Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'estrazione del veleno da Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale creato con film di polietilene e soluzione di amminoacidi.
Abstract
Le vespe parassitoidi sono un gruppo eterogeneo di insetti imenotteri che fungono da risorse inestimabili per il biocontrollo dei parassiti. Per garantire il successo del parassitismo, le vespe parassitoidi iniettano veleno nei loro ospiti per sopprimere l'immunità dei loro ospiti, modulare lo sviluppo, il metabolismo e persino il comportamento degli ospiti. Con oltre 600.000 specie stimate, la diversità delle vespe parassitoidi supera quella di altri animali velenosi, come serpenti, lumache a cono e ragni. Il veleno di vespa parassitoide è una fonte poco esplorata di molecole bioattive con potenziali applicazioni nel controllo dei parassiti e nella medicina. Tuttavia, la raccolta del veleno parassitoide è impegnativa a causa dell'impossibilità di utilizzare la stimolazione diretta o elettrica e della difficoltà di dissezione a causa delle loro piccole dimensioni. Trichogramma è un genere di vespe parassitoidi di minuscole (~0,5 mm) uova ampiamente utilizzate per il controllo biologico dei parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Riportiamo qui un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. Questi ospiti artificiali vengono creati con film di polietilene e soluzioni di amminoacidi e poi inoculati con vespe Trichogramma per il parassitismo. Il veleno è stato successivamente raccolto e concentrato. Questo metodo consente l'estrazione di grandi quantità di veleno di Trichogramma evitando la contaminazione da altri tessuti causata dalla dissezione, un problema comune nei protocolli di dissezione del serbatoio del veleno. Questo approccio innovativo facilita lo studio del veleno di Trichogramma , aprendo la strada a nuove ricerche e potenziali applicazioni.
Introduction
Le vespe parassitoidi sono insetti imenotteri parassiti che rappresentano importanti risorse per la lotta biologica1. Esiste un'ampia varietà di vespe parassitoidi, con oltre 600.000 specie stimate2. La diversità delle vespe parassitoidi supera di gran lunga quella di altri artropodi velenosi, come serpenti, lumache a cono, ragni, scorpioni e api. Il veleno è un importante fattore parassitario nelle vespe parassitoidi. Per il successo del parassitismo, il veleno viene iniettato nell'ospite, modulando il comportamento, l'immunità, lo sviluppo e il metabolismodell'ospite 3. Inoltre, il veleno delle vespe parassitoidi mostra una notevole diversità nelle sue strutture molecolari, nei suoi bersagli e nelle sue funzioni, riflettendo la complessa coevoluzione con i loro ospiti. Pertanto, il veleno parassitoide è una risorsa preziosa e sottovalutata di molecole attive per scopi insetticidi o medici4. A differenza del veleno di serpenti, lumache, ragni, scorpioni e api, il veleno di vespe parassitoidi non può essere raccolto mediante stimolazione diretta o elettrostimolazione5. L'attuale metodo di estrazione del veleno di vespa parassitoide consiste nel sezionare il serbatoio del veleno. Tuttavia, le vespe parassitoidi sono spesso piccole e la dissezione delle vespe parassitoidi richiede elevate competenze tecniche. Pertanto, se riusciamo a trovare un modo per raccogliere il veleno delle vespe parassitoidi in modo efficiente e conveniente, sarà di grande aiuto ricercare il veleno delle vespe parassitoidi.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) è un genere di minuscole vespe parassitoidi (lunghe ~0,5 mm)6. Queste vespe sono tra gli agenti di biocontrollo più utilizzati, in particolare per le uova di vari parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Ad esempio, T. dendrolimi, una delle specie di Trichogramma più utilizzate in Cina, è stata ampiamente applicata per controllare una varietà di parassiti agricoli e forestali, come Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis e Chilo suppressalis. Studi precedenti hanno dimostrato che le vespe Trichogramma potevano iniettare le loro uova in ospiti artificiali7. Gli ospiti artificiali possono essere creati utilizzando materiali come cera8, agar9, Parafilm10 e film plastico11. La soluzione in ospiti artificiali che induce un'ovideposizione sufficiente per Trichogramma può essere semplice, come amminoacidi o sali inorganici12. Sulla base della caratteristica che T. dendrolimi può parassitare gli ospiti artificiali, questo studio fornisce un nuovo metodo per estrarre il veleno dalle vespe parassitoidi utilizzando ospiti artificiali. Questo approccio mira ad affrontare le carenze di bassa resa, bassa purezza e suscettibilità alla contaminazione nelle attuali tecniche di estrazione. Utilizzando questo metodo, è possibile estrarre una grande quantità di veleno ad alta purezza da T. dendrolimi , che soddisfa le esigenze della ricerca scientifica e dello screening di molecole bioattive per scopi insetticidi o medici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allevamento di insetti
- Somministrare Corcyra cephalonica con farina di mais ad una temperatura di 26 ± 1°C e un'umidità relativa del 40% ± 10%.
