Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor diatomeeën-DNA-extractie met behulp van een aangepaste gemeenschappelijke DNA-extractiekit.
Abstract
Diatomeeënonderzoek is een essentieel hulpmiddel in de forensische praktijk om te bepalen of het lijk in water is verdronken en om de verdrinkingslocatie af te leiden. Diatomeeëntesten is ook een belangrijke onderzoeksinhoud op het gebied van milieu en plankton. De diatomeeën moleculair biologische testtechnologie, die zich richt op diatomeeën-DNA als primair onderzoeksobject, is een nieuwe methode voor het testen van diatomeeën. Diatomeeën-DNA-extractie is de basis van moleculair testen van diatomeeën. Op dit moment zijn de kits die vaak worden gebruikt voor diatomeeën-DNA-extractie duur, wat de kosten van het uitvoeren van gerelateerd onderzoek verhoogt. Ons laboratorium verbeterde de algemene volbloed genomische DNA-snelextractiekit en verkreeg een bevredigend diatomeeën-DNA-extractie-effect, waardoor een alternatieve economische en betaalbare DNA-extractieoplossing wordt geboden op basis van glasparels voor gerelateerd onderzoek. Het diatomeeën-DNA dat met behulp van dit protocol wordt geëxtraheerd, zou kunnen voldoen aan veel stroomafwaartse toepassingen, zoals PCR en sequencing.
Introduction
In de forensische praktijk is het essentieel voor de goede afwikkeling vande zaak om vast te stellen of een lijk dat in het water is gevonden, te verdrinken of na de dood in het water is gegooid. Het is ook een van de moeilijke kwesties die dringend moeten worden opgelost in de forensische praktijk2. Diatomeeën zijn overvloedig aanwezig in de natuurlijke omgeving (vooral in water)3,4. Tijdens het verdrinkingsproces, als gevolg van hypoxie en stressreactie, zullen mensen intense ademhalingsbewegingen hebben en een grote hoeveelheid verdrinkingsvloeistof inademen. Daarom komen de diatomeeën in het water de longen binnen met de verdrinkingsvloeistof, en sommige diatomeeën kunnen via de alveolair-capillaire barrière in de bloedcirculatie terechtkomen en zich verspreiden naar inwendige organen met de bloedstroom 5,6. De detectie van diatomeeën in inwendige weefsels en organen zoals longen, lever en beenmerg is een sterk bewijs van verdrinking voor de dood 7,8. Momenteel is forensisch diatomeeënonderzoek voornamelijk gebaseerd op morfologische testmethoden. Na een reeks voorvertering van het weefsel worden de morfologische kwalitatieve en kwantitatieve schattingen van onverteerde diatomeeën onder de microscoop uitgevoerd. Gedurende deze periode moeten gevaarlijke en milieuonvriendelijke reagentia zoals salpeterzuur worden gebruikt. Dit proces is tijdrovend en vereist dat onderzoekers beschikken over solide taxonomische expertise en uitgebreide ervaring. Dit alles brengt bepaalde uitdagingen met zich mee voor het forensisch personeel9. Diatomeeën-DNA-testtechnologie is een nieuwe technologie voor diatomeeëntesten die de afgelopen jaren is ontwikkeld 10,11,12. Deze technologie realiseert de soortidentificatie van diatomeeën door de specifieke DNA-sequentiesamenstelling van diatomeeënte analyseren 13,14. PCR-technologie en sequencing-technologie zijn veelgebruikte technische methoden, maar hun basis is de succesvolle extractie van DNA uit diatomeeën. Diatomeeën hebben echter een speciale structuur die verschilt van andere organismen, waardoor hun DNA-extractietechnieken ook anders zijn.
De celwand van diatomeeën heeft een hoge mate van verkiezeling en het hoofdbestanddeel is siliciumdioxide 15,16,17. De kiezelcelwand is erg hard en moet worden vernietigd voordat het DNA wordt geëxtraheerd. Gewone DNA-extractiekits zijn vaak moeilijk direct te gebruiken voor de extractie van diatomeeën-DNA, omdat ze de kiezelhoudende schil van diatomeeën niet kunnen vernietigen18. Daarom is het vernietigen van de kiezelhoudende schil van diatomeeën een van de belangrijkste technische problemen die moeten worden opgelost bij het extraheren van diatomeeën-DNA.
Tegelijkertijd, aangezien het aantal diatomeeën in forensische onderzoeksmonsters, of het nu gaat om watermonsters of organen en weefsels van verdronken lichamen, vaak beperkt is, is het noodzakelijk om diatomeeën te verrijken. De essentie van verrijking is het scheiden van stoffen. Terwijl u diatomeeën probeert te verzamelen, minimaliseert u het gehalte aan andere materiële componenten (storende componenten). Bij forensisch werk gebruiken laboratoria vaak centrifugatie- of membraanfiltratieverrijkingsmethoden om diatomeeëncellen te scheiden19. Omdat vacuümpompapparatuur echter niet veel wordt gebruikt, wordt de membraanverrijkingsmethode niet vaak gebruikt in gewone primaire forensische laboratoria. De centrifugatiemethode is dus nog steeds gebruikelijk diatomeeënverrijking in forensische laboratoria20.
