Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת ארס מ Trichogramma dendrolimi באמצעות מארח מלאכותי שנוצר עם סרט פוליאתילן ותמיסת חומצות אמינו.
Abstract
צרעות טפיליות הן קבוצה מגוונת של חרקים הימנופטריים המשמשים כמשאבים יקרי ערך להדברה ביולוגית של מזיקים. כדי להבטיח טפילות מוצלחת, צרעות טפיליות מזריקות ארס לפונדקאים שלהן כדי לדכא את חסינות המארחים שלהן, לווסת את התפתחות הפונדקאים, חילוף החומרים ואפילו ההתנהגות שלהם. עם יותר מ-600,000 מינים מוערך, מגוון הצרעות הטפיליות עולה על זה של בעלי חיים ארסיים אחרים, כגון נחשים, חלזונות חרוט ועכבישים. ארס צרעה טפילי הוא מקור לא נחקר מספיק של מולקולות ביו-אקטיביות עם יישומים פוטנציאליים בהדברה וברפואה. עם זאת, איסוף ארס הטפילים מאתגר בשל חוסר היכולת להשתמש בגירוי ישיר או חשמלי והקושי בדיסקציה בגלל גודלם הקטן. טריכוגרמה (שם מדעי: Trichogramma ) הוא סוג של צרעות טפיליות ביצים זעירות (~0.5 מ"מ) הנמצאות בשימוש נרחב להדברה ביולוגית של מזיקים לפידופטרניים הן בחקלאות והן ביערות. כאן, אנו מדווחים על שיטה להפקת ארס מ T. dendrolimi באמצעות פונדקאים מלאכותיים. פונדקאים מלאכותיים אלה נוצרים עם סרט פוליאתילן ותמיסות חומצות אמינו ולאחר מכן מחוסנים בצרעות טריכוגרמה לטיפול בטפילות. לאחר מכן נאסף הארס ורוכז. שיטה זו מאפשרת מיצוי כמויות גדולות של ארס טריכוגרמה תוך הימנעות מזיהום מרקמות אחרות הנגרמות כתוצאה מדיסקציה, בעיה נפוצה בפרוטוקולי דיסקציה של מאגרי ארס. גישה חדשנית זו מאפשרת את המחקר של ארס טריכוגרמה , וסוללת את הדרך למחקר חדש וליישומים פוטנציאליים.
Introduction
צרעות טפיליות הן חרקים טפיליים המהווים משאבים חשובים להדברה ביולוגית1. יש מגוון רחב של צרעות טפיליות, עם מעל 600,000 מינים מוערכים2. מגוון הצרעות הטפיליות עולה בהרבה על זה של פרוקי רגליים ארסיים אחרים, כגון נחשים, חלזונות חרוט, עכבישים, עקרבים ודבורים. ארס הוא גורם טפילי חשוב בצרעות טפיליות. לטפילות מוצלחת, הארס מוזרק לפונדקאי, ומווסת את התנהגותו, חסינותו, התפתחותו וחילוף החומרים של הפונדקאי3. יתר על כן, הארס של צרעות טפיליות מציג מגוון יוצא דופן במבנים המולקולריים שלו, במטרות ובתפקודים, ומשקף קו-אבולוציה מורכבת עם המארחים שלהם. לפיכך, ארס טפילי הוא משאב יקר ערך ולא מוערך מספיק של מולקולות פעילות למטרות קוטלי חרקים או רפואיים4. בניגוד לארס של נחשים, חלזונות חרוט, עכבישים, עקרבים ודבורים, ארס צרעה טפילי אינו יכול להיאסף על ידי גירוי ישיר או גירוי חשמלי5. השיטה הנוכחית להפקת ארס צרעה טפילי היא לנתח את מאגר הארס. עם זאת, צרעות טפיליות הן לרוב קטנות, ונתיחת צרעות טפיליות דורשת מיומנויות טכניות גבוהות. לכן, אם נוכל למצוא דרך לאסוף את ארס הצרעות הטפיליות בצורה יעילה ונוחה, זה יעזור מאוד לחקור את הארס של צרעות טפיליות.
