Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخراج السم من Trichogramma dendrolimi باستخدام مضيف اصطناعي تم إنشاؤه باستخدام فيلم البولي إيثيلين ومحلول الأحماض الأمينية.
Abstract
الدبابير الطفيلية هي مجموعة متنوعة من حشرات غشاء البكارة التي تعمل كموارد لا تقدر بثمن للمكافحة الحيوية للآفات. لضمان التطفل الناجح ، تقوم الدبابير الطفيلية بحقن السم في مضيفيها لقمع مناعة مضيفيها ، وتعديل نمو المضيفين ، والتمثيل الغذائي ، وحتى السلوك. مع أكثر من 600000 نوع تقديري ، فإن تنوع الدبابير الطفيلية يفوق تنوع السامة الأخرى ، مثل الثعابين والقواقع المخروطية والعناكب. سم الدبابير الطفيلي هو مصدر غير مستكشف للجزيئات النشطة بيولوجيا مع تطبيقات محتملة في مكافحة الآفات والطب. ومع ذلك ، فإن جمع سم الطفيليات يمثل تحديا بسبب عدم القدرة على استخدام التحفيز المباشر أو الكهربائي وصعوبة التشريح بسبب صغر حجمها. Trichogramma هو جنس من الدبابير الطفيلية الصغيرة (~ 0.5 مم) التي تستخدم على نطاق واسع للمكافحة البيولوجية للآفات lepidopteran في كل من الزراعة والغابات. هنا ، نبلغ عن طريقة لاستخراج السم من T. dendrolimi باستخدام مضيفات اصطناعية. يتم إنشاء هذه العوائل الاصطناعية مع فيلم البولي ايثيلين ومحاليل الأحماض الأمينية ومن ثم تلقيح مع الدبابير Trichogramma للتطفل. تم جمع السم وتركيزه في وقت لاحق. تتيح هذه الطريقة استخراج كميات كبيرة من سم Trichogramma مع تجنب التلوث من الأنسجة الأخرى الناتجة عن التشريح ، وهي مشكلة شائعة في بروتوكولات تشريح خزان السم. يسهل هذا النهج المبتكر دراسة سم Trichogramma ، مما يمهد الطريق لأبحاث جديدة وتطبيقات محتملة.
Introduction
الدبابير الطفيلية هي حشرات غشاء البكارة الطفيلية التي تعد موارد مهمة للمكافحة البيولوجية1. هناك مجموعة واسعة من الدبابير الطفيلية ، مع أكثر من 600000 نوع تقديري2. يتجاوز تنوع الدبابير الطفيلية بكثير تنوع المفصليات السامة الأخرى ، مثل الثعابين والقواقع المخروطية والعناكب والعقارب والنحل. السم هو عامل طفيلي مهم في الدبابير الطفيلية. من أجل التطفل الناجح ، يتم حقن السم في المضيف ، مما يؤدي إلى تعديل سلوك المضيف والمناعة والتطور والتمثيل الغذائي3. علاوة على ذلك ، يظهر سم الدبابير الطفيلية تنوعا ملحوظا في هياكلها الجزيئية وأهدافها ووظائفها ، مما يعكس التطور المشترك المعقد مع مضيفيها. وبالتالي ، فإن السم الطفيلي هو مورد قيم وغير مقدر من الجزيئات النشطة لأغراض مبيدات الحشرات أو الطبية4. على عكس سم الثعابين والقواقع المخروطية والعناكب والعقارب والنحل ، لا يمكن جمع سم الدبابير الطفيلية عن طريق التحفيز المباشر أو التحفيز الكهربائي5. الطريقة الحالية لاستخراج سم الطفيلي هي تشريح خزان السم. ومع ذلك ، غالبا ما تكون الدبابير الطفيلية صغيرة ، ويتطلب تشريح الدبابير الطفيلية مهارات تقنية عالية. لذلك ، إذا تمكنا من إيجاد طريقة لجمع سم الدبابير الطفيلية بكفاءة وسهولة ، فسيكون من المفيد جدا البحث عن سم الدبابير الطفيلية.