DNA-extractie uit diatomeeën wordt momenteel voornamelijk gebruikt in de forensische praktijk en er zijn aanzienlijke beperkingen aan de toepassing ervan. Op dit moment zijn er maar weinig diatomeeën-DNA-extractiekits op de markt die in de forensische wetenschap worden gebruikt en ze zijn over het algemeen duur21. Dit artikel biedt een verbeterde diatomeeën-DNA-extractiemethode, waardoor diatomeeën-DNA-extractie eenvoudig, handig en kosteneffectief wordt. Dit verhoogt de toepassing van latere moleculair-biologische tests van diatomeeën en kan problemen met betrekking tot verdrinking in de forensische geneeskunde beter oplossen door middel van diatomeeëntesten. Deze methode breekt de kiezelhoudende celwanden van diatomeeën door glasparels toe te voegen en een geschikte tijd voor vortex in te stellen. Op deze manier lyseren het proteïnase K en de bindingsoplossing de cellen snel en inactiveren ze verschillende enzymen in de cellen. Het genomische DNA wordt geabsorbeerd in het matrixmembraan in de adsorptiekolom en uiteindelijk geëlueerd door de elutiebuffer. Zo'n verbeterde volbloed genextractiekit verbetert het diatomeeën-DNA-extractie-effect van de bloedkit in forensisch onderzoeksmateriaal, verlaagt de kosten van diatomeeën-DNA-extractie in de forensische praktijk en kan beter worden toegepast op forensisch onderzoek aan de basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Hainan Medical University. De weefselmonsters die in dit onderzoek zijn gebruikt, worden niet beschouwd als studies met menselijke proefpersonen. Deze monsters werden verkregen met het oog op forensische pathologische diagnose en de rest werd gebruikt voor de extractie van diatomeeën-DNA in dit experiment. Onderzoekers kunnen niet gemakkelijk individuen identificeren om geïnformeerde toestemming van relevante belanghebbenden te verkrijgen.
OPMERKING: Om de algemene toepasbaarheid van de onderzoeksmethode die in dit experiment wordt gerapporteerd te garanderen, volgde dit experiment in principe de gebruiksaanwijzing van de gebruikte kit en werden slechts enkele stappen gewijzigd. De watermonsters die in dit experiment werden gebruikt, werden willekeurig genomen uit vijvers in de buurt van het laboratorium (aanvullende figuur 1A). In dit experiment werd het longweefsel van het verdronken lichaam bevestigd als het onderzoeksweefsel om het extractieprotocol te demonstreren (aanvullende figuur 1B). In de forensische praktijk is het soms ook nodig om andere organen en weefsels van verdronken lichamen (zoals lever, milt, nieren, beenmerg, enz.) te gebruiken om diatomeeën-DNA te extraheren, wat kleine overeenkomstige verbeteringen aan deze experimentele methode vereist, die zullen worden uitgelegd in het overeenkomstige deel van het experiment. De longweefselmonsters die in dit experiment werden gebruikt, waren afkomstig van lijken die duidelijk waren verdronken in forensische gevallen. Morfologische tests zijn uitgevoerd om aan te tonen dat het longweefsel diatomeeën bevat (aanvullende figuur 2).
1. Voorbehandeling van monsters
- Voorbehandeling van watermonsters
- Neem 10 ml watermonster in de centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 13.400 x g . Gooi 9,8 ml supernatans voorzichtig weg met een pipetpistool en breng ongeveer 200 μl verrijkt diatomeeënwatermonster dat op de bodem achterblijft over in een centrifugebuisje van 2 ml.
OPMERKING: Pre-experiment kan eerst worden uitgevoerd en de initiële hoeveelheid kan worden verhoogd als een watermonster van 10 ml niet voldoende is voor verrijking.
- Neem 10 ml watermonster in de centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 13.400 x g . Gooi 9,8 ml supernatans voorzichtig weg met een pipetpistool en breng ongeveer 200 μl verrijkt diatomeeënwatermonster dat op de bodem achterblijft over in een centrifugebuisje van 2 ml.
- Voorbehandeling van weefselmonsters
- Neem 0,5 g van het longrandweefsel uit het verdronken lichaam, hak of maal het longweefsel volledig totdat het modderig wordt. Het voorkomen van contaminatie van exogene diatomeeën is de kern van deze stap. Knip het weefsel herhaaldelijk in stukjes met een schaar.
2. DNA-extractie
NOTITIE: Alle centrifugeerstappen worden voltooid bij kamertemperatuur. Met behulp van een desktopcentrifuge met een middelpuntvliedende kracht van 14.500 x g; een tot 70 °C voorverwarmd waterbad (of metaalbad) moet worden voorbereid voordat het experiment begint. Alle stappen moeten strikt de principes van aseptische werking volgen.
