Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para extração de veneno de Trichogramma dendrolimi usando um hospedeiro artificial criado com filme de polietileno e solução de aminoácidos.
Abstract
As vespas parasitoides são um grupo diversificado de insetos himenópteros que servem como recursos inestimáveis para o biocontrole de pragas. Para garantir o sucesso do parasitismo, as vespas parasitoides injetam veneno em seus hospedeiros para suprimir a imunidade de seus hospedeiros, modular o desenvolvimento, o metabolismo e até mesmo o comportamento dos hospedeiros. Com mais de 600.000 espécies estimadas, a diversidade de vespas parasitoides supera a de outros animais peçonhentos, como cobras, caracóis cônicos e aranhas. O veneno da vespa parasitoide é uma fonte pouco explorada de moléculas bioativas com potenciais aplicações no controle de pragas e na medicina. No entanto, a coleta de veneno de parasitoides é um desafio devido à incapacidade de usar estimulação direta ou elétrica e à dificuldade de dissecção devido ao seu pequeno tamanho. Trichogramma é um gênero de vespas parasitoides de ovos minúsculas (~0,5 mm) que são amplamente utilizadas para o controle biológico de pragas de lepidópteros na agricultura e florestas. Aqui, relatamos um método para extração de veneno de T. dendrolimi usando hospedeiros artificiais. Esses hospedeiros artificiais são criados com filme de polietileno e soluções de aminoácidos e, em seguida, inoculados com vespas Trichogramma para parasitismo. O veneno foi posteriormente coletado e concentrado. Este método permite a extração de grandes quantidades de veneno de Trichogramma , evitando a contaminação de outros tecidos causada pela dissecção, um problema comum em protocolos de dissecção de reservatórios de veneno. Esta abordagem inovadora facilita o estudo do veneno de Trichogramma , abrindo caminho para novas pesquisas e potenciais aplicações.
Introduction
As vespas parasitoides são insetos himenópteros parasitas que são importantes recursos para o controle biológico1. Existe uma grande variedade de vespas parasitoides, com mais de 600.000 espécies estimadas2. A diversidade de vespas parasitoides excede em muito a de outros artrópodes peçonhentos, como cobras, caracóis cônicos, aranhas, escorpiões e abelhas. O veneno é um importante fator parasitário em vespas parasitoides. Para o sucesso do parasitismo, o veneno é injetado no hospedeiro, modulando o comportamento, a imunidade, o desenvolvimento e o metabolismo do hospedeiro3. Além disso, o veneno de vespas parasitoides exibe notável diversidade em suas estruturas moleculares, alvos e funções, refletindo complexa coevolução com seus hospedeiros. Assim, o veneno do parasitoide é um recurso valioso e pouco valorizado de moléculas ativas para fins inseticidas oumedicinais4. Ao contrário do veneno de cobras, caracóis, aranhas, escorpiões e abelhas, o veneno da vespa parasitoide não pode ser coletado por estimulação direta ou estimulação elétrica5. O método atual de extração do veneno da vespa parasitoide é dissecar o reservatório de veneno. No entanto, as vespas parasitoides são frequentemente pequenas, e a dissecção de vespas parasitoides requer altas habilidades técnicas. Portanto, se pudermos encontrar uma maneira de coletar o veneno de vespas parasitoides de forma eficiente e conveniente, será de grande ajuda pesquisar o veneno de vespas parasitoides.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) é um gênero de vespas parasitoides minúsculas (~0,5 mm de comprimento)6. Essas vespas estão entre os agentes de biocontrole mais amplamente utilizados, particularmente visando ovos de várias pragas de lepidópteros na agricultura e nas florestas. Por exemplo, T. dendrolimi, uma das espécies de Trichogramma mais utilizadas na China, tem sido extensivamente aplicada para controlar uma variedade de pragas agrícolas e florestais, como Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis e Chilo suppressalis. Estudos anteriores mostraram que vespas Trichogramma poderiam injetar seus ovos em hospedeiros artificiais7. Hospedeiros artificiais podem ser criados usando materiais como cera8, ágar9, Parafilm10 e filme plástico11. A solução em hospedeiros artificiais que induz oviposição suficiente para Trichogramma pode ser simples, como aminoácidos ou sais inorgânicos12. Baseado na característica de que T. dendrolimi pode parasitar hospedeiros artificiais, este estudo fornece um novo método para extrair veneno de vespas parasitoides usando hospedeiros artificiais. Esta abordagem visa abordar as deficiências de baixo rendimento, baixa pureza e suscetibilidade à contaminação nas técnicas de extração atuais. Usando este método, uma grande quantidade de veneno de alta pureza de T. dendrolimi pode ser extraída, o que atende às necessidades de pesquisa científica e triagem de moléculas bioativas para fins inseticidas ou médicos.
