Summary
여기에서는 폴리에틸렌 필름과 아미노산 용액으로 만든 인공 숙주를 사용하여 Trichogramma dendrollimi 에서 독을 추출하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
기생 말벌은 해충 생물 방제에 귀중한 자원 역할을하는 다양한 hymenopteran 곤충 그룹입니다. 성공적인 기생을 위해 기생 말벌은 숙주에 독을 주입하여 숙주의 면역력을 억제하고 숙주의 발달, 신진 대사 및 행동을 조절합니다. 600,000 종 이상의 추정 종으로 기생 말벌의 다양성은 뱀, 원뿔 달팽이 및 거미와 같은 다른 독이 있는 동물의 다양성을 능가합니다. 기생 말벌 독은 해충 방제 및 의학에 잠재적으로 응용 할 수있는 생체 활성 분자의 미개척 된 공급원입니다. 그러나 기생충 독을 채취하는 것은 직접적인 자극이나 전기적 자극을 사용할 수 없고 크기가 작아 해부가 어렵기 때문에 어렵습니다. Trichogramma 는 농업과 산림 모두에서 나비목 해충의 생물학적 방제에 널리 사용되는 작은(~0.5mm) 알 기생 말벌의 속입니다. 여기에서, 우리는 인공 숙주를 사용하여 T. dendrolimi 에서 독을 추출하는 방법을보고합니다. 이 인공 숙주는 폴리에틸렌 필름과 아미노산 용액으로 만든 다음 기생충을 위해 Trichogramma 말벌을 접종합니다. 그 후 독을 채취하여 농축하였다. 이 방법을 사용하면 독 저장소 해부 프로토콜의 일반적인 문제인 해부로 인한 다른 조직의 오염을 방지하면서 다량의 Trichogramma 독을 추출할 수 있습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 Trichogramma 독 연구를 촉진하여 새로운 연구 및 잠재적 응용 분야를 위한 길을 열어줍니다.
Introduction
기생 말벌은 생물학적 방제에 중요한 자원인 기생 hymenopteran 곤충입니다1. 다양한 기생 말벌이 있으며 600,000 종 이상의 추정 종2. 기생 말벌의 다양성은 뱀, 원뿔 달팽이, 거미, 전갈 및 꿀벌과 같은 다른 독이 있는 절지동물의 다양성을 훨씬 능가합니다. 독은 기생 말벌의 중요한 기생 인자입니다. 성공적인 기생을 위해 숙주에 독을 주입하여 숙주의 행동, 면역, 발달 및 신진대사를 조절한다3. 더욱이, 기생 말벌의 독은 분자 구조, 표적 및 기능에서 놀라운 다양성을 나타내며 숙주와의 복잡한 공진화를 반영합니다. 따라서 기생충 독은 살충 또는 의료 목적을 위한 활성 분자의 귀중하고 과소평가된 자원이다4. 뱀, 원뿔 달팽이, 거미, 전갈, 꿀벌의 독과 달리 기생 말벌 독은 직접적인 자극이나 전기 자극으로 채취할 수 없다5. 기생 말벌 독을 추출하는 현재 방법은 독 저장소를 해부하는 것입니다. 그러나 기생 말벌은 종종 작으며 기생 말벌의 해부는 높은 기술이 필요합니다. 따라서 기생 말벌의 독을 효율적이고 편리하게 채취 할 수있는 방법을 찾을 수 있다면 기생 말벌의 독을 연구하는 데 큰 도움이 될 것입니다.
