la valeur maximale était d’environ 85,5 °C, ce qui prouvait qu’il y avait une amplification spécifique de l’ADN cible, indiquant qu’il y avait de l’ADN de diatomée dans la solution d’ADN extraite. Le colorant pourrait également être directement ajouté au produit d’amplification PCR conventionnel, et la courbe de fusion pourrait être obtenue par la technologie de courbe de fusion PCR quantitative de fluorescence en temps réel pour prouver s’il y avait une amplification spécifique. Par conséquent, lorsque l’électrophorèse conventionnelle PCR-gel d’agarose n’a pas pu prouver s’il y avait de l’ADN de diatomée dans la solution d’ADN extraite, la technologie de PCR quantitative fluorescente en temps réel avec une sensibilité plus élevée a pu être sélectionnée pour vérification et évaluation. Dans cette expérience, la technologie de courbe de fusion quantitative par PCR fluorescente en temps réel n’a été utilisée qu’à des fins d’analyse qualitative.
Comme nous l’avons montré dans un rapport précédent21, le kit d’extraction d’ADN du sol traditionnel et le kit d’extraction d’ADN sanguin modifié étaient fondamentalement les mêmes pour l’extraction de l’ADN des diatomées à partir d’échantillons d’eau et de tissus. La différence de coût de l’extraction de l’ADN des diatomées était principalement la différence de prix des deux kits, et le coût des autres consommables était fondamentalement le même. Dans cette étude, une simple amélioration du kit d’extraction d’ADN sanguin couramment utilisé dans les expériences de biologie moléculaire pourrait permettre d’obtenir de meilleurs résultats expérimentaux, ce qui a non seulement augmenté la possibilité pour les chercheurs de sélectionner le kit de test dans les activités de recherche liées à l’extraction de l’ADN des diatomées, mais a également réduit le coût des tests.
Le processus d’amélioration de ce protocole a été publié21. En concevant la combinaison de différents rapports de masse des billes de verre et du temps d’oscillation du vortex, les conditions optimales d’extraction de l’ADN de l’oscillation des billes de verre ont été ajoutées au kit conventionnel, par conséquent, la méthode pourrait améliorer l’effet d’extraction de l’ADN des diatomées dans les échantillons médico-légaux, en particulier dans les échantillons de tissus. La combinaison optimale d’extraction d’ADN a été obtenue lorsque la fréquence d’oscillation du vortex était de 3000 tr/min ; Le temps d’oscillation du vortex était de 4 min, le rapport de masse des grosses billes de verre d’un diamètre de 1,5 à 2,0 mm et des petites billes de verre d’un diamètre de 0,4 à 0,6 mm était de 1 :1. Une comparaison entre la méthode conventionnelle du kit et la méthode améliorée a été effectuée. Il a été démontré que le kit utilisé pouvait répondre aux besoins d’amplification de l’ADN des diatomées, et que la luminosité des bandes électrophorétiques après amplification effectuée par la méthode améliorée dans les échantillons d’eau était similaire à la luminosité de la méthode conventionnelle, et que les bandes électrophorétiques après amplification effectuée par la méthode améliorée dans les échantillons de tissus étaient plus brillantes (Figure 4).