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Protocol
1. Criação de insetos
- Alimentar Corcyra cephalonica em farinha de milho à temperatura de 26 ± 1°C e umidade relativa de 40% ± 10%.
- Cepa T. dendrolimi do insetário Jilin em ambientes fechados utilizando ovos de Corcyra cephalonica como hospedeiros. Alimentar adultos de vespa a 10% de água de sacarose em tubos de Drosophila a uma temperatura de 26 ± 1 °C, umidade relativa de 70% ± 10%, claro (L): escuro (D) período de 14 h: 10 h.
2. Preparação de cartões de ovo de filme plástico de polietileno
- Pegue um filme plástico de polietileno com um comprimento de 16 cm, uma largura de 12 cm e uma espessura de 20 μm. Pressione 30 saliências semicirculares com um diâmetro de 2-3 mm e uma altura de aproximadamente 3 mm usando uma haste de moagem de vidro de acordo com o layout padrão da placa de PCR de 96 furos.
NOTA: O processo de prensagem de 30 saliências semicirculares usando uma haste de moagem de vidro precisa ser feito prestando atenção à pressão, pois uma prensa muito dura perfurará o plástico e contaminará a haste de moagem sem veneno extraída. - Desinfete o filme plástico de polietileno prensado expondo ambos os lados à luz ultravioleta (UV) por 1 h.
- Adicione uma pequena quantidade de álcool polivinílico a 10% à superfície semicircular.
3. Parasitismo por Trichogramma dendrolimi
- Após a anestesia com CO2 , colocar vespas fêmeas de T. dendrolimi em uma caixa de coleta e o número de vespas foi de ~3000.
- Coloque o lado convexo do cartão de ovo de filme em direção à caixa coletora e prenda as bordas com um elástico.
- Adicionar 4 μL de solução de aminoácidos (6 g/L de leucina, 4 g/L de fenilalanina, 4,25 g/L de histidina) a cada protrusão semicircular. Cubra com um filme plástico plano de polietileno de 16 cm de comprimento por 12 cm de largura. Use um elástico para cobrir bem a caixa coletora com duas folhas de plástico.
- Deixe as vespas T. dendrolimi parasitarem livremente por 4-8 h e forneça 10% de água de sacarose através do algodão molhado.
4. Coleta de veneno de T. dendrolimi
- Obter a solução de aminoácidos parasitados a partir da protrusão interna do cartão de ovo artificial e transferi-la para a tampa de tubos de 1,5 mL.
- Cubra a tampa do tubo com uma rede de nylon de 10 μm com um diâmetro de 25 mm, prenda bem a rede de nylon e o tubo de centrifugação. Coloque o tubo da centrífuga na vertical para centrifugação curta usando uma minicentrífuga (1360 x g) por 10 s e colete a solução filtrada (~100 μL de veneno de T. dendrolimi ).
- Medir a concentração do veneno de T. dendrolimi coletado usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Tabela de Materiais).
- Conservar o veneno a -80 °C para análises complementares.
5. Análises do SDS-PAGE
- Adicionar 30 μL de veneno de T. dendrolimi a 10 μL de 4x tampão de carregamento de amostra de eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) (Tabela de Materiais) e aquecer a 95 °C por 10 min.
- Execute a corrida de gel SDS-PAGE a 130 V por 120 min.
- Corar e descolorir o gel de SDS-PAGE com o aparelho de coloração de proteínas (Tabela de Materiais).
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Representative Results
A concentração proteica das amostras representativas de veneno foi medida por meio do kit de ensaio proteico, com os resultados apresentados na Tabela 1. Os resultados mostraram que a concentração de proteína do veneno coletada por esse método variou de 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, enquanto o controle negativo da solução de aminoácidos apresentou apenas uma concentração proteica de 0,03 μg/μL a 0,05 μg/μL. A concentração de proteína do veneno coletada por este método é muito maior do que a do controle negativo, o que mostra que este método pode coletar bem o veneno de vespas parasitas. Além disso, não há correlação específica entre o tempo de parasitismo e a concentração, pois diferentes lotes de vespas parasitas podem ter vitalidade diferente.
Adicionalmente, o veneno de T. dendrolimi foi analisado por SDS-PAGE, revelando uma faixa de proteína do veneno que varia de menos de 10 kDa a mais de 130 kDa na Figura 1. No entanto, quando o controle negativo do aminoácido foi analisado por SDS-PAGE, verificou-se que não havia proteína nele (Figura 1 Suplementar), o que também comprovou que a proteína coletada por esse método era realmente a proteína do veneno de vespas parasitas.
