Summary
この記事は修正された共通のDNAの抽出のキットを使用して珪藻DNAの抽出のためのプロトコルを記述する。
Abstract
珪藻の検査は、死体が水中で溺死したかどうかを判断し、溺死した場所を推測するために、法医学の実践において不可欠な補助手段です。珪藻試験は、環境・プランクトンの分野においても重要な研究内容です。珪藻DNAを主な研究対象とする珪藻分子生物学的試験技術は、珪藻の新しい試験方法です。珪藻DNA抽出は、珪藻分子試験の基本です。現在、珪藻DNA抽出に一般的に使用されているキットは高価であり、関連する研究を実施するためのコストが増加します。私たちの研究室は、一般的な全血ゲノムDNA迅速抽出キットを改良し、満足のいく珪藻DNA抽出効果を得て、関連研究のためのガラスビーズに基づく代替の経済的で手頃な価格のDNA抽出ソリューションを提供しました。このプロトコルを使用して抽出された珪藻DNAは、PCRやシーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを満たすことができます。
Introduction
法医学の実践では、水中で発見された死体が溺死したのか、それとも死後に水中に投げ込まれたのかを判断することは、事件1の適切な解決に不可欠です。また、法医学の実践2において緊急に解決しなければならない難しい問題の1つでもあります。珪藻は自然環境(特に水中)に豊富に存在します3,4。溺死の過程で、低酸素症とストレス反応により、人々は激しい呼吸運動をし、溺れる液体を大量に吸い込みます。したがって、水中の珪藻は溺れた液体とともに肺に入り、一部の珪藻は肺胞毛細血管関門を介して血液循環に入り、血流とともに内臓に広がる可能性があります5,6。肺、肝臓、骨髄などの内部組織や臓器で珪藻が検出されることは、死ぬ前に溺死したことを示す強力な証拠です7,8。現在、法医学的珪藻試験は、主に形態学的試験方法に基づいています。組織の一連の前消化の後、未消化珪藻の形態学的定性的および定量的推定が顕微鏡下で行われる。この期間中は、硝酸などの危険で環境に優しくない試薬を使用する必要があります。このプロセスには時間がかかり、研究者は分類学の確かな専門知識と豊富な経験を持っている必要があります。これらはすべて、法医学スタッフに特定の課題をもたらします9.珪藻DNA検査技術は、近年開発された珪藻検査の新技術である10,11,12。本技術は、珪藻の特異的なDNA配列構成を解析することにより、珪藻の種同定を実現する13,14。PCR技術やシーケンシング技術は一般的に用いられる技術的手法ですが、その基本は珪藻からのDNA抽出の成功です。しかし、珪藻は他の生物とは異なる特殊な構造をしており、DNA抽出技術も異なります。
珪藻の細胞壁は珪化度が高く、その主成分は二酸化ケイ素15,16,17です。珪質細胞壁は非常に硬く、DNAを抽出する前に破壊する必要があります。通常のDNA抽出キットは、珪藻の珪質殻を破壊できないため、珪藻DNAの抽出に直接使用することは難しい場合が多い18。したがって、珪藻の殻を破壊することは、珪藻DNAを抽出する上で解決すべき重要な技術的問題の1つです。
同時に、法医学研究サンプルに含まれる珪藻の数は、水試料であろうと溺死体の臓器や組織であろうと、限られていることが多いため、珪藻を濃縮する必要があります。濃縮の本質は物質の分離です。珪藻をまとめようとするときは、他の材料成分(干渉成分)の含有量を最小限に抑えます。法医学研究では、実験室はしばしば遠心分離または膜ろ過濃縮法を使用して珪藻細胞を分離します19。しかし、真空ポンプ装置が広く使用されていないため、膜濃縮法は通常の一次法医学研究所ではあまり使用されていません。そのため、遠心分離法は、法医学研究所20において依然として一般的に珪藻濃縮である。