- Assemblage van watermonsters en weefsels
OPMERKING: De DNA-extractiemethode van het watermonster en de DNA-extractiemethode van weefseldiatomeeën zijn hetzelfde.- Voeg glasparels toe aan een centrifugebuis van 2 ml met daarin het voorbehandelde watermonster. Keer 10x-15x om om goed te mengen. De toegevoegde glaskralen zijn samengesteld uit grote en kleine glaskralen gemengd in een massaverhouding van 1:1. De diameter van grote glaskralen is 1,5-2,0 mm en van de kleine glaskralen is 0,4-0,6 mm.
- Neem 0,5 g fijngehakt weefsel, voeg glasparels toe aan een centrifugebuisje van 2 ml met het weefsel zoals hierboven beschreven. Keer 10x-15x om om te mengen.
- Voeg 40 μL proteïnase K (20 mg/ml) toe aan de buisjes. Zet 15 minuten op kamertemperatuur, keer in deze periode om en meng 10x om de 3 minuten.
OPMERKING: Als het weefsel niet volledig wordt verteerd, kan de hoeveelheid proteïnase K op de juiste manier worden verhoogd totdat de oplossing helder wordt. - Voeg 200 μL bindingsbuffer toe aan de centrifugebuizen, onmiddellijk vortex, en meng gedurende 4 minuten (oscillatiemengfrequentie: 3000 tpm).
NOTITIE: In deze stap moeten de intensiteit en tijd van het schudden strikt worden gecontroleerd om voldoende mengintensiteit en -tijd te garanderen. - Leg de centrifugebuisjes gedurende 10 minuten in een waterbad van 70 °C en de oplossing wordt helder.
- Voeg 100 μL isopropanol toe aan de centrifugebuisjes, vortex en meng gedurende 15 s, op dit moment kan er vlokkige neerslag optreden.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om goed te mengen met de juiste sterkte in de bovenstaande bedieningsstappen, maar krachtig schudden moet worden vermeden om DNA-afschuiving te voorkomen. - Breng de in de vorige stap verkregen oplossing samen met het vlokkige neerslag in de adsorptiekolom (de adsorptiekolom wordt in de opvangbuis geplaatst). De lengte van de adsorptiekolom is 3,0 cm, de diameter is 1,0 cm en de adsorptiematrix is een membraan van een siliciummatrix.
- Centrifugeer gedurende 30 s bij 8.000 x g , gooi de afvalvloeistof in de opvangbuis en plaats de adsorptiekolom terug in de opvangbuis.
- Voeg 500 μL inhibitorverwijderingsbuffer toe aan de adsorptiekolom. Centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis.
- Voeg 700 μL wasbuffer toe aan de adsorptiekolom. Centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis.
NOTITIE: Voeg voor het eerste gebruik de gespecificeerde hoeveelheid absolute ethanol toe aan de wasbufferfles. - Voeg 500 μL wasbuffer toe aan de adsorptiekolom. Centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis.
- Plaats de adsorptiekolom terug in de lege opvangbuis. Centrifugeer op 14.500 x g gedurende 2 minuten en verwijder de wasbuffer zoveel mogelijk, om te voorkomen dat de resterende ethanol in de wasbuffer de stroomafwaartse reacties remt.
- Haal de adsorptiekolom eruit en plaats deze in een schone centrifugebuis. Voeg 100 μL elutiebuffer toe aan het middelste deel van het adsorptiemembraan.
- Plaats de adsorptiekolom 3-5 minuten op kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 1 minuut op 13.400 x g .
- Voeg de in de vorige stap verkregen oplossing opnieuw toe aan de centrifugale adsorptiekolom. Plaats de centrifugale adsorptiekolom gedurende 2 minuten op kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 1 minuut op 13.400 x g .
OPMERKING: De elutiebuffer moet ongeveer 10 minuten worden voorverwarmd in een waterbad van 70 °C. Het elutievolume mag niet minder zijn dan 50 μL; anders wordt de DNA-opbrengst verminderd. - Bewaar het geëxtraheerde diatomeeën-DNA bij 2-8 °C voor toekomstig gebruik. Als de DNA-oplossing lange tijd moet worden bewaard, bewaar deze dan bij -20 °C.
3. PCR-test
OPMERKING: Aangezien het gehalte aan diatomeeën in forensische monsters vaak laag is, kunnen de weefselmonsterextracten van de verdronken lichamen ook verschillende gradaties van weefsel en organen (zoals de longen in dit experiment) met hun eigen DNA bevatten. Daarom weerspiegelt directe detectie van totaal DNA in DNA-extracten niet de situatie van diatomeeën-DNA-extractie. In dit experiment werden diatomeeënspecifieke primers geselecteerd en werden PCR-producten gebruikt om de diatomeeën-DNA-extractie in het extract te evalueren. De producten kunnen worden waargenomen en geanalyseerd door middel van agarosegelelektroforese en kunnen ook worden geanalyseerd door middel van een real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-smeltcurve, die een hogere gevoeligheid heeft.
