Summary
Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de diatomeas utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.
Abstract
La prueba de diatomeas es un medio auxiliar esencial en la práctica forense para determinar si el cadáver se ahogó en el agua e inferir el lugar del ahogamiento. Las pruebas de diatomeas también son un importante contenido de investigación en el campo del medio ambiente y el plancton. La tecnología de pruebas de biología molecular de diatomeas, que se centra en el ADN de diatomeas como objeto de investigación principal, es un nuevo método de prueba de diatomeas. La extracción de ADN de diatomeas es la base de las pruebas moleculares de diatomeas. En la actualidad, los kits comúnmente utilizados para la extracción de ADN de diatomeas son costosos, lo que aumenta el costo de llevar a cabo investigaciones relacionadas. Nuestro laboratorio mejoró el kit general de extracción rápida de ADN genómico de sangre entera y obtuvo un efecto satisfactorio de extracción de ADN de diatomeas, proporcionando así una solución alternativa de extracción de ADN económica y asequible basada en perlas de vidrio para la investigación relacionada. El ADN de diatomeas extraído mediante este protocolo podría satisfacer muchas aplicaciones posteriores, como la PCR y la secuenciación.
Introduction
En la práctica forense, determinar si un cadáver encontrado en el agua ahogándose o fue arrojado al agua después de la muerte es esencial para la correcta resolución del caso1. También es una de las cuestiones difíciles que deben resolverse con urgencia en la práctica forense2. Las diatomeas son abundantes en el medio natural (especialmente en el agua)3,4. En el proceso de ahogamiento, debido a la hipoxia y la respuesta al estrés, las personas tendrán movimientos respiratorios intensos e inhalarán una gran cantidad de líquido de ahogamiento. Por lo tanto, las diatomeas en el agua ingresan al pulmón con el líquido que se ahoga, y algunas diatomeas pueden ingresar a la circulación sanguínea a través de la barrera alveolar-capilar y extenderse a los órganos internos con el flujo sanguíneo 5,6. La detección de diatomeas en tejidos y órganos internos como pulmón, hígado y médula ósea es una fuerte evidencia de ahogamiento antes de la muerte 7,8. En la actualidad, las pruebas forenses de diatomeas se basan principalmente en métodos de pruebas morfológicas. Después de una serie de predigestión del tejido, las estimaciones morfológicas cualitativas y cuantitativas de las diatomeas no digeridas se llevan a cabo bajo el microscopio. Durante este período, es necesario utilizar reactivos peligrosos y poco respetuosos con el medio ambiente, como el ácido nítrico. Este proceso requiere mucho tiempo y requiere que los investigadores tengan sólidos conocimientos taxonómicos y una amplia experiencia. Todo esto conlleva ciertos desafíos para el personal forense9. La tecnología de prueba de ADN de diatomeas es una nueva tecnología para la prueba de diatomeas desarrollada en los últimos años 10,11,12. Esta tecnología realiza la identificación de especies de diatomeas mediante el análisis de la composición específica de la secuencia de ADN de las diatomeas13,14. La tecnología de PCR y la tecnología de secuenciación son métodos técnicos comúnmente utilizados, pero su base es la extracción exitosa de ADN de diatomeas. Sin embargo, las diatomeas tienen una estructura especial diferente a la de otros organismos, lo que hace que sus técnicas de extracción de ADN también sean diferentes.
La pared celular de la diatomea tiene un alto grado de silicificación, y su componente principal es el dióxido de silicio 15,16,17. La pared celular silícea es muy dura y debe ser destruida antes de extraer el ADN. Los kits de extracción de ADN ordinarios suelen ser difíciles de utilizar directamente para la extracción de ADN de diatomeas porque no pueden destruir la capa silícea de diatomeas18. Por lo tanto, la destrucción de la capa silícea de las diatomeas es uno de los problemas técnicos clave a resolver en la extracción del ADN de diatomeas.
Al mismo tiempo, dado que el número de diatomeas contenidas en las muestras de investigación forense, ya sean muestras de agua u órganos y tejidos de cuerpos ahogados, suele ser limitado, es necesario enriquecer las diatomeas. La esencia del enriquecimiento es la separación de sustancias. Al tratar de juntar diatomeas, minimice el contenido de otros componentes materiales (componentes que interfieren). En el trabajo forense, los laboratorios a menudo utilizan métodos de enriquecimiento por centrifugación o filtración por membrana para separar las células de diatomeas19. Sin embargo, dado que el equipo de bombeo de vacío no se usa ampliamente, el método de enriquecimiento por membrana no se usa a menudo en los laboratorios forenses primarios ordinarios. Por lo tanto, el método de centrifugación sigue siendo comúnmente el enriquecimiento de diatomeas en los laboratorios forenses20.