珪藻からのDNA抽出は、現在、主に法医学の現場で使用されており、その適用には大きな制限があります。現在、法医学で使用される珪藻DNA抽出キットは市場に出回っており、一般的に高価です21。この記事では、改良された珪藻DNA抽出法を提供し、珪藻DNA抽出を簡単、便利、かつ費用対効果の高いものにします。これにより、その後の珪藻の分子生物学的検査の適用が増加し、珪藻検査を通じて法医学における溺死に関連する問題をよりよく解決することができます。珪藻の珪質細胞壁をガラスビーズで壊し、渦に適切な時間を設定する方法です。このようにして、プロテイナーゼKと結合溶液は細胞を急速に溶解し、細胞内のさまざまな酵素を不活性化します。ゲノムDNAは吸着カラムのマトリックス膜に吸収され、最終的に溶出バッファーによって溶出されます。このような改良された全血遺伝子抽出キットは、法医学検査材料における血液キットの珪藻DNA抽出効果を向上させ、法医学診療における珪藻DNA抽出のコストを削減し、草の根法医学研究によりよく適用することができる。
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Protocol
この研究は、海南医科大学の倫理委員会によって承認されました。この研究で使用された組織サンプルは、ヒトを対象とする研究とは見なされません。これらの標本は法医学的病理診断を目的として得られたもので、残りは今回の実験で珪藻DNAの抽出に用いられた。研究者は、関連する利害関係者からインフォームドコンセントを得るために、個人を簡単に特定することはできません。
注:この実験で報告された研究方法の一般的な適用性を確保するために、この実験は基本的に使用したキットの操作手順に従い、いくつかの手順のみを変更しました。この実験で使用した水サンプルは、実験室近くの池から無作為に採取しました(補足図1A)。この実験では、抽出プロトコルを実証するための研究組織として、溺死した遺体の肺組織が確認されました(補足図1B)。法医学の実践では、珪藻のDNAを抽出するために、溺死した遺体の他の臓器や組織(肝臓、脾臓、腎臓、骨髄など)を使用する必要がある場合もありますが、これには、実験の対応するセクションで説明するこの実験方法に対応するわずかな改善が必要です。この実験で使用された肺組織サンプルは、法医学事件で明らかに溺死した死体から採取されたものです。肺組織に珪藻が含まれていることを証明するために、形態学的試験が実施されています(補足図2)。
1. 試料の前処理
- 水サンプルの前処理
- 10 mLの水サンプルを遠心チューブに入れ、13,400 x g で5分間遠心分離します。上清9.8mLをピペットガンで慎重に廃棄し、底部に残った濃縮珪藻水サンプル約200μLを2mLの遠心チューブに移します。
注:最初に事前実験を行うことができ、10 mLの水サンプルが濃縮に十分でない場合は、初期量を増やすことができます。
- 10 mLの水サンプルを遠心チューブに入れ、13,400 x g で5分間遠心分離します。上清9.8mLをピペットガンで慎重に廃棄し、底部に残った濃縮珪藻水サンプル約200μLを2mLの遠心チューブに移します。
- 組織サンプルの前処理
- 溺死した体から肺縁組織0.5gを取り出し、肺組織が泥だらけになるまで完全に切り刻むか粉砕します。外因性珪藻の汚染を防ぐことは、このステップの中核です。はさみを使って繰り返しティッシュを細かく切ります。
2. DNA抽出
注:すべての遠心分離ステップは室温で完了します。14,500 x gの遠心力を持つ卓上遠心分離機を使用する。実験を開始する前に、70°Cに予熱したウォーターバス(または金属バス)を準備する必要があります。すべてのステップは、無菌操作の原則に厳密に従う必要があります。
- 水サンプルと組織の組み立て
注:水サンプルと組織珪藻DNA抽出法は同じです。- 前処理水サンプルを含む2 mL遠心チューブにガラスビーズを加えます。10x-15xを反転させてよく混ぜます。添加されたガラスビーズは、大小のガラスビーズが1:1の質量比で混合されたものです。大きなガラスビーズの直径は1.5〜2.0 mm、小さなガラスビーズの直径は0.4〜0.6 mmです。
- 細かく刻んだ組織0.5gを取り、上記のように組織を含む2mL遠心分離管にガラスビーズを加えます。10x-15xを反転させて混ぜます。