Trichogramma (غشائيات الأجنحة: Trichogrammatidae) هو جنس من الدبابير الطفيلية الصغيرة (~ 0.5 مم)6. هذه الدبابير هي من بين عوامل المكافحة الحيوية الأكثر استخداما على نطاق واسع ، ولا سيما استهداف بيض مختلف الآفات حرشفية الأجنحة في كل من الزراعة والغابات. على سبيل المثال ، تم تطبيق T. dendrolimi ، أحد أكثر أنواع Trichogramma استخداما في الصين ، على نطاق واسع لمكافحة مجموعة متنوعة من الآفات الزراعية والحرجية ، مثل Dendrolimus superans و Ostrinia furnacalis و Chilo suppressalis. أظهرت الدراسات السابقة أن الدبابير Trichogramma يمكن أن تحقن بيضها في مضيفات اصطناعية7. يمكن إنشاء مضيفات اصطناعية باستخدام مواد مثل الشمع8 والأجار9 و Parafilm10 والفيلم البلاستيكي11. يمكن أن يكون الحل في العوائل الاصطناعية التي تحفز وضع البيض الكافي ل Trichogramma بسيطا ، مثل الأحماض الأمينية أو الأملاح غير العضوية12. استنادا إلى خاصية أن T. dendrolimi يمكن أن تتطفل على المضيفين الاصطناعيين ، توفر هذه الدراسة طريقة جديدة لاستخراج السم من الدبابير الطفيلية باستخدام مضيفات اصطناعية. يهدف هذا النهج إلى معالجة أوجه القصور في انخفاض الغلة ، وانخفاض النقاء ، والقابلية للتلوث في تقنيات الاستخراج الحالية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن استخراج كمية كبيرة من السم عالي النقاء من T. dendrolimi ، والذي يلبي احتياجات البحث العلمي وفحص الجزيئات النشطة بيولوجيا لأغراض مبيدات الحشرات أو الطبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية الحشرات
- تغذية Corcyra cephalonica على دقيق الذرة عند درجة حرارة 26 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية من 40 ٪ ± 10 ٪.
- سلالة T. dendrolimi من حشرة جيلين في الداخل باستخدام بيض Corcyra cephalonica كمضيفين. تغذية دبور البالغين 10٪ ماء السكروز في أنابيب ذبابة الفاكهة عند درجة حرارة 26 ± 1 درجة مئوية ، الرطوبة النسبية 70٪ ± 10٪ ، الضوء (L): الظلام (D) فترة 14 ساعة: 10 ساعات.
2. إعداد بطاقات البيض فيلم البولي ايثيلين البلاستيك
- خذ فيلم بلاستيكي من البولي إيثيلين بطول 16 سم وعرض 12 سم وسمك 20 ميكرومتر. اضغط على 30 نتوءا نصف دائري بقطر 2-3 مم وارتفاع حوالي 3 مم باستخدام قضيب طحن زجاجي وفقا لتخطيط لوحة PCR القياسي المكون من 96 فتحة.
ملاحظة: يجب أن تتم عملية الضغط على 30 نتوءا نصف دائري باستخدام قضيب طحن زجاجي مع الانتباه إلى الضغط لأن الضغط الشديد سيؤدي إلى ثقب البلاستيك وتلوث قضيب الطحن الخالي من السم المستخرج. - تطهير فيلم البلاستيك البولي ايثيلين المضغوط عن طريق تعريض كلا الجانبين للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 1 ساعة.
- أضف كمية صغيرة من كحول البولي فينيل بنسبة 10٪ إلى السطح نصف الدائري.
3. تطفل الترايكوجراما الشجري
- بعد تخدير CO2 ، ضع الدبابير الإناث T. dendrolimi في صندوق تجميع ، وكان عدد الدبابير ~ 3000.
- ضع الجانب المحدب من بطاقة بيضة الفيلم باتجاه صندوق التجميع وقم بتأمين الحواف بشريط مطاطي.
- أضف 4 ميكرولتر من محلول الأحماض الأمينية (6 جم / لتر ليوسين ، 4 جم / لتر فينيل ألانين ، 4.25 جم / لتر هستيدين) إلى كل نتوء نصف دائري. قم بتغطيته بغشاء بلاستيكي مسطح من البولي إيثيلين بطول 16 سم وعرض 12 سم. استخدم شريطا مطاطيا لتغطية صندوق التجميع بإحكام بصفحتين من البلاستيك.
- دع الدبابير T. dendrolimi تتطفل بحرية لمدة 4-8 ساعات وتوفر 10٪ من ماء السكروز من خلال القطن المبلل.
4. جمع سم T. dendrolimi
- احصل على محلول الأحماض الأمينية المتطفل من النتوء الداخلي لبطاقة البيض الاصطناعية وانقله إلى غطاء أنابيب سعة 1.5 مل.