La extracción de ADN a partir de diatomeas se utiliza actualmente principalmente en la práctica forense, y existen importantes limitaciones para su aplicación. En la actualidad, existen pocos kits de extracción de ADN de diatomeas utilizados en la ciencia forense en el mercado y generalmente son caros21. Este artículo proporciona un método mejorado de extracción de ADN de diatomeas, lo que hace que la extracción de ADN de diatomeas sea simple, conveniente y rentable. Esto aumenta la aplicación de las pruebas posteriores de biología molecular de las diatomeas y puede resolver mejor los problemas relacionados con el ahogamiento en la medicina forense a través de las pruebas de diatomeas. Este método rompe las paredes celulares silíceas de las diatomeas mediante la adición de perlas de vidrio y el establecimiento de un tiempo apropiado para el vórtice. De esta manera, la proteinasa K y la solución de unión lisan rápidamente las células e inactivan varias enzimas en las células. El ADN genómico se absorbe en la membrana de la matriz en la columna de adsorción y finalmente es eluido por el tampón de elución. Un kit de extracción de genes de sangre total mejorado mejora el efecto de extracción de ADN de diatomeas del kit de sangre en materiales de examen forense, reduce el costo de la extracción de ADN de diatomeas en la práctica forense y se puede aplicar mejor a la investigación forense de base.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Hainan. Las muestras de tejido utilizadas en este estudio no se consideran estudios con seres humanos. Estos especímenes se obtuvieron con el propósito de realizar un diagnóstico patológico forense, y el resto se utilizó para la extracción de ADN de diatomeas en este experimento. Los investigadores no pueden identificar fácilmente a las personas para obtener el consentimiento informado de las partes interesadas pertinentes.
NOTA: Para garantizar la aplicabilidad general del método de investigación reportado en este experimento, este experimento siguió básicamente las instrucciones de operación del kit utilizado, y solo se modificaron algunos pasos. Las muestras de agua utilizadas en este experimento se tomaron aleatoriamente de estanques cercanos al laboratorio (Figura suplementaria 1A). En este experimento, se confirmó que el tejido pulmonar del cuerpo ahogado era el tejido de investigación para demostrar el protocolo de extracción (Figura suplementaria 1B). En la práctica forense, a veces también es necesario utilizar otros órganos y tejidos de cuerpos ahogados (como hígado, bazo, riñón, médula ósea, etc.) para extraer el ADN de diatomeas, lo que requiere pequeñas mejoras correspondientes a este método experimental, que se explicarán en la sección correspondiente del experimento. Las muestras de tejido pulmonar utilizadas en este experimento procedían de cadáveres que estaban claramente ahogados en casos forenses. Se han realizado pruebas morfológicas para demostrar que el tejido pulmonar contiene diatomeas (Figura complementaria 2).
1. Pretratamiento de las muestras
- Pretratamiento de muestras de agua
- Tome 10 ml de muestra de agua en el tubo de la centrífuga y centrifugue a 13.400 x g durante 5 min. Deseche cuidadosamente 9,8 ml de sobrenadante con una pistola de pipetas y transfiera aproximadamente 200 μl de la muestra de agua de diatomeas enriquecida que queda en el fondo a un tubo de centrífuga de 2 ml.
NOTA: El pre-experimento se puede llevar a cabo primero, y la cantidad inicial se puede aumentar si una muestra de agua de 10 ml no es suficiente para el enriquecimiento.
- Tome 10 ml de muestra de agua en el tubo de la centrífuga y centrifugue a 13.400 x g durante 5 min. Deseche cuidadosamente 9,8 ml de sobrenadante con una pistola de pipetas y transfiera aproximadamente 200 μl de la muestra de agua de diatomeas enriquecida que queda en el fondo a un tubo de centrífuga de 2 ml.
- Pretratamiento de muestras de tejido
- Tome 0,5 g del tejido del margen pulmonar del cuerpo ahogado, pique o muela completamente el tejido pulmonar hasta que se vuelva fangoso. La prevención de la contaminación de diatomeas exógenas es el núcleo de este paso. Corta el pañuelo en pedazos repetidamente con unas tijeras.
2. Extracción de ADN
NOTA: Todos los pasos de centrifugación se completan a temperatura ambiente. Utilizando una centrífuga de sobremesa con una fuerza centrífuga de 14.500 x g; antes de comenzar el experimento es necesario preparar un baño de agua (o baño de metal) precalentado a 70 °C. Todos los pasos deben seguir estrictamente los principios de funcionamiento aséptico.
