Summary
이 글에서는 수정된 일반 DNA 추출 키트를 사용한 규조류 DNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
규조류 검사는 법의학 실무에서 시체가 물에 빠졌는지 여부를 결정하고 익사 위치를 추론하는 데 필수적인 보조 수단입니다. 규조류 검사는 환경과 플랑크톤 분야에서도 중요한 연구 내용입니다. 규조류 DNA를 주요 연구 대상으로 하는 규조류 분자 생물학 검사 기술은 규조류 검사의 새로운 방법입니다. 규조류 DNA 추출은 규조류 분자 검사의 기초입니다. 현재 규조류 DNA 추출에 일반적으로 사용되는 키트는 고가이므로 관련 연구 수행 비용이 증가합니다. 우리 연구실은 일반 전혈 유전체 DNA 신속 추출 키트를 개선하여 만족스러운 규조류 DNA 추출 효과를 얻어 관련 연구를 위한 글라스 비드 기반의 경제적이고 저렴한 대안 DNA 추출 솔루션을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 추출된 규조류 DNA는 PCR 및 염기서열분석과 같은 많은 다운스트림 응용 분야를 만족시킬 수 있습니다.
Introduction
법의학에서는 물속에서 발견된 시체가 익사했는지 아니면 사망 후 물에 던져졌는지를 판단하는 것이 사건의 적절한 해결을 위해 필수적이다1. 또한 법의학 실무에서 시급히 해결해야 할 어려운 문제 중 하나입니다2. 규조류는 자연 환경(특히 물)에 풍부합니다.3,4. 익사 과정에서 저산소증과 스트레스 반응으로 인해 사람들은 격렬한 호흡 움직임을 보이고 많은 양의 익사 액체를 흡입합니다. 따라서 물 속의 규조류는 익사액과 함께 폐로 들어가고 일부 규조류는 폐포-모세혈관 장벽을 통해 혈액 순환에 들어가 혈류와 함께 내부 장기로 퍼질 수 있습니다 5,6. 폐, 간, 골수와 같은 내부 조직과 장기에서 규조류가 검출되는 것은 사망 전 익사의 강력한 증거입니다 7,8. 현재 법의학 규조류 검사는 주로 형태학적 검사 방법을 기반으로 합니다. 조직의 일련의 사전 소화 후, 소화되지 않은 규조류의 형태학적 정성적 및 정량적 추정이 현미경 하에서 수행됩니다. 이 기간 동안 질산과 같은 위험하고 환경 친화적이지 않은 시약을 사용해야 합니다. 이 프로세스는 시간이 많이 걸리며 연구자는 확실한 분류학 전문 지식과 광범위한 경험을 필요로 합니다. 이 모든 것은 법의학 직원에게 특정 문제를 야기합니다9. 규조류 DNA 검사 기술은 최근 몇 년 동안 개발된 규조류 검사의 새로운 기술입니다 10,11,12. 이 기술은 규조류13,14의 특정 DNA 서열 조성을 분석하여 규조류의 종 식별을 실현합니다. PCR 기술과 시퀀싱 기술은 일반적으로 사용되는 기술적 방법이지만 그 기본은 규조류에서 DNA를 성공적으로 추출하는 것입니다. 그러나 규조류는 다른 유기체와 다른 특별한 구조를 가지고 있어 DNA 추출 기술도 다릅니다.
규조류의 세포벽은 규화도가 높으며 주성분은 이산화규소15,16,17입니다. 규산질 세포벽은 매우 단단하며 DNA를 추출하기 전에 파괴해야 합니다. 통상의 DNA 추출 키트는 규조류18의 규산질 껍질을 파괴할 수 없기 때문에 규조류 DNA의 추출에 직접 사용하기 어려운 경우가 많다. 따라서 규조류의 규산 껍질을 파괴하는 것은 규조류 DNA를 추출할 때 해결해야 할 주요 기술 문제 중 하나입니다.
동시에 법의학 연구 샘플에 포함된 규조류의 수는 물 샘플이든 익사한 시체의 장기 및 조직이든 종종 제한되어 있기 때문에 규조류를 농축할 필요가 있습니다. 농축의 본질은 물질의 분리입니다. 규조류를 함께 모으려고 할 때 다른 재료 구성 요소(간섭 구성 요소)의 함량을 최소화합니다. 법의학 작업에서, 실험실은 규조류 세포를 분리하기 위해 종종 원심분리 또는 막 여과 농축 방법을 사용한다19. 그러나 진공 펌핑 장비가 널리 사용되지 않기 때문에 멤브레인 농축 방법은 일반 1차 법의학 실험실에서 자주 사용되지 않습니다. 따라서, 원심분리 방법은 여전히 법의학 실험실(20)에서 규조류 농축이다.