Figura 1: Análise em SDS-PAGE da proteína venenosa de T. dendrolimi. Faixas 1-2: as quantidades carregadas de proteína do veneno foram de 8 μg e 10 μg, respectivamente. M: Marcador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra | Tempo de parasitismo (h) | Concentração (μg/μL) | |
| Veneno | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Controle | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabela 1: Informações de concentração do veneno e controle. A concentração proteica das amostras representativas de veneno e controle foi medida usando o kit de ensaio de proteína BCA. Controle: os controles não parasitados. NP: sem parasitismo
Figura suplementar 1: Análise SDS-PAGE do controle e do veneno. Controle: o controle não parasitado. Veneno: as quantidades carregadas de proteína do veneno foram de 10 μg. M: Marcador. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, apresentamos um método para extração de veneno de T. dendrolimi usando hospedeiros artificiais. Os pontos-chave no experimento de coleta de veneno são os seguintes. (1) Durante a preparação, T. dendrolimi deve ser anestesiado rapidamente com uma concentração adequada de CO2. Se a concentração de CO2 for muito baixa, será insuficiente para anestesiar o Trichogramma rapidamente. Por outro lado, se a concentração for muito alta, Trichogramma pode morrer, reduzindo sua capacidade de parasitar o hospedeiro artificial. (2) A esterilidade da solução de aminoácidos deve ser assegurada, pois a contaminação da solução de aminoácidos pode afetar negativamente a eficiência do parasitismo. (3) A parasitização de cartões de ovos artificiais deve ser realizada em condições escuras para promover parasitismo. (4) Recomenda-se a realização directa de experiências a jusante ou o congelamento das amostras para assegurar a actividade do veneno e evitar a degradação.
Recomenda-se julgar a parasitização visualizando os ovos depositados. Se os ovos depositados não forem observados ao microscópio, nenhum veneno pode ter sido extraído. A limitação da técnica é que requer um grande número de vespas parasitoides. Uma única extração de veneno requer cerca de 3.000 vespas parasitoides, o que aumenta a carga de trabalho.
O método prévio de extração do veneno da vespa parasitoide foi dissecar o reservatório do veneno. No entanto, as vespas parasitoides são minúsculas; por exemplo, Trichogramma tem menos de 1 mm de comprimento. Não só os requisitos técnicos de dissecção de reservatórios de veneno são altos, mas a contaminação de outros tecidos durante a dissecção também é comum. O novo método usando hospedeiros artificiais pode melhorar a eficiência da extração do veneno e evitar a contaminação de outros tecidos causada pela dissecção.
Este método também pode ser estendido a outras vespas parasitoides. Por exemplo, ovócitos de filme plástico de polietileno contendo uma mistura de íons de sal e aminoácidos podem ser usados para obter veneno de T. neustadt, e ovos de cera artificial contendo solução de KCl-MgSO4 podem ser usados para obter veneno de T. pretiosum. Além de Trichogramma, tem sido relatado que Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 e Habrobracon hebetor10 podem parasitar hospedeiros artificiais. Usando as propriedades dessas vespas parasitoides para parasitar hospedeiros artificiais, métodos semelhantes de extração de veneno podem ser desenvolvidos.
O veneno da vespa parasitoide é uma fonte pouco explorada de moléculas biológicas com potencial para controle de pragas e aplicações médicas. Recentemente, os usos potenciais do veneno de parasitoides na farmacologia e na agricultura têm sido reconhecidos14,15. Farmacologicamente, muitos componentes do veneno de parasitoides têm amplas perspectivas de aplicação potencial na otimização da imunoterapia, no tratamento de distúrbios trombóticos e na busca de modelos para novos antibióticos. Na agricultura, alguns componentes do veneno do parasitoide podem ser utilizados como agentes de controle biológico para regular o desenvolvimento, a reprodução e a imunidade de pragas, visando atingir o objetivo de controlar efetivamente as pragas15. No entanto, a falta de métodos eficientes de extração de veneno muitas vezes limita a pesquisa sobre o veneno de vespas parasitoides, especialmente minúsculas vespas parasitoides como Trichogramma. Este trabalho fornece um método eficiente para extrair o veneno de Trichogramma, que fornece um método para o estudo de acompanhamento do veneno de Trichogramma, como a identificação da composição proteica e função do veneno. Além disso, este método também pode ser usado como referência para outras pesquisas de veneno de vespas parasitoides e fornece suporte para promover a triagem de moléculas bioativas de venenos de parasitoides para aplicações inseticidas ou médicas.
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Disclosures
O autor não tem nada a revelar e nenhum interesse financeiro conflitante.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro da Fundação de Ciências Naturais da Província de Hainan (Grant no. 323QN262), da National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31701843 e 32172483), do Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (Grant No. CX(22)3012 e CX(21)3008), a Fundação "Doutor Shuangchhuang" da Província de Jiangsu (Grant No. 202030472), e o fundo de inicialização da Universidade Agrícola de Nanjing (Grant No. 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
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