트리코그람마(Hymenoptera: Trichogrammatidae)는 작은(~0.5mm 길이) 기생 말벌속이다 6. 이 말벌은 가장 널리 사용되는 생물 방제제 중 하나이며, 특히 농업과 산림 모두에서 다양한 나비목 해충의 알을 표적으로 삼습니다. 예를 들어, 중국에서 가장 널리 사용되는 Trichogramma 종 중 하나인 T. dendrolimi는 Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis 및 Chilo suppressalis와 같은 다양한 농업 및 임업 해충을 방제하는 데 광범위하게 적용되었습니다. 이전 연구에서는 Trichogramma 말벌이 인공 숙주에 알을 주입할 수 있음을 보여주었다7. 인공 호스트는 왁스8, 한천9, 파라막10 및 플라스틱 필름11과 같은 재료를 사용하여 만들 수 있습니다. 트리코그람마(Trichogramma)에 대한 충분한 산란을 유도하는 인공 숙주에서의 용액은 아미노산 또는 무기염과 같이 간단할 수 있다12. 본 연구는 T. dendrolimi가 인공 숙주에 기생할 수 있다는 특성을 바탕으로 인공 숙주를 사용하여 기생 말벌에서 독을 추출하는 새로운 방법을 제공합니다. 이 접근 방식은 현재 추출 기술에서 낮은 수율, 낮은 순도 및 오염에 대한 민감성의 단점을 해결하는 것을 목표로 합니다. 이 방법을 사용하면 T. dendrolimi에서 다량의 고순도 독을 추출할 수 있으며, 이는 살충 또는 의료 목적을 위한 생체 활성 분자의 과학적 연구 및 스크리닝의 요구를 충족합니다.
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Protocol
1. 곤충 사육
- Corcyra cephalonica를 옥수수 가루에 26 ± 1°C의 온도와 40% ± 10%의 상대 습도에서 먹이십시오.
- 길림성 곤충의 T. dendrolimi 균주를 숙주로 삼아 길림성 곤충을 실내에서 번식시킨다. 말벌 성인 10 % 자당 물 초파리 튜브의 온도에서 26 ± 1 °C, 상대 습도 70 % ± 10 %, 빛 (L) : 어두운 (D) 기간 14 시간 : 10 시간.
2. 폴리에틸렌 플라스틱 필름 달걀 카드의 준비
- 길이 16cm, 너비 12cm, 두께 20μm의 폴리에틸렌 플라스틱 필름을 사용합니다. 96개 구멍의 표준 PCR 플레이트 레이아웃에 따라 유리 연삭 막대를 사용하여 직경 2-3mm, 높이 약 3mm의 반원형 돌출부 30개를 압착합니다.
알림: 유리 연삭봉을 사용하여 30개의 반원형 돌출부를 압착하는 과정은 너무 세게 누르면 플라스틱에 구멍이 뚫리고 추출된 독이 없는 연삭봉이 오염되기 때문에 압력에 주의하면서 수행해야 합니다. - 압착된 폴리에틸렌 플라스틱 필름을 양면을 자외선(UV)에 1시간 동안 노출시켜 소독합니다.
- 반원형 표면에 소량의 10% 폴리비닐 알코올을 첨가합니다.
3. 트리코그람마 덴드로리미 기생
- CO2 마취 후 T. dendrolimi 암컷 말벌을 수집 상자에 넣고 말벌의 수는 ~ 3000 개였습니다.
- 필름 에그 카드의 볼록한 면을 수거 상자 쪽으로 놓고 가장자리를 고무 밴드로 고정합니다.
- 각 반원형 돌출부에 4μL의 아미노산 용액(류신 6g/L, 페닐알라닌 4g/L, 히스티딘 4.25g/L)을 추가합니다. 길이 16cm, 너비 12cm의 평평한 폴리에틸렌 플라스틱 필름으로 덮습니다. 고무 밴드를 사용하여 두 장의 플라스틱으로 수거함을 단단히 덮습니다.
- T. dendrolimi 말벌이 4-8 시간 동안 자유롭게 기생하도록하고 젖은면을 통해 10 %의 자당수를 제공합니다.
4. T. dendrolimi 독 수집
- 인공 계란 카드의 내부 돌출부에서 기생 아미노산 용액을 얻어 1.5mL 튜브의 캡으로 옮깁니다.