- Voeg 2 μL van het geëxtraheerde DNA uit watermonsters en weefsels toe als sjabloon. Kies een van de volgende twee inspectiemethoden.
- Conventionele PCR-test
- Gebruik primers22 die specifiek diatomeeën 18S rDNA-fragmenten kunnen versterken. Zie tabel 1 voor nadere bijzonderheden.
- Stel het PCR-reactiesysteem en de amplificatievoorwaarden vast volgens de kenmerken van de primers. Zie tabel 2 voor nadere bijzonderheden.
- Voer de producten van PCR-amplificatie uit op 2% agarosegel. Observeer en analyseer de beeldvorming met een gelimager.
- Fluorescerende kwantitatieve PCR-test
- Gebruik de bovenstaande primers die specifiek diatomeeën 18S rDNA-fragmenten kunnen amplificeren om een real-time fluorescerend kwantitatief PCR-reactiesysteem voor te bereiden. Zie tabel 3 voor nadere bijzonderheden.
- Voer PCR-amplificatie uit en analyseer de verkregen amplificatiecurve en Ct-waarden. Stel tegelijkertijd een programma in, smelt de dubbele strengen van de geamplificeerde producten geleidelijk in enkele strengen door middel van fluorescerende kwantitatieve PCR-smeltcurvetechnologie en analyseer vervolgens de verkregen smeltcurves.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aangezien de DNA-oplossing die met de momenteel gebruikte DNA-extractiemethode wordt geëxtraheerd, alle DNA-componenten uit verschillende bronnen in het monster bevat, was het DNA dat door dit protocol werd verkregen geen uitzondering. De DNA-oplossing was dus niet alleen een oplossing van diatomeeën-genoom-DNA. De primers die specifiek diatomeeën 18S rDNA-fragmenten kunnen versterken, zijn geselecteerd door de literatuur te raadplegen 22,23,24. De primers werden geverifieerd door NCBI-Blast Primer en de resultaten toonden aan dat de voorwaartse primer D512 en omgekeerde primer D978 van 18S rDNA algenspecifieke primers waren en veel diatomeeënsoorten bedekten. De amplificatieresultaten toonden geen menselijke genen. Ze gebruikten een betrouwbare DNA-biomarker voor diatomeeëntesten, dus werden ze geselecteerd voor verificatie van de resultaten van dit experiment. Met behulp van het geëxtraheerde DNA als sjabloon voor diatomeeënspecifieke PCR-amplificatie, toonde het amplificatieproduct door middel van agarosegelelektroforese aan dat watermonsters en weefsels diatomeeën-DNA-banden hadden, deze elektroforesebanden lagen tussen 250-500 bp (dichter bij 500 bp), in overeenstemming met de lengtegrootte van het primerdoelamplificatieproduct (390-410 bp). Hieruit bleek dat het extractieprotocol succesvol was in het extraheren van diatomeeën-DNA (Figuur 1A,B).
Real-time fluorescentie kwantitatieve PCR-technologie is een soort gentesttechnologie met strikte specificiteit en hoge gevoeligheid. Door fluorescerende groepen toe te voegen aan het PCR-reactiesysteem, kan de accumulatie van fluorescerende signalen ervoor zorgen dat het hele PCR-proces in realtime wordt bewaakt en is de gevoeligheid hoog25,26. Producten die specifiek zijn geamplificeerd door conventionele PCR kunnen soms moeilijk te observeren zijn in agarosegelelektroforese vanwege het lage gehalte en andere redenen27 (Figuur 1C). Door de specifieke amplificatie van real-time fluorescerende kwantitatieve PCR werd een typische amplificatiecurve met vier karakteristieke stadia verkregen (Figuur 2). Tegelijkertijd, door de real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-smeltcurvetechnologie, werden de dubbele DNA-strengen van het geamplificeerde product bij hoge temperatuur gesmolten tot enkele strengen, werd de kleurstof bevrijd van de dubbele strengen en nam de fluorescentiewaarde af. Door de verandering in de fluorescentiewaarde te detecteren, werd de smeltcurve verkregen (figuur 3). De verkregen smeltcurven hadden karakteristieke pieken en de piekwaarde lag rond de 85,5 °C, wat bewees dat er een specifieke amplificatie van het doel-DNA was, wat aangeeft dat er diatomeeën-DNA in de geëxtraheerde DNA-oplossing zat. De kleurstof kan ook direct worden toegevoegd aan het conventionele PCR-amplificatieproduct en de smeltcurve kan worden verkregen door real-time fluorescentie kwantitatieve PCR-smeltcurvetechnologie om te bewijzen of er specifieke amplificatie was. Daarom, wanneer conventionele PCR-agarosegelelektroforese niet kon bewijzen of er diatomeeën-DNA in de geëxtraheerde DNA-oplossing zat, kon de real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-technologie met een hogere gevoeligheid worden geselecteerd voor verificatie en evaluatie. In dit experiment werd de real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-smeltcurvetechnologie alleen gebruikt voor kwalitatieve analyse.
