Summary
Burada, polietilen film ve amino asit çözeltisi ile oluşturulan yapay bir konakçı kullanarak Trichogramma dendrolimi'den zehir çıkarmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Parazitoid yaban arıları, haşere biyokontrolü için paha biçilmez kaynaklar olarak hizmet eden çeşitli bir hymenopteran böcek grubudur. Başarılı parazitizm sağlamak için parazitoid yaban arıları, konakçılarının bağışıklığını bastırmak, konakçıların gelişimini, metabolizmasını ve hatta davranışlarını modüle etmek için konakçılarına zehir enjekte eder. 600.000'den fazla tahmini türle, parazitoid yaban arılarının çeşitliliği,, koni salyangozları ve örümcekler gibi diğer zehirli hayvanlarınkini geride bırakıyor. Parazitoid yaban arısı zehiri, haşere kontrolü ve tıpta potansiyel uygulamaları olan, yeterince keşfedilmemiş bir biyoaktif molekül kaynağıdır. Bununla birlikte, parazitoit zehrin toplanması, doğrudan veya elektriksel stimülasyonun kullanılamaması ve küçük boyutları nedeniyle diseksiyonun zorluğu nedeniyle zordur. Trichogramma , hem tarımda hem de ormanlarda lepidopteran zararlılarının biyolojik kontrolü için yaygın olarak kullanılan küçük (~0,5 mm) yumurta parazitoid yaban arısı cinsidir. Burada, yapay konakçılar kullanarak T. dendrolimi'den zehir çıkarmak için bir yöntem bildiriyoruz. Bu yapay konakçılar, polietilen film ve amino asit çözeltileri ile oluşturulur ve daha sonra parazitizm için Trichogramma yaban arıları ile aşılanır. Zehir daha sonra toplandı ve konsantre edildi. Bu yöntem, zehir rezervuarı diseksiyon protokollerinde yaygın bir sorun olan diseksiyonun neden olduğu diğer dokulardan kontaminasyonu önlerken, büyük miktarlarda Trichogramma zehirinin çıkarılmasını sağlar. Bu yenilikçi yaklaşım, Trichogramma zehirinin incelenmesini kolaylaştırarak yeni araştırmaların ve potansiyel uygulamaların önünü açıyor.
Introduction
Parazitoid yaban arıları, biyolojik mücadele için önemli kaynaklar olan parazitik hymenopteran böceklerdir1. 600.000'den fazla tahmini türe sahip çok çeşitli parazitoid yaban arıları vardır2. Parazitoid yaban arılarının çeşitliliği,, koni salyangozları, örümcekler, akrepler ve arılar gibi diğer zehirli eklembacaklılarınkinden çok daha fazladır. Zehir, parazitoid yaban arılarında önemli bir parazit faktörüdür. Başarılı bir parazitizm için, konakçıya zehir enjekte edilir ve konakçının davranışını, bağışıklığını, gelişimini ve metabolizmasını modüle eder3. Dahası, parazitoid yaban arılarının zehiri, moleküler yapılarında, hedeflerinde ve işlevlerinde dikkate değer bir çeşitlilik gösterir ve konakçılarıyla karmaşık birlikte evrimi yansıtır. Bu nedenle, parazitoid zehir, böcek öldürücü veya tıbbi amaçlar için değerli ve yeterince takdir edilmeyen bir aktif molekül kaynağıdır4. Yılan, koni salyangoz, örümcek, akrep ve arı zehirinin aksine, parazitoid yaban arısı zehiri doğrudan stimülasyon veya elektriksel stimülasyon ile toplanamaz5. Parazitoid yaban arısı zehirinin çıkarılması için mevcut yöntem, zehir rezervuarını incelemektir. Bununla birlikte, parazitoid yaban arıları genellikle küçüktür ve parazitoid yaban arılarının diseksiyonu yüksek teknik beceriler gerektirir. Bu nedenle, parazitoid yaban arılarının zehirini verimli ve rahat bir şekilde toplamanın bir yolunu bulabilirsek, parazitoid yaban arılarının zehirini araştırmak çok yardımcı olacaktır.