Summary
Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione del DNA delle diatomee utilizzando un kit di estrazione del DNA comune modificato.
Abstract
Il test delle diatomee è un mezzo ausiliario essenziale nella pratica forense per determinare se il cadavere è annegato in acqua e per dedurre il luogo dell'annegamento. Il test delle diatomee è anche un importante contenuto di ricerca nel campo dell'ambiente e del plancton. La tecnologia di analisi della biologia molecolare delle diatomee, che si concentra sul DNA delle diatomee come oggetto di ricerca primario, è un nuovo metodo di test delle diatomee. L'estrazione del DNA delle diatomee è alla base dei test molecolari delle diatomee. Attualmente, i kit comunemente usati per l'estrazione del DNA delle diatomee sono costosi, il che aumenta il costo della ricerca correlata. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit generale di estrazione rapida del DNA genomico del sangue intero e ha ottenuto un effetto soddisfacente di estrazione del DNA delle diatomee, fornendo così una soluzione alternativa economica e conveniente per l'estrazione del DNA basata su perle di vetro per la ricerca correlata. Il DNA di diatomee estratto utilizzando questo protocollo potrebbe soddisfare molte applicazioni a valle, come la PCR e il sequenziamento.
Introduction
Nella pratica forense, determinare se un cadavere trovato in acqua annegava o è stato gettato in acqua dopo la morte è essenziale per la corretta risoluzione del caso1. È anche una delle questioni difficili che devono essere risolte con urgenza nella pratica forense2. Le diatomee sono abbondanti nell'ambiente naturale (soprattutto nell'acqua)3,4. Nel processo di annegamento, a causa dell'ipossia e della risposta allo stress, le persone avranno intensi movimenti respiratori e inaleranno una grande quantità di liquido di annegamento. Pertanto, le diatomee nell'acqua entrano nel polmone con il liquido di annegamento e alcune diatomee possono entrare nella circolazione sanguigna attraverso la barriera alveolare-capillare e diffondersi agli organi interni con il flusso sanguigno 5,6. Il rilevamento di diatomee nei tessuti interni e negli organi come il polmone, il fegato e il midollo osseo è una forte evidenza di annegamento prima della morte 7,8. Attualmente, l'analisi forense delle diatomee si basa principalmente su metodi di analisi morfologici. Dopo una serie di pre-digestioni del tessuto, vengono effettuate al microscopio le stime morfologiche qualitative e quantitative delle diatomee non digerite. Durante questo periodo, è necessario utilizzare reagenti pericolosi e dannosi per l'ambiente come l'acido nitrico. Questo processo richiede molto tempo e richiede ai ricercatori una solida competenza tassonomica e una vasta esperienza. Tutto ciò comporta alcune sfide per il personale forense9. La tecnologia di test del DNA delle diatomee è una nuova tecnologia per il test delle diatomee sviluppata negli ultimi anni 10,11,12. Questa tecnologia realizza l'identificazione delle specie delle diatomee analizzando la composizione specifica della sequenza di DNA delle diatomee13,14. La tecnologia PCR e la tecnologia di sequenziamento sono metodi tecnici comunemente usati, ma la loro base è l'estrazione di successo del DNA dalle diatomee. Tuttavia, le diatomee hanno una struttura speciale diversa da quella di altri organismi, rendendo diverse anche le loro tecniche di estrazione del DNA.
La parete cellulare della diatomea ha un alto grado di silicizzazione e il suo componente principale è il biossido di silicio 15,16,17. La parete cellulare silicea è molto dura e deve essere distrutta prima di estrarre il DNA. I normali kit di estrazione del DNA sono spesso difficili da utilizzare direttamente per l'estrazione del DNA delle diatomee perché non possono distruggere il guscio siliceo delle diatomee18. Pertanto, la distruzione del guscio siliceo delle diatomee è uno dei principali problemi tecnici da risolvere nell'estrazione del DNA delle diatomee.
Allo stesso tempo, poiché il numero di diatomee contenute nei campioni di ricerca forense, che si tratti di campioni d'acqua o di organi e tessuti di corpi annegati, è spesso limitato, è necessario arricchire le diatomee. L'essenza dell'arricchimento è la separazione delle sostanze. Mentre si cerca di raccogliere le diatomee, ridurre al minimo il contenuto di altri componenti materiali (componenti interferenti). Nel lavoro forense, i laboratori utilizzano spesso metodi di arricchimento della centrifugazione o della filtrazione a membrana per separare le cellule delle diatomee19. Tuttavia, poiché le apparecchiature di pompaggio del vuoto non sono ampiamente utilizzate, il metodo di arricchimento della membrana non viene spesso utilizzato nei normali laboratori forensi primari. Quindi, il metodo di centrifugazione è ancora comunemente l'arricchimento di diatomee nei laboratori forensi20.