- Allevare il ceppo di T. dendrolimi dell'insetto Jilin indoor utilizzando le uova di Corcyra cephalonica come ospiti. Nutrire gli adulti di vespe con acqua di saccarosio al 10% in provette di Drosophila a una temperatura di 26 ± 1 °C, umidità relativa del 70% ± 10%, luce (L): buio (D) periodo di 14 h: 10 h.
2. Preparazione delle carte uovo in film plastico di polietilene
- Prendi una pellicola di plastica in polietilene con una lunghezza di 16 cm, una larghezza di 12 cm e uno spessore di 20 μm. Pressare 30 sporgenze semicircolari con un diametro di 2-3 mm e un'altezza di circa 3 mm utilizzando un'asta di molatura del vetro secondo la disposizione standard della piastra PCR di 96 fori.
NOTA: Il processo di pressatura di 30 sporgenze semicircolari utilizzando un'asta di macinazione del vetro deve essere eseguito prestando attenzione alla pressione perché una pressa troppo dura perforerà la plastica e contaminerà l'asta di macinazione senza veleno estratta. - Disinfettare il film plastico di polietilene pressato esponendo entrambi i lati alla luce ultravioletta (UV) per 1 ora.
- Aggiungere una piccola quantità di alcol polivinilico al 10% sulla superficie semicircolare.
3. Parassitismo di Trichogramma dendrolimi
- Dopo l'anestesia CO2 , posizionare le vespe femmine di T. dendrolimi in una scatola di raccolta e il numero di vespe era ~ 3000.
- Posizionare il lato convesso della carta uovo in pellicola verso la scatola di raccolta e fissare i bordi con un elastico.
- Aggiungere 4 μL di soluzione aminoacidica (6 g/L di leucina, 4 g/L di fenilalanina, 4,25 g/L di istidina) a ciascuna protrusione semicircolare. Copritela con una pellicola di plastica piatta in polietilene lunga 16 cm e larga 12 cm. Utilizzare un elastico per coprire ermeticamente il contenitore di raccolta con due fogli di plastica.
- Lasciare che le vespe T. dendrolimi parassitino liberamente per 4-8 ore e forniscano il 10% di acqua di saccarosio attraverso il cotone bagnato.
4. Raccolta del veleno di T. dendrolimi
- Ottenere la soluzione di amminoacidi parassitati dalla sporgenza interna della scheda uovo artificiale e trasferirla nel tappo delle provette da 1,5 mL.
- Coprire il tappo della provetta con una rete di nylon da 10 μm di diametro 25 mm, fissare saldamente la rete di nylon e la provetta da centrifuga. Posizionare la provetta da centrifuga in posizione verticale per una centrifugazione breve utilizzando una minicentrifuga (1360 x g) per 10 secondi e raccogliere la soluzione filtrata (~100 μL di veleno di T. dendrolimi ).
- Misurare la concentrazione del veleno di T. dendrolimi raccolto utilizzando un kit per il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) (Tabella dei materiali).
- Conservare il veleno a -80 °C per ulteriori analisi.
5. Analisi SDS-PAGE
- Aggiungere 30 μL di veleno di T. dendrolimi a 10 μL di tampone di caricamento del campione su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (Tabella dei materiali) e riscaldare a 95 °C per 10 min.
- Eseguire il ciclo del gel SDS-PAGE a 130 V per 120 min.
- Colorare e decolorare il gel SDS-PAGE utilizzando l'apparato di colorazione delle proteine (Tabella dei materiali).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La concentrazione proteica di campioni di veleno rappresentativi è stata misurata utilizzando il kit di analisi delle proteine, con i risultati presentati nella Tabella 1. I risultati hanno mostrato che la concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo metodo variava da 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mentre il controllo negativo della soluzione di amminoacidi aveva solo una concentrazione proteica compresa tra 0,03 μg/μL e 0,05 μg/μL. La concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo metodo è molto più alta di quella del controllo negativo, il che dimostra che questo metodo può raccogliere bene il veleno delle vespe parassite. Inoltre, non esiste una correlazione specifica tra il tempo e la concentrazione del parassitismo perché diversi lotti di vespe parassite possono avere una vitalità diversa.
Inoltre, il veleno di T. dendrolimi è stato analizzato mediante SDS-PAGE, rivelando un intervallo di proteine del veleno che va da meno di 10 kDa a oltre 130 kDa nella Figura 1. Tuttavia, quando il controllo negativo dell'amminoacido è stato analizzato mediante SDS-PAGE, si è scoperto che non c'era alcuna proteina in esso (Figura supplementare 1), il che ha anche dimostrato che la proteina raccolta con questo metodo era effettivamente la proteina del veleno delle vespe parassite.