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae), küçük (~0.5 mm uzunluğunda) parazitoid yaban arılarının bir cinsidir6. Bu yaban arıları, özellikle hem tarımda hem de ormanlarda çeşitli lepidopteran zararlılarının yumurtalarını hedef alan en yaygın kullanılan biyokontrol ajanları arasındadır. Örneğin, Çin'de en yaygın kullanılan Trichogramma türlerinden biri olan T. dendrolimi, Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis ve Chilo suppressalis gibi çeşitli tarım ve ormancılık zararlılarını kontrol etmek için yaygın olarak uygulanmıştır. Önceki çalışmalar, Trichogramma yaban arılarının yumurtalarını yapay konakçılara enjekte edebildiğini gösterdi7. Balmumu8, agar9, Parafilm10 ve plastik film11 gibi malzemeler kullanılarak yapay konakçılar oluşturulabilir. Trichogramma için yeterli yumurtlamayı indükleyen yapay konakçılardaki çözelti, amino asitler veya inorganik tuzlargibi basit olabilir 12. T. dendrolimi'nin yapay konakçıları parazitleştirebilme özelliğine dayanarak, bu çalışma yapay konakçılar kullanarak parazitoid yaban arılarından zehir çıkarmak için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşım, mevcut ekstraksiyon tekniklerinde düşük verim, düşük saflık ve kontaminasyona yatkınlık eksikliklerini gidermeyi amaçlamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, bilimsel araştırma ve biyoaktif moleküllerin böcek öldürücü veya tıbbi amaçlar için taranması ihtiyaçlarını karşılayan T. dendrolimi'den büyük miktarda yüksek saflıkta zehir ekstrakte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Böcek yetiştirme
- Corcyra cephalonica'yı mısır unu üzerinde 26 ± 1°C sıcaklıkta ve %40 ± %10 bağıl nemde besleyin.
- Breed T. dendrolimi suşu, iç mekanlarda Corcyra cephalonica'nın yumurtalarını konakçı olarak kullanarak Jilin böceğinden elde edilir. Yaban arısı yetişkinlerini besleyin Drosophila tüplerinde 26 ± 1 °C sıcaklıkta,% 70 ±% 10 bağıl nem, açık (L): 14 saat: 10 saat karanlık (D) döneminde% 10 sakaroz suyu.
2. Polietilen plastik film yumurta kartlarının hazırlanması
- 16 cm uzunluğunda, 12 cm genişliğinde ve 20 μm kalınlığında bir polietilen plastik film alın. 96 delikli standart PCR plaka düzenine göre bir cam taşlama çubuğu kullanarak 2-3 mm çapında ve yaklaşık 3 mm yüksekliğinde 30 yarım daire biçimli çıkıntıyı bastırın.
NOT: Bir cam taşlama çubuğu kullanarak 30 yarım daire biçimli çıkıntıyı presleme işlemi, basınca dikkat edilerek yapılmalıdır çünkü çok sert bir pres plastiği delecek ve çıkarılan zehirsiz öğütme çubuğunu kirletecektir. - Preslenmiş polietilen plastik filmi her iki tarafını 1 saat boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakarak dezenfekte edin.
- Yarım daire biçimli yüzeye az miktarda% 10 polivinil alkol ekleyin.
3. Trichogramma dendrolimi parazitizm
- CO2 anestezisinden sonra, T. dendrolimi dişi yaban arılarını bir toplama kutusuna koyun ve yaban arısı sayısı ~ 3000 idi.
- Film yumurta kartının dışbükey tarafını toplama kutusuna doğru yerleştirin ve kenarlarını bir lastik bantla sabitleyin.
- Her yarım daire biçimli çıkıntıya 4 μL amino asit çözeltisi (6 g/L lösin, 4 g/L fenilalanin, 4.25 g/L histidin) ekleyin. 16 cm uzunluğunda ve 12 cm genişliğinde düz bir polietilen plastik film ile örtün. Toplama kutusunu iki plastik tabakayla sıkıca kapatmak için bir lastik bant kullanın.
- T. dendrolimi yaban arılarının 4-8 saat boyunca serbestçe parazitlenmesine izin verin ve ıslatılmış pamuktan% 10 sakaroz suyu sağlayın.
4. T. dendrolimi zehirinin toplanması
- Yapay yumurta kartının iç çıkıntısından parazitlenmiş amino asit çözeltisini elde edin ve 1.5 mL'lik tüplerin kapağına aktarın.