L'estrazione del DNA dalle diatomee è attualmente utilizzata principalmente nella pratica forense e ci sono limitazioni significative alla sua applicazione. Attualmente, ci sono pochi kit di estrazione del DNA di diatomee utilizzati nella scienza forense sul mercato e sono generalmente costosi21. Questo articolo fornisce un metodo di estrazione del DNA delle diatomee migliorato, rendendo l'estrazione del DNA delle diatomee semplice, conveniente ed economica. Ciò aumenta l'applicazione dei successivi test di biologia molecolare delle diatomee e può risolvere meglio i problemi legati all'annegamento in medicina legale attraverso il test delle diatomee. Questo metodo rompe le pareti cellulari silicee delle diatomee aggiungendo perle di vetro e impostando un tempo appropriato per il vortice. In questo modo, la proteinasi K e la soluzione di legame lisano rapidamente le cellule e inattivano vari enzimi nelle cellule. Il DNA genomico viene assorbito nella membrana della matrice nella colonna di adsorbimento e infine eluito dal tampone di eluizione. Un kit di estrazione genica del sangue intero così migliorato migliora l'effetto di estrazione del DNA delle diatomee del kit di sangue nei materiali di esame forense, riduce il costo dell'estrazione del DNA delle diatomee nella pratica forense e può essere applicato meglio alla ricerca forense di base.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Hainan. I campioni di tessuto utilizzati in questo studio non sono considerati studi che coinvolgono soggetti umani. Questi campioni sono stati ottenuti ai fini della diagnosi patologica forense e il resto è stato utilizzato per l'estrazione del DNA delle diatomee in questo esperimento. I ricercatori non sono in grado di identificare prontamente gli individui per ottenere il consenso informato dalle parti interessate.
NOTA: Per garantire l'applicabilità generale del metodo di ricerca riportato in questo esperimento, questo esperimento ha sostanzialmente seguito le istruzioni operative del kit utilizzato, e solo alcuni passaggi sono stati modificati. I campioni d'acqua utilizzati in questo esperimento sono stati prelevati in modo casuale da stagni vicino al laboratorio (Figura supplementare 1A). In questo esperimento, il tessuto polmonare del corpo annegato è stato confermato come il tessuto di ricerca per dimostrare il protocollo di estrazione (Figura supplementare 1B). Nella pratica forense, a volte è anche necessario utilizzare altri organi e tessuti di corpi annegati (come fegato, milza, rene, midollo osseo, ecc.) per estrarre il DNA delle diatomee, il che richiede piccoli miglioramenti corrispondenti a questo metodo sperimentale, che saranno spiegati nella sezione corrispondente dell'esperimento. I campioni di tessuto polmonare utilizzati in questo esperimento provenivano da cadaveri che erano stati chiaramente annegati in casi forensi. Sono stati condotti test morfologici per dimostrare che il tessuto polmonare contiene diatomee (Figura 2 supplementare).
1. Pretrattamento dei campioni
- Pretrattamento dei campioni d'acqua
- Prelevare 10 ml di campione d'acqua nella provetta da centrifuga e centrifugare a 13.400 x g per 5 minuti. Scartare con cautela 9,8 mL di surnatante con una pistola a pipetta e trasferire circa 200 μL di campione di acqua di diatomee arricchita rimasto sul fondo in una provetta da centrifuga da 2 mL.
NOTA: Il pre-esperimento può essere eseguito prima e la quantità iniziale può essere aumentata se un campione di acqua da 10 ml non è sufficiente per l'arricchimento.
- Prelevare 10 ml di campione d'acqua nella provetta da centrifuga e centrifugare a 13.400 x g per 5 minuti. Scartare con cautela 9,8 mL di surnatante con una pistola a pipetta e trasferire circa 200 μL di campione di acqua di diatomee arricchita rimasto sul fondo in una provetta da centrifuga da 2 mL.
- Pretrattamento di campioni di tessuto
- Prelevare 0,5 g di tessuto del margine polmonare dal corpo annegato, tritare o macinare completamente il tessuto polmonare fino a quando non diventa fangoso. Prevenire la contaminazione delle diatomee esogene è il fulcro di questa fase. Taglia ripetutamente il tessuto a pezzi usando le forbici.
2. Estrazione del DNA
NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione vengono completate a temperatura ambiente. Utilizzando una centrifuga da tavolo con una forza centrifuga di 14.500 x g; prima dell'inizio dell'esperimento è necessario preparare un bagno d'acqua (o un bagno metallico) preriscaldato a 70 °C. Tutte le fasi devono seguire rigorosamente i principi del funzionamento asettico.