Zoals in een eerder rapport21 is aangetoond, waren de traditionele DNA-extractiekit voor de bodem en de gemodificeerde DNA-extractiekit voor bloed in principe hetzelfde voor diatomeeën-DNA-extractie uit watermonsters en weefsels. Het kostenverschil van diatomeeën-DNA-extractie was voornamelijk het prijsverschil van de twee kits, en de kosten van andere verbruiksartikelen waren in principe hetzelfde. In deze studie zou een eenvoudige verbetering van de bloed-DNA-extractiekit die gewoonlijk wordt gebruikt in moleculair-biologische experimenten betere experimentele resultaten kunnen opleveren, wat niet alleen de ruimte voor de onderzoekers vergrootte om de testkit te selecteren in onderzoeksactiviteiten met betrekking tot diatomeeën-DNA-extractie, maar ook de kosten van testen verlaagde.
Het verbeterproces van dit protocol is gepubliceerd21. Door de combinatie van verschillende massaverhoudingen van glasparels en vortexoscillerende tijd te ontwerpen, werden de optimale DNA-extractieomstandigheden van de oscillatie van glaskralen toegevoegd aan de conventionele kit, daarom zou de methode het extractie-effect van diatomeeën-DNA in forensische monsters kunnen verbeteren, vooral in weefselmonsters. De optimale combinatie van DNA-extractie werd verkregen wanneer de oscillerende frequentie van de vortex 3000 tpm was; De oscillerende tijd van de vortex was 4 minuten, de massaverhouding van grote glaskralen met een diameter van 1,5-2,0 mm en kleine glaskralen met een diameter van 0,4-0,6 mm was 1:1. Er werd een vergelijking gemaakt tussen de conventionele methode van de kit en de verbeterde methode. Er werd aangetoond dat de gebruikte kit kon voldoen aan de behoeften van het amplificeren van diatomeeën-DNA, en de helderheid van elektroforetische banden na amplificatie uitgevoerd met de verbeterde methode in watermonsters was vergelijkbaar met de helderheid van de conventionele methode, en de elektroforetische banden na amplificatie uitgevoerd door de verbeterde methode in weefselmonsters waren helderder (Figuur 4).
Figuur 1: Elektroforeseresultaten van DNA geëxtraheerd met behulp van het protocol na PCR-amplificatie. In totaal werd 2 μL DNA-extract gebruikt als DNA-sjabloon voor PCR-specifieke amplificatie. De PCR-amplificatieproducten werden geëlektroforeerd op 1x TAE-bufferoplossing door 2% agarosegel en liepen gedurende 25-30 minuten op een constante spanning van 100V. Voor alle gels werd een D2000 DNA-ladder gebruikt. (A) De elektroforeseresultaten van diatomeeën-DNA in watermonsters na PCR-amplificatie, baan 1 is blanco controle; Banen 2-7 zijn watermonsters van verschillende locaties in hetzelfde gebied. (B) De resultaten van elektroforese na PCR-amplificatie van diatomeeën-DNA in het weefsel. Banen 1-6 zijn de weefsels die uit verschillende posities van hetzelfde longweefsel zijn weggesneden; Baan 7 is de blanco besturing. (C) In een mislukt experiment, na diatomeeën-DNA-amplificatie, vertoonden de elektroforeseresultaten geen elektroforesebanden op de overeenkomstige posities, wat aangeeft dat er geen amplificatieproducten of te weinig amplificatieproducten waren. Op dat moment konden de elektroforeseresultaten niet aangeven of er diatomeeën-DNA in de voorgestelde DNA-oplossing zat, wat moest worden uitgevoerd met gevoeligere methoden (zoals een PCR-smeltcurve). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Diatomeeën DNA qPCR amplificatiecurve. Een totaal van 2 μL DNA-oplossingsextract dat geen banden vertoonde door conventionele PCR- en agarosegelelektroforese werd gebruikt als sjabloon om een real-time fluorescentie kwantitatief PCR-systeem voor te bereiden en een programma op te zetten. Ten slotte werden typische amplificatiecurven verkregen met vier karakteristieke stadia van de lineaire basislijnfase, het begin van de exponentiële fase, de exponentiële fase en de plateaufase. De Ct-waarde van elke curve werd ook verkregen door middel van analyse, wat aangeeft dat DNA-extractie succesvol was. Elk getal vertegenwoordigt de Ct-waarde van de corresponderende curve. De drempel is 5,2. De eenheid van de y-as is