Figura 1: Analisi SDS-PAGE della proteina del veleno di T. dendrolimi. Corsia 1-2: le quantità caricate di proteina del veleno erano rispettivamente di 8 μg e 10 μg. M: Marcatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Campione | Tempo parassitismo (h) | Concentrazione (μg/μL) | |
| Veleno | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Controllo | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabella 1: Informazioni sulla concentrazione del veleno e sul controllo. La concentrazione proteica di campioni rappresentativi di veleno e di controllo è stata misurata utilizzando il kit di analisi delle proteine BCA. Controllo: i controlli non parassitati. NP: nessun parassitismo
Figura 1 supplementare: Analisi SDS-PAGE del controllo e del veleno. Controllo: il controllo non parassitato. Veleno: le quantità caricate di proteina velenifera erano di 10 μg. M: Marcatore. Fare clic qui per scaricare il file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, presentiamo un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. I punti chiave dell'esperimento di raccolta del veleno sono i seguenti. (1) Durante la preparazione, T. dendrolimi deve essere anestetizzato rapidamente con un'adeguata concentrazione di CO2 . Se la concentrazione di CO2 è troppo bassa, sarà insufficiente per anestetizzare rapidamente il Trichogramma . Al contrario, se la concentrazione è troppo alta, i Trichogramma possono morire, riducendo la loro capacità di parassitare l'ospite artificiale. (2) Deve essere garantita la sterilità della soluzione amminoacidica, poiché la contaminazione della soluzione amminoacidica può avere un impatto negativo sull'efficienza del parassitismo. (3) La parassitizzazione delle carte uovo artificiali dovrebbe essere condotta in condizioni di oscurità per promuovere il parassitismo. (4) Si raccomanda di effettuare direttamente esperimenti a valle o di congelare i campioni per garantire l'attività del veleno e prevenirne la degradazione.
Si raccomanda di giudicare la parassitizzazione visualizzando le uova depositate. Se le uova depositate non vengono osservate al microscopio, è possibile che non sia stato estratto alcun veleno. Il limite della tecnica è che richiede un gran numero di vespe parassitoidi. Una singola estrazione di veleno richiede circa 3.000 vespe parassitoidi, il che aumenta il carico di lavoro.
Il precedente metodo di estrazione del veleno di vespa parassitoide consisteva nel sezionare il serbatoio del veleno. Tuttavia, le vespe parassitoidi sono minuscole; ad esempio, il Trichogramma è lungo meno di 1 mm. Non solo i requisiti tecnici per la dissezione dei serbatoi di veleno sono elevati, ma è comune anche la contaminazione di altri tessuti durante la dissezione. Il nuovo metodo che utilizza ospiti artificiali può migliorare l'efficienza dell'estrazione del veleno ed evitare la contaminazione da altri tessuti causata dalla dissezione.
Questo metodo può essere esteso anche ad altre vespe parassitoidi. Ad esempio, gli ovociti in film plastico di polietilene contenenti una miscela di ioni sali e amminoacidi possono essere utilizzati per ottenere il veleno di T. neustadt e le uova di cera artificiale contenenti la soluzione di KCl-MgSO4 possono essere utilizzate per ottenere il veleno di T. pretiosum. Oltre a Trichogramma, è stato riportato che Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 e Habrobracon hebetor10 possono parassitare gli ospiti artificiali. Utilizzando le proprietà di queste vespe parassitoidi per parassitare ospiti artificiali, è possibile sviluppare metodi di estrazione del veleno simili.
Il veleno di vespa parassitoide è una fonte inesplorata di molecole biologiche con potenziali applicazioni mediche e di controllo dei parassiti. Recentemente, sono stati riconosciuti i potenziali usi del veleno parassitoide in farmacologia e agricoltura14,15. Dal punto di vista farmacologico, molti componenti del veleno parassitoide hanno ampie prospettive di applicazione nell'ottimizzazione dell'immunoterapia, nel trattamento dei disturbi trombotici e nella ricerca di modelli per nuovi antibiotici. In agricoltura, alcuni componenti del veleno parassitoide possono essere utilizzati come agenti di controllo biologico per regolare lo sviluppo, la riproduzione e l'immunità dei parassiti per raggiungere lo scopo di controllare efficacemente i parassiti15. Tuttavia, la mancanza di metodi efficienti di estrazione del veleno spesso limita la ricerca sul veleno delle vespe parassitoidi, in particolare delle minuscole vespe parassitoidi come Trichogramma. Questo documento fornisce un metodo efficiente per estrarre il veleno di Trichogramma, che fornisce un metodo per lo studio di follow-up del veleno di Trichogramma, come l'identificazione della composizione proteica e della funzione del veleno. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche come riferimento per altre ricerche sul veleno di vespa parassitoide e fornisce supporto per promuovere lo screening di molecole bioattive da veleni parassitoidi per applicazioni insetticide o mediche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare e non ha interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Riconosciamo il sostegno finanziario della Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Hainan (Sovvenzione n. 323QN262), della Fondazione Nazionale per le Scienze Naturali della Cina (Sovvenzione n. 31701843 e 32172483), del Fondo per l'Innovazione Scientifica e Tecnologica dell'Agricoltura del Jiangsu (Sovvenzione n. CX(22)3012 e CX(21)3008), la Fondazione "Shuangchuang Doctor" della provincia di Jiangsu (sovvenzione n. 202030472) e il fondo di avvio dell'Università agraria di Nanchino (sovvenzione n. 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