- Assemblaggio di campioni d'acqua e tessuti
NOTA: Il campione d'acqua e il metodo di estrazione del DNA delle diatomee tissutali sono gli stessi.- Aggiungere le perle di vetro a una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il campione di acqua pretrattata. Invertire 10x-15x per mescolare bene. Le perle di vetro aggiunte sono composte da perle di vetro grandi e piccole mescolate in un rapporto di massa di 1:1. Il diametro delle perle di vetro grandi è di 1,5-2,0 mm e quello delle perle di vetro piccole è di 0,4-0,6 mm.
- Prelevare 0,5 g di tessuto tritato finemente, aggiungere le perle di vetro in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il tessuto come descritto sopra. Invertire 10x-15x per mescolare.
- Aggiungere 40 μL di proteinasi K (20 mg/mL) alle provette. Mettere a temperatura ambiente per 15 minuti, durante questo periodo, capovolgere e mescolare 10 volte ogni 3 minuti.
NOTA: Se il tessuto non è completamente digerito, la quantità di proteinasi K può essere opportunamente aumentata fino a quando la soluzione non diventa limpida. - Aggiungere 200 μL di tampone di legame alle provette da centrifuga, vorticare immediatamente e mescolare per 4 minuti (frequenza di miscelazione dell'oscillazione: 3000 giri/min).
NOTA: In questa fase, l'intensità e il tempo di agitazione devono essere rigorosamente controllati per garantire un'intensità e un tempo di miscelazione sufficienti. - Mettere le provette da centrifuga a bagnomaria a 70 °C per 10 minuti e la soluzione diventa limpida.
- Aggiungere 100 μL di isopropanolo alle provette da centrifuga, vorticare e mescolare per 15 s, in questo momento potrebbe apparire una precipitazione flocculante.
NOTA: È molto importante mescolare bene con la forza appropriata nelle fasi operative di cui sopra, ma l'agitazione vigorosa dovrebbe essere evitata per prevenire il taglio del DNA. - Mettere la soluzione ottenuta nella fase precedente insieme al precipitato flocculante nella colonna di adsorbimento (la colonna di adsorbimento è posta nella provetta di raccolta). La lunghezza della colonna di adsorbimento è di 3,0 cm, il diametro è di 1,0 cm e la matrice di adsorbimento è una membrana a matrice di silicio.
- Centrifugare a 8.000 x g per 30 s, scartare il liquido di scarto nella provetta di raccolta e reinserire la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta.
- Aggiungere 500 μL di tampone per la rimozione dell'inibitore alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
- Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
NOTA: Aggiungere la quantità specificata di etanolo assoluto al flacone tampone di lavaggio prima del primo utilizzo. - Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
- Rimettere la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta vuota. Centrifugare a 14.500 x g per 2 minuti e rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio, per evitare che l'etanolo residuo nel tampone di lavaggio inibisca le reazioni a valle.
- Estrarre la colonna di adsorbimento e inserirla in una provetta da centrifuga pulita. Aggiungere 100 μL di tampone di eluizione alla parte centrale della membrana di adsorbimento.
- Posizionare la colonna di adsorbimento a temperatura ambiente per 3-5 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto.
- Aggiungere nuovamente la soluzione ottenuta nel passaggio precedente alla colonna di adsorbimento centrifugo. Posizionare la colonna di adsorbimento centrifugo a temperatura ambiente per 2 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto.
NOTA: Il tampone di eluizione deve essere preriscaldato a bagnomaria a 70 °C per circa 10 minuti. Il volume di eluizione non deve essere inferiore a 50 μL; in caso contrario, la resa del DNA sarà ridotta. - Conservare il DNA di diatomee estratto a 2-8 °C per un uso futuro. Se la soluzione di DNA deve essere conservata per lungo tempo, conservarla a -20 °C.
3. Test PCR
NOTA: Poiché il contenuto di diatomee nei campioni forensi è spesso basso, gli estratti di campioni di tessuto dei corpi annegati possono anche contenere vari gradi di tessuto e organi (come i polmoni in questo esperimento) con il proprio DNA. Pertanto, il rilevamento diretto del DNA totale negli estratti di DNA non riflette la situazione dell'estrazione del DNA delle diatomee. In questo esperimento, sono stati selezionati primer specifici per le diatomee e sono stati utilizzati prodotti PCR per valutare l'estrazione del DNA delle diatomee nell'estratto. I prodotti possono essere osservati e analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio e possono anche essere analizzati mediante curva di fusione PCR quantitativa fluorescente in tempo reale, che ha una maggiore sensibilità.
- Aggiungere 2 μL di DNA estratto da campioni d'acqua e tessuti come stampo. Scegliere uno dei due metodi seguenti per l'ispezione.
- Test PCR convenzionale
- Utilizzare primer22 in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S. Per i dettagli, vedere la Tabella 1.