Rn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Diatomeeën DNA smeltcurve. Met behulp van een real-time fluorescentie kwantitatief PCR-systeem werd een programma ingesteld waarbij de temperatuur stijgt van 60-95 °C. Dit genereerde een smeltcurve en het specifiek geamplificeerde dubbelstrengs DNA smolt bij hoge temperaturen tot enkele strengen, de kleurstof was vrij van de dubbele strengen en de fluorescentiewaarde nam af tot deze 0 was. De grafiek werd verkregen door het negatieve omgekeerde van de originele grafiek te nemen. De abscis vertegenwoordigde de temperatuur, de abscis die overeenkomt met de hoogste piekwaarde was de Tm-waarde en de Tm-waarde van de smeltcurve in de grafiek was 85,5 °C. De nummering van elke bocht komt overeen met de nummering van elke rijstrook in figuur 1C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Elektroforeseresultaten van het verbeterde proces. (A) Elektroforeseresultaten voor verschillende combinaties van glasparelverhoudingen en vortexoscillatietijden. Banen 1, 4, 7, 10 en 13 waar de gemengde massaverhouding van grote en kleine glasparels 1:2 is, banen 2, 5, 8, 11 en 14 waar de gemengde massaverhouding van grote en kleine glasparels 1:1 is, banen 3, 6, 9, 12 en 15 waar de gemengde massaverhouding van grote en kleine glasparels 2:1 is, en de oscillatietijden waren 2 min voor banen 1-3, 3 min voor banen 4-6, 4 min voor banen 7-9, 5 min voor banen 10-12 en 6 min voor banen 13-15. Rijstrook 16 is de blanco bediening. (B) Elektroforeseresultaten na PCR-amplificatie van de kitextractieproducten voor en na verbetering. Banen 1-3 zijn conventionele methoden voor het extraheren van watermonsters, banen 4-6 zijn verbeterde methoden voor het extraheren van watermonsters, banen 7-9 zijn conventionele methoden voor het extraheren van weefsels, banen 10-12 zijn verbeterde methoden voor het extraheren van weefsels, baan 13 is een blanco controle. De resultaten zijn gewijzigd van21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Watermonsters en weefselmonsters. De gebruikte watermonsters werden genomen uit een vijver in de buurt van het laboratorium en de gebruikte weefselmonsters werden bevestigd als longweefsel van het verdronken lichaam. (A) De plaats waar het experimentele watermonster werd genomen, was een vijver in de buurt van het laboratorium. (B) Verrijkte watermonsters en versnipperde longweefselmonsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Microfoto van kiezelwier. Beelden (A) en (B) zijn gemaakt onder een 400x optische microscoop. De pijl wijst naar diatomeeën. De beelden (C) en (D) zijn gemaakt onder een elektronenmicroscoop. Afbeeldingen (A) en (B) tonen de diatomeeën in het water op de verdrinkingsplaats. De diatomeeën genaamd Fragilaria en Navicula. Afbeeldingen (C) en (D) tonen diatomeeën in de longen, die Nitzschia en Navicula worden genoemd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Doel | Naam van de primer | Volgorde |
| 18S rDNA | voorwoord primer D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| omgekeerde primer D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabel 1: Lijst van gebruikte primers. Deze tabel beschrijft de sequenties, namen en doelregio's van specifieke primers die in dit artikel worden gebruikt.
| PCR-reactiesysteem | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| voorwoord primer D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| omgekeerde primer D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| sjabloon DNA | 2 μL | ||
| Nucleasevrij water | tot 20 μL | ||
| Opmerking: Het blanco controlesjabloon DNA wordt vervangen door dezelfde hoeveelheid nucleasevrij water. | |||
| PCR-programma | |||
| temperatuur | Tijd | Cycli | |
| 94 °C | 10 min | 1 | |
| 94 °C | 45 seconden | 40 | |
| 50 °C | 45 seconden | ||
| 72 °C | 1 minuut | ||
| 72 °C | 10 min | 1 | |
Tabel 2: PCR-componenten. Deze tabel beschrijft de configuratie van het reactiesysteem voor conventionele PCR en de instellingen van de reactietemperatuur, tijd en aantal cycli voor PCR. Het totale volume van het gebruikte reactiesysteem bedroeg 20 μL.