- قم بتغطية غطاء الأنبوب بشبكة نايلون 10 ميكرومتر بقطر 25 مم ، واربط شبكة النايلون وأنبوب الطرد المركزي بإحكام. ضع أنبوب الطرد المركزي في وضع مستقيم للطرد المركزي القصير باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (1360 × جم) لمدة 10 ثوان واجمع المحلول المصفى (~ 100 ميكرولتر من سم T. dendrolimi ).
- قم بقياس تركيز سم T. dendrolimi الذي تم جمعه باستخدام مجموعة مقايسة حمض Bicinchoninic (BCA) (جدول المواد).
- قم بتخزين السم في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
5. تحليلات SDS-PAGE
- أضف 30 ميكرولتر من سم T. dendrolimi إلى 10 ميكرولتر من 4x صوديوم دوديسيل سلفات-بولي أكريلاميد جل الكهربائي (SDS-PAGE) مخزن تحميل عينة (جدول المواد) وسخنه عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بإجراء تشغيل جل SDS-PAGE عند 130 فولت لمدة 120 دقيقة.
- قم بتلطيخ وإزالة لون جل SDS-PAGE باستخدام جهاز تلطيخ البروتين (جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم قياس تركيز البروتين لعينات السم التمثيلية باستخدام مجموعة مقايسة البروتين ، مع عرض النتائج في الجدول 1. أظهرت النتائج أن تركيز بروتين السم الذي تم جمعه بهذه الطريقة تراوح من 0.35 ميكروغرام / ميكرولتر إلى 0.46 ميكروغرام / ميكرولتر ، في حين أن السيطرة السلبية على محلول الأحماض الأمينية كان تركيز البروتين فقط من 0.03 ميكروغرام / ميكرولتر إلى 0.05 ميكروغرام / ميكرولتر. تركيز بروتين السم الذي تم جمعه بهذه الطريقة أعلى بكثير من تركيز التحكم السلبي ، مما يدل على أن هذه الطريقة يمكن أن تجمع سم الدبابير الطفيلية جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، لا يوجد ارتباط محدد بين وقت التطفل والتركيز لأن الدفعات المختلفة من الدبابير الطفيلية قد يكون لها حيوية مختلفة.
بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل سم T. dendrolimi بواسطة SDS-PAGE ، وكشف عن نطاق بروتين السم الذي يمتد من أقل من 10 كيلو دالتون إلى أكثر من 130 كيلو دالتون في الشكل 1. ومع ذلك ، عندما تم تحليل السيطرة السلبية على الأحماض الأمينية بواسطة SDS-PAGE ، وجد أنه لا يوجد بروتين فيه (الشكل التكميلي 1) ، والذي أثبت أيضا أن البروتين الذي تم جمعه بهذه الطريقة كان بالفعل بروتين السم للدبابير الطفيلية.
الشكل 1: تحليل SDS-PAGE لبروتين سم T. dendrolimi. الممرات 1-2: كانت الكميات المحملة من بروتين السم 8 ميكروغرام و 10 ميكروغرام ، على التوالي. م: ماركر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عينة | وقت التطفل (ح) | التركيز (ميكروغرام / ميكرولتر) | |
| السم | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| تحكم | 1 | إن بي | 0.04 |
| 2 | إن بي | 0.03 | |
| 3 | إن بي | 0.05 | |
| 4 | إن بي | 0.03 | |
| 5 | إن بي | 0.03 | |
الجدول 1: معلومات تركيز السم والسيطرة. تم قياس تركيز البروتين للسم التمثيلي وعينات التحكم باستخدام مجموعة مقايسة البروتين BCA. التحكم: الضوابط غير المتطفلة. NP: لا تطفل
الشكل التكميلي 1: تحليل SDS-PAGE للتحكم والسم. التحكم: السيطرة غير الطفيلية. السم: كانت الكميات المحملة من بروتين السم 10 ميكروغرام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، نقدم طريقة لاستخراج السم من T. dendrolimi باستخدام مضيفات اصطناعية. النقاط الرئيسية في تجربة جمع السم هي كما يلي. (1) أثناء التحضير ، يجب تخدير T. dendrolimi بسرعة بتركيز مناسب من CO2. إذا كان تركيز CO2 منخفضا جدا ، فلن يكون كافيا لتخدير Trichogramma بسرعة. على العكس من ذلك ، إذا كان التركيز مرتفعا جدا ، فقد يموت Trichogramma ، مما يقلل من قدرتها على تطفل المضيف الاصطناعي. (2) يجب ضمان عقم محلول الأحماض الأمينية ، لأن تلوث محلول الأحماض الأمينية قد يؤثر سلبا على كفاءة التطفل. (3) يجب إجراء تطفل بطاقات البيض الاصطناعية في ظروف مظلمة لتعزيز التطفل. (4) يوصى إما بإجراء تجارب مباشرة في اتجاه مجرى النهر أو تجميد العينات لضمان نشاط السم ومنع التحلل.