- 40 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL)をチューブに加えます。室温で15分間置き、この間、反転させ、3分ごとに10回混合します。
注:組織が完全に消化されていない場合は、溶液が透明になるまでプロテイナーゼKの量を適切に増やすことができます。 - 遠心チューブに結合緩衝液200μLを添加し、直ちにボルテックスし、4分間混合する(発振混合頻度:3000rpm)。
注意: このステップでは、十分な混合強度と時間を確保するために、振とうの強度と時間を厳密に制御する必要があります。 - 遠心分離管を70°Cのウォーターバスに10分間入れると、溶液が透明になります。
- 100μLのイソプロパノールを遠心分離管に加え、ボルテックスして15秒間混合すると、この時点で凝集状の沈殿物が現れることがあります。
注:上記の操作手順では、適切な強度でよく混合することが非常に重要ですが、DNAの剪断を防ぐために激しい振とうは避けてください。 - 前の工程で得られた溶液を凝集剤沈殿物と一緒に吸着塔に入れます(吸着塔は収集チューブに入れられます)。吸着カラムの長さは3.0cm、直径は1.0cmで、吸着マトリックスはシリコンマトリックス膜です。
- 8,000 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管内に廃棄し、吸着塔を回収管に戻します。
- 500 μLの阻害剤除去バッファーを吸着カラムに添加します。13,400 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管に廃棄します。
- 吸着カラムに700 μLの洗浄バッファーを加えます。13,400 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管に廃棄します。
注意: 最初に使用する前に、指定された量の無水エタノールを洗浄バッファーボトルに追加してください。 - 500 μLの洗浄バッファーを吸着カラムに添加します。13,400 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管に廃棄します。
- 吸着カラムを空のコレクションチューブに戻します。14,500 x g で 2 分間遠心分離し、洗浄バッファー中の残留エタノールが下流の反応を阻害しないように、洗浄バッファーを可能な限り除去します。
- 吸着カラムを取り出し、清潔な遠心分離管に入れます。100 μLの溶出バッファーを吸着膜の中央部に添加します。
- 吸着カラムを室温で3〜5分間置き、13,400 x g で1分間遠心分離します。
- 前のステップで得られた溶液を遠心吸着カラムに再度加えます。遠心吸着カラムを室温で2分間置き、13,400 x g で1分間遠心分離します。
注:溶出バッファーは、70°Cのウォーターバスで約10分間予熱する必要があります。溶出量は50μL以上でなければなりません。そうしないと、DNA収量が減少します。 - 抽出した珪藻DNAは、将来の使用のために2〜8°Cで保存してください。DNA溶液を長期間保存する場合は、-20°Cで保存してください。
3. PCR検査
注:法医学的サンプル中の珪藻の含有量は少ないことが多いため、溺死した遺体の組織サンプル抽出物には、独自のDNAを持つさまざまな程度の組織や臓器(この実験の肺など)が含まれている場合もあります。したがって、DNA抽出物中の全DNAの直接検出は、珪藻DNA抽出の状況を反映していません。この実験では、珪藻特異的プライマーを選択し、PCR産物を使用して抽出物中の珪藻DNA抽出を評価しました。生成物は、アガロースゲル電気泳動によって観察および分析することができ、また、より高い感度を有するリアルタイム蛍光定量PCR融解曲線によって分析することができます。
- 水サンプルおよび組織から抽出したDNA2 μLをテンプレートとして添加します。検査方法は、以下の2つからお選びください。
- 従来のPCR検査
- 珪藻18S rDNA断片を特異的に増幅できるプライマー22 を使用する。詳しくは、 表 1 を参照してください。