- Stabilire il sistema di reazione PCR e le condizioni di amplificazione in base alle caratteristiche dei primer. Per i dettagli, vedere la tabella 2.
- Eseguire i prodotti di amplificazione PCR su gel di agarosio al 2%. Osservare e analizzare l'imaging con un gel imager.
- Test PCR quantitativo fluorescente
- Utilizzare i primer di cui sopra in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S per preparare un sistema di reazione di PCR quantitativa fluorescente in tempo reale. Per i dettagli, vedere la tabella 3.
- Eseguire l'amplificazione PCR e analizzare la curva di amplificazione ottenuta e i valori di Ct. Allo stesso tempo, impostare un programma, fondere gradualmente i doppi filamenti dei prodotti amplificati in singoli filamenti attraverso la tecnologia della curva di fusione PCR quantitativa fluorescente, quindi analizzare le curve di fusione ottenute.
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Representative Results
Poiché la soluzione di DNA estratta con il metodo di estrazione del DNA attualmente utilizzato contiene tutti i componenti del DNA provenienti da diverse fonti nel campione, il DNA ottenuto con questo protocollo non ha fatto eccezione. Quindi, la soluzione del DNA non era solo una soluzione del DNA genomico delle diatomee. I primer in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S sono stati selezionati consultando la letteratura 22,23,24. I primer sono stati verificati da NCBI-Blast Primer e i risultati hanno mostrato che il primer diretto D512 e il primer inverso D978 dell'rDNA 18S erano primer specifici per le alghe e coprivano molte specie di diatomee. I risultati dell'amplificazione non hanno mostrato alcun gene umano. Sono stati utilizzati un biomarcatore di DNA affidabile per il test delle diatomee, quindi sono stati selezionati per la verifica dei risultati di questo esperimento. Utilizzando il DNA estratto come modello per l'amplificazione PCR diatomee-specifica, il prodotto di amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio ha mostrato che i campioni d'acqua e i tessuti avevano bande di DNA di diatomee, queste bande di elettroforesi erano comprese tra 250-500 bp (più vicino a 500 bp), in linea con la dimensione della lunghezza del prodotto di amplificazione del bersaglio del primer (390-410 bp). Ciò ha dimostrato che il protocollo di estrazione ha avuto successo nell'estrazione del DNA delle diatomee (Figura 1A,B).
La tecnologia di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale è un tipo di tecnologia di test genico con una specificità rigorosa e un'elevata sensibilità. Aggiungendo gruppi fluorescenti nel sistema di reazione PCR, l'accumulo di segnali fluorescenti può far sì che l'intero processo PCR venga monitorato in tempo reale e la sensibilità è elevata25,26. I prodotti specificamente amplificati dalla PCR convenzionale possono talvolta essere difficili da osservare nell'elettroforesi su gel di agarosio a causa del basso contenuto e per altri motivi27 (Figura 1C). Attraverso l'amplificazione specifica della PCR quantitativa fluorescente in tempo reale, è stata ottenuta una tipica curva di amplificazione con quattro stadi caratteristici (Figura 2). Allo stesso tempo, attraverso la tecnologia della curva di fusione della PCR quantitativa fluorescente in tempo reale, i doppi filamenti di DNA del prodotto amplificato sono stati fusi in singoli filamenti ad alta temperatura, il colorante è stato liberato dai doppi filamenti e il valore di fluorescenza è diminuito. Rilevando la variazione del valore di fluorescenza, è stata ottenuta la curva di fusione (Figura 3). Le curve di fusione ottenute avevano picchi caratteristici e il valore di picco era di circa 85,5 °C, il che dimostrava che c'era un'amplificazione specifica del DNA bersaglio, indicando che c'era DNA di diatomee nella soluzione di DNA estratto. Il colorante potrebbe anche essere aggiunto direttamente al prodotto di amplificazione PCR convenzionale e la curva di fusione potrebbe essere ottenuta mediante la tecnologia della curva di fusione PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale per dimostrare se c'era un'amplificazione specifica. Pertanto, quando l'elettroforesi convenzionale su gel di agarosio PCR non è stata in grado di dimostrare la presenza di DNA di diatomee nella soluzione di DNA estratto, è stato possibile selezionare la tecnologia di PCR quantitativa fluorescente in tempo reale con una maggiore sensibilità per la verifica e la valutazione. In questo esperimento, la tecnologia della curva di fusione della PCR quantitativa fluorescente in tempo reale è stata utilizzata solo per l'analisi qualitativa.