يوصى بالحكم على التطفل من خلال تصور البيض المودع. إذا لم يتم ملاحظة البويضات المودعة تحت المجهر ، فقد لا يتم استخراج أي سم. الحد من هذه التقنية هو أنها تتطلب عددا كبيرا من الدبابير الطفيلية. يتطلب استخراج سم واحد حوالي 3000 دبور طفيلي ، مما يزيد من عبء العمل.
كانت الطريقة السابقة لاستخراج سم الدبابير الطفيلية هي تشريح خزان السم. ومع ذلك ، الدبابير الطفيلية صغيرة. على سبيل المثال ، يبلغ طول Trichogramma أقل من 1 مم. ليس فقط المتطلبات الفنية لتشريح خزانات السم عالية ، ولكن تلوث الأنسجة الأخرى أثناء التشريح أمر شائع أيضا. يمكن للطريقة الجديدة باستخدام مضيفات اصطناعية تحسين كفاءة استخراج السم وتجنب التلوث من الأنسجة الأخرى الناجمة عن التشريح.
يمكن أيضا تمديد هذه الطريقة لتشمل الدبابير الطفيلية الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن استخدام بويضات فيلم البولي إيثيلين البلاستيكي التي تحتوي على خليط من أيونات الملح والأحماض الأمينية للحصول على سم T. neustadt ، ويمكن استخدام بيض الشمع الاصطناعي الذي يحتوي على محلول KCl-MgSO4 للحصول على سم T. pretiosum. بالإضافة إلى Trichogramma ، تم الإبلاغ عن أن Anastatus japonicus13 و Microplitis croceipes9 و Habrobracon hebetor10 يمكن أن يتطفل على المضيفين الاصطناعيين. باستخدام خصائص هذه الدبابير الطفيلية لتطفل المضيفين الاصطناعيين ، يمكن تطوير طرق مماثلة لاستخراج السم.
سم الدبابير الطفيلية هو مصدر غير مستكشف للجزيئات البيولوجية مع إمكانية مكافحة الآفات والتطبيقات الطبية. في الآونة الأخيرة ، تم التعرف على الاستخدامات المحتملة لسم الطفيليات في الصيدلة والزراعة14,15. من الناحية الدوائية ، فإن العديد من المكونات في سم الطفيليات لها آفاق تطبيق محتملة واسعة في تحسين العلاج المناعي ، وعلاج الاضطرابات الخثارية ، وإيجاد قوالب للمضادات الحيوية الجديدة. في الزراعة ، يمكن استخدام بعض المكونات في سم الطفيليات كعوامل مكافحة بيولوجية لتنظيم تطور الآفات وتكاثرها ومناعتها لتحقيق الغرض من السيطرة الفعالة على الآفات15. ومع ذلك ، فإن عدم وجود طرق فعالة لاستخراج السم غالبا ما يحد من البحث عن سم الدبابير الطفيلية ، وخاصة الدبابير الطفيلية الصغيرة مثل Trichogramma. توفر هذه الورقة طريقة فعالة لاستخراج سم Trichogramma ، والتي توفر طريقة لمتابعة دراسة سم Trichogramma ، مثل تحديد تكوين البروتين ووظيفة السم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة كمرجع لأبحاث سم الدبابير الطفيلية الأخرى وتوفر الدعم لتعزيز فحص الجزيئات النشطة بيولوجيا من السموم الطفيلية للتطبيقات المبيدة للحشرات أو الطبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه ولا مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ونعرب عن تقديرنا للدعم المالي المقدم من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هاينان (المنحة رقم 323QN262)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31701843 و 32172483)، وصندوق جيانغسو للابتكار في مجال العلوم والتكنولوجيا الزراعية (المنحة رقم. CX (22) 3012 و CX (21) 3008) ، ومؤسسة "Shuangchuang Doctor" بمقاطعة Jiangsu (المنحة رقم 202030472) ، وصندوق بدء تشغيل جامعة نانجينغ الزراعية (المنحة رقم 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