- プライマーの特性に応じたPCR反応系と増幅条件を確立します。詳しくは、 表 2 を参照してください。
- PCR増幅産物を2%アガロースゲルで泳動します。ゲルイメージャーでイメージングを観察し、分析します。
- 蛍光定量PCR検査
- 珪藻18S rDNA断片を特異的に増幅できる上記のプライマーを使用して、リアルタイム蛍光定量PCR反応システムを調製します。詳しくは、 表 3 を参照してください。
- PCR増幅を行い、得られた増幅曲線とCt値を解析します。同時に、プログラムを設定し、増幅産物の二本鎖を蛍光定量PCR融解曲線技術により徐々に一本鎖に溶融し、得られた融解曲線を分析します。
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Representative Results
現在使用されているDNA抽出法で抽出されたDNA溶液は、サンプル中に異なるソースからのすべてのDNA成分を含んでいるため、このプロトコルによって得られたDNAも例外ではありませんでした。つまり、DNA溶液は単なる珪藻のゲノムDNAの溶液ではなかったのです。珪藻18S rDNA断片を特異的に増幅できるプライマーは、文献22,23,24を参照して選択された。NCBI-Blast Primerでプライマーを検証したところ、18S rDNAのフォワードプライマーD512とリバースプライマーD978は藻類特異的プライマーであり、多くの珪藻種をカバーしていることがわかりました。増幅の結果、ヒトの遺伝子は検出されませんでした。珪藻類の試験には信頼性の高いDNAバイオマーカーが用いられていたため、今回の実験結果の検証のために選ばれました。抽出されたDNAを珪藻特異的PCR増幅の鋳型として使用して、アガロースゲル電気泳動による増幅産物は、水サンプルおよび組織に珪藻DNAバンドを有することを示した、これらの電気泳動バンドは250 - 500 bp (500 bpに近い)の間に、プライマーターゲット拡大生成物の長さサイズ(390 -410 bp)と一直線にあった。これにより、抽出プロトコルが珪藻DNAの抽出に成功したことが示されました(図1A、B)。
リアルタイム蛍光定量PCR技術は、厳格な特異性と高感度を備えた一種の遺伝子検査技術です。PCR反応システムに蛍光基を添加することにより、蛍光シグナルの蓄積により、PCRプロセス全体をリアルタイムで監視することができ、感度は高い25,26。従来のPCRで特異的に増幅された産物は、含有量が低いなどの理由により、アガロースゲル電気泳動での観察が困難な場合があります27(図1C)。リアルタイム蛍光定量PCRの特異的増幅により、4つの特徴的な段階を持つ典型的な増幅曲線が得られました(図2)。同時に、リアルタイム蛍光定量PCR融解曲線技術により、増幅産物のDNA二本鎖を高温で一本鎖に溶融し、色素を二本鎖から遊離させ、蛍光値を低下させました。蛍光値の変化を検出することで、融解曲線が得られました(図3)。得られた融解曲線には特徴的なピークがあり、ピーク値は85.5°C付近であり、抽出したDNA溶液中に珪藻DNAが存在することから、標的DNAの特異的な増幅があることが証明されました。また、従来のPCR増幅産物に直接色素を添加することもでき、リアルタイム蛍光定量PCR融解曲線技術により融解曲線を取得し、特異的増幅があったかどうかを証明することができました。そのため、従来のPCRアガロースゲル電気泳動では、抽出したDNA溶液中に珪藻DNAが存在するかどうかを証明できない場合、より高感度なリアルタイム蛍光定量PCR技術を選択して検証・評価することができました。この実験では、リアルタイム蛍光定量PCR融解曲線技術は、定性分析にのみ使用されました。
前回報告21に示したように、従来の土壌DNA抽出キットと改変血液DNA抽出キットは、水試料や組織からの珪藻DNA抽出については基本的に同じであった。珪藻DNA抽出のコスト差は、主に2つのキットの価格差であり、他の消耗品のコストは基本的に同じでした。本研究では、分子生物学の実験で一般的に用いられている血液DNA抽出キットを改良するだけで、より良い実験結果が得られ、研究者が珪藻DNA抽出に関する研究活動において検査キットを選択する範囲が広がるだけでなく、検査コストの低減にもつながりました。