Come mostrato in un precedente rapporto21, il tradizionale kit per l'estrazione del DNA nel suolo e il kit per l'estrazione del DNA nel sangue modificato erano fondamentalmente gli stessi per l'estrazione del DNA delle diatomee da campioni d'acqua e tessuti. La differenza di costo dell'estrazione del DNA di diatomee era principalmente la differenza di prezzo dei due kit e il costo di altri materiali di consumo era fondamentalmente lo stesso. In questo studio, un semplice miglioramento del kit di estrazione del DNA del sangue comunemente utilizzato negli esperimenti di biologia molecolare potrebbe ottenere risultati sperimentali migliori, che non solo hanno aumentato la possibilità per i ricercatori di selezionare il kit di test nelle attività di ricerca relative all'estrazione del DNA delle diatomee, ma hanno anche ridotto il costo dei test.
Il processo di miglioramento di questo protocollo è stato pubblicato21. Progettando la combinazione di diversi rapporti di massa delle perle di vetro e del tempo di oscillazione del vortice, le condizioni ottimali di estrazione del DNA dell'oscillazione delle perle di vetro sono state aggiunte al kit convenzionale, quindi il metodo potrebbe migliorare l'effetto di estrazione del DNA di diatomee nei campioni forensi, in particolare nei campioni di tessuto. La combinazione ottimale di estrazione del DNA è stata ottenuta quando la frequenza di oscillazione del vortice era di 3000 giri/min; Il tempo di oscillazione del vortice è stato di 4 minuti, il rapporto di massa delle grandi perle di vetro con diametro di 1,5-2,0 mm e delle piccole perle di vetro con diametro di 0,4-0,6 mm è stato di 1:1. È stato eseguito un confronto tra il metodo convenzionale del kit e il metodo migliorato. È stato dimostrato che il kit utilizzato poteva soddisfare le esigenze di amplificazione del DNA delle diatomee e che la luminosità delle bande elettroforetiche dopo l'amplificazione eseguita con il metodo migliorato nei campioni d'acqua era simile alla luminosità del metodo convenzionale e le bande elettroforetiche dopo l'amplificazione eseguita con il metodo migliorato nei campioni di tessuto erano più luminose (Figura 4).
Figura 1: Risultati dell'elettroforesi del DNA estratto utilizzando il protocollo dopo l'amplificazione PCR. Un totale di 2 μL di estratto di DNA è stato utilizzato come stampo di DNA per l'amplificazione specifica della PCR. I prodotti di amplificazione PCR sono stati elettroforesi su una soluzione tampone TAE 1x attraverso gel di agarosio al 2% e hanno funzionato a una tensione costante di 100 V per 25-30 minuti. Per tutti i gel è stata utilizzata una scala di DNA D2000. (A) I risultati dell'elettroforesi del DNA delle diatomee in campioni d'acqua dopo l'amplificazione PCR, la corsia 1 è il controllo in bianco; Le corsie 2-7 sono campioni d'acqua provenienti da diverse località della stessa area. (B) I risultati dell'elettroforesi dopo amplificazione PCR del DNA delle diatomee nel tessuto. Le corsie 1-6 sono i tessuti asportati da diverse posizioni dello stesso tessuto polmonare; La corsia 7 è il controllo vuoto. (C) In un esperimento fallito, dopo l'amplificazione del DNA delle diatomee, i risultati dell'elettroforesi non hanno mostrato bande di elettroforesi nelle posizioni corrispondenti, indicando che non c'erano prodotti di amplificazione o troppo pochi prodotti di amplificazione. A quel tempo, i risultati dell'elettroforesi non potevano indicare se ci fosse DNA di diatomee nella soluzione di DNA proposta, che doveva essere eseguita con metodi più sensibili (come una curva di fusione PCR). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Curva di amplificazione qPCR del DNA delle diatomee. Un totale di 2 μL di estratto di soluzione di DNA che non ha mostrato bande mediante PCR convenzionale ed elettroforesi su gel di agarosio è stato utilizzato come modello per preparare un sistema di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale e impostare un programma. Infine, sono state ottenute curve di amplificazione tipiche con quattro stadi caratteristici di fase lineare di base, l'inizio della fase esponenziale, la fase esponenziale e la fase di plateau. Il valore Ct di ciascuna curva è stato ottenuto anche attraverso l'analisi, indicando che l'estrazione del DNA ha avuto successo. Ogni numero rappresenta il valore Ct della curva corrispondente. La soglia è 5,2. L'unità dell'asse y è Rn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Curva di fusione del DNA delle diatomee. Utilizzando un sistema di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale, è stato impostato un programma in cui la temperatura aumenta da 60 a 95 °C. Questo ha generato una curva di fusione e il DNA a doppio filamento specificamente amplificato si è fuso in singoli filamenti ad alte temperature, il colorante era libero dai doppi filamenti