| Real-time kwantitatief PCR-reactiesysteem | |||
| 2x qPCR mix | 10 μL | ||
| voorwoord primer D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| omgekeerde primer D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| sjabloon DNA | 2 μL | ||
| Nucleasevrij water | tot 20 μL | ||
| Opmerking: Het blanco controlesjabloon DNA wordt vervangen door dezelfde hoeveelheid nucleasevrij water. | |||
| Real-time kwantitatief PCR-programma | |||
| temperatuur | Tijd | Cycli | |
| 94 °C | 10 min | 1 | |
| 94 °C | 45 seconden | 40 | |
| 50 °C | 45 seconden | ||
| 72 °C | 1 minuut | ||
Tabel 3: Real-time kwantitatieve PCR-componenten. Deze tabel beschrijft de configuratie van het reactiesysteem voor real-time kwantitatieve PCR en de instellingen van de reactietemperatuur, tijd en aantal cycli voor PCR. Het totale volume van het gebruikte reactiesysteem bedroeg 20 μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diatomeeëncellen worden beschermd door harde kiezelhoudende celwanden17, en deze structuur moet worden vernietigd om diatomeeën-DNA te extraheren. Gewone kits vernietigen niet gemakkelijk de kiezelhoudende schil van diatomeeën; dus het is moeilijk om diatomeeën-DNA21 met succes te extraheren. Ons laboratorium verbeterde de meest gebruikte bloed-DNA-extractiekit door glasparels met verschillende diameters en verschillende massaverhoudingen toe te voegen tijdens het proces van diatomeeënextractie. Tegelijkertijd wordt vortex-oscillatie uitgevoerd, die de diatomeeënschaal volledig kan breken en het diatomeeën-DNA-extractie-effect kan verbeteren. Zoals in het vorige rapport21 is aangetoond, zouden de diameter van glasparels, de intensiteit van de oscillatie en de tijd rechtstreeks van invloed zijn op de kwaliteit van de DNA-extractie. De vortex-oscillatietijd mag niet te lang zijn (niet meer dan 10 minuten). Als de tijd te lang is, zal het DNA breken door overmatige trillingen. Tegelijkertijd mag de tijd niet te kort zijn. Als de tijd te kort is (niet minder dan 2 minuten), wordt de diatomeeënschelp niet volledig verwijderd, waardoor de DNA-extractie inefficiënt wordt. Kies bij het selecteren van glasparels kralen met verschillende omtrekdiameters, de grote glasparels zorgen voor de botsingssterkte en de kleine glasparels zorgen ervoor dat er geen dode botsing is tussen de glasparels tijdens het botsingsfragmentatieproces, wat de efficiëntie van het breken van de schaal verbetert.
Om diatomeeën-DNA uit monsters te extraheren, is het over het algemeen nodig om diatomeeën te verrijken. Dit proces zal een grote impact hebben op de extractie van diatomeeën-DNA. Het doel van verrijking is om de concentratie van diatomeeën in monsters te verhogen, zodat de concentratie van geëxtraheerd diatomeeën-DNA binnen detecteerbaar bereik kan liggen; voor de volgende stap toepassingen zoals real-time fluorescerende kwantitatieve PCR en high-throughput sequencing.
Aangezien diatomeeën wijd verspreid zijn in de natuur4, is het voorkomen van laboratoriumbesmetting een topprioriteit28. Contaminatie tijdens het DNA-extractieproces zal leiden tot afwijkingen van de werkelijke resultaten en verlies van gebruikswaarde. Let daarom altijd op het principe van aseptische werking bij het extraheren van diatomeeën-DNA en neem alle mogelijke maatregelen om besmetting van exogene diatomeeën te verminderen en te voorkomen. Wanneer het weefsel uit het dode lichaam wordt gehaald, moeten maatregelen worden genomen om te voorkomen dat het wordt besmet met exogene diatomeeën. Nadat het weefsel is geëxtraheerd, moet het worden bewaard in een container of monsterzak die vrij is van diatomeeënbesmetting. Het weefsel mag niet worden behandeld met formaldehyde. De apparatuur voor het extraheren en verwerken van weefsels moet 2-3 keer herhaaldelijk worden gewassen met gedestilleerd water en vervolgens worden gesteriliseerd met ultraviolet licht of hoge temperatuur om ervoor te zorgen dat er geen besmetting van diatomeeën uit andere bronnen is. Het weefsel vóór de test moet met een diatomeeënvrij instrument van het oppervlakkige weefsel worden afgesneden en vervolgens moet het instrument worden vervangen om het onderste weefsel eruit te halen voor onderzoek. Tegelijkertijd kan het standaardiseren van het operatieproces ook het probleem van laboratoriumbesmetting effectief voorkomen.
Aangezien diatomeeën het voedsel zijn van veel waterorganismen, zullen ze verloren gaan tijdens langdurige opslag29. Diatomeeën kunnen ook groeien en zich voortplanten onder lichtomstandigheden. Daarom moet de DNA-extractiestap zo snel mogelijk na de bemonstering worden gestart en moet een snelle monsterverwerking worden uitgevoerd om verlies van diatomeeën in het monster te voorkomen. Als de DNA-extractie niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, moeten alle monsters worden ingevroren en in het donker worden bewaard om de reductie van diatomeeën zoveel mogelijk te voorkomen.