규조류에서 DNA를 추출하는 것은 현재 법의학 분야에서 주로 사용되며 그 적용에는 상당한 한계가 있습니다. 현재 시중에 법의학에 사용되는 규조류 DNA 추출 키트는 거의 없으며 일반적으로 고가입니다21. 이 기사는 규조류 DNA 추출을 간단하고 편리하며 비용 효율적으로 만드는 개선된 규조류 DNA 추출 방법을 제공합니다. 이는 규조류의 후속 분자 생물학 테스트의 적용을 증가시키고 규조류 테스트를 통해 법의학에서 익사와 관련된 문제를 더 잘 해결할 수 있습니다. 이 방법은 유리 구슬을 첨가하고 소용돌이에 적절한 시간을 설정하여 규조류의 규산 세포벽을 파괴합니다. 이러한 방식으로 단백질 분해 효소 K와 결합 용액은 세포를 빠르게 용해시키고 세포 내의 다양한 효소를 비활성화합니다. 게놈 DNA는 흡착 컬럼의 매트릭스 막에 흡수되고 최종적으로 용출 완충액에 의해 용출됩니다. 이러한 개선된 전혈 유전자 추출 키트는 법의학 검사 재료에서 혈액 키트의 규조류 DNA 추출 효과를 향상시키고, 법의학 실무에서 규조류 DNA 추출 비용을 절감하며, 풀뿌리 법의학 연구에 더 잘 적용될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구는 하이난 의과 대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 조직 샘플은 인간 피험자와 관련된 연구로 간주되지 않습니다. 이 표본은 법의학 병리학적 진단을 위해 얻었고 나머지는 이 실험에서 규조류 DNA 추출에 사용되었습니다. 연구자는 관련 이해 관계자로부터 정보에 입각한 동의를 얻기 위해 개인을 쉽게 식별할 수 없습니다.
참고: 이 실험에서 보고된 연구 방법의 일반적인 적용 가능성을 보장하기 위해 이 실험은 기본적으로 사용된 키트의 작동 지침을 따랐으며 일부 단계만 수정되었습니다. 이 실험에 사용된 물 샘플은 실험실 근처의 연못에서 무작위로 채취되었습니다(보충 그림 1A). 이 실험에서는 익사한 시신의 폐 조직을 추출 프로토콜을 입증하기 위한 연구 조직으로 확인하였다(보충 그림 1B). 법의학 실습에서는 규조류 DNA를 추출하기 위해 익사한 시체의 다른 장기 및 조직(예: 간, 비장, 신장, 골수 등)을 사용해야 하는 경우도 있으며, 이는 실험의 해당 섹션에서 설명할 이 실험 방법에 대한 약간의 개선이 필요합니다. 이 실험에 사용된 폐 조직 샘플은 법의학 사례에서 익사한 것이 분명한 시체에서 나왔다. 폐 조직에 규조류가 포함되어 있음을 증명하기 위해 형태학적 검사가 수행되었습니다(보충 그림 2).
1. 샘플의 전처리
- 물 샘플의 전처리
- 10mL의 물 샘플을 원심분리기 튜브에 넣고 13,400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫 건으로 9.8mL의 상층액을 조심스럽게 버리고 바닥에 남아 있는 약 200μL의 농축 규조수 샘플을 2mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
참고: 사전 실험을 먼저 수행할 수 있으며 10mL의 물 샘플이 농축에 충분하지 않은 경우 초기 양을 늘릴 수 있습니다.
- 10mL의 물 샘플을 원심분리기 튜브에 넣고 13,400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫 건으로 9.8mL의 상층액을 조심스럽게 버리고 바닥에 남아 있는 약 200μL의 농축 규조수 샘플을 2mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 조직 샘플의 전처리
- 익사한 몸에서 폐 가장자리 조직 0.5g을 채취하여 폐 조직이 진흙탕이 될 때까지 완전히 자르거나 갈아줍니다. 외인성 규조류의 오염을 방지하는 것이 이 단계의 핵심입니다. 가위를 사용하여 티슈를 반복적으로 조각으로 자릅니다.
2. DNA 추출
알림: 모든 원심분리 단계는 실온에서 완료됩니다. 원심력이 14,500 x g인 데스크탑 원심분리기를 사용하는 단계; 실험을 시작하기 전에 70°C로 예열된 수조(또는 금속 수조)를 준비해야 합니다. 모든 단계는 무균 작동 원칙을 엄격히 따라야 합니다.
- 물 샘플 및 조직 조립
참고: 물 샘플과 조직 규조류 DNA 추출 방법은 동일합니다.- 전처리된 물 샘플이 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 유리 구슬을 추가합니다. 10x-15x를 뒤집어 잘 섞습니다. 첨가된 유리구슬은 크고 작은 유리구슬이 1:1의 질량비로 혼합되어 구성된다. 큰 유리 구슬의 직경은 1.5-2.0mm이고 작은 유리 구슬의 직경은 0.4-0.6mm입니다.