- Ensamblaje de muestras de agua y tejidos
NOTA: La muestra de agua y el método de extracción de ADN de diatomeas tisulares son los mismos.- Agregue perlas de vidrio a un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga la muestra de agua pretratada. Invierta 10x-15x para mezclar bien. Las perlas de vidrio añadidas se componen de perlas de vidrio grandes y pequeñas mezcladas en una proporción de masa de 1:1. El diámetro de las cuentas de vidrio grandes es de 1,5-2,0 mm y el de las cuentas de vidrio pequeñas es de 0,4-0,6 mm.
- Tome 0,5 g de pañuelo finamente picado, agregue perlas de vidrio a un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga el tejido como se describió anteriormente. Invierta 10x-15x para mezclar.
- Añadir 40 μL de proteinasa K (20 mg/mL) a las sondas. Coloque a temperatura ambiente durante 15 minutos, durante este período, invierta y mezcle 10 veces cada 3 minutos.
NOTA: Si el tejido no se digiere completamente, la cantidad de proteinasa K se puede aumentar adecuadamente hasta que la solución se vuelva clara. - Añadir 200 μL de tampón de unión a los tubos de centrífuga, inmediatamente en vórtice, y mezclar durante 4 min (frecuencia de mezcla de oscilación: 3000 rpm).
NOTA: En este paso, la intensidad y el tiempo de agitación deben controlarse estrictamente para garantizar una intensidad y un tiempo de mezcla suficientes. - Coloque los tubos de centrífuga en un baño de agua a 70 °C durante 10 minutos y la solución se vuelve clara.
- Agregue 100 μL de isopropanol a los tubos de la centrífuga, vórtice y mezcle durante 15 s, puede aparecer precipitación de floculante en este momento.
NOTA: Es muy importante mezclar bien con la fuerza adecuada en los pasos de operación anteriores, pero se debe evitar agitar vigorosamente para evitar el cizallamiento del ADN. - Coloque la solución obtenida en el paso anterior junto con el precipitado floculante en la columna de adsorción (la columna de adsorción se coloca en el tubo de recolección). La longitud de la columna de adsorción es de 3,0 cm, el diámetro es de 1,0 cm y la matriz de adsorción es una membrana de matriz de silicio.
- Centrifugar a 8.000 x g durante 30 s, desechar el líquido residual en el tubo de recogida y volver a colocar la columna de adsorción en el tubo de recogida.
- Añadir 500 μL de tampón de eliminación de inhibidores a la columna de adsorción. Centrifugar a 13.400 x g durante 30 s y desechar el líquido residual en el tubo de recogida.
- Añadir 700 μL de tampón de lavado a la columna de adsorción. Centrifugar a 13.400 x g durante 30 s y desechar el líquido residual en el tubo de recogida.
NOTA: Agregue la cantidad especificada de etanol absoluto a la botella de tampón de lavado antes del primer uso. - Añadir 500 μL de tampón de lavado a la columna de adsorción. Centrifugar a 13.400 x g durante 30 s y desechar el líquido residual en el tubo de recogida.
- Vuelva a colocar la columna de adsorción en el tubo de recolección vacío. Centrifugar a 14.500 x g durante 2 minutos y retirar el tampón de lavado en la medida de lo posible, para evitar que el etanol residual en el tampón de lavado inhiba las reacciones posteriores.
- Saque la columna de adsorción y colóquela en un tubo de centrífuga limpio. Añadir 100 μL de tampón de elución a la parte media de la membrana de adsorción.
- Coloque la columna de adsorción a temperatura ambiente durante 3-5 minutos y centrifugue a 13.400 x g durante 1 minuto.
- Añadir de nuevo la solución obtenida en el paso anterior a la columna de adsorción centrífuga. Coloque la columna de adsorción centrífuga a temperatura ambiente durante 2 minutos y centrifugue a 13.400 x g durante 1 minuto.
NOTA: El tampón de elución debe precalentarse en un baño de agua a 70 °C durante unos 10 min. El volumen de elución no debe ser inferior a 50 μL; de lo contrario, el rendimiento de ADN se reducirá. - Almacene el ADN de diatomeas extraído a 2-8 °C para su uso futuro. Si la solución de ADN se va a almacenar durante mucho tiempo, guárdela a -20 °C.
3. Prueba PCR
NOTA: Dado que el contenido de diatomeas en las muestras forenses suele ser bajo, los extractos de muestras de tejido de los cuerpos ahogados también pueden contener diversos grados de tejido y órganos (como los pulmones en este experimento) con su propio ADN. Por lo tanto, la detección directa del ADN total en los extractos de ADN no refleja la situación de la extracción de ADN de diatomeas. En este experimento, se seleccionaron cebadores específicos para diatomeas y se utilizaron productos de PCR para evaluar la extracción de ADN de diatomeas en el extracto. Los productos se pueden observar y analizar mediante electroforesis en gel de agarosa y también se pueden analizar mediante una curva de fusión de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real, que tiene una mayor sensibilidad.