e il valore di fluorescenza è diminuito fino a raggiungere lo 0. Il grafico è stato ottenuto prendendo il reciproco negativo del grafico originale. L'ascissa rappresentava la temperatura, l'ascissa corrispondente al valore di picco più alto era il valore Tm e il valore Tm della curva di fusione nel grafico era 85,5 °C. La numerazione di ciascuna curva corrisponde alla numerazione di ciascuna corsia nella Figura 1C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati dell'elettroforesi del processo migliorato. (A) Risultati dell'elettroforesi per diverse combinazioni di rapporti di microsfere di vetro e tempi di oscillazione del vortice. Corsia 1, 4, 7, 10 e 13 in cui il rapporto di massa mista di perle di vetro grandi e piccole è 1:2, corsie 2, 5, 8, 11 e 14 in cui il rapporto di massa mista di perle di vetro grandi e piccole è 1:1, corsie 3, 6, 9, 12 e 15 in cui il rapporto di massa mista di perle di vetro grandi e piccole è 2:1, e i tempi di oscillazione erano di 2 minuti per le corsie 1-3, 3 minuti per le corsie 4-6, 4 minuti per le corsie 7-9, 5 minuti per le corsie 10-12 e 6 minuti per le corsie 13-15. La corsia 16 è il controllo vuoto. (B) Risultati dell'elettroforesi dopo l'amplificazione PCR dei prodotti di estrazione del kit prima e dopo il miglioramento. Le corsie 1-3 sono metodi convenzionali per l'estrazione di campioni d'acqua, le corsie 4-6 sono metodi migliorati per l'estrazione di campioni d'acqua, le corsie 7-9 sono metodi convenzionali per l'estrazione dei tessuti, le corsie 10-12 sono metodi migliorati per l'estrazione dei tessuti, la corsia 13 è un controllo in bianco. I risultati sono stati modificati rispetto a21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Campioni d'acqua e campioni di tessuto. I campioni d'acqua utilizzati sono stati prelevati da uno stagno vicino al laboratorio e i campioni di tessuto utilizzati sono stati confermati come tessuto polmonare del corpo annegato. (A) Il sito sperimentale di raccolta dei campioni d'acqua era uno stagno vicino al laboratorio. (B) Campioni di acqua arricchita e campioni di tessuto polmonare triturato. Fare clic qui per scaricare il file.
Figura supplementare 2: Micrografia della diatomee. Le immagini (A) e (B) sono state scattate al microscopio ottico 400x. La freccia indica le diatomee. Le immagini (C) e (D) sono state prese al microscopio elettronico. Le immagini (A) e (B) mostrano le diatomee nell'acqua nel sito di annegamento. Le diatomee denominate Fragilaria e Navicula. Le immagini (C) e (D) mostrano le diatomee nei polmoni, che sono chiamate Nitzschia e Navicula. Fare clic qui per scaricare il file.
| Bersaglio | Nome primer | Sequenza |
| 18S rDNA | primer per parole D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| primer inverso D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabella 1: Elenco dei primer utilizzati. Questa tabella descrive le sequenze, i nomi e le regioni di destinazione di primer specifici utilizzati in questo documento.
| Sistema di reazione PCR | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| primer per parole D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| primer inverso D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| modello di DNA | 2 μL | ||
| Acqua priva di nucleasi | fino a 20 μL | ||
| Nota: il DNA del modello di controllo in bianco viene sostituito dalla stessa quantità di acqua priva di Nucleasi. | |||
| Programma PCR | |||
| temperatura | Ore | Cicli | |
| 94 °C | 10 minuti | 1 | |
| 94 °C | 45 secondi | 40 | |
| 50 °C | 45 secondi | ||
| 72 °C | 1 minuto | ||
| 72 °C | 10 minuti | 1 | |
Tabella 2: Componenti della PCR. Questa tabella descrive la configurazione del sistema di reazione per la PCR convenzionale e le impostazioni della temperatura di reazione, del tempo e del numero di cicli per la PCR. Il volume totale del sistema di reazione utilizzato è stato di 20 μL.
| Sistema di reazione PCR quantitativa in tempo reale | |||
| 2x miscela qPCR | 10 μL | ||
| primer per parole D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| primer inverso D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| modello di DNA | 2 μL | ||
| Acqua priva di nucleasi | fino a 20 μL | ||
| Nota: il DNA del modello di controllo in bianco viene sostituito dalla stessa quantità di acqua priva di Nucleasi. | |||
| Programma di PCR quantitativa in tempo reale | |||
| temperatura | Ore | Cicli | |
| 94 °C | 10 minuti | 1 | |
| 94 °C | 45 secondi | 40 | |
| 50 °C | 45 secondi | ||
| 72 °C | 1 minuto | ||
Tabella 3: Componenti della PCR quantitativa in tempo reale. Questa tabella descrive la configurazione del sistema di reazione per la PCR quantitativa in tempo reale e le impostazioni della temperatura di reazione, del tempo e del numero di cicli per la PCR. Il volume totale del sistema di reazione utilizzato è stato di 20 μL.
