Summary
Aquí, presentamos un protocolo para extraer veneno de Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial creado con una película de polietileno y una solución de aminoácidos.
Abstract
Las avispas parasitoides son un grupo diverso de insectos himenópteros que sirven como recursos invaluables para el control biológico de plagas. Para garantizar el éxito del parasitismo, las avispas parasitoides inyectan veneno en sus huéspedes para suprimir la inmunidad de sus huéspedes, modular el desarrollo, el metabolismo e incluso el comportamiento de los huéspedes. Con más de 600.000 especies estimadas, la diversidad de avispas parasitoides supera a la de otros animales venenosos, como serpientes, caracoles cono y arañas. El veneno de avispa parasitoide es una fuente poco explorada de moléculas bioactivas con aplicaciones potenciales en el control de plagas y la medicina. Sin embargo, la recolección de veneno parasitoide es un desafío debido a la incapacidad de usar estimulación directa o eléctrica y la dificultad en la disección debido a su pequeño tamaño. Trichogramma es un género de avispas parasitoides de huevo diminutas (~0,5 mm) que se utilizan ampliamente para el control biológico de plagas de lepidópteros tanto en la agricultura como en los bosques. Aquí, reportamos un método para extraer veneno de T. dendrolimi usando huéspedes artificiales. Estos huéspedes artificiales se crean con una película de polietileno y soluciones de aminoácidos y luego se inoculan con avispas Trichogramma para el parasitismo. Posteriormente, el veneno fue recogido y concentrado. Este método permite la extracción de grandes cantidades de veneno de Trichogramma al tiempo que evita la contaminación de otros tejidos causada por la disección, un problema común en los protocolos de disección de reservorios de veneno. Este enfoque innovador facilita el estudio del veneno de Trichogramma , allanando el camino para nuevas investigaciones y posibles aplicaciones.
Introduction
Las avispas parasitoides son insectos himenópteros parásitos que son recursos importantes para el control biológico1. Existe una gran variedad de avispas parasitoides, con más de 600.000 especies estimadas2. La diversidad de avispas parasitoides supera con creces la de otros artrópodos venenosos, como serpientes, caracoles cono, arañas, escorpiones y abejas. El veneno es un factor parasitario importante en las avispas parasitoides. Para un parasitismo exitoso, el veneno se inyecta en el huésped, modulando el comportamiento, la inmunidad, el desarrollo y el metabolismo delhuésped. Además, el veneno de las avispas parasitoides muestra una notable diversidad en sus estructuras moleculares, objetivos y funciones, lo que refleja una compleja coevolución con sus huéspedes. Por lo tanto, el veneno parasitoide es un recurso valioso y subestimado de moléculas activas con fines insecticidas o médicos4. A diferencia del veneno de serpientes, caracoles cono, arañas, escorpiones y abejas, el veneno de avispa parasitoide no se puede recolectar por estimulación directa o estimulacióneléctrica. El método actual de extracción del veneno de avispa parasitoide es diseccionar el depósito de veneno. Sin embargo, las avispas parasitoides suelen ser pequeñas, y la disección de avispas parasitoides requiere altas habilidades técnicas. Por lo tanto, si podemos encontrar una manera de recolectar el veneno de las avispas parasitoides de manera eficiente y conveniente, será de gran ayuda investigar el veneno de las avispas parasitoides.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) es un género de avispas parasitoides diminutas (~0,5 mm de largo)6. Estas avispas se encuentran entre los agentes de control biológico más utilizados, especialmente en los huevos de diversas plagas de lepidópteros, tanto en la agricultura como en los bosques. Por ejemplo, T. dendrolimi, una de las especies de Trichogramma más utilizadas en China, se ha aplicado ampliamente para controlar una variedad de plagas agrícolas y forestales, como Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis y Chilo suppressalis. Estudios previos demostraron que las avispas Trichogramma podían inyectar sus huevos en huéspedes artificiales7. Los anfitriones artificiales se pueden crear utilizando materiales como cera8, agar9, Parafilm10 y película plástica11. La solución en huéspedes artificiales que induce suficiente oviposición para Trichogramma puede ser simple, como aminoácidos o sales inorgánicas12. Basado en la característica de que T. dendrolimi puede parasitar huéspedes artificiales, este estudio proporciona un nuevo método para extraer veneno de avispas parasitoides utilizando huéspedes artificiales. Este enfoque tiene como objetivo abordar las deficiencias de bajo rendimiento, baja pureza y susceptibilidad a la contaminación en las técnicas de extracción actuales. Mediante el uso de este método, se puede extraer una gran cantidad de veneno de alta pureza de T. dendrolimi , lo que satisface las necesidades de investigación científica y detección de moléculas bioactivas con fines insecticidas o médicos.