- Añadir 2 μL del ADN extraído de muestras de agua y tejidos como plantilla. Elija uno de los dos métodos siguientes para la inspección.
- Prueba PCR convencional
- Utilice cebadores22 que puedan amplificar específicamente los fragmentos de ADNr de diatomeas 18S. Para obtener más información, consulte la Tabla 1.
- Establecer el sistema de reacción de PCR y las condiciones de amplificación de acuerdo con las características de los cebadores. Para obtener más información, consulte la Tabla 2.
- Ejecute los productos de amplificación de PCR en gel de agarosa al 2%. Observe y analice las imágenes con un generador de imágenes en gel.
- Prueba PCR cuantitativa fluorescente
- Utilice los cebadores anteriores que pueden amplificar específicamente fragmentos de ADNr de diatomeas 18S para preparar un sistema de reacción de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real. Para obtener más información, consulte la Tabla 3.
- Realizar la amplificación por PCR y analizar la curva de amplificación obtenida y los valores de Ct. Al mismo tiempo, establezca un programa, derrita las hebras dobles de los productos amplificados en hebras simples gradualmente a través de la tecnología de curva de fusión de PCR cuantitativa fluorescente y luego analice las curvas de fusión obtenidas.
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Representative Results
Dado que la solución de ADN extraída por el método de extracción de ADN utilizado actualmente contiene todos los componentes de ADN de diferentes fuentes en la muestra, el ADN obtenido por este protocolo no fue una excepción. Por lo tanto, la solución de ADN no era solo una solución de ADN genómico de diatomeas. Los cebadores que pueden amplificar específicamente los fragmentos de ADNr de diatomeas 18S fueron seleccionados mediante la consulta de la literatura 22,23,24. Los cebadores fueron verificados por NCBI-Blast Primer, y los resultados mostraron que el cebador directo D512 y el cebador inverso D978 del ADNr 18S eran cebadores específicos de algas y cubrían muchas especies de diatomeas. Los resultados de la amplificación no mostraron ningún gen humano. Se utilizaron como un biomarcador de ADN confiable para la prueba de diatomeas, por lo que se seleccionaron para la verificación de los resultados de este experimento. Utilizando el ADN extraído como plantilla para la amplificación de PCR específica de diatomeas, el producto de amplificación por electroforesis en gel de agarosa mostró que las muestras de agua y los tejidos tenían bandas de ADN de diatomeas, estas bandas de electroforesis estaban entre 250 y 500 pb (más cerca de 500 pb), en línea con el tamaño de la longitud del producto de amplificación del objetivo del cebador (390 -410 pb). Esto demostró que el protocolo de extracción tuvo éxito en la extracción de ADN de diatomeas (Figura 1A, B).
La tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real es un tipo de tecnología de prueba genética con estricta especificidad y alta sensibilidad. Al agregar grupos fluorescentes en el sistema de reacción de PCR, la acumulación de señales fluorescentes puede hacer que todo el proceso de PCR se monitoree en tiempo real, y la sensibilidad es alta25,26. Los productos amplificados específicamente por PCR convencional a veces pueden ser difíciles de observar en la electroforesis en gel de agarosa debido al bajo contenido y otras razones27 (Figura 1C). A través de la amplificación específica de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real, se obtuvo una curva de amplificación típica con cuatro etapas características (Figura 2). Al mismo tiempo, a través de la tecnología de curva de fusión de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real, las hebras dobles de ADN del producto amplificado se fundieron en hebras simples a alta temperatura, el tinte se liberó de las hebras dobles y el valor de fluorescencia disminuyó. Al detectar el cambio en el valor de fluorescencia, se obtuvo la curva de fusión (Figura 3). Las curvas de fusión obtenidas tuvieron picos característicos, y el valor máximo fue de alrededor de 85,5 °C, lo que demostró que hubo una amplificación específica del ADN diana, lo que indica que había ADN de diatomeas en la solución de ADN extraída. El colorante también podría agregarse directamente al producto de amplificación de PCR convencional, y la curva de fusión podría obtenerse mediante la tecnología de curva de fusión de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real para demostrar si hubo amplificación específica. Por lo tanto, cuando la electroforesis convencional en gel de PCR-agarosa no pudo demostrar si había ADN de diatomeas en la solución de ADN extraída, se pudo seleccionar la tecnología de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real con mayor sensibilidad para su verificación y evaluación. En este experimento, la tecnología de curva de fusión de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real solo se utilizó para el análisis cualitativo.