- 직경 25mm의 10μm 나일론 그물망으로 튜브 캡을 덮고 나일론 그물망과 원심분리기 튜브를 단단히 고정합니다. 미니 원심분리기(1360 x g)를 사용하여 10초 동안 짧은 원심분리를 위해 원심분리기 튜브를 똑바로 세우고 여과된 용액(~100μL의 T. dendrolimi 독)을 수집합니다.
- Bicinchoninic acid (BCA) assay kit (Table of Materials)를 사용하여 수집 된 T. dendrolimi 독의 농도를 측정합니다.
- 추가 분석을 위해 독을 -80 °C에서 보관하십시오.
5. SDS-PAGE 분석
- 30 μL의 T. 덴드로리미 독을 10 μL의 4x 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 샘플 로딩 버퍼(재료 표)에 넣고 95°C에서 10분 동안 가열합니다.
- 130분 동안 120V에서 SDS-PAGE 겔 실행을 수행합니다.
- 단백질 염색 장치(재료 표)를 사용하여 SDS-PAGE 겔을 염색 및 탈색합니다.
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Representative Results
대표적인 독 샘플의 단백질 농도는 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였으며, 그 결과는 표 1에 제시하였다. 그 결과, 이 방법으로 채취한 독 단백질의 농도는 0.35μg/μL에서 0.46μg/μL 사이인 반면, 아미노산 용액의 음성 대조군은 0.03μg/μL에서 0.05μg/μL의 단백질 농도에 불과했습니다. 이 방법으로 채취한 독 단백질의 농도는 음성 대조군보다 훨씬 높기 때문에 이 방법이 기생 말벌의 독을 잘 채취할 수 있음을 보여줍니다. 또한 기생 말벌의 배치에 따라 생명력이 다를 수 있기 때문에 기생 시간과 농도 사이에는 특별한 상관 관계가 없습니다.
게다가, T. dendrolimi 독은 SDS-PAGE에 의해 분석되어, 그림 1에 있는 10 kDa 미만에서 130 kDa 이상에 이르는 독 단백질 범위를 계시하. 그러나, 아미노산의 음성 대조군을 SDS-PAGE에 의해 분석했을 때, 그 안에 단백질이 없다는 것을 발견하였으며(보충 그림 1), 이 방법으로 수집된 단백질이 실제로 기생 말벌의 독 단백질임을 증명하였다.
그림 1: T. 덴드로리미 독 단백질의 SDS-PAGE 분석. 레인 1-2: 독 단백질의 적재량은 각각 8μg 및 10μg이었습니다. M: 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 견본 | 기생 시간(h) | 농도(μg/μL) | |
| 독 | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| 제어 | 1 | 엔피 | 0.04 |
| 2 | 엔피 | 0.03 | |
| 3 | 엔피 | 0.05 | |
| 4 | 엔피 | 0.03 | |
| 5 | 엔피 | 0.03 | |
표 1: 독 및 대조군의 농도 정보. 대표적인 독 및 대조군 샘플의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정했습니다. Control: 기생하지 않는 컨트롤입니다. NP: 기생 없음
보충 그림 1: 대조군 및 독의 SDS-PAGE 분석. 제어: 기생하지 않는 제어입니다. 독: 독 단백질의 적재량은 10μg이었습니다. M: 마커. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 인공 숙주를 사용하여 T. dendrolimi 에서 독을 추출하는 방법을 제시합니다. 독 채취 실험의 핵심은 다음과 같습니다. (1) 준비하는 동안 T. dendrollimi 는 적절한 농도의CO2로 신속하게 마취되어야 합니다. CO2 농도가 너무 낮으면 Trichogramma 를 빠르게 마취하기에 충분하지 않습니다. 반대로, 농도가 너무 높으면 Trichogramma 가 죽어 인공 숙주에 기생하는 능력이 떨어질 수 있습니다. (2) 아미노산 용액의 오염은 기생 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 아미노산 용액의 무균성이 보장되어야 합니다. (3) 인공 난자의 기생은 기생을 촉진하기 위해 어두운 조건에서 수행되어야 합니다. (4) 독의 활성을 보장하고 분해를 방지하기 위해 다운스트림 실험을 직접 수행하거나 샘플을 동결하는 것이 좋습니다.