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Protocol
1. Cría de insectos
- Alimente Corcyra cephalonica con harina de maíz a una temperatura de 26 ± 1 °C y una humedad relativa del 40% ± 10%.
- Cría una cepa de T. dendrolimi del insectario Jilin en interiores utilizando los huevos de Corcyra cephalonica como huéspedes. Alimente a los adultos de avispa al 10% con agua de sacarosa en tubos de Drosophila a una temperatura de 26 ± 1 °C, humedad relativa del 70% ± 10%, luz (L): oscuridad (D) período de 14 h: 10 h.
2. Preparación de tarjetas de huevo de película plástica de polietileno
- Tome una película de plástico de polietileno con una longitud de 16 cm, un ancho de 12 cm y un grosor de 20 μm. Presione 30 protuberancias semicirculares con un diámetro de 2-3 mm y una altura de aproximadamente 3 mm utilizando una varilla abrasiva de vidrio de acuerdo con el diseño estándar de la placa PCR de 96 orificios.
NOTA: El proceso de prensar 30 protuberancias semicirculares con una varilla de molienda de vidrio debe realizarse prestando atención a la presión porque una prensa demasiado fuerte perforará el plástico y contaminará la varilla de molienda sin veneno extraída. - Desinfecte la película de plástico de polietileno prensado exponiendo ambos lados a la luz ultravioleta (UV) durante 1 h.
- Agregue una pequeña cantidad de alcohol polivinílico al 10% a la superficie semicircular.
3. Parasitismo por Trichogramma dendrolimi
- Después de la anestesia con CO2 , coloque las avispas hembras de T. dendrolimi en una caja de recolección, y el número de avispas fue de ~ 3000.
- Coloque el lado convexo de la tarjeta de huevo de película hacia la caja de recolección y asegure los bordes con una banda elástica.
- Añadir 4 μL de solución de aminoácidos (6 g/L de leucina, 4 g/L de fenilalanina, 4,25 g/L de histidina) a cada protuberancia semicircular. Cúbrelo con una película plástica plana de polietileno de 16 cm de largo y 12 cm de ancho. Use una banda elástica para cubrir herméticamente la caja de recolección con dos hojas de plástico.
- Deje que las avispas T. dendrolimi parasiten libremente durante 4-8 h y proporcione un 10% de agua de sacarosa a través del algodón mojado.
4. Recolección del veneno de T. dendrolimi
- Obtenga la solución de aminoácidos parasitados de la protuberancia interna de la tarjeta de huevo artificial y transfiérala a la tapa de los tubos de 1,5 ml.
- Cubra la tapa del tubo con una red de nailon de 10 μm con un diámetro de 25 mm, sujete firmemente la red de nailon y el tubo de centrífuga. Coloque el tubo de centrífuga en posición vertical para una centrifugación corta con una minicentrífuga (1360 x g) durante 10 s y recoja la solución filtrada (~100 μL de veneno de T. dendrolimi ).
- Mida la concentración de veneno de T. dendrolimi recolectado utilizando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Tabla de materiales).
- Almacene el veneno a -80 °C para su posterior análisis.
5. Análisis SDS-PAGE
- Añadir 30 μL de veneno de T. dendrolimi a 10 μL de tampón de carga de muestras de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) 4x (Tabla de materiales) y calentar a 95 °C durante 10 min.
- Realice el funcionamiento del gel SDS-PAGE a 130 V durante 120 min.
- Tiñir y decolorar el gel SDS-PAGE utilizando el aparato de tinción de proteínas (Tabla de materiales).
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Representative Results
La concentración de proteínas de las muestras representativas de veneno se midió utilizando el kit de ensayo de proteínas, con los resultados presentados en la Tabla 1. Los resultados mostraron que la concentración de proteína de veneno recolectada por este método varió de 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mientras que el control negativo de la solución de aminoácidos solo tuvo una concentración de proteína de 0,03 μg/μL a 0,05 μg/μL. La concentración de proteína de veneno recolectada por este método es mucho mayor que la del control negativo, lo que demuestra que este método puede recolectar bien el veneno de avispas parásitas. Además, no existe una correlación específica entre el tiempo de parasitismo y la concentración porque diferentes lotes de avispas parásitas pueden tener diferente vitalidad.
Además, el veneno de T. dendrolimi fue analizado por SDS-PAGE, revelando un rango de proteínas de veneno que abarca desde menos de 10 kDa hasta más de 130 kDa en la Figura 1. Sin embargo, cuando se analizó el control negativo del aminoácido por SDS-PAGE, se encontró que no había proteína en él (Figura suplementaria 1), lo que también demostró que la proteína recolectada por este método era efectivamente la proteína venenosa de las avispas parásitas.