טריכוגרמה (שם מדעי: Trichogrammatidae) היא סוג של צרעות טפיליות זעירות (~0.5 מ"מ אורך)6. צרעות אלה הן בין חומרי ההדברה הביולוגית הנפוצים ביותר, במיוחד נגד ביצים של מזיקים לפידופטרנים שונים הן בחקלאות והן ביערות. לדוגמה, T. dendrolimi, אחד ממיני הטריכוגרמה הנפוצים ביותר בסין, יושם באופן נרחב להדברת מגוון מזיקים חקלאיים וייעוריים, כגון Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis, ו Chilo suppressalis. מחקרים קודמים הראו כי צרעות טריכוגרמה יכולות להזריק את ביציהן לפונדקאים מלאכותיים7. ניתן ליצור פונדקאים מלאכותיים באמצעות חומרים כגון שעווה8, אגר9, פרפילם10 ופילם פלסטיק11. התמיסה בפונדקאים מלאכותיים המשרה מספיק אוביפוזיציה עבור טריכוגרמה יכולה להיות פשוטה, כגון חומצות אמינו או מלחים אנאורגניים12. בהתבסס על המאפיין כי T. dendrolimi יכול לטפיל פונדקאים מלאכותיים, מחקר זה מספק שיטה חדשה להפקת ארס מצרעות טפיליות באמצעות פונדקאים מלאכותיים. גישה זו נועדה לטפל בחסרונות של תפוקה נמוכה, טוהר נמוך ורגישות לזיהום בטכניקות מיצוי נוכחיות. באמצעות שיטה זו, כמות גדולה של ארס טוהר גבוה מ T. dendrolimi ניתן לחלץ, אשר עונה על הצרכים של מחקר מדעי וסינון של מולקולות ביו-אקטיביות למטרות קוטלי חרקים או רפואיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול חרקים
- להאכיל Corcyra cephalonica על קמח תירס בטמפרטורה של 26 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 40% ± 10%.
- הזן T. dendrolimi מחרק Jilin בתוך הבית תוך שימוש בביצים של Corcyra cephalonica כפונדקאים. להאכיל צרעות בוגרות 10% מי סוכרוז בצינורות דרוזופילה בטמפרטורה של 26 ± 1 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 70% ± 10%, בהיר (L): כהה (D) תקופה של 14 שעות: 10 שעות.
2. הכנת כרטיסי ביצה מפלסטיק פוליאתילן
- קח סרט פלסטיק פוליאתילן באורך של 16 ס"מ, רוחב של 12 ס"מ, ועובי של 20 מיקרומטר. לחץ החוצה 30 בליטות חצי עגולות בקוטר של 2-3 מ"מ וגובה של כ -3 מ"מ באמצעות מוט השחזה זכוכית על פי פריסת צלחת PCR סטנדרטית של 96 חורים.
הערה: תהליך של לחיצה החוצה 30 בליטות חצי עגולות באמצעות מוט השחזה זכוכית צריך להיעשות תוך שימת לב ללחץ מכיוון שלחיצה חזקה מדי תנקב את הפלסטיק ותנהם את מוט השחזה חסר הארס שחולץ. - יש לחטא את שכבת הפלסטיק הדחוסה מפוליאתילן על ידי חשיפת שני הצדדים לאור אולטרה סגול (UV) למשך שעה אחת.
- הוסיפו כמות קטנה של 10% אלכוהול פוליוויניל למשטח החצי עגול.
3. טפילות Trichogramma dendrolimi
- לאחר הרדמת CO2 , הכניסו את נקבות הצרעות T. dendrolimi לקופסת איסוף, ומספר הצרעות היה ~3000.
- מניחים את הצד הקמור של כרטיס ביצת הסרט לכיוון קופסת האיסוף ומאבטחים את הקצוות בגומייה.
- הוסף 4 מיקרוליטר של תמיסת חומצות אמינו (6 גרם / ליטר לאוצין, 4 גרם / ליטר פנילאלנין, 4.25 גרם / ליטר היסטידין) לכל בליטה חצי עגולה. מכסים אותו בסרט פלסטיק פוליאתילן שטוח באורך 16 ס"מ וברוחב 12 ס"מ. השתמש בגומייה כדי לכסות היטב את קופסת האיסוף בשתי יריעות פלסטיק.
- תנו לצרעות T. dendrolimi לטפיל בחופשיות במשך 4-8 שעות ולספק 10% מי סוכרוז דרך כותנה רטובה.