Figure 1 : Résultats de l’électrophorèse de l’ADN extrait selon le protocole après amplification par PCR. Au total, 2 μL d’extrait d’ADN ont été utilisés comme matrice d’ADN pour l’amplification spécifique à la PCR. Les produits d’amplification PCR ont été électrophorisés sur 1 solution tampon TAE à travers un gel d’agarose à 2 % et ont fonctionné à une tension constante de 100 V pendant 25 à 30 minutes. Une échelle d’ADN D2000 a été utilisée pour tous les gels. (A) Les résultats de l’électrophorèse de l’ADN des diatomées dans les échantillons d’eau après amplification par PCR, la voie 1 est un contrôle à blanc ; Les voies 2 à 7 sont des échantillons d’eau prélevés à différents endroits dans la même zone. (B) Les résultats de l’électrophorèse après amplification par PCR de l’ADN des diatomées dans le tissu. Les voies 1 à 6 sont les tissus excisés à différentes positions du même tissu pulmonaire ; La voie 7 est le contrôle vide. (C) Dans une expérience infructueuse, après amplification de l’ADN des diatomées, les résultats de l’électrophorèse n’ont pas montré de bandes d’électrophorèse aux positions correspondantes, ce qui indique qu’il n’y avait pas de produits d’amplification ou trop peu de produits d’amplification. À ce stade, les résultats de l’électrophorèse n’ont pas pu indiquer s’il y avait de l’ADN de diatomée dans la solution d’ADN proposée, ce qui a dû être effectué par des méthodes plus sensibles (telles qu’une courbe de fusion PCR). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Courbe d’amplification de la qPCR de l’ADN des diatomées. Un total de 2 μL d’extrait de solution d’ADN qui ne présentait aucune bande par PCR conventionnelle et électrophorèse sur gel d’agarose a été utilisé comme modèle pour préparer un système de PCR quantitative par fluorescence en temps réel et mettre en place un programme. Enfin, des courbes d’amplification typiques avec quatre étapes caractéristiques de la phase de base linéaire, du début de la phase exponentielle, de la phase exponentielle et de la phase de plateau ont été obtenues. La valeur Ct de chaque courbe a également été obtenue par analyse, ce qui indique que l’extraction de l’ADN a réussi. Chaque nombre représente la valeur Ct de la courbe correspondante. Le seuil est de 5,2. L’unité de l’axe des ordonnées est Rn. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Courbe de fusion de l’ADN des diatomées. À l’aide d’un système de PCR quantitative par fluorescence en temps réel, un programme a été mis en place où la température augmente de 60 à 95 °C. Cela a généré une courbe de fusion et l’ADN double brin spécifiquement amplifié a fondu en brins simples à des températures élevées, le colorant était exempt des brins doubles et la valeur de fluorescence a diminué jusqu’à ce qu’elle soit égale à 0. Le graphe a été obtenu en prenant l’inverse négative du graphe original. L’abscisse représentait la température, l’abscisse correspondant à la valeur maximale la plus élevée était la valeur Tm, et la valeur Tm de la courbe de fusion dans le graphique était de 85,5 °C. La numérotation de chaque courbe correspond à la numérotation de chaque voie de la figure 1C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats de l’électrophorèse du procédé amélioré. (A) Résultats de l’électrophorèse pour différentes combinaisons de rapports de billes de verre et de temps d’oscillation des tourbillons. Voies 1, 4, 7, 10 et 13 où le rapport de masse mixte des grosses et petites billes de verre est de 1 :2, voies 2, 5, 8, 11 et 14 où le rapport de masse mixte des grosses et petites perles de verre est de 1 :1, voies 3, 6, 9, 12 et 15 où le rapport de masse mixte des grosses et petites perles de verre est de 2 :1, et les temps d’oscillation étaient de 2 min pour les couloirs 1 à 3, de 3 min pour les couloirs 4 à 6, de 4 min pour les couloirs 7 à 9, de 5 min pour les couloirs 10 à 12 et de 6 min pour les couloirs 13 à 15. La voie 16 est le contrôle vide. (B) Résultats de l’électrophorèse après amplification par PCR des produits d’extraction du kit avant et après amélioration. Les voies 1 à 3 sont des méthodes conventionnelles d’extraction d’échantillons d’eau, les voies 4 à 6 sont des méthodes améliorées d’extraction d’échantillons d’eau, les voies 7 à 9 sont des méthodes conventionnelles d’extraction de tissus, les voies 10 à 12 sont des méthodes améliorées d’extraction de tissus, la voie 13 est un contrôle à blanc. Les résultats ont été modifiés à partir de21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Échantillons d’eau et échantillons de tissus. Les échantillons d’eau utilisés ont été prélevés dans un étang près du laboratoire, et les échantillons de tissus utilisés ont été confirmés comme étant du tissu pulmonaire du corps noyé. (A) Le site expérimental de prélèvement d’échantillons d’eau était un étang situé près du laboratoire. (B) Échantillons d’eau enrichie et échantillons de tissus pulmonaires déchiquetés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Micrographie de la diatomée. Les images (A) et (B) ont été prises sous un microscope optique 400x. La flèche pointe vers les diatomées. Les images (C) et (D) ont été prises au microscope électronique. Les images (A) et (B) montrent les diatomées dans l’eau sur le site de la noyade. Les diatomées nommées Fragilaria et Navicula. Les images (C) et (D) montrent des diatomées dans les poumons, appelées Nitzschia et Navicula. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| Cible | Nom de l’amorce | Séquence |
| ADNr 18S | amorce forword D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| apprêt inversé D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tableau 1 : Liste des apprêts utilisés. Ce tableau décrit les séquences, les noms et les régions cibles des amorces spécifiques utilisées dans cet article.