このプロトコルの改善プロセスは21公開されています。ガラスビーズの質量比と渦振動時間の組み合わせを設計することで、ガラスビーズの振動の最適なDNA抽出条件を従来のキットに追加し、法医学試料、特に組織試料中の珪藻DNAの抽出効果を向上させることができました。DNA抽出の最適な組み合わせは、渦振動周波数が3000rpmのときに得られました。渦振動時間は4分で、直径1.5〜2.0mmの大きなガラスビーズと直径0.4〜0.6mmの小さなガラスビーズの質量比は1:1でした。キットの従来法と改良法との比較を行った。使用したキットは珪藻DNAの増幅ニーズを満たすことができ、改良法で水試料で増幅した後の電気泳動バンドの輝度は従来法と同等であり、組織試料では改良法で増幅した後の電気泳動バンドがより明るくなったことが示されました(図4)。
図1:PCR増幅後にプロトコルを用いて抽出したDNAの電気泳動結果。 合計 2 μL の DNA 抽出物を、PCR 特異的増幅の DNA テンプレートとして使用しました。PCR増幅産物は、2%アガロースゲルを介して1x TAE緩衝液で電気泳動し、100Vの定電圧で25〜30分間泳動しました。すべてのゲルに D2000 DNA ラダーを使用しました。(A)PCR増幅後の水サンプル中の珪藻DNAの電気泳動結果、レーン1はブランクコントロールです。レーン 2 から 7 は、同じエリア内の異なる場所からの水サンプルです。(B)組織中の珪藻DNAをPCR増幅した後の電気泳動の結果。レーン1〜6は、同じ肺組織の異なる位置から切除された組織です。レーン 7 はブランクのコントロールです。(C)実験に失敗した場合、珪藻のDNA増幅後、電気泳動の結果、対応する位置に電気泳動バンドが見られず、増幅産物がないか、増幅産物が少なすぎることが示されました。このとき、電気泳動の結果は、提案されたDNA溶液に珪藻DNAが存在するかどうかを示すことができず、より感度の高い方法(PCR融解曲線など)で実施する必要がありました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:珪藻DNA qPCR増幅曲線。 従来のPCRおよびアガロースゲル電気泳動でバンドを示さなかった合計2μLのDNA溶液抽出物を鋳型として使用し、リアルタイム蛍光定量PCRシステムを調製し、プログラムを設定しました。最後に、線形基線位相、指数位相の始まり、指数位相、およびプラトー相の4つの特徴的な段階を持つ典型的な増幅曲線が得られました。また、各曲線のCt値も解析により得られており、DNA抽出が成功したことが分かりました。各数値は、対応する曲線の Ct 値を表します。しきい値は 5.2 です。y軸の単位はRnです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:珪藻のDNA融解曲線。 リアルタイム蛍光定量PCRシステムを使用して、温度が60〜95°Cに上昇するプログラムを設定しました。 これにより融解曲線が形成され、特異的に増幅された二本鎖DNAが高温で一本鎖に融解し、色素は二本鎖から解放され、蛍光値は0になるまで減少しました。グラフは、元のグラフの負の逆数を取ることによって得られました。横軸は温度を表し、最高ピーク値に対応する横軸はTm値、グラフの融解曲線のTm値は85.5°Cであった。 各曲線の番号付けは、 図1Cの各レーンの番号付けに対応しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:改良したプロセスによる電気泳動結果。 (A)ガラスビーズ比と渦振動時間の異なる組み合わせに対する電気泳動結果。レーン1、4、7、10、13(大小ガラスビーズの混合質量比が1:2)、レーン2、5、8、11、14(大小ガラスビーズの混合質量比が1:1)、レーン3、6、9、12、15(大小ガラスビーズの混合質量比が2:1)、 振動時間は、レーン1-3で2分、レーン4-6で3分、レーン7-9で4分、レーン10-12で5分、レーン13-15で6分でした。