4. איסוף ארס T. dendrolimi
- השג את תמיסת חומצות האמינו הטפיליות מהבליטה הפנימית של כרטיס הביצה המלאכותית והעבר אותה למכסה של צינורות 1.5 מ"ל.
- מכסים את מכסה הצינור ברשת ניילון 10 מיקרומטר בקוטר 25 מ"מ, מהדקים היטב את רשת הניילון וצינור הצנטריפוגה. מניחים את צינור הצנטריפוגה זקוף לצנטריפוגה קצרה באמצעות מיני צנטריפוגה (1360 x גרם) למשך 10 שניות ואוספים את התמיסה המסוננת (~ 100 מיקרוליטר ארס T. dendrolimi ).
- מדוד את ריכוז ארס T. dendrolimi שנאסף באמצעות ערכת בדיקה של חומצה ביצינכונינית (BCA) (טבלה של חומרים).
- אחסנו את הארס בטמפרטורה של -80°C לניתוחים נוספים.
5. ניתוחי SDS-PAGE
- הוסף 30 μL של ארס T. dendrolimi ל 10 μL של 4x סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) דגימת חיץ טעינה (טבלה של חומרים) וחום ב 95 ° C במשך 10 דקות.
- ביצוע ריצת ג'ל SDS-PAGE במתח של 130 וולט למשך 120 דקות.
- יש לצבוע ולהסיר את הצבע של ג'ל SDS-PAGE באמצעות מנגנון צביעת החלבונים (Table of Materials).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ריכוז החלבונים של דגימות ארס מייצגות נמדד באמצעות ערכת בדיקת החלבון, והתוצאות מוצגות בטבלה 1. התוצאות הראו כי ריכוז חלבון הארס שנאסף בשיטה זו נע בין 0.35 מיקרוגרם/מיקרוליטר ל-0.46 מק"ג/מיקרוליטר, בעוד שבבקרה השלילית של תמיסת חומצות אמינו היה ריכוז חלבון של 0.03 מק"ג/μL עד 0.05 מיקרוגרם/μL. ריכוז חלבון הארס שנאסף בשיטה זו גבוה בהרבה מזה של בקרה שלילית, מה שמראה כי שיטה זו יכולה לאסוף היטב את הארס של צרעות טפיליות. בנוסף, אין מתאם ספציפי בין זמן הטפילות לריכוז, מכיוון שקבוצות שונות של צרעות טפיליות עשויות להיות בעלות חיוניות שונה.
נוסף על כך, ארס T. dendrolimi נותח על-ידי SDS-PAGE, וחשף טווח חלבוני ארס שנע בין פחות מ-10 kDa ליותר מ-130 kDa באיור 1. אולם כאשר הבקרה השלילית של חומצת אמינו נותחה על-ידי SDS-PAGE, נמצא שאין בה חלבון (איור משלים 1), מה שהוכיח גם שהחלבון שנאסף בשיטה זו הוא אכן חלבון ארס של צרעות טפיליות.
איור 1: ניתוח SDS-PAGE של חלבון ארס T. dendrolimi. נתיבים 1-2: הכמויות הטעונות של חלבון ארס היו 8 מיקרוגרם ו-10 מיקרוגרם, בהתאמה. M: מרקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| לדוגמה | זמן טפילות (ח) | ריכוז (מק"ג/μL) | |
| ארס | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| לשלוט | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
טבלה 1: מידע הריכוז של הארס ובקרה. ריכוז החלבון של דגימות הארס והביקורת המייצגות נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. שליטה: הבקרות הלא טפיליות. NP: אין טפילות
איור משלים 1: ניתוח SDS-PAGE של בקרה וארס. שליטה: השליטה הלא טפילית. ארס: הכמויות הטעונות של חלבון הארס היו 10 מיקרוגרם. M: מרקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה להפקת ארס מ T. dendrolimi באמצעות פונדקאים מלאכותיים. להלן נקודות המפתח בניסוי איסוף הארס. (1) במהלך ההכנה, T. dendrolimi חייב להיות מורדם במהירות עם ריכוז מתאים של CO2. אם ריכוז CO2 נמוך מדי, זה לא יהיה מספיק כדי להרדים את Trichogramma במהירות. לעומת זאת, אם הריכוז גבוה מדי, טריכוגרמה עלולה למות, מה שמקטין את יכולתם לטפיל את הפונדקאי המלאכותי. (2) יש להבטיח את הסטריליות של תמיסת חומצות האמינו, שכן זיהום של תמיסת חומצות האמינו עלול להשפיע לרעה על יעילות הטפילות. (3) הטפילות של קלפי ביצים מלאכותיות צריכה להתבצע בתנאים חשוכים כדי לקדם טפילות. (4) מומלץ לבצע ישירות ניסויים במורד הזרם או להקפיא את הדגימות כדי להבטיח את פעילות הארס ולמנוע התפרקות.
