Summary
ここでは、ポリエチレンフィルムとアミノ酸溶液で作成した人工宿主を用いて、 Trichogramma dendrolimi から毒液を抽出するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
寄生バチは、害虫の生物防除のための貴重な資源として機能する膜翅目昆虫の多様なグループです。寄生バチは、寄生を成功させるために、宿主に毒液を注入して宿主の免疫を抑制し、宿主の発達、代謝、さらには行動を調節します。推定60万種以上が生息する寄生バチの多様性は、ヘビ、カタツムリ、クモなどの他の毒動物を凌駕しています。寄生バチの毒は、生物活性分子の未開拓の供給源であり、害虫駆除や医療への応用が期待されています。しかし、寄生毒は直接刺激や電気刺激が使えないことや、サイズが小さいため解剖が難しいため、採取が困難です。 Trichogramma は、農業と森林の両方で鱗翅目の害虫の生物学的防除に広く使用されている小さな(~0.5 mm)卵寄生バチの属です。本稿では、人工宿主を用いて T. dendrolimi から毒液を抽出する方法について報告する。これらの人工宿主は、ポリエチレンフィルムとアミノ酸溶液で作成され、寄生のために トリコグラマ バチに接種されます。その後、毒液を採取し、濃縮した。この方法により、大量の トリコグラマ 毒を抽出しながら、毒液リザーバー解剖プロトコルで一般的な問題である解剖によって引き起こされる他の組織からの汚染を回避できます。この革新的なアプローチは、 トリコグラマ 毒の研究を促進し、新しい研究と潜在的な応用への道を開きます。
Introduction
寄生バチは寄生性膜翅目昆虫で、生物防除の重要な資源である1。寄生バチには多種多様な生物が生息しており、推定60万種以上が生息しています2。寄生バチの多様性は、ヘビ、円錐形カタツムリ、クモ、サソリ、ミツバチなどの他の毒節足動物の多様性をはるかに上回っています。毒は寄生バチの重要な寄生因子です。寄生を成功させるために、毒液を宿主に注入し、宿主の行動、免疫、発達、代謝を調節します3。また、寄生バチの毒は、宿主との複雑な共進化を反映して、分子構造、標的、機能に著しい多様性を示します。したがって、寄生毒は、殺虫剤や医療目的での活性分子の貴重で過小評価されている資源です4。ヘビ、カタツムリ、クモ、サソリ、ミツバチの毒とは異なり、寄生バチの毒は直接刺激や電気刺激では採取できない5。寄生バチの毒を抽出する現在の方法は、毒液リザーバーを解剖することです。しかし、寄生バチは小型のものが多く、寄生バチの解剖には高い技術力が求められます。そのため、効率よく便利に寄生バチの毒を採取する方法が見つかれば、寄生バチの毒の研究にも大きな助けとなるでしょう。
膜翅目(膜翅目:Trichogrammatidae)は、小さな(~0.5 mm)寄生バチの属です6。これらのスズメバチは、最も広く使用されている生物防除剤の一つであり、特に農業と森林の両方でさまざまな鱗翅目の害虫の卵を標的としています。例えば、中国で最も広く使用されているTrichogramma種の1つであるT. dendrolimiは、Dendrolimus superans、Ostrinia furnacalis、Chilo suppressalisなど、さまざまな農林業害虫の防除に広く適用されています。これまでの研究では、スズメバチが人工宿主に卵を注入できることが示されました7。人工宿主は、ワックス8、寒天9、パラフィルム10、プラスチックフィルム11などの材料を用いて作製することができる。トリコグラムに十分な産卵を誘導する人工宿主中の溶液は、アミノ酸や無機塩などの単純なものとすることができる12。本研究は、T. dendrolimiが人工宿主に寄生できるという特徴から、人工宿主を用いて寄生バチから毒液を抽出する新しい手法を提案します。このアプローチは、現在の抽出技術における低収率、低純度、および汚染に対する感受性の欠点に対処することを目的としています。この方法を用いることで、T. dendrolimiから高純度の毒液を大量に抽出することができ、殺虫剤や医療目的での生理活性分子の科学的研究やスクリーニングのニーズを満たしています。
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Protocol
1.昆虫の飼育
- トウモロコシ粉に26±1°Cの温度と40%±10%の相対湿度で Corcyra cephalonica を与えます。