- 잘게 썬 조직 0.5g을 위에서 설명한 대로 조직이 들어 있는 2mL 원심분리 튜브에 유리 구슬을 추가합니다. 10x-15x를 뒤집어 혼합합니다.
- 40μL의 proteinase K(20mg/mL)를 튜브에 추가합니다. 실온에서 15분 동안 두었다가 이 기간 동안 뒤집어서 3분마다 10번 섞습니다.
참고: 조직이 완전히 소화되지 않으면 용액이 맑아질 때까지 proteinase K의 양을 적절하게 늘릴 수 있습니다. - 원심분리기 튜브에 결합 완충액 200μL를 추가하고 즉시 와류를 발생시키고 4분 동안 혼합합니다(진동 혼합 주파수: 3000rpm).
알림: 이 단계에서는 충분한 혼합 강도와 시간을 보장하기 위해 흔들림 강도와 시간을 엄격하게 제어해야 합니다. - 원심분리기 튜브를 70°C 수조에 10분 동안 넣으면 용액이 투명해집니다.
- 100μL의 이소프로판올을 원심분리기 튜브에 넣고 소용돌이 및 15초 동안 혼합하면 이때 응집성 침전이 나타날 수 있습니다.
알림: 위의 작업 단계에서 적절한 강도로 잘 혼합하는 것이 매우 중요하지만 DNA 전단을 방지하기 위해 격렬한 흔들림은 피해야 합니다. - 이전 단계에서 얻은 용액을 응집성 침전물과 함께 흡착 컬럼에 넣습니다(흡착 컬럼은 수집 튜브에 배치됨). 흡착 컬럼 길이는 3.0cm, 직경은 1.0cm, 흡착 매트릭스는 실리콘 매트릭스 멤브레인입니다.
- 8,000 x g 에서 30초 동안 원심분리기를 사용하여 수집 튜브의 폐액을 버리고 흡착 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣습니다.
- 500μL의 억제제 제거 완충액을 흡착 컬럼에 추가합니다. 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 수집 튜브에 있는 폐액을 버립니다.
- 700μL의 세척 버퍼를 흡착 컬럼에 추가합니다. 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 수집 튜브에 있는 폐액을 버립니다.
알림: 처음 사용하기 전에 세척 버퍼 병에 지정된 양의 절대 에탄올을 추가하십시오. - 500μL의 세척 완충액을 흡착 컬럼에 추가합니다. 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 수집 튜브에 있는 폐액을 버립니다.
- 흡착 컬럼을 빈 수집 튜브에 다시 넣습니다. 14,500 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 세척 완충액을 최대한 제거하여 세척 완충액의 잔류 에탄올이 다운스트림 반응을 억제하지 않도록 합니다.
- 흡착 컬럼을 꺼내 깨끗한 원심분리기 튜브에 넣습니다. 100μL의 용출 완충액을 흡착막의 중간 부분에 추가합니다.
- 흡착 컬럼을 실온에 3-5분 동안 놓고 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 이전 단계에서 얻은 용액을 원심 흡착 컬럼에 다시 추가합니다. 원심 흡착 컬럼을 실온에서 2분 동안 놓고 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
알림: 용출 버퍼는 70°C 수조에서 약 10분 동안 예열해야 합니다. 용출량은 50μL 이상이어야 합니다. 그렇지 않으면 DNA 수율이 감소합니다. - 추출된 규조류 DNA를 나중에 사용할 수 있도록 2-8°C에서 보관합니다. DNA 용액을 장기간 보관해야 하는 경우 -20°C에서 보관하십시오.
3. PCR 검사
참고: 법의학 샘플의 규조류 함량이 낮은 경우가 많기 때문에 익사한 시신의 조직 샘플 추출물에는 자체 DNA가 있는 다양한 정도의 조직과 장기(예: 이 실험의 폐)가 포함될 수도 있습니다. 따라서 DNA 추출물에서 전체 DNA를 직접 검출하는 것은 규조류 DNA 추출의 상황을 반영하지 않습니다. 이 실험에서는 규조류 특이적 프라이머를 선택하고 PCR 산물을 사용하여 추출물에서 규조류 DNA 추출을 평가했습니다. 제품은 아가로스 겔 전기영동으로 관찰 및 분석할 수 있으며 감도가 더 높은 실시간 형광 정량 PCR 용융 곡선으로도 분석할 수 있습니다.
- 물 샘플과 조직에서 추출한 DNA 2μL를 템플릿으로 추가합니다. 다음 두 가지 검사 방법 중 하나를 선택합니다.
- 기존 PCR 검사
- 규조류 18S rDNA 단편을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머22 를 사용합니다. 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
- 프라이머의 특성에 따라 PCR 반응 시스템 및 증폭 조건을 설정합니다. 자세한 내용은 표 2를 참조하십시오.