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Discussion
Le cellule di diatomee sono protette da pareti cellulari silicee dure17 e questa struttura deve essere distrutta per estrarre il DNA delle diatomee. I kit ordinari non distruggono facilmente il guscio siliceo delle diatomee; quindi è difficile estrarre con successo il DNA21 delle diatomee. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit di estrazione del DNA sanguigno più comunemente usato, aggiungendo perle di vetro di diversi diametri e diversi rapporti di massa nel processo di estrazione delle diatomee. Allo stesso tempo, viene eseguita l'oscillazione del vortice, che può rompere completamente il guscio della diatomea e migliorare l'effetto di estrazione del DNA della diatomesa . Come mostrato nel precedente rapporto21, il diametro delle perle di vetro, l'intensità dell'oscillazione e il tempo influenzerebbero direttamente la qualità dell'estrazione del DNA. Il tempo di oscillazione del vortice non deve essere troppo lungo (non più di 10 min). Se il tempo è troppo lungo, il DNA si romperà a causa di vibrazioni eccessive. Allo stesso tempo, il tempo non dovrebbe essere troppo breve. Se il tempo è troppo breve (non meno di 2 minuti), il guscio della diatomea non verrà completamente rimosso, il che renderà inefficiente l'estrazione del DNA. Mentre si selezionano le perle di vetro scegliendo perline con diversi diametri circonferenziali, le grandi perle di vetro garantiscono la resistenza alla collisione e le piccole perle di vetro assicurano che non vi sia collisione morta tra le perle di vetro durante il processo di frammentazione della collisione, il che migliora l'efficienza della rottura del guscio.
Per estrarre il DNA delle diatomee dai campioni, è generalmente necessario arricchire le diatomee. Questo processo avrà un grande impatto sull'estrazione del DNA delle diatomee. Lo scopo dell'arricchimento è quello di aumentare la concentrazione di diatomee nei campioni in modo che la concentrazione di DNA di diatomee estratto possa essere rilevabile; per le applicazioni successive come la PCR quantitativa fluorescente in tempo reale e il sequenziamento ad alto rendimento.
Poiché le diatomee sono ampiamente distribuite in natura4, prevenire la contaminazione del laboratorio è una priorità assoluta28. La contaminazione durante il processo di estrazione del DNA porterà a deviazioni dai risultati effettivi e alla perdita di valore d'uso. Pertanto, prestare sempre attenzione al principio del funzionamento asettico durante l'estrazione del DNA delle diatomee e adottare tutte le misure possibili per ridurre ed evitare la contaminazione delle diatomee esogene. Quando il tessuto viene estratto dal corpo morto, devono essere prese misure per evitare che venga contaminato da diatomee esogene. Dopo che il tessuto è stato estratto, deve essere conservato in un contenitore o in una sacca per campioni priva di contaminazione da diatomee. Il tessuto non deve essere trattato con formaldeide. L'attrezzatura per l'estrazione e la lavorazione dei tessuti deve essere lavata ripetutamente 2-3 volte con acqua distillata, quindi sterilizzata con luce ultravioletta o ad alta temperatura per garantire che non vi sia contaminazione di diatomee da altre fonti. Il tessuto prima del test deve essere tagliato dal tessuto superficiale con uno strumento privo di diatomee, quindi lo strumento deve essere sostituito per prelevare il tessuto inferiore per l'esame. Allo stesso tempo, la standardizzazione del processo operativo può anche evitare efficacemente il problema della contaminazione del laboratorio.
Poiché le diatomee sono il cibo di molti organismi acquatici, andranno perse durante la conservazione a lungo termine29. Le diatomee possono anche crescere e riprodursi in condizioni di luce. Pertanto, la fase di estrazione del DNA deve essere avviata il prima possibile dopo il campionamento e deve essere eseguita una rapida elaborazione del campione per prevenire la perdita di diatomee nel campione. Se l'estrazione del DNA non può essere effettuata immediatamente, tutti i campioni devono essere congelati e conservati al buio per evitare il più possibile la riduzione delle diatomee.