| Système de réaction PCR | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| amorce forword D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| apprêt inversé D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| modèle ADN | 2 μL | ||
| Eau sans nucléase | jusqu’à 20 μL | ||
| Remarque : L’ADN de la matrice de contrôle vierge est remplacé par la même quantité d’eau exempte de nucléase. | |||
| Programme de PCR | |||
| température | Heure | Cycles | |
| 94 °C | 10 min (en anglais) | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min (en anglais) | ||
| 72 °C | 10 min (en anglais) | 1 | |
Tableau 2 : Composantes de la PCR. Ce tableau décrit la configuration du système de réaction pour la PCR conventionnelle et les réglages de la température, de la durée et du nombre de cycles de réaction pour la PCR. Le volume total du système de réaction utilisé était de 20 μL.
| Système de réaction PCR quantitative en temps réel | |||
| 2x mélange de qPCR | 10 μL | ||
| amorce forword D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| apprêt inversé D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| modèle ADN | 2 μL | ||
| Eau sans nucléase | jusqu’à 20 μL | ||
| Remarque : L’ADN de la matrice de contrôle vierge est remplacé par la même quantité d’eau exempte de nucléase. | |||
| Programme de PCR quantitative en temps réel | |||
| température | Heure | Cycles | |
| 94 °C | 10 min (en anglais) | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 min (en anglais) | ||
Tableau 3 : Composantes quantitatives de la PCR en temps réel. Ce tableau décrit la configuration du système de réaction pour la PCR quantitative en temps réel et les paramètres de la température, de la durée et du nombre de cycles de réaction pour la PCR. Le volume total du système de réaction utilisé était de 20 μL.
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Discussion
Les cellules de diatomées sont protégées par des parois cellulaires siliceuses dures17, et cette structure doit être détruite pour extraire l’ADN des diatomées. Les kits ordinaires ne détruisent pas facilement la coquille siliceuse des diatomées ; il est donc difficile d’extraire avec succès l’ADN21 des diatomées. Notre laboratoire a amélioré le kit d’extraction d’ADN sanguin le plus couramment utilisé, en ajoutant des billes de verre de différents diamètres et différents rapports de masse dans le processus d’extraction des diatomées. L’oscillation du vortex est effectuée en même temps, ce qui peut briser complètement la coquille de diatomée et améliorer l’effet d’extraction de l’ADN des diatomées. Comme nous l’avons montré dans le rapport précédent21, le diamètre des billes de verre, l’intensité de l’oscillation et le temps affecteraient directement la qualité de l’extraction de l’ADN. Le temps d’oscillation du vortex ne doit pas être trop long (pas plus de 10 min). Si le temps est trop long, l’ADN se brisera en raison de vibrations excessives. En même temps, le temps ne doit pas être trop court. Si le temps est trop court (pas moins de 2 min), la coquille de diatomée ne sera pas complètement retirée, ce qui rendra l’extraction de l’ADN inefficace. Lors de la sélection des perles de verre, choisissez des perles de différents diamètres circonférentiels, les grandes billes de verre assurent la résistance à la collision, et les petites billes de verre garantissent qu’il n’y a pas de collision morte entre les billes de verre pendant le processus de fragmentation de la collision, ce qui améliore l’efficacité de la rupture de la coquille.