- PCR 증폭 산물을 2% 아가로스 겔에서 실행합니다. 겔 이미저로 이미징을 관찰하고 분석합니다.
- 형광 정량 PCR 검사
- 규조류 18S rDNA 단편을 특이적으로 증폭할 수 있는 위의 프라이머를 사용하여 실시간 형광 정량 PCR 반응 시스템을 준비합니다. 자세한 내용은 표 3을 참조하십시오.
- PCR 증폭을 수행하고, 얻어진 증폭 곡선 및 Ct 값을 분석한다. 동시에 프로그램을 설정하고 형광 정량 PCR 용융 곡선 기술을 통해 증폭된 제품의 이중 가닥을 점차적으로 단일 가닥으로 녹인 다음 얻은 용융 곡선을 분석합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
현재 사용되는 DNA 추출 방법에 의해 추출된 DNA 용액은 샘플의 다른 출처에서 추출된 모든 DNA 성분을 포함하기 때문에 이 프로토콜에 의해 얻어진 DNA도 예외는 아니었습니다. 따라서 DNA 용액은 규조류 게놈 DNA의 단순한 용액이 아니었습니다. 규조류 18S rDNA 단편을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머는 문헌 22,23,24를 참조하여 선택하였다. 프라이머는 NCBI-Blast Primer로 검증되었으며, 그 결과 18S rDNA의 정방향 프라이머 D512와 리버스 프라이머 D978이 조류 특이적 프라이머이며 많은 규조류 종을 포괄하는 것으로 나타났습니다. 증폭 결과, 인간 유전자는 발견되지 않았다. 규조류 검사에 신뢰할 수 있는 DNA 바이오마커로 사용되었기 때문에 이 실험 결과의 검증을 위해 선택되었습니다. 추출된 DNA를 규조류 특이적 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하여, 아가로스 겔 전기영동에 의한 증폭 산물은 물 샘플 및 조직이 규조류 DNA 밴드를 갖는 것을 보여주었고, 이러한 전기영동 밴드는 프라이머 타겟 증폭 산물 길이 크기(390-410bp)와 일치하여 250-500bp(500bp에 가까움)였다. 이는 추출 프로토콜이 규조류 DNA를 추출하는 데 성공했음을 보여주었습니다(그림 1A,B).
실시간 형광 정량 PCR 기술은 엄격한 특이성과 높은 감도를 가진 일종의 유전자 검사 기술입니다. PCR 반응 시스템에 형광기를 추가하면 형광 신호가 축적되어 전체 PCR 프로세스를 실시간으로 모니터링 할 수 있으며 감도는25,26으로 높습니다. 종래의 PCR에 의해 특이적으로 증폭된 생성물은 낮은 함량 및 다른 이유로 인해 아가로스 겔 전기영동에서 때때로 관찰하기 어려울 수 있다(27)(도 1C). 실시간 형광 정량 PCR의 특이적 증폭을 통해 4개의 특성 단계를 갖는 일반적인 증폭 곡선을 얻었습니다(그림 2). 동시에 실시간 형광 정량 PCR 용융 곡선 기술을 통해 증폭된 산물의 DNA 이중 가닥을 고온에서 단일 가닥으로 용융하고 염료를 이중 가닥에서 분리하여 형광 값을 감소시켰습니다. 형광 값의 변화를 감지하여 용융 곡선을 얻었습니다(그림 3). 얻어진 용융 곡선은 특징적인 피크를 가졌으며 피크 값은 약 85.5°C였으며, 이는 표적 DNA의 특정 증폭이 있음을 증명하여 추출된 DNA 용액에 규조류 DNA가 있음을 나타냅니다. 염료는 또한 기존의 PCR 증폭 제품에 직접 첨가할 수 있으며, 실시간 형광 정량 PCR 용융 곡선 기술로 용융 곡선을 얻어 특정 증폭이 있는지 여부를 증명할 수 있습니다. 따라서, 기존의 PCR-아가로스 겔 전기영동으로는 추출된 DNA 용액에 규조류 DNA가 있는지 여부를 증명할 수 없는 경우, 고감도의 실시간 형광 정량 PCR 기술을 선택하여 검증 및 평가할 수 있었습니다. 이 실험에서는 실시간 형광 정량 PCR-용융 곡선 기술을 정성 분석에만 사용했습니다.