レーン 16 はブランク コントロールです。(B)改善前後のキット抽出産物のPCR増幅後の電気泳動結果。レーン1〜3は水試料を抽出するための従来の方法であり、レーン4〜6は水試料を抽出するための改良された方法であり、レーン7〜9は組織を抽出するための従来の方法であり、レーン10〜12は組織を抽出するための改良された方法であり、レーン13はブランクコントロールである。結果は21から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:水サンプルと組織サンプル。 使用された水サンプルは研究所近くの池から採取され、使用された組織サンプルは溺死体の肺組織であることが確認されました。(A)実験用水サンプル採取場所は、実験室近くの池でした。(B)濃縮水サンプルおよび細断肺組織サンプル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:珪藻の顕微鏡写真。 画像(A)と(B)は400倍光学顕微鏡で撮影したものです。矢印は珪藻を指しています。画像(C)と(D)は電子顕微鏡で撮影したものです。画像(A)と(B)は、溺死現場の水中の珪藻を示しています。珪藻は Fragilaria と Naviculaと名付けられました。画像(C)と(D)は、 Nitzschia と Naviculaと呼ばれる肺の珪藻を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| ターゲット | プライマー名 | 順序 |
| 18S rDNAの | forwordプライマー D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| 逆下塗液 D978 | ガクタカガットタクタクガットタクガクガタガットタ |
表1:使用したプライマーのリスト。 この表は、この論文で使用した特定のプライマーの配列、名称、および標的領域を示しています。
| PCR反応システム | |||
| 2x Taq Mix プロ | 10 μL | ||
| forwordプライマー D512 | 0.5 μL (10 μmol/L) | ||
| 逆下塗液 D978 | 0.5 μL (10 μmol/L) | ||
| テンプレートDNA | 2 μL | ||
| ヌクレアーゼフリーの水 | 20 μLまで | ||
| 注:ブランクコントロールテンプレートDNAは、同量のヌクレアーゼフリー水で置き換えます。 | |||
| PCRプログラム | |||
| 温度 | 時間 | サイクル | |
| 94 °C | 10分 | 1 | |
| 94 °C | 45秒 | 40 | |
| 50°C | 45秒 | ||
| 72 °C | 1 分 | ||
| 72 °C | 10分 | 1 | |
表2:PCRコンポーネント。 この表は、従来のPCRにおける反応系の構成と、PCRにおける反応温度、時間、サイクル数の設定について記載したものです。使用した反応系の総容量は20μLであった。
| リアルタイム定量PCR反応システム | |||
| 2x qPCRミックス | 10 μL | ||
| forwordプライマー D512 | 0.45 μL (10 μmol/L) | ||
| 逆下塗液 D978 | 0.45 μL (10 μmol/L) | ||
| テンプレートDNA | 2 μL | ||
| ヌクレアーゼフリーの水 | 20 μLまで | ||
| 注:ブランクコントロールテンプレートDNAは、同量のヌクレアーゼフリー水で置き換えます。 | |||
| リアルタイム定量PCRプログラム | |||
| 温度 | 時間 | サイクル | |
| 94 °C | 10分 | 1 | |
| 94 °C | 45秒 | 40 | |
| 50°C | 45秒 | ||
| 72 °C | 1 分 | ||