- Tüp kapağını 25 mm çapında 10 μm naylon ağ ile kapatın, naylon ağı ve santrifüj tüpünü sıkıca sabitleyin. Santrifüj tüpünü 10 saniye boyunca bir mini santrifüj (1360 x g) kullanarak kısa santrifüjleme için dik olarak yerleştirin ve filtrelenmiş çözeltiyi (~100 μL T. dendrolimi zehiri) toplayın.
- Toplanan T. dendrolimi zehirinin konsantrasyonunu bir Bikinkoninik asit (BCA) tahlil kiti kullanarak ölçün (Malzeme Tablosu).
- Daha fazla analiz için zehri -80 °C'de saklayın.
5. SDS-PAGE analizleri
- 10 μL 4x sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) numune yükleme tamponuna (Malzeme Tablosu) 30 μL T. dendrolimi zehiri ekleyin ve 95 °C'de 10 dakika ısıtın.
- SDS-PAGE jeli 120 dakika boyunca 130 V'ta çalıştırın.
- Protein boyama aparatını (Malzeme Tablosu) kullanarak SDS-PAGE jelini boyayın ve rengini giderin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili zehir örneklerinin protein konsantrasyonu, protein tahlil kiti kullanılarak ölçüldü ve sonuçlar Tablo 1'de sunuldu. Sonuçlar, bu yöntemle toplanan zehir proteini konsantrasyonunun 0.35 μg/μL ila 0.46 μg/μL arasında değiştiğini, amino asit çözeltisinin negatif kontrolünün ise sadece 0.03 μg/μL ila 0.05 μg/μL protein konsantrasyonuna sahip olduğunu gösterdi. Bu yöntemle toplanan zehir proteini konsantrasyonu, negatif kontrolden çok daha yüksektir, bu da bu yöntemin parazitik yaban arılarının zehirini iyi toplayabildiğini gösterir. Ek olarak, parazitlik süresi ile konsantrasyon arasında belirli bir ilişki yoktur, çünkü farklı parazitik yaban arısı grupları farklı canlılığa sahip olabilir.
Ek olarak, T. dendrolimi zehiri SDS-PAGE ile analiz edildi ve Şekil 1'de 10 kDa'nın altından 130 kDa'nın üzerine kadar uzanan bir zehir protein aralığı ortaya çıktı. Bununla birlikte, amino asidin negatif kontrolü SDS-PAGE ile analiz edildiğinde, içinde protein bulunmadığı bulundu (Ek Şekil 1), bu yöntemle toplanan proteinin gerçekten de parazitik yaban arılarının zehir proteini olduğunu kanıtladı.
Şekil 1: T. dendrolimi zehir proteininin SDS-PAGE analizi. Şerit 1-2: Yüklenen zehir proteini miktarları sırasıyla 8 μg ve 10 μg idi. M: İşaretleyici. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | Parazitlik süresi (h) | Konsantrasyon (μg/μL) | |
| Zehir | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Kontrol | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tablo 1: Zehrin konsantrasyon bilgisi ve kontrolü. Temsili zehir ve kontrol örneklerinin protein konsantrasyonu, BCA protein test kiti kullanılarak ölçüldü. Kontrol: parazitlenmemiş kontroller. NP: parazitlik yok
Ek Şekil 1: SDS-PAGE kontrol ve zehir analizi. Kontrol: parazitlenmemiş kontrol. Zehir: Yüklenen zehir proteini miktarları 10 μg idi. M: İşaretleyici. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, yapay konakçılar kullanarak T. dendrolimi'den zehir çıkarmak için bir yöntem sunuyoruz. Zehir toplama deneyinde kilit noktalar aşağıdaki gibidir. (1) Hazırlık sırasında, T. dendrolimi uygun bir CO2 konsantrasyonu ile hızlı bir şekilde uyuşturulmalıdır. CO2 konsantrasyonu çok düşükse, Trichogramma'yı hızlı bir şekilde uyuşturmak yetersiz olacaktır. Tersine, konsantrasyon çok yüksekse, Trichogramma ölebilir ve yapay konağı parazitleme yeteneklerini azaltabilir. (2) Amino asit çözeltisinin kirlenmesi parazitizm verimliliğini olumsuz yönde etkileyebileceğinden, amino asit çözeltisinin sterilitesi sağlanmalıdır. (3) Yapay yumurta kartlarının parazitleştirilmesi, parazitliği teşvik etmek için karanlık koşullarda yapılmalıdır. (4) Zehrin aktivitesini sağlamak ve bozunmayı önlemek için doğrudan aşağı akış deneylerinin yapılması veya numunelerin dondurulması tavsiye edilir.