Como se mostró en un informe anterior21, el kit tradicional de extracción de ADN del suelo y el kit de extracción de ADN sanguíneo modificado eran básicamente los mismos para la extracción de ADN de diatomeas de muestras de agua y tejidos. La diferencia de costo de la extracción de ADN de diatomeas fue principalmente la diferencia de precio de los dos kits, y el costo de otros consumibles fue básicamente el mismo. En este estudio, una simple mejora del kit de extracción de ADN sanguíneo comúnmente utilizado en experimentos de biología molecular podría obtener mejores resultados experimentales, lo que no solo aumentó el alcance de los investigadores para seleccionar el kit de prueba en actividades de investigación relacionadas con la extracción de ADN de diatomeas, sino que también redujo el costo de las pruebas.
El proceso de mejora de este protocolo ha sido publicado21. Al diseñar la combinación de diferentes proporciones de masa de perlas de vidrio y tiempo de oscilación de vórtice, se agregaron al kit convencional las condiciones óptimas de extracción de ADN de la oscilación de perlas de vidrio, por lo tanto, el método podría mejorar el efecto de extracción de ADN de diatomeas en muestras forenses, especialmente en muestras de tejido. La combinación óptima de extracción de ADN se obtuvo cuando la frecuencia de oscilación del vórtice fue de 3000 rpm; El tiempo de oscilación del vórtice fue de 4 min, la relación de masa de las perlas de vidrio grandes con un diámetro de 1,5-2,0 mm y las perlas de vidrio pequeñas con un diámetro de 0,4-0,6 mm fue de 1:1. Se realizó una comparación entre el método convencional del kit y el método mejorado. Se demostró que el kit utilizado podía satisfacer las necesidades de amplificación del ADN de diatomeas, y el brillo de las bandas electroforéticas después de la amplificación realizada por el método mejorado en muestras de agua fue similar al brillo del método convencional, y las bandas electroforéticas después de la amplificación realizada por el método mejorado en muestras de tejido fueron más brillantes (Figura 4).
Figura 1: Resultados de la electroforesis del ADN extraído mediante el protocolo después de la amplificación por PCR. Se utilizó un total de 2 μL de extracto de ADN como molde de ADN para la amplificación específica de PCR. Los productos de amplificación de PCR se electroforezaron en 1x solución tampón TAE a través de gel de agarosa al 2% y se ejecutaron a un voltaje constante de 100 V durante 25-30 min. Se utilizó una escalera de ADN D2000 para todos los geles. (A) Los resultados de la electroforesis del ADN de diatomeas en muestras de agua después de la amplificación por PCR, el carril 1 es el control en blanco; Los carriles 2-7 son muestras de agua de diferentes lugares en la misma área. (B) Los resultados de la electroforesis después de la amplificación por PCR del ADN de diatomeas en el tejido. Los carriles 1-6 son los tejidos extirpados de diferentes posiciones del mismo tejido pulmonar; El carril 7 es el control en blanco. (C) En un experimento fallido, después de la amplificación del ADN de diatomeas, los resultados de la electroforesis no mostraron bandas de electroforesis en las posiciones correspondientes, lo que indica que no había productos de amplificación o muy pocos productos de amplificación. En este momento, los resultados de la electroforesis no podían indicar si había ADN de diatomeas en la solución de ADN propuesta, lo que debía llevarse a cabo mediante métodos más sensibles (como una curva de fusión por PCR). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curva de amplificación de qPCR del ADN de diatomeas. Un total de 2 μL de extracto de solución de ADN que no mostró bandas por PCR convencional y electroforesis en gel de agarosa se utilizó como plantilla para preparar un sistema de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real y establecer un programa. Finalmente, se obtuvieron curvas de amplificación típicas con cuatro etapas características de fase de línea de base lineal, el inicio de la fase exponencial, la fase exponencial y la fase de meseta. El valor de Ct de cada curva también se obtuvo a través del análisis, lo que indica que la extracción de ADN fue exitosa. Cada número representa el valor Ct de la curva correspondiente. El umbral es 5.2. La unidad del eje Y es Rn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Curva de fusión del ADN de diatomeas. Utilizando un sistema de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, se estableció un programa en el que la temperatura aumenta de 60 a 95 °C. Esto generó una curva de fusión y el ADN bicatenario específicamente amplificado se derritió en hebras simples a altas temperaturas, el colorante estaba libre de las hebras dobles y el valor de