이전 보고서(21)에서 볼 수 있듯이, 종래의 토양 DNA 추출 키트와 변형된 혈액 DNA 추출 키트는 물 샘플 및 조직으로부터 규조류 DNA 추출에 대해 기본적으로 동일하였다. 규조류 DNA 추출의 비용 차이는 주로 두 키트의 가격 차이였으며 다른 소모품의 비용은 기본적으로 동일했습니다. 본 연구에서는 분자생물학 실험에서 일반적으로 사용되는 혈액 DNA 추출 키트를 간단히 개선하여 더 나은 실험 결과를 얻을 수 있었으며, 이는 규조류 DNA 추출과 관련된 연구 활동에서 연구자가 테스트 키트를 선택할 수 있는 범위를 넓혔을 뿐만 아니라 검사 비용을 절감했습니다.
이 프로토콜의 개선 프로세스는21 게시되었습니다. 유리 구슬의 다양한 질량 비율과 와류 진동 시간의 조합을 설계함으로써 유리 구슬 진동의 최적 DNA 추출 조건을 기존 키트에 추가했기 때문에 법의학 샘플, 특히 조직 샘플에서 규조류 DNA의 추출 효과를 향상시킬 수 있었습니다. DNA 추출의 최적 조합은 와류 진동 주파수가 3000rpm일 때 얻어졌습니다. 와류 진동 시간은 4분이었고 직경 1.5-2.0mm의 큰 유리 구슬과 직경 0.4-0.6mm의 작은 유리 구슬의 질량 비율은 1:1이었습니다. 키트의 기존 방법과 개선된 방법을 비교했습니다. 사용된 키트는 규조류 DNA 증폭의 요구를 충족시킬 수 있는 것으로 나타났으며, 물 샘플에서 개선된 방법으로 수행한 증폭 후 전기영동 밴드의 밝기는 기존 방법의 밝기와 유사했으며, 조직 샘플에서 개선된 방법으로 수행한 증폭 후 전기영동 밴드는 더 밝았습니다(그림 4).
그림 1: PCR 증폭 후 프로토콜을 사용하여 추출한 DNA의 전기영동 결과. 총 2μL의 DNA 추출물을 PCR 특이적 증폭을 위한 DNA 템플릿으로 사용했습니다. PCR 증폭 산물을 2% 아가로스 겔을 통해 1x TAE 완충 용액에 전기영동하고, 100V의 정전압에서 25-30분 동안 실행하였다. D2000 DNA ladder는 모든 겔에 사용되었습니다. (A) PCR 증폭 후 물 샘플에서 규조류 DNA의 전기영동 결과, 레인 1은 블랭크 대조군입니다. 2-7번 레인은 같은 지역의 다른 위치에서 채취한 물 샘플입니다. (B) 조직 내 규조류 DNA의 PCR 증폭 후 전기영동 결과. 레인 1-6은 동일한 폐 조직의 다른 위치에서 절제된 조직입니다. 레인 7은 빈 컨트롤입니다. (C) 실패한 실험에서 규조류 DNA 증폭 후 전기 영동 결과는 해당 위치에 전기 영동 밴드를 보여주지 않았으며, 이는 증폭 생성물이 없거나 증폭 생성물이 너무 적음을 나타냅니다. 이때, 전기영동 결과는 제안된 DNA 용액에 규조류 DNA가 있는지 여부를 나타낼 수 없었으며, 이는 보다 민감한 방법(예: PCR-용융 곡선)에 의해 수행되어야 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 규조류 DNA qPCR 증폭 곡선. 기존 PCR과 아가로스 겔 전기영동에서 밴드가 나타나지 않는 총 2μL의 DNA 용액 추출물을 템플릿으로 사용하여 Real-Time 형광 정량 PCR 시스템을 준비하고 프로그램을 설정하였습니다. 마지막으로, 선형 기준선 위상, 지수 위상의 시작, 지수 위상 및 고원 위상의 4가지 특징적인 단계를 갖는 전형적인 증폭 곡선을 얻었습니다. 분석을 통해 각 곡선의 Ct 값도 얻어져 DNA 추출이 성공했음을 알 수 있습니다. 각 숫자는 해당 곡선의 Ct 값을 나타냅니다. 임계값은 5.2입니다. y축의 단위는 Rn입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 규조류 DNA 용융 곡선. 실시간 형광 정량 PCR 시스템을 사용하여 온도가 60-95°C에서 상승하는 프로그램을 설정했습니다. 이로 인해 용융 곡선이 생성되고 특이적으로 증폭된 이중 가닥 DNA가 고온에서 단일 가닥으로 용융되고 염료에 이중 가닥이 없으며 형광 값이 0이 될 때까지 감소했습니다. 