퇴적된 알을 시각화하여 기생을 판단하는 것이 좋습니다. 침전된 알이 현미경으로 관찰되지 않으면 독이 추출되지 않았을 수 있습니다. 이 기술의 한계는 많은 수의 기생 말벌이 필요하다는 것입니다. 단일 독 추출에는 약 3,000마리의 기생 말벌이 필요하며, 이는 작업량을 증가시킵니다.
기생 말벌 독을 추출하는 이전 방법은 독 저장소를 해부하는 것이 었습니다. 그러나 기생 말벌은 작습니다. 예를 들어, Trichogramma 는 길이가 1mm 미만입니다. 독 저장소를 해부하는 데 필요한 기술적 요구 사항이 높을 뿐만 아니라 해부 중 다른 조직의 오염도 일반적입니다. 인공 숙주를 사용하는 새로운 방법은 독 추출의 효율성을 향상시키고 해부로 인한 다른 조직의 오염을 방지할 수 있습니다.
이 방법은 다른 기생 말벌에도 확장 될 수 있습니다. 예를 들어, 염 이온과 아미노산의 혼합물을 함유하는 폴리에틸렌 플라스틱 필름 난모세포를 사용하여 T. neustadt 독을 얻을 수 있고, KCl-MgSO4 용액을 함유하는 인공 왁스 알을 사용하여 T. pretiosum 독을 얻을 수 있습니다. Trichogramma 외에도 Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 및 Habrobracon hebetor10이 인공 숙주에 기생할 수 있는 것으로 보고되었습니다. 인공 숙주에 기생하는 이러한 기생 말벌의 특성을 사용하여 유사한 독 추출 방법을 개발할 수 있습니다.
기생 말벌 독은 잠재적인 해충 방제 및 의료 응용 분야와 함께 생물학적 분자의 미개척 소스입니다. 최근에, 약리학과 농업에 있는 기생충 독의 잠재적인 용도는 인식되었다14,15. 약리학적으로 기생충 독의 많은 성분은 면역 요법 최적화, 혈전 장애 치료 및 새로운 항생제 템플릿 찾기에 광범위한 잠재적 응용 전망을 가지고 있습니다. 농업에서 기생독의 일부 성분은 해충의 발달, 번식 및 면역을 조절하여 해충을 효과적으로 방제하는 목적을 달성하기 위한 생물학적 방제제로 사용될 수 있다15. 그러나 효율적인 독 추출 방법의 부족은 종종 기생 말벌, 특히 Trichogramma와 같은 작은 기생 말벌의 독에 대한 연구를 제한합니다. 본 논문은 트리코그람마의 독을 추출하는 효율적인 방법을 제공하며, 단백질 조성 및 독 기능의 확인과 같은 트리코그람마 독의 후속 연구를 위한 방법을 제공합니다. 또한 이 방법은 다른 기생충 말벌 독 연구를 위한 참조로도 사용할 수 있으며 살충 또는 의료 응용 분야를 위해 기생충 독에서 생체 활성 분자의 스크리닝을 촉진하기 위한 지원을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없으며 경쟁하는 재정적 이익도 없습니다.
Acknowledgments
우리는 하이난성 자연과학재단(보조금 번호 323QN262), 중국 국립자연과학재단(보조금 번호 31701843 및 32172483), 장쑤 농업 과학 기술 혁신 기금(보조금 번호. CX(22)3012 및 CX(21)3008), 장쑤성 "Shuangchuang Doctor" 재단(보조금 번호 202030472) 및 난징 농업 대학 창업 기금(보조금 번호 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
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