表3:リアルタイム定量PCRコンポーネント。 この表は、リアルタイム定量PCR用の反応システムの構成と、PCR用の反応温度、時間、およびサイクル数の設定を示しています。使用した反応系の総容量は20μLであった。
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Discussion
珪藻細胞は硬い珪質細胞壁17によって保護されており、珪藻DNAを抽出するにはこの構造を破壊する必要があります。通常のキットでは、珪藻の珪質殻を簡単に破壊することはできません。したがって、珪藻DNA21の抽出に成功することは困難である。私たちの研究室では、最も一般的に使用されている血液DNA抽出キットを改良し、珪藻抽出の過程で異なる直径と異なる質量比のガラスビーズを追加しました。渦振動が同時に行われるため、珪藻の殻を完全に破壊し、珪藻DNA抽出効果を向上させることができます。前回のレポート21で示したように、ガラスビーズの直径、振動強度、および時間は、DNA抽出の品質に直接影響します。渦振動時間は長すぎてはいけません(10分以下)。時間が長すぎると、過度の振動によりDNAが壊れてしまいます。同時に、時間が短すぎてもいけません。時間が短すぎると(2分以上)、珪藻の殻が完全に除去されず、DNA抽出が非効率的になります。ガラスビーズを選択する際には、円周直径の異なるビーズを選択し、大きなガラスビーズは衝突強度を確保し、小さなガラスビーズは衝突フラグメンテーションプロセス中にガラスビーズ間にデッドコリジョンがないことを保証し、シェルの破壊効率を向上させます。
サンプルから珪藻DNAを抽出するには、一般的に珪藻を濃縮する必要があります。このプロセスは、珪藻DNAの抽出に大きな影響を与えます。濃縮の目的は、抽出された珪藻DNAの濃度が検出可能な範囲に収まるように、サンプル中の珪藻の濃度を高めることです。リアルタイム蛍光定量PCRやハイスループットシーケンシングなどの次のステップアプリケーション向け。
珪藻は自然界に広く分布しているため4、実験室の汚染を防ぐことは最優先事項です28。DNA抽出プロセス中の汚染は、実際の結果からの逸脱と使用価値の損失につながります。したがって、珪藻DNAを抽出するときは常に無菌操作の原則に注意を払い、外因性の珪藻の汚染を減らして回避するために可能な限りの対策を講じてください。死体から組織を採取するときは、外因性の珪藻による汚染を防ぐための対策を講じる必要があります。組織を抽出した後は、珪藻の汚染のない容器またはサンプルバッグに保管する必要があります。組織はホルムアルデヒドで処理しないでください。組織を抽出および処理するための機器は、蒸留水で2〜3回繰り返し洗浄してから、紫外線または高温で滅菌して、他の発生源からの珪藻の汚染がないことを確認する必要があります。検査前の組織は、珪藻類を含まない器具で表在性組織から切り取り、次に器具を交換して、検査のために下部組織を摘出する必要があります。同時に、操作プロセスを標準化することで、実験室の汚染の問題を効果的に回避することもできます。
珪藻は多くの水生生物の餌であるため、長期保存中に失われます29。珪藻は、光の条件下でも成長して繁殖することができます。したがって、DNA抽出ステップはサンプリング後できるだけ早く開始し、サンプル中の珪藻の損失を防ぐために迅速なサンプル処理を行う必要があります。DNA抽出をすぐに実行できない場合は、珪藻の減少を可能な限り防ぐために、すべてのサンプルを凍結して暗所に保管する必要があります。