그래프는 원래 그래프의 음의 역수를 취하여 얻었습니다. 가로 좌표는 온도를 나타내고, 가장 높은 피크 값에 해당하는 가로 좌표는 Tm 값이며, 그래프에서 용융 곡선의 Tm 값은 85.5 °C입니다. 각 곡선의 번호 매기기는 그림 1C의 각 차선 번호에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 개선된 공정의 전기영동 결과. (A) 유리 비드 비율과 와류 진동 시간의 다양한 조합에 대한 전기영동 결과. 대형유리구슬과 소유리구슬의 혼합질량비가 1:2인 레인 1, 4, 7, 10, 13레인, 대소유리구슬의 혼합질량비가 1:1인 레인 2, 5, 8, 11, 14레인, 대형유리구슬과 소형 유리구슬의 혼합질량비가 2:1인 레인 3, 6, 9, 12, 15레인, 진동 시간은 1-3 레인의 경우 2 분, 4-6 레인의 경우 3 분, 7-9 레인의 경우 4 분, 10-12 레인의 경우 5 분, 13-15 레인의 경우 6 분이었습니다. 레인 16은 빈 컨트롤입니다. (B) 개선 전후의 키트 추출 산물의 PCR 증폭 후 전기영동 결과. 레인 1-3은 물 샘플을 추출하기 위한 기존 방법이고, 레인 4-6은 물 샘플을 추출하기 위한 개선된 방법이며, 레인 7-9는 조직을 추출하는 기존 방법이며, 레인 10-12는 조직을 추출하기 위한 개선된 방법이며, 레인 13은 블랭크 컨트롤입니다. 결과는21에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 물 샘플 및 조직 샘플. 사용된 물 샘플은 실험실 근처의 연못에서 채취한 것으로, 사용된 조직 샘플은 익사한 시신의 폐 조직으로 확인되었습니다. (A) 실험용 물 샘플 채취 장소는 실험실 근처의 연못이었습니다. (B) 농축수 샘플 및 파쇄된 폐 조직 샘플. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 규조류의 현미경 사진. 이미지 (A)와 (B)는 400x 광학 현미경으로 촬영했습니다. 화살표는 규조류를 가리킵니다. 이미지 (C)와 (D)는 전자 현미경으로 촬영하였다. 이미지 (A)와 (B)는 익사 현장의 물 속에 있는 규조류를 보여줍니다. 규조류는 Fragilaria 와 Navicula라는 이름을 붙였습니다. 이미지 (C)와 (D)는 Nitzschia 와 Navicula라고 불리는 폐의 규조류를 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 과녁 | 프라이머 이름 | 순서 |
| 18S rDNA | forword 프라이머 D512 | 얏캇카그크차아태그cg |
| 리버스 프라이머 D978 | 겅탁갓그타트타아트크 |
표 1: 사용된 프라이머 목록. 이 표는 이 논문에 사용된 특정 프라이머의 염기서열, 이름 및 표적 영역을 설명합니다.
| PCR 반응 시스템 | |||
| Taq Mix Pro 2개 | 10 μL | ||
| forword 프라이머 D512 | 0.5 μL (10 μmol/L) | ||
| 리버스 프라이머 D978 | 0.5 μL (10 μmol/L) | ||
| 템플릿 DNA | 2 μL | ||
| 뉴클레아제가 없는 물 | 20 μL까지 | ||
| 참고: 빈 대조군 템플릿 DNA는 동일한 양의 뉴클레아제가 없는 물로 대체됩니다. | |||
| PCR 프로그램 | |||
| 온도 | 시간 | 사이클 | |
| 94 캜 | 10분 | 1 | |
| 94 캜 | 45들 | 40 | |
| 50 캜 | 45들 | ||
| 72 캜 | 1 민 | ||
| 72 캜 | 10분 | 1 | |
표 2: PCR 구성 요소. 이 표는 기존 PCR에 대한 반응 시스템의 구성과 PCR에 대한 반응 온도, 시간 및 주기 수의 설정을 설명합니다. 사용된 반응 시스템의 총 부피는 20μL였습니다.