Figura 1: Análisis SDS-PAGE de la proteína del veneno de T. dendrolimi. Carriles 1-2: las cantidades cargadas de proteína venenosa fueron de 8 μg y 10 μg, respectivamente. M: Marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | Tiempo de parasitismo (h) | Concentración (μg/μL) | |
| Veneno | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Control | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabla 1: Información sobre la concentración del veneno y el control. La concentración de proteínas de las muestras representativas de veneno y control se midió utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA. Control: los controles no parasitados. NP: sin parasitismo
Figura complementaria 1: Análisis SDS-PAGE del control y el veneno. Control: el control no parasitado. Veneno: las cantidades cargadas de proteína venenosa fueron de 10 μg. M: Marcador. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, presentamos un método para extraer veneno de T. dendrolimi utilizando huéspedes artificiales. Los puntos clave en el experimento de recolección de veneno son los siguientes. (1) Durante la preparación, T. dendrolimi debe anestesiarse rápidamente con una concentración adecuada de CO2. Si la concentración deCO2 es demasiado baja, será insuficiente para anestesiar el Trichogramma rápidamente. Por el contrario, si la concentración es demasiado alta, Trichogramma puede morir, reduciendo su capacidad para parasitar al huésped artificial. (2) Debe garantizarse la esterilidad de la solución de aminoácidos, ya que la contaminación de la solución de aminoácidos puede afectar negativamente a la eficiencia del parasitismo. (3) La parasitación de las tarjetas de huevos artificiales debe realizarse en condiciones de oscuridad para promover el parasitismo. (4) Se recomienda llevar a cabo directamente experimentos posteriores o congelar las muestras para garantizar la actividad del veneno y evitar su degradación.
Se recomienda juzgar la parasitación visualizando los huevos depositados. Si los huevos depositados no se observan bajo el microscopio, es posible que no se haya extraído veneno. La limitación de la técnica es que requiere un gran número de avispas parasitoides. Una sola extracción de veneno requiere alrededor de 3.000 avispas parasitoides, lo que aumenta la carga de trabajo.
El método anterior de extracción del veneno de avispa parasitoide era diseccionar el reservorio de veneno. Sin embargo, las avispas parasitoides son diminutas; por ejemplo, Trichogramma mide menos de 1 mm de largo. No solo los requisitos técnicos para diseccionar los depósitos de veneno son altos, sino que también es común la contaminación de otros tejidos durante la disección. El novedoso método que utiliza anfitriones artificiales puede mejorar la eficiencia de la extracción de veneno y evitar la contaminación de otros tejidos causada por la disección.
Este método también se puede extender a otras avispas parasitoides. Por ejemplo, los ovocitos de película plástica de polietileno que contienen una mezcla de iones de sal y aminoácidos se pueden usar para obtener el veneno de T. neustadt, y los huevos de cera artificial que contienen una solución de KCl-MgSO4 se pueden usar para obtener el veneno de T. pretiosum. Además de Trichogramma, se ha reportado que Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 y Habrobracon hebetor10 pueden parasitar huéspedes artificiales. Utilizando las propiedades de estas avispas parasitoides para parasitar huéspedes artificiales, se pueden desarrollar métodos similares de extracción de veneno.
El veneno de avispa parasitoide es una fuente poco explorada de moléculas biológicas con potencial para el control de plagas y aplicaciones médicas. Recientemente, se han reconocido los usos potenciales del veneno parasitoide en farmacología y agricultura14,15. Desde el punto de vista farmacológico, muchos componentes del veneno parasitoide tienen amplias perspectivas de aplicación potencial en la optimización de la inmunoterapia, el tratamiento de trastornos trombóticos y la búsqueda de plantillas para nuevos antibióticos. En la agricultura, algunos componentes del veneno de parasitoides pueden utilizarse como agentes de control biológico para regular el desarrollo, la reproducción y la inmunidad de las plagas con el fin de lograr el propósito de controlar eficazmente las plagas15. Sin embargo, la falta de métodos eficientes de extracción de veneno a menudo limita la investigación sobre el veneno de las avispas parasitoides, especialmente las avispas parasitoides diminutas como Trichogramma. Este artículo proporciona un método eficiente para extraer el veneno de Trichogramma, que proporciona un método para el estudio de seguimiento del veneno de Trichogramma, como la identificación de la composición de proteínas y la función del veneno. Además, este método también se puede utilizar como referencia para otras investigaciones sobre el veneno de avispa parasitoide y proporciona apoyo para promover la detección de moléculas bioactivas de venenos de parasitoides para aplicaciones insecticidas o médicas.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar ni intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hainan (Subvención n.º 323QN262), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención n.º 31701843 y 32172483), el Fondo de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de Jiangsu (Subvención No. CX(22)3012 y CX(21)3008), la Fundación "Shuangchuang Doctor" de la provincia de Jiangsu (subvención n.º 202030472) y el fondo inicial de la Universidad Agrícola de Nanjing (subvención n.º 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
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