מומלץ לשפוט טפילות על ידי הדמיה של ביצים שהופקדו. אם הביצים שהושקעו לא נצפו במיקרוסקופ, ייתכן שלא נשאב ארס. המגבלה של הטכניקה היא שהיא דורשת מספר רב של צרעות טפיליות. שאיבת ארס אחת דורשת כ-3,000 צרעות טפיליות, מה שמגדיל את עומס העבודה.
השיטה הקודמת להפקת ארס צרעה טפילי הייתה לנתח את מאגר הארס. עם זאת, צרעות טפיליות הן זעירות; לדוגמה, Trichogramma הוא פחות מ 1 מ"מ אורך. לא רק הדרישות הטכניות של ניתוח מאגרי ארס גבוהות, אלא גם זיהום של רקמות אחרות במהלך הדיסקציה נפוץ. השיטה החדשנית באמצעות פונדקאים מלאכותיים יכולה לשפר את יעילות מיצוי הארס ולמנוע זיהום מרקמות אחרות הנגרמות על ידי דיסקציה.
שיטה זו יכולה להיות מורחבת גם לצרעות טפיליות אחרות. לדוגמה, ניתן להשתמש בביציות סרט פלסטיק פוליאתילן המכילות תערובת של יוני מלח וחומצות אמינו כדי להשיג ארס T. neustadt, וביצי שעווה מלאכותיות המכילות תמיסת KCl-MgSO4 ניתן להשתמש כדי לקבל ארס T. pretiosum. בנוסף לטריכוגרמה, דווח כי Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 ו- Habrobracon hebetor10 יכולים לטפיל פונדקאים מלאכותיים. באמצעות התכונות של צרעות טפיליות אלה כדי לטפיל פונדקאים מלאכותיים, ניתן לפתח שיטות מיצוי ארס דומות.
ארס צרעה טפילי הוא מקור לא נחקר מספיק של מולקולות ביולוגיות עם פוטנציאל הדברה ויישומים רפואיים. לאחרונה, השימושים הפוטנציאליים של ארס טפילים בפרמקולוגיה ובחקלאות הוכרו14,15. מבחינה פרמקולוגית, למרכיבים רבים בארס טפילי יש פוטנציאל יישום רחב באופטימיזציה של אימונותרפיה, טיפול בהפרעות טרומבוטיות ומציאת תבניות לאנטיביוטיקה חדשה. בחקלאות, מרכיבים מסוימים בארס טפילי יכולים לשמש כחומרי הדברה ביולוגיים כדי לווסת את ההתפתחות, הרבייה והחסינות של מזיקים כדי להשיג את המטרה של שליטה יעילה במזיקים15. עם זאת, היעדר שיטות יעילות למיצוי ארס מגביל לעתים קרובות את המחקר על ארס של צרעות טפיליות, במיוחד צרעות טפיליות זעירות כמו טריכוגרמה. מאמר זה מספק שיטה יעילה למיצוי הארס של טריכוגרמה, המספקת שיטה לחקר המשך של ארס טריכוגרמה, כגון זיהוי הרכב החלבונים ותפקוד הארס. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש גם כנקודת התייחסות למחקר ארס צרעות טפיליות אחרות ומספקת תמיכה לקידום סינון של מולקולות ביו-אקטיביות מארס טפילי ליישומים קוטלי חרקים או רפואיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין מה לחשוף ואין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מכירים בתמיכה כספית מהקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן (מענק מס '323QN262), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '31701843 ו -32172483), קרן החדשנות המדעית והטכנולוגית של ג'יאנגסו לחקלאות (מענק מס '. CX(22)3012 ו- CX(21)3008), קרן "Shuangchuang Doctor" של מחוז ג'יאנגסו (מענק מס '202030472), וקרן הסטארט-אפים של האוניברסיטה החקלאית נאנג'ינג (מענק מס '804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