Biriken yumurtaları görselleştirerek parazitleşmeyi yargılamanız önerilir. Biriken yumurtalar mikroskop altında gözlenmezse, zehir çıkarılmamış olabilir. Tekniğin sınırlaması, çok sayıda parazitoid yaban arısı gerektirmesidir. Tek bir zehir ekstraksiyonu, iş yükünü artıran yaklaşık 3.000 parazitoid yaban arısı gerektirir.
Parazitoid yaban arısı zehirinin çıkarılmasının önceki yöntemi, zehir rezervuarını incelemekti. Bununla birlikte, parazitoid yaban arıları küçüktür; örneğin, Trichogramma 1 mm'den daha kısadır. Sadece zehir rezervuarlarının diseksiyonunun teknik gereksinimleri yüksek olmakla kalmaz, aynı zamanda diseksiyon sırasında diğer dokuların kontaminasyonu da yaygındır. Yapay konakçıların kullanıldığı yeni yöntem, zehir ekstraksiyonunun etkinliğini artırabilir ve diseksiyonun neden olduğu diğer dokulardan kontaminasyonu önleyebilir.
Bu yöntem aynı zamanda diğer parazitoid yaban arılarına da genişletilebilir. Örneğin, T. neustadt zehri elde etmek için tuz iyonları ve amino asitlerin bir karışımını içeren polietilen plastik film oositler ve T. pretiosum zehri elde etmek için KCl-MgS04 solüsyonu içeren yapay mum yumurtaları kullanılabilir. Trichogramma'ya ek olarak, Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 ve Habrobracon hebetor10'un yapay konakçıları parazitleştirebileceği bildirilmiştir. Yapay konakçıları parazitleştirmek için bu parazitoid yaban arılarının özelliklerini kullanarak, benzer zehir ekstraksiyon yöntemleri geliştirilebilir.
Parazitoid yaban arısı zehiri, potansiyel haşere kontrolü ve tıbbi uygulamaları olan az keşfedilmiş bir biyolojik molekül kaynağıdır. Son zamanlarda, parazitoit zehirinin farmakoloji ve tarımdaki potansiyel kullanımları kabul edilmiştir14,15. Farmakolojik olarak, parazitoid zehirindeki birçok bileşen, immünoterapiyi optimize etmede, trombotik bozuklukları tedavi etmede ve yeni antibiyotikler için şablonlar bulmada geniş potansiyel uygulama beklentilerine sahiptir. Tarımda, parazitoit zehirindeki bazı bileşenler, zararlıları etkili bir şekilde kontrol etme amacına ulaşmak için zararlıların gelişimini, üremesini ve bağışıklığını düzenlemek için biyolojik kontrol ajanları olarak kullanılabilir15. Bununla birlikte, etkili zehir ekstraksiyon yöntemlerinin olmaması, genellikle parazitoid yaban arılarının, özellikle de Trichogramma gibi küçük parazitoid yaban arılarının zehiri üzerine yapılan araştırmaları sınırlar. Bu makale, protein bileşimi ve zehir fonksiyonunun tanımlanması gibi Trichogramma zehirinin takip çalışması için bir yöntem sağlayan Trichogramma zehirini çıkarmak için etkili bir yöntem sağlar. Ek olarak, bu yöntem diğer parazitoid yaban arısı zehiri araştırmaları için bir referans olarak da kullanılabilir ve böcek öldürücü veya tıbbi uygulamalar için parazitoid zehirlerden biyoaktif moleküllerin taranmasını teşvik etmek için destek sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur ve rekabet eden mali çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Hainan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (Hibe no. 323QN262), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (Hibe no. 31701843 ve 32172483), Jiangsu Tarım Bilimi ve Teknoloji İnovasyon Fonu'ndan (Hibe No. CX (22) 3012 ve CX (21) 3008), Jiangsu Eyaleti "Shuangchuang Doktor" Vakfı (Hibe No. 202030472) ve Nanjing Ziraat Üniversitesi başlangıç fonu (Hibe No. 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