La nostra ricerca ha selezionato un kit comune ed economico per l'estrazione del DNA del sangue basato sul metodo di digestione della proteinasi K, che è stato migliorato per estrarre il DNA delle diatomee da campioni d'acqua e tessuti con buoni risultati30. Il tessuto è sufficientemente tagliato per essere a pieno contatto con la proteinasi K e il tessuto viene completamente digerito. Il possibile principio di successo dell'estrazione è il seguente: durante la fase di agitazione, il guscio duro della diatomea viene ripetutamente colpito e frammentato tra le perle di vetro in rapido movimento, esponendo la membrana cellulare; la configurazione di perle di vetro di diverse dimensioni può colmare lo spazio tra la collisione di perle di vetro di dimensioni singole, in modo da coprire il più completamente possibile la superficie di contatto della collisione; dopo aver perso il guscio di silicio, la proteinasi K aiuta a liberare il DNA dalla diatomea. Rispetto al kit di estrazione del DNA del suolo attualmente utilizzato, il kit di estrazione del DNA del sangue migliorato può soddisfare i requisiti dell'estrazione del DNA delle diatomee, che è più economica e più facile da ottenere. Non solo facilita l'uso dell'ispezione forense delle diatomee, ma è adatto per l'applicazione ad altre discipline legate alla ricerca sulle diatomee e può essere utilizzato anche per l'estrazione di altri DNA di plancton. Quando si estrae il DNA di diatomee da campioni d'acqua, la quantità di proteinasi K utilizzata deve essere regolata in base al numero di plancton nell'acqua. La quantità di proteinasi K può essere aumentata o diminuita in base a esperimenti preliminari. Quando si estrae il DNA delle diatomee dai tessuti, i diversi tipi di tessuto degli organi, la contaminazione dei tessuti e altri fattori influenzeranno la quantità di proteinasi K necessaria per la digestione. Nell'esperimento, la proteinasi K nel kit deve essere conservata a -20 °C dopo l'uso, altrimenti l'inattivazione della proteinasi K influenzerà il processo di estrazione.
In conclusione, l'estrazione del DNA di diatomee deve essere eseguita il prima possibile dopo il campionamento e l'elaborazione del campione, altrimenti conservato a -20 °C per la conservazione. La manipolazione dei campioni, la conservazione e l'intero processo di estrazione devono essere eseguiti con attenzione per evitare la contaminazione da diatomee esogene. In caso contrario, non è possibile valutare che il DNA di diatomee estratto fosse nel campione o che vi fosse una contaminazione esogena. Quando si utilizza la proteinasi K per digerire i tessuti, il suo dosaggio può essere un problema. Una digestione tissutale insufficiente può aumentare la quantità di proteinasi K. Pertanto, è importante tranciare adeguatamente il tessuto. Una digestione sufficiente del tessuto impedisce inoltre ai detriti tissutali di ostruire la membrana plasmatica all'interno della colonna di adsorbimento. Dopo che la membrana è stata bloccata, non è possibile utilizzare il puntale della pipetta per individuare l'ostruzione o centrifugare ripetutamente, danneggiando la membrana. La soluzione finale di DNA contiene molte impurità, che influenzeranno il rilevamento del DNA delle diatomee. Anche l'intensità e il tempo dell'oscillazione sono questioni chiave. Il primo tempo di oscillazione del vortice è controllato a 4-5 minuti e la frequenza di oscillazione è controllata a 3000 giri/min, altrimenti l'estrazione del DNA ne risentirà. Se le bande elettroforetiche non sono chiare dopo la PCR, potrebbe essere necessario aumentare ulteriormente la quantità di stampo di DNA. Il DNA estratto in questo studio è una miscela di DNA, tra cui DNA di diatomee e DNA di altre specie, quindi la concentrazione di DNA di diatomee non può essere determinata. Pertanto, non è adatto per applicazioni che richiedono un'elevata purezza dei modelli di DNA.
Gli studi hanno dimostrato che diverse specie di diatomee possono essere amplificate da diversi primer31,32. In questo studio, solo i primer specifici per le diatomee D512 e D978 sull'rDNA della diatomea 18S sono stati utilizzati per verificare se il DNA della diatomea è stato estratto con successo, il che non poteva coprire tutte le specie di diatomee22,33. Inoltre, poiché la lunghezza del frammento del prodotto di amplificazione della coppia di primer è di 390-410 bp, il metodo migliorato seleziona tutte le dimensioni dei frammenti di DNA di diatomee per verificare se vi è un impatto sui parametri sperimentali, che necessita di ulteriori studi. Gli studi successivi utilizzeranno anche primer di diverse regioni e diverse lunghezze di amplificazione per esplorare l'effetto dell'estrazione.
Rispetto al tradizionale metodo di estrazione del DNA delle diatomee, questo metodo presenta i principali vantaggi dell'estrazione del DNA delle diatomee a basso costo e su larga scala. Può integrare i vantaggi dei metodi morfologici delle diatomee e può soddisfare le esigenze di diagnosi dell'annegamento nei laboratori forensi primari. Allo stesso tempo, amplia anche la gamma di selezione dei kit di estrazione del DNA delle diatomee e ha una buona prospettiva di applicazione. In futuro, questo metodo non si limiterà solo all'estrazione del DNA delle diatomee, ma sarà utilizzato per l'estrazione del DNA da altre alghe.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) e dall'Academician Innovation Platform Scientific Research Project della provincia di Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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