Pour extraire l’ADN des diatomées des échantillons, il est généralement nécessaire d’enrichir les diatomées. Ce processus aura un grand impact sur l’extraction de l’ADN des diatomées. Le but de l’enrichissement est d’augmenter la concentration de diatomées dans les échantillons afin que la concentration d’ADN de diatomées extraite puisse être détectable ; pour les applications de l’étape suivante telles que la PCR quantitative fluorescente en temps réel et le séquençage à haut débit.
Étant donné que les diatomées sont largement répandues dans la nature4, la prévention de la contamination en laboratoire est une priorité absolue28. La contamination pendant le processus d’extraction de l’ADN entraînera des écarts par rapport aux résultats réels et une perte de valeur d’usage. Par conséquent, faites toujours attention au principe de fonctionnement aseptique lors de l’extraction de l’ADN des diatomées et prenez toutes les mesures possibles pour réduire et éviter la contamination des diatomées exogènes. Lorsque le tissu est extrait du cadavre, des mesures doivent être prises pour éviter qu’il ne soit contaminé par des diatomées exogènes. Une fois le tissu extrait, il doit être conservé dans un récipient ou un sac d’échantillon exempt de contamination par les diatomées. Le tissu ne doit pas être traité avec du formaldéhyde. L’équipement d’extraction et de traitement des tissus doit être lavé 2 à 3 fois avec de l’eau distillée à plusieurs reprises, puis stérilisé à la lumière ultraviolette ou à haute température pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination des diatomées provenant d’autres sources. Le tissu avant le test doit être coupé du tissu superficiel avec un instrument sans diatomées, puis l’instrument doit être remplacé pour prélever le tissu inférieur pour l’examen. Dans le même temps, la standardisation du processus d’exploitation peut également éviter efficacement le problème de la contamination du laboratoire.
Étant donné que les diatomées sont la nourriture de nombreux organismes aquatiques, elles seront perdues lors d’un stockage à long terme29. Les diatomées peuvent également croître et se reproduire dans des conditions d’éclairage. Par conséquent, l’étape d’extraction de l’ADN doit être initiée dès que possible après l’échantillonnage et un traitement rapide de l’échantillon doit être effectué pour éviter la perte de diatomées dans l’échantillon. Si l’extraction de l’ADN ne peut pas être effectuée immédiatement, tous les échantillons doivent être congelés et conservés dans l’obscurité afin d’éviter autant que possible la réduction des diatomées.
Notre recherche a sélectionné un kit d’extraction d’ADN sanguin commun et bon marché basé sur la méthode de digestion de la protéinase K, qui a été améliorée pour extraire l’ADN des diatomées à partir d’échantillons d’eau et de tissus avec de bons résultats30. Le tissu est suffisamment coupé pour être en contact complet avec la protéinase K et le tissu est complètement digéré. Le principe possible d’une extraction réussie est le suivant : au cours de l’étape d’agitation, la coquille dure de la diatomée est heurtée à plusieurs reprises et fragmentée entre des billes de verre se déplaçant rapidement, exposant la membrane cellulaire ; la configuration de billes de verre de différentes tailles peut combler l’espace entre la collision de billes de verre de taille unique, de manière à couvrir la surface de contact de collision aussi complètement que possible ; après avoir perdu la coquille de silicium, la protéinase K aide à libérer l’ADN de la diatomée. Par rapport au kit d’extraction d’ADN du sol actuellement utilisé, le kit d’extraction d’ADN sanguin amélioré peut répondre aux exigences de l’extraction d’ADN de diatomées, qui est plus économique et plus facile à obtenir. Il facilite non seulement l’utilisation de l’inspection médico-légale des diatomées, mais peut également être utilisé pour d’autres disciplines liées à la recherche sur les diatomées et peut également être utilisé pour d’autres extractions d’ADN planctonique. Lors de l’extraction de l’ADN des diatomées à partir d’échantillons d’eau, la quantité de protéinase K utilisée doit être ajustée en fonction du nombre de plancton dans l’eau. La quantité de protéinase K peut être augmentée ou diminuée en fonction des expériences préliminaires. Lors de l’extraction de l’ADN des diatomées des tissus, différents types de tissus organiques, la contamination des tissus et d’autres facteurs affecteront la quantité de protéinase K nécessaire à la digestion. Dans l’expérience, la protéinase K contenue dans le kit doit être stockée à -20 °C après utilisation, sinon l’inactivation de la protéinase K affectera le processus d’extraction.