fluorescencia disminuyó hasta que fue 0. La gráfica se obtuvo tomando el recíproco negativo de la gráfica original. La abscisa representó la temperatura, la abscisa correspondiente al valor pico más alto fue el valor Tm y el valor Tm de la curva de fusión en el gráfico fue de 85,5 °C. La numeración de cada curva corresponde a la numeración de cada carril en la Figura 1C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados de la electroforesis del proceso mejorado. (A) Resultados de la electroforesis para diferentes combinaciones de relaciones de perlas de vidrio y tiempos de oscilación del vórtice. Carriles 1, 4, 7, 10 y 13 donde la relación de masa mixta de perlas de vidrio grandes y pequeñas es de 1:2, carriles 2, 5, 8, 11 y 14 donde la relación de masa mixta de perlas de vidrio grandes y pequeñas es de 1:1, carriles 3, 6, 9, 12 y 15 donde la relación de masa mixta de perlas de vidrio grandes y pequeñas es de 2:1, y los tiempos de oscilación fueron de 2 minutos para los carriles 1-3, 3 minutos para los carriles 4-6, 4 minutos para los carriles 7-9, 5 minutos para los carriles 10-12 y 6 minutos para los carriles 13-15. El carril 16 es el control en blanco. (B) Resultados de la electroforesis después de la amplificación por PCR de los productos de extracción del kit antes y después de la mejora. Los carriles 1-3 son métodos convencionales para extraer muestras de agua, los carriles 4-6 son métodos mejorados para extraer muestras de agua, los carriles 7-9 son métodos convencionales para extraer tejidos, los carriles 10-12 son métodos mejorados para extraer tejidos, el carril 13 es un control en blanco. Los resultados han sido modificados a partir de21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Muestras de agua y muestras de tejido. Las muestras de agua utilizadas se tomaron de un estanque cercano al laboratorio, y las muestras de tejido utilizadas se confirmaron como tejido pulmonar del cuerpo ahogado. (A) El sitio experimental de recolección de muestras de agua fue un estanque cerca del laboratorio. (B) Muestras de agua enriquecida y muestras de tejido pulmonar triturado. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Micrografía de diatomeas. Las imágenes (A) y (B) fueron tomadas bajo un microscopio óptico de 400x. La flecha apunta a las diatomeas. Las imágenes (C) y (D) fueron tomadas bajo un microscopio electrónico. Las imágenes (A) y (B) muestran las diatomeas en el agua en el lugar del ahogamiento. Las diatomeas llamadas Fragilaria y Navicula. Las imágenes (C) y (D) muestran diatomeas en los pulmones, que se llaman Nitzschia y Navicula. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Blanco | Nombre del cebador | Secuencia |
| ADNr 18S | imprimación para palabras D512 | ATTCCAGCTCCAATAGCG |
| imprimación inversa D978 | GACTACGATGGTATCTAATC |
Tabla 1: Lista de imprimaciones utilizadas. En esta tabla se describen las secuencias, los nombres y las regiones de destino de los cebadores específicos utilizados en este documento.
| Sistema de reacción PCR | |||
| 2x Taq Mix Pro | 10 μL | ||
| imprimación para palabras D512 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| imprimación inversa D978 | 0,5 μL (10 μmol/L) | ||
| ADN de la plantilla | 2 μL | ||
| Agua libre de nucleasas | hasta 20 μL | ||
| Nota: El ADN de la plantilla de control en blanco se reemplaza por la misma cantidad de agua libre de nucleasa. | |||
| Programa de PCR | |||
| temperatura | Hora | Ciclos | |
| 94 °C | 10 minutos | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 minuto | ||
| 72 °C | 10 minutos | 1 | |
Tabla 2: Componentes de la PCR. Esta tabla describe la configuración del sistema de reacción para la PCR convencional y los ajustes de la temperatura de reacción, el tiempo y el número de ciclos para la PCR. El volumen total del sistema de reacción utilizado fue de 20 μL.
| Sistema de reacción de PCR cuantitativa en tiempo real | |||
| 2x mezcla de qPCR | 10 μL | ||
| imprimación para palabras D512 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| imprimación inversa D978 | 0,45 μL (10 μmol/L) | ||
| ADN de la plantilla | 2 μL | ||
| Agua libre de nucleasas | hasta 20 μL | ||
| Nota: El ADN de la plantilla de control en blanco se reemplaza por la misma cantidad de agua libre de nucleasa. | |||
| Programa de PCR cuantitativa en tiempo real | |||
| temperatura | Hora | Ciclos | |
| 94 °C | 10 minutos | 1 | |
| 94 °C | 45 s | 40 | |
| 50 °C | 45 s | ||
| 72 °C | 1 minuto | ||
Tabla 3: Componentes cuantitativos de la PCR en tiempo real. Esta tabla describe la configuración del sistema de reacción para la PCR cuantitativa en tiempo real y los ajustes de la temperatura, el tiempo y el número de ciclos de reacción para la PCR. El volumen total del sistema de reacción utilizado fue de 20 μL.