- 吉林省の昆虫から、Corcyra cephalonicaの卵を宿主として屋内でT.dendrolimi株を繁殖させます。スズメバチの成虫に、26±1°Cの温度、相対湿度70%±10%、明るい(L):14時間の暗い(D)期間:10時間のショウジョウバエチューブ中の10%ショ糖水を与えます。
2.ポリエチレンプラスチックフィルムエッグカードの準備
- 長さ16cm、幅12cm、厚さ20μmのポリエチレンプラスチックフィルムを用意します。直径2〜3mm、高さ約3mmの半円形の突起を、標準的なPCRプレートの96穴レイアウトに従ってガラス砥石棒で30個押し出します。
注:ガラス砥石棒を使用して30個の半円形の突起を押し出すプロセスは、圧しすぎるとプラスチックに穴が開き、抽出された毒のない砥石棒を汚染するため、圧力に注意して行う必要があります。 - プレスされたポリエチレンプラスチックフィルムの両面を紫外線(UV)に1時間さらして消毒します。
- 半円形の表面に少量の10%ポリビニルアルコールを加えます。
3. トリコグラマデンドロリミ 寄生
- CO2麻酔後、T. dendrolimi雌のスズメバチを回収箱に入れたところ、スズメバチの数は~3000匹であった。
- フィルムエッグカードの凸面をコレクションボックスに向けて置き、端を輪ゴムで固定します。
- 各半円形突起に4 μLのアミノ酸溶液(6 g/Lロイシン、4 g/Lフェニルアラニン、4.25 g/Lヒスチジン)を加えます。長さ16cm、幅12cmの平らなポリエチレンプラスチックフィルムで覆います。輪ゴムを使用して、回収ボックスを2枚のプラスチックでしっかりと覆います。
- T. dendrolimi スズメバチに4〜8時間自由に寄生させ、湿らせた綿を通して10%のショ糖水を与えます。
4. T. dendrolimi毒 の採取
- 人工卵カードの内側の突起から寄生アミノ酸溶液を得て、1.5mLチューブのキャップに移します。
- チューブキャップを直径25mmの10μmナイロンネットで覆い、ナイロンネットと遠心チューブをしっかりと固定します。遠心分離チューブを直立させて、ミニ遠心分離機(1360 x g)を使用して10秒間短時間の遠心分離を行い、ろ過した溶液(~100 μLの T. dendrolimi 毒液)を回収します。
- 採取した T. dendrolimi 毒液の濃度を、ビシンコニン酸(BCA)アッセイキット(材料表)を用いて測定する。
- 毒液は-80°Cで保存し、さらに分析してください。
5. SDS-PAGE分析
- T. dendrolimi 毒液 30 μL を 4x ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) サンプルローディングバッファー (材料表) 10 μL に加え、95 °C で 10 分間加熱します。
- SDS-PAGEゲルを130Vで120分間泳動します。
- タンパク質染色装置(材料表)を使用してSDS-PAGEゲルを染色および脱色します。
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Representative Results
代表的な毒サンプルのタンパク質濃度をタンパク質アッセイキットを用いて測定し、その結果を 表1に示しました。その結果、この方法で採取した毒タンパク質の濃度は0.35μg/μLから0.46μg/μLの範囲であったのに対し、アミノ酸溶液のネガティブコントロールでは0.03μg/μLから0.05μg/μLのタンパク質濃度しか得られなかった。この方法で採取した毒タンパク質の濃度は、ネガティブコントロールの濃度よりもはるかに高く、この方法では寄生バチの毒をよく採取できることが分かります。さらに、寄生バチのバッチが異なれば生命力も異なるため、寄生時間と集中の間には特定の相関関係はありません。
さらに、 T. dendrolimi 毒液を SDS-PAGE で分析したところ、 図 1 では 10 kDa 未満から 130 kDa を超える毒タンパク質の範囲が明らかになりました。しかし、アミノ酸のネガティブコントロールをSDS-PAGEで解析したところ、アミノ酸にはタンパク質が含まれていないことがわかり(補足図1)、この方法で採取したタンパク質が確かに寄生バチの毒タンパク質であることが証明されました。