| Real-Time 정량 PCR 반응 시스템 | |||
| qPCR 믹스 2개 | 10 μL | ||
| forword 프라이머 D512 | 0.45 μL (10 μmol/L) | ||
| 리버스 프라이머 D978 | 0.45 μL (10 μmol/L) | ||
| 템플릿 DNA | 2 μL | ||
| 뉴클레아제가 없는 물 | 20 μL까지 | ||
| 참고: 빈 대조군 템플릿 DNA는 동일한 양의 뉴클레아제가 없는 물로 대체됩니다. | |||
| Real-time 정량 PCR 프로그램 | |||
| 온도 | 시간 | 사이클 | |
| 94 캜 | 10분 | 1 | |
| 94 캜 | 45들 | 40 | |
| 50 캜 | 45들 | ||
| 72 캜 | 1 민 | ||
표 3: Real-Time 정량적 PCR 구성 요소. 이 표는 Real-Time 정량 PCR을 위한 반응 시스템의 구성과 PCR에 대한 반응 온도, 시간 및 사이클 수 설정에 대해 설명합니다. 사용된 반응 시스템의 총 부피는 20μL였습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
규조류 세포는 단단한 규산질 세포벽(17)에 의해 보호되며, 규조류 DNA를 추출하기 위해서는 이 구조를 파괴해야 한다. 일반 키트는 규조류의 규산 껍질을 쉽게 파괴하지 않습니다. 따라서 규조류 DNA21을 성공적으로 추출하는 것은 어렵다. 우리 연구실은 규조류 추출 과정에서 직경과 질량비가 다른 유리 구슬을 추가하여 가장 일반적으로 사용되는 혈액 DNA 추출 키트를 개선했습니다. 와류 진동이 동시에 수행되어 규조류 껍질을 완전히 깨고 규조류 DNA 추출 효과를 향상시킬 수 있습니다. 이전 보고서(21)에서 볼 수 있듯이 유리 구슬의 직경, 진동 강도 및 시간은 DNA 추출의 품질에 직접적인 영향을 미칩니다. 와류 진동 시간은 너무 길지 않아야 합니다(10분 이하). 시간이 너무 길면 과도한 진동으로 인해 DNA가 파손됩니다. 동시에 시간이 너무 짧아서는 안됩니다. 시간이 너무 짧으면(2분 이상) 규조류 껍질이 완전히 제거되지 않아 DNA 추출이 비효율적입니다. 유리 구슬을 선택하는 동안 원주 직경이 다른 구슬을 선택하는 동안 큰 유리 구슬은 충돌 강도를 보장하고 작은 유리 구슬은 충돌 파편화 과정에서 유리 구슬 사이에 죽은 충돌이 없도록 하여 쉘 파손의 효율성을 향상시킵니다.
샘플에서 규조류 DNA를 추출하려면 일반적으로 규조류를 농축해야 합니다. 이 과정은 규조류 DNA 추출에 큰 영향을 미칩니다. 농축의 목적은 추출된 규조류 DNA의 농도가 검출 가능한 범위에 있을 수 있도록 샘플에서 규조류의 농도를 증가시키는 것입니다. Real-Time 형광 정량 PCR 및 고처리량 염기서열분석과 같은 다음 단계 응용 분야에 적합합니다.
규조류는 자연계에 널리 분포되어 있기 때문에4 실험실 오염을 방지하는 것이 최우선 과제이다28. DNA 추출 과정에서 오염이 발생하면 실제 결과와 차이가 발생하고 사용 가치가 손실됩니다. 따라서 규조류 DNA를 추출할 때 항상 무균 작동 원리에 주의를 기울이고 외인성 규조류의 오염을 줄이고 피하기 위해 가능한 모든 조치를 취하십시오. 시체에서 조직을 추출할 때 외인성 규조류에 의해 오염되지 않도록 조치를 취해야 합니다. 조직을 추출한 후에는 규조류 오염이 없는 용기 또는 샘플 백에 보관해야 합니다. 조직은 포름알데히드로 처리해서는 안 됩니다. 조직 추출 및 처리 장비는 증류수로 2-3회 반복적으로 세척한 다음 자외선 또는 고온으로 멸균하여 다른 출처에서 규조류가 오염되지 않도록 해야 합니다. 검사 전 조직은 규조류가 없는 기구로 표재성 조직에서 잘라낸 다음 기구를 교체하여 검사를 위해 하부 조직을 골라내야 합니다. 동시에 운영 프로세스를 표준화하면 실험실 오염 문제도 효과적으로 피할 수 있습니다.
규조류는 많은 수생 생물의 먹이이기 때문에, 장기 보관 시 손실될 것이다29. 규조류는 빛 조건에서도 성장하고 번식할 수 있습니다. 따라서 DNA 추출 단계는 샘플링 후 가능한 한 빨리 시작되어야 하며 샘플에서 규조류가 손실되는 것을 방지하기 위해 빠른 샘플 처리를 수행해야 합니다. DNA 추출을 즉시 수행할 수 없는 경우 모든 샘플을 냉동하고 어두운 곳에 보관하여 규조류가 최대한 감소하지 않도록 해야 합니다.