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Discussion
Las células de diatomeas están protegidas por paredes celulares silíceas duras17, y esta estructura debe ser destruida para extraer el ADN de diatomeas. Los kits ordinarios no destruyen fácilmente la cáscara silícea de las diatomeas; por lo tanto, es difícil extraer con éxito el ADN de diatomeas21. Nuestro laboratorio mejoró el kit de extracción de ADN sanguíneo más utilizado, añadiendo perlas de vidrio de diferentes diámetros y diferentes proporciones de masa en el proceso de extracción de diatomeas. La oscilación del vórtice se lleva a cabo al mismo tiempo, lo que puede romper completamente la cubierta de diatomeas y mejorar el efecto de extracción de ADN de diatomeas. Como se mostró en el informe anterior21, el diámetro de las perlas de vidrio, la intensidad de la oscilación y el tiempo afectarían directamente la calidad de la extracción de ADN. El tiempo de oscilación del vórtice no debe ser demasiado largo (no más de 10 min). Si el tiempo es demasiado largo, el ADN se romperá debido a una vibración excesiva. Al mismo tiempo, el tiempo no debe ser demasiado corto. Si el tiempo es demasiado corto (no menos de 2 minutos), la cubierta de diatomeas no se eliminará por completo, lo que hará que la extracción de ADN sea ineficiente. Al seleccionar perlas de vidrio, elija perlas con diferentes diámetros circunferenciales, las perlas de vidrio grandes aseguran la resistencia a la colisión, y las perlas de vidrio pequeñas aseguran que no haya colisión muerta entre las perlas de vidrio durante el proceso de fragmentación de colisión, lo que mejora la eficiencia de la rotura de la carcasa.
Para extraer el ADN de diatomeas de las muestras, generalmente es necesario enriquecer diatomeas. Este proceso tendrá un gran impacto en la extracción del ADN de diatomeas. El propósito del enriquecimiento es aumentar la concentración de diatomeas en las muestras para que la concentración de ADN de diatomeas extraído pueda estar en un rango detectable; para las siguientes aplicaciones, como la PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real y la secuenciación de alto rendimiento.
Dado que las diatomeas están ampliamente distribuidas en la naturaleza4, la prevención de la contaminación en el laboratorio es una prioridad absoluta28. La contaminación durante el proceso de extracción de ADN provocará desviaciones de los resultados reales y pérdida de valor de uso. Por lo tanto, siempre preste atención al principio de funcionamiento aséptico al extraer el ADN de diatomeas y tome todas las medidas posibles para reducir y evitar la contaminación de diatomeas exógenas. Cuando se extrae el tejido del cadáver, se deben tomar medidas para evitar que se contamine con diatomeas exógenas. Después de extraer el tejido, debe almacenarse en un recipiente o bolsa de muestra libre de contaminación por diatomeas. El tejido no debe tratarse con formaldehído. El equipo para extraer y procesar tejidos debe lavarse 2-3 veces con agua destilada repetidamente y luego esterilizarse con luz ultravioleta o alta temperatura para garantizar que no haya contaminación de diatomeas de otras fuentes. El tejido antes de la prueba debe cortarse del tejido superficial con un instrumento libre de diatomeas, y luego se debe reemplazar el instrumento para seleccionar el tejido inferior para su examen. Al mismo tiempo, la estandarización del proceso de operación también puede evitar eficazmente el problema de la contaminación del laboratorio.
Dado que las diatomeas son el alimento de muchos organismos acuáticos, se perderán durante el almacenamiento a largo plazo29. Las diatomeas también pueden crecer y reproducirse en condiciones de luz. Por lo tanto, el paso de extracción de ADN debe iniciarse lo antes posible después del muestreo y se debe realizar un procesamiento rápido de la muestra para evitar la pérdida de diatomeas en la muestra. Si la extracción de ADN no se puede llevar a cabo de inmediato, todas las muestras deben congelarse y mantenerse en la oscuridad para evitar la reducción de diatomeas tanto como sea posible.