Ons onderzoek selecteerde een gewone en goedkope bloed-DNA-extractiekit op basis van de proteïnase K-verteringsmethode, die is verbeterd om diatomeeën-DNA uit watermonsters en weefsels te extraheren met goede resultaten. Het weefsel wordt voldoende doorgesneden om volledig in contact te komen met proteïnase K en het weefsel wordt volledig verteerd. Het mogelijke principe van succesvolle extractie is als volgt: tijdens de schudstap wordt de harde schaal van diatomeeën herhaaldelijk geraakt en gefragmenteerd tussen snel bewegende glasparels, waardoor het celmembraan bloot komt te liggen; de configuratie van glasparels van verschillende afmetingen kan de opening tussen de botsing van glasparels van één grootte opvullen, zodat het contactoppervlak van de botsing zo volledig mogelijk wordt bedekt; na het verlies van het siliciumomhulsel helpt proteïnase K om DNA uit de diatomeeën vrij te maken. Vergeleken met de momenteel gebruikte bodem-DNA-extractiekit, kan de verbeterde bloed-DNA-extractiekit voldoen aan de vereisten van diatomeeën-DNA-extractie, die zuiniger en gemakkelijker te verkrijgen is. Het vergemakkelijkt niet alleen het gebruik van forensische diatomeeëninspectie, maar is ook geschikt voor toepassing op andere diatomeeënonderzoeksgerelateerde disciplines en kan ook worden gebruikt voor andere plankton-DNA-extractie. Bij het extraheren van diatomeeën-DNA uit watermonsters moet de gebruikte hoeveelheid proteïnase K worden aangepast aan de hoeveelheid plankton in het water. De hoeveelheid proteïnase K kan worden verhoogd of verlaagd op basis van voorafgaande experimenten. Bij het extraheren van diatomeeën-DNA uit weefsels, verschillende soorten orgaanweefsel, weefselbesmetting en andere factoren zullen de hoeveelheid proteïnase K die nodig is voor de spijsvertering beïnvloeden. In het experiment moet het proteïnase K in de kit na gebruik bij -20 °C worden bewaard, anders zal de inactivering van proteïnase K het extractieproces beïnvloeden.
Concluderend kan worden gesteld dat diatomeeën-DNA-extractie zo snel mogelijk na bemonstering en monsterverwerking moet worden uitgevoerd, anders moet deze voor bewaring bij -20 °C worden bewaard. De behandeling, opslag en het hele extractieproces van het monster moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om besmetting door exogene diatomeeën te voorkomen. Anders kan niet worden vastgesteld dat het geëxtraheerde diatomeeën-DNA zich in het monster of exogene besmetting bevond. Bij gebruik van proteïnase K om weefsel te verteren, kan de dosering een probleem zijn. Onvoldoende weefselvertering kan de hoeveelheid proteïnase K verhogen. Daarom is het belangrijk om het weefsel adequaat af te schuiven. Voldoende vertering van het weefsel voorkomt ook dat het weefselafval het plasmamembraan in de adsorptiekolom verstopt. Nadat het membraan is geblokkeerd, is het niet mogelijk om de pipetpunt te gebruiken om de verstopping eruit te halen of om herhaaldelijk te centrifugeren, waardoor het membraan beschadigd raakt. De uiteindelijke DNA-oplossing bevat veel onzuiverheden, die de detectie van diatomeeën-DNA beïnvloeden. Oscillatie-intensiteit en tijd zijn ook belangrijke kwesties. De eerste vortex-oscillatietijd wordt gecontroleerd op 4-5 minuten en de oscillatiefrequentie wordt geregeld op 3000 tpm, anders wordt de DNA-extractie beïnvloed. Als de elektroforetische banden na PCR niet helder zijn, kan het nodig zijn om de hoeveelheid DNA-sjabloon verder te verhogen. Het DNA dat in deze studie is geëxtraheerd, is een mengsel van DNA, inclusief diatomeeën-DNA en DNA van andere soorten, dus de concentratie diatomeeën-DNA kan niet worden bepaald. Daarom is het niet geschikt voor toepassingen die een hoge zuiverheid van DNA-sjablonen vereisen.
Studies hebben aangetoond dat verschillende diatomeeënsoorten kunnen worden versterkt door verschillende primers31,32. In deze studie werden alleen de diatomeeënspecifieke primers D512 en D978 op het diatomeeën 18S rDNA gebruikt om te testen of het diatomeeën-DNA met succes was geëxtraheerd, wat niet alle diatomeeënsoorten kon dekken22,33. Bovendien, aangezien de lengte van het amplificatieproductfragment van het paar primers 390-410 bp is, selecteert de verbeterde methode alle fragmentgroottes van diatomeeën-DNA om te testen of er een impact is op de experimentele parameters, die verder moeten worden bestudeerd. Latere studies zullen ook primers van verschillende regio's en verschillende amplificatielengtes gebruiken om het effect van extractie te onderzoeken.
Vergeleken met de traditionele diatomeeën-DNA-extractiemethode heeft deze methode de belangrijkste voordelen van goedkope en grootschalige diatomeeën-DNA-extractie. Het kan een aanvulling vormen op de voordelen van diatomeeënmorfologische methoden en kan voldoen aan de behoeften van verdrinkingsdiagnose in primaire forensische laboratoria. Tegelijkertijd breidt het ook het selectiebereik van diatomeeën-DNA-extractiekits uit en heeft het een goed toepassingsvooruitzicht. In de toekomst zal deze methode niet alleen beperkt blijven tot de extractie van diatomeeën-DNA, maar ook worden gebruikt voor de extractie van DNA uit andere algen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) en door het Academician Innovation Platform Scientific Research Project van de provincie Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