우리의 연구는 proteinase K 분해 방법을 기반으로 하는 일반적이고 저렴한 혈액 DNA 추출 키트를 선택했으며, 이는 물 샘플과 조직에서 규조류 DNA를 추출하여 좋은 결과를 얻었습니다30. 조직이 proteinase K와 완전히 접촉할 수 있을 만큼 충분히 절단되고 조직이 완전히 소화됩니다. 성공적인 추출의 가능한 원리는 다음과 같습니다 : 흔들리는 단계 동안 규조류의 단단한 껍질이 빠르게 움직이는 유리 구슬 사이에 반복적으로 충격을 받고 파편화되어 세포막을 노출시킵니다. 크기가 다른 유리 구슬의 구성은 단일 크기의 유리 구슬의 충돌 사이의 간격을 메워 충돌 접촉면을 가능한 한 완전히 덮을 수 있습니다. 실리콘 껍질을 잃은 후 proteinase K는 규조류에서 DNA를 방출하는 데 도움이 됩니다. 현재 사용되는 토양 DNA 추출 키트와 비교하여 개선된 혈액 DNA 추출 키트는 규조류 DNA 추출의 요구 사항을 충족할 수 있어 보다 경제적이고 쉽게 얻을 수 있습니다. 법의학 규조류 검사의 사용을 용이하게 할 뿐만 아니라 다른 규조류 연구 관련 분야에 적용하기에 적합하며 다른 플랑크톤 DNA 추출에도 사용할 수 있습니다. 물 샘플에서 규조류 DNA를 추출할 때 사용되는 단백질 분해효소 K의 양은 물 속의 플랑크톤 수에 따라 조정되어야 합니다. proteinase K의 양은 예비 실험에 따라 증가하거나 감소할 수 있습니다. 조직에서 규조류 DNA를 추출할 때 다양한 장기 조직 유형, 조직 오염 및 기타 요인이 소화에 필요한 단백질 분해 효소 K의 양에 영향을 미칩니다. 실험에서 키트의 proteinase K는 사용 후 -20°C에서 보관해야 하며, 그렇지 않으면 proteinase K의 비활성화가 추출 과정에 영향을 미칩니다.
결론적으로, 규조류 DNA 추출은 샘플링 및 샘플 처리 후 가능한 한 빨리 수행되어야 하며, 그렇지 않으면 보존을 위해 -20°C에서 보관해야 합니다. 시료 취급, 보관 및 전체 추출 공정은 외인성 규조류에 의한 오염을 방지하기 위해 신중하게 수행되어야 합니다. 그렇지 않으면 추출된 규조류 DNA가 샘플 또는 외인성 오염에 있었는지 평가할 수 없습니다. proteinase K를 사용하여 조직을 소화할 때 복용량이 문제가 될 수 있습니다. 조직 소화가 불충분하면 단백질 분해 효소 K의 양이 증가할 수 있습니다. 따라서 조직을 적절하게 깎는 것이 중요합니다. 조직의 충분한 소화는 또한 조직 파편이 흡착 컬럼 내부의 원형질막을 막는 것을 방지합니다. 멤브레인이 막힌 후에는 피펫 팁을 사용하여 막힌 부분을 골라내거나 반복적으로 원심분리할 수 없어 멤브레인이 손상됩니다. 최종 DNA 용액에는 규조류 DNA 검출에 영향을 미치는 많은 불순물이 포함되어 있습니다. 진동 강도와 시간도 중요한 문제입니다. 첫 번째 와류 진동 시간은 4-5분으로 제어되고 진동 주파수는 3000rpm으로 제어되며, 그렇지 않으면 DNA 추출이 영향을 받습니다. PCR 후 전기영동 밴드가 명확하지 않으면 DNA 주형의 양을 더 늘려야 할 수도 있습니다. 본 연구에서 추출한 DNA는 규조류 DNA와 다른 종의 DNA를 포함한 DNA가 혼합된 것이므로 규조류 DNA의 농도를 확인할 수 없다. 따라서 고순도의 DNA 템플릿이 필요한 응용 분야에는 적합하지 않습니다.
연구에 따르면 상이한 규조류 종은 상이한 프라이머에 의해 증폭될 수 있다31,32. 이 연구에서는 규조류 18S rDNA의 규조류 특이적 프라이머 D512 및 D978만 사용하여 규조류 DNA가 성공적으로 추출되었는지 여부를 테스트했으며, 이는 모든 규조류 종22,33을 포함할 수 없었습니다. 또한, 한 쌍의 프라이머의 증폭 산물 단편의 길이가 390-410 bp이므로, 개선된 방법은 규조류 DNA의 모든 단편 크기를 선택하여 실험 파라미터에 영향이 있는지 여부를 테스트하므로 추가 연구가 필요합니다. 후속 연구에서는 추출 효과를 탐구하기 위해 다양한 영역과 다양한 증폭 길이의 프라이머를 사용합니다.
기존의 규조류 DNA 추출 방법과 비교할 때 이 방법은 저비용 및 대규모 규조류 DNA 추출의 주요 장점이 있습니다. 규조류 형태학적 방법의 장점을 보완할 수 있으며 1차 법의학 실험실에서 익사 진단의 요구를 충족할 수 있습니다. 동시에 규조류 DNA 추출 키트의 선택 범위를 확장하고 응용 전망이 좋습니다. 앞으로 이 방법은 규조류 DNA의 추출에만 국한되지 않고 다른 조류로부터 DNA를 추출하는 데에도 사용될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82060341,81560304)과 하이난성 학술 혁신 플랫폼 과학 연구 프로젝트 (YSPTZX202134)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