Nuestra investigación seleccionó un kit de extracción de ADN sanguíneo común y barato basado en el método de digestión de la proteinasa K, que ha sido mejorado para extraer ADN de diatomeas de muestras de agua y tejidos con buenos resultados30. El tejido está lo suficientemente cortado como para estar en contacto total con la proteinasa K y el tejido se digiere por completo. El posible principio de extracción exitosa es el siguiente: durante el paso de agitación, la capa dura de diatomea se impacta repetidamente y se fragmenta entre perlas de vidrio que se mueven rápidamente, exponiendo la membrana celular; la configuración de perlas de vidrio de diferentes tamaños puede llenar el vacío entre la colisión de perlas de vidrio de un solo tamaño, a fin de cubrir la superficie de contacto de colisión lo más completamente posible; después de perder la cubierta de silicio, la proteinasa K ayuda a liberar el ADN de la diatomea. En comparación con el kit de extracción de ADN del suelo que se usa actualmente, el kit de extracción de ADN sanguíneo mejorado puede cumplir con los requisitos de la extracción de ADN de diatomeas, que es más económica y fácil de obtener. No solo facilita el uso de la inspección forense de diatomeas, sino que es adecuado para su aplicación a otras disciplinas relacionadas con la investigación de diatomeas y también se puede utilizar para la extracción de ADN de otros plancton. Al extraer ADN de diatomeas de muestras de agua, la cantidad de proteinasa K utilizada debe ajustarse de acuerdo con la cantidad de plancton en el agua. La cantidad de proteinasa K puede aumentarse o disminuirse en función de experimentos preliminares. Al extraer el ADN de diatomeas de los tejidos, los diferentes tipos de tejidos de órganos, la contaminación de los tejidos y otros factores afectarán la cantidad de proteinasa K necesaria para la digestión. En el experimento, la proteinasa K en el kit debe almacenarse a -20 °C después de su uso, de lo contrario, la inactivación de la proteinasa K afectará el proceso de extracción.
En conclusión, la extracción de ADN de diatomeas debe realizarse lo antes posible después del muestreo y el procesamiento de la muestra, de lo contrario se almacenará a -20 °C para su conservación. La manipulación de las muestras, el almacenamiento y todo el proceso de extracción deben realizarse con cuidado para evitar la contaminación por diatomeas exógenas. De lo contrario, no se puede evaluar que el ADN de diatomeas extraído estaba en la muestra o que estaba contaminado con exógenos. Cuando se usa proteinasa K para digerir tejidos, su dosis puede ser un problema. Una digestión insuficiente de los tejidos puede aumentar la cantidad de proteinasa K. Por lo tanto, es importante cortar el tejido adecuadamente. Una digestión suficiente del tejido también evita que los restos tisulares obstruyan la membrana plasmática dentro de la columna de adsorción. Una vez bloqueada la membrana, no es posible utilizar la punta de la pipeta para detectar la obstrucción o centrifugar repetidamente, lo que dañará la membrana. La solución final de ADN contiene muchas impurezas, lo que afectará la detección del ADN de diatomeas. La intensidad de la oscilación y el tiempo también son cuestiones clave. El tiempo de oscilación del primer vórtice se controla a 4-5 min, y la frecuencia de oscilación se controla a 3000 rpm, de lo contrario, la extracción de ADN se verá afectada. Si las bandas electroforéticas no están claras después de la PCR, puede ser necesario aumentar aún más la cantidad de plantilla de ADN. El ADN extraído en este estudio es una mezcla de ADN, incluyendo ADN de diatomeas y ADN de otras especies, por lo que no se puede determinar la concentración de ADN de diatomeas. Por lo tanto, no es adecuado para aplicaciones que requieren una alta pureza de plantillas de ADN.
Los estudios han demostrado que diferentes especies de diatomeas pueden ser amplificadas por diferentes cebadores31,32. En este estudio, solo se utilizaron los cebadores específicos de diatomeas D512 y D978 en el ADNr de diatomeas 18S para probar si el ADN de diatomeas se extrajo con éxito, lo que no pudo cubrir todas las especies de diatomeas22,33. Además, dado que la longitud del fragmento del producto de amplificación del par de cebadores es de 390-410 pb, el método mejorado selecciona todos los tamaños de fragmentos de ADN de diatomeas para probar si hay un impacto en los parámetros experimentales, lo que necesita más estudio. Los estudios posteriores también utilizarán cebadores de diferentes regiones y diferentes longitudes de amplificación para explorar el efecto de la extracción.
En comparación con el método tradicional de extracción de ADN de diatomeas, este método tiene las principales ventajas de la extracción de ADN de diatomeas de bajo costo y a gran escala. Puede complementar las ventajas de los métodos morfológicos de diatomeas y puede satisfacer las necesidades de diagnóstico de ahogamiento en los laboratorios forenses primarios. Al mismo tiempo, también amplía el rango de selección de kits de extracción de ADN de diatomeas y tiene una buena perspectiva de aplicación. En el futuro, este método no solo se limitará a la extracción de ADN de diatomeas, sino que se utilizará para la extracción de ADN de otras algas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82060341,81560304) y del Proyecto de Investigación Científica de la Plataforma de Innovación Académica de la Provincia de Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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