En conclusion, l’extraction de l’ADN des diatomées doit être effectuée dès que possible après l’échantillonnage et le traitement de l’échantillon, sinon stockée à -20 °C pour la conservation. La manipulation des échantillons, leur stockage et l’ensemble du processus d’extraction doivent être effectués avec soin pour éviter la contamination par des diatomées exogènes. Dans le cas contraire, il n’est pas possible d’évaluer si l’ADN de la diatomée extrait se trouvait dans l’échantillon ou s’il s’agissait d’une contamination exogène. Lors de l’utilisation de la protéinase K pour digérer les tissus, son dosage peut être un problème. Une digestion tissulaire insuffisante peut augmenter la quantité de protéinase K. Par conséquent, il est important de cisailler le tissu de manière adéquate. Une digestion suffisante des tissus empêche également les débris tissulaires d’obstruer la membrane plasmique à l’intérieur de la colonne d’adsorption. Une fois la membrane bloquée, il n’est pas possible d’utiliser la pointe de la pipette pour repérer le blocage ou de centrifuger à plusieurs reprises, ce qui endommagerait la membrane. La solution finale d’ADN contient de nombreuses impuretés, ce qui affectera la détection de l’ADN des diatomées. L’intensité et le temps d’oscillation sont également des questions clés. Le premier temps d’oscillation du vortex est contrôlé à 4-5 min et la fréquence d’oscillation est contrôlée à 3000 tr/min, sinon, l’extraction de l’ADN sera affectée. Si les bandes électrophorétiques ne sont pas claires après la PCR, il peut être nécessaire d’augmenter encore la quantité de matrice d’ADN. L’ADN extrait dans cette étude est un mélange d’ADN, y compris l’ADN des diatomées et l’ADN d’autres espèces, de sorte que la concentration d’ADN des diatomées ne peut pas être déterminée. Par conséquent, il n’est pas adapté aux applications nécessitant une grande pureté des matrices d’ADN.
Des études ont montré que différentes espèces de diatomées peuvent être amplifiées par différentes amorces31,32. Dans cette étude, seules les amorces spécifiques aux diatomées D512 et D978 sur l’ADNr de la diatomée 18S ont été utilisées pour tester si l’ADN des diatomées a été extrait avec succès, ce qui ne pouvait pas couvrir toutes les espèces de diatomées22,33. De plus, étant donné que la longueur du fragment de produit d’amplification de la paire d’amorces est de 390 à 410 pb, la méthode améliorée sélectionne toutes les tailles de fragments d’ADN de diatomées pour tester s’il y a un impact sur les paramètres expérimentaux, ce qui nécessite une étude plus approfondie. Des études ultérieures utiliseront également des amorces de différentes régions et de différentes longueurs d’amplification pour explorer l’effet de l’extraction.
Par rapport à la méthode traditionnelle d’extraction de l’ADN des diatomées, cette méthode présente les principaux avantages de l’extraction de l’ADN des diatomées à faible coût et à grande échelle. Il peut compléter les avantages des méthodes morphologiques des diatomées et peut répondre aux besoins de diagnostic de noyade dans les laboratoires médico-légaux primaires. Dans le même temps, il élargit également la gamme de sélection des kits d’extraction d’ADN de diatomées et présente de bonnes perspectives d’application. À l’avenir, cette méthode ne se limitera pas seulement à l’extraction de l’ADN des diatomées, mais sera également utilisée pour l’extraction de l’ADN d’autres algues.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82060341,81560304) et par le projet de recherche scientifique de la plate-forme d’innovation académicienne de la province de Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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