私たちの研究では、水サンプルや組織から珪藻DNAを抽出するように改良されたプロテイナーゼK消化法に基づいて、一般的で安価な血液DNA抽出キットを選択し、良好な結果を得ました30。組織はプロテイナーゼKと完全に接触するように十分に切断され、組織は完全に消化されます。抽出が成功する原理は、振とうステップ中に、珪藻の硬い殻が高速で移動するガラスビーズの間で繰り返し衝撃を受け、断片化され、細胞膜が露出することです。異なるサイズのガラスビーズの構成は、衝突接触面を可能な限り完全に覆うために、単一サイズのガラスビーズの衝突間のギャップを埋めることができます。ケイ素の殻を失った後、プロテイナーゼKは珪藻からDNAを放出するのを助けます。現在使用されている土壌DNA抽出キットと比較して、改良された血液DNA抽出キットは、より経済的で入手しやすい珪藻DNA抽出の要件を満たすことができます。法医学的珪藻検査の利用を容易にするだけでなく、他の珪藻研究関連分野への応用に適しており、他のプランクトンDNA抽出にも使用できます。水サンプルから珪藻DNAを抽出する場合、水中のプランクトンの数に応じて使用するプロテイナーゼKの量を調整する必要があります。プロテイナーゼKの量は、予備実験に基づいて増減することができる。組織から珪藻DNAを抽出する場合、さまざまな臓器組織の種類、組織の汚染、およびその他の要因が消化に必要なプロテイナーゼKの量に影響を与えます。実験では、キット内のプロテイナーゼKは使用後に-20°Cで保存する必要があり、そうでなければプロテイナーゼKの不活性化が抽出プロセスに影響を与えます。
結論として、珪藻のDNA抽出は、サンプリングとサンプル処理の後、できるだけ早く行う必要があり、それ以外の場合は保存のために-20°Cで保存する必要があります。外因性の珪藻による汚染を防ぐために、サンプルの取り扱い、保管、および抽出プロセス全体を慎重に行う必要があります。そうでなければ、抽出された珪藻DNAがサンプル中にあったか、外因性の汚染であったかを評価することはできません。プロテイナーゼKを使用して組織を消化する場合、その投与量が問題になることがあります。組織消化が不十分な場合、プロテイナーゼKの量が増加する可能性があります。したがって、組織を適切にせん断することが重要です。また、組織を十分に消化することで、組織の破片が吸着カラム内の原形質膜を詰まらせるのを防ぎます。メンブレンが詰まった後は、ピペットチップを使用して詰まりを取り出したり、メンブレンを損傷する遠心分離を繰り返し行うことはできません。最終的なDNA溶液には多くの不純物が含まれており、珪藻DNAの検出に影響を与えます。振動の強さと時間も重要な問題です。最初の渦振動時間は4〜5分に制御され、振動周波数は3000rpmに制御され、そうでなければDNA抽出が影響を受けます。PCR後に電気泳動バンドが明瞭でない場合は、DNAテンプレートの量をさらに増やす必要があるかもしれません。本研究で抽出したDNAは、珪藻のDNAを含むDNAと他の生物のDNAが混ざり合ったものであるため、珪藻のDNAの濃度は決定できません。そのため、高純度のDNAテンプレートを必要とする用途には適していません。
研究によると、異なる珪藻種は異なるプライマーによって増幅され得ることが示されている31,32。本研究では、珪藻18S rDNA上の珪藻特異的プライマーD512およびD978のみを用いて、珪藻DNAの抽出に成功したかどうかを試験したが、珪藻種すべてをカバーすることはできなかった22,33。さらに、一対のプライマーの増幅産物断片の長さは390〜410 bpであるため、改良された方法では、珪藻DNAのすべての断片サイズを選択して、実験パラメータに影響があるかどうかを試験しますが、これはさらなる研究が必要です。その後の研究では、さまざまな領域とさまざまな増幅長のプライマーを使用して、抽出の効果を調査します。
従来の珪藻DNA抽出法と比較して、この方法には、低コストで大規模な珪藻DNA抽出の主な利点があります。珪藻の形態学的方法の利点を補完し、一次法医学研究所での溺死診断のニーズを満たすことができます。同時に、珪藻DNA抽出キットの選択範囲も拡大し、アプリケーションの見通しも良好です。将来的には、この方法は珪藻のDNA抽出に限らず、他の藻類からのDNA抽出にも利用されるようになるでしょう。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(82060341,81560304)と海南省アカデミーイノベーションプラットフォーム科学研究プロジェクト(YSPTZX202134)の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