図1: T. dendrolimi 毒タンパク質のSDS-PAGE分析。 レーン 1-2: 毒タンパク質の負荷量は、それぞれ 8 μg と 10 μg でした。M:マーカー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 見本 | 寄生時間(h) | 濃度(μg/μL) | |
| 毒 | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| コントロール | 1 | NPの | 0.04 |
| 2 | NPの | 0.03 | |
| 3 | NPの | 0.05 | |
| 4 | NPの | 0.03 | |
| 5 | NPの | 0.03 | |
表1:毒液の濃度情報と対照。 代表的な毒液および対照サンプルのタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキットを使用して測定しました。コントロール:寄生されていないコントロール。NP:寄生なし
補足図1:コントロールと毒液のSDS-PAGE分析。 コントロール:寄生されていないコントロール。毒:毒タンパク質の負荷量は10μgでした。 M:マーカー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、人工宿主を用いてT. dendrolimiから毒液を抽出する方法を紹介します。毒液採取実験のポイントは、以下の通りです。(1)調製中、T. dendrolimiは適切な濃度のCO2で迅速に麻酔をかける必要があります。CO2濃度が低すぎると、トリコグラマを迅速に麻酔するには不十分です。逆に、濃度が高すぎると、トリコグラマが死滅し、人工宿主に寄生する能力が低下する可能性があります。(2)アミノ酸溶液の汚染は寄生効率に悪影響を及ぼす可能性があるため、アミノ酸溶液の無菌性を確保する必要があります。(3)人工卵カードの寄生は、寄生を促進するために暗い条件で行う必要があります。(4)毒の活性を確保し、分解を防ぐために、下流の実験を直接行うか、サンプルを凍結することをお勧めします。
寄生卵の可視化による寄生の判断が推奨されます。堆積した卵を顕微鏡で観察しない場合、毒液が抽出されていない可能性があります。この技術の限界は、多数の寄生バチを必要とすることです。1回の毒液の抽出には約3,000匹の寄生バチが必要で、作業負荷が増大します。
寄生バチの毒を抽出する以前の方法は、毒の貯蔵庫を解剖することでした。しかし、寄生バチは小さいです。たとえば、 トリコグラマ の長さは1mm未満です。毒液リザーバーを解剖するための技術的要件が高いだけでなく、解剖中の他の組織の汚染も一般的です。人工宿主を用いた新しい方法は、毒の抽出効率を向上させ、解剖によって引き起こされる他の組織からの汚染を回避することができます。
この方法は、他の寄生バチにも拡張できます。例えば、塩イオンとアミノ酸の混合物を含むポリエチレンプラスチックフィルムの卵母細胞を使用して、T.ノイシュタット毒を得ることができ、KCl-MgSO4溶液を含む人工ワックス卵を使用して、T.pretiosum毒を得ることができる。Trichogrammaの他に、Anastatus japonicus13、Microplitis croceipes9、Habrobracon hebetor10が人工宿主に寄生できることが報告されています。この寄生バチの性質を利用して人工宿主に寄生させることで、同様の毒液抽出法を開発することができます。
寄生バチの毒は、害虫駆除や医療への応用が期待できる生体分子の未開拓の供給源です。最近、薬理学と農業における寄生虫毒の潜在的な使用が認識されています14,15。薬理学的には、寄生虫毒の多くの成分は、免疫療法の最適化、血栓性疾患の治療、および新しい抗生物質のテンプレートの発見において、幅広い応用の可能性を秘めています。農業では、寄生虫毒の一部の成分を生物学的防除剤として使用して、害虫の発生、繁殖、および免疫を調節し、害虫を効果的に防除する目的を達成することができます15。しかし、効率的な毒抽出法がないため、寄生バチ、特にトリコグラマなどの小型寄生バチの毒に関する研究が制限されることがよくあります。本論文は、トリコグラマ毒の効率的な抽出法を提示し、タンパク質組成や毒機能の同定など、トリコグラマ毒の追跡研究の方法を提供する。また、他の寄生バチ毒研究の参考にもなり、殺虫剤や医療用途での寄生虫毒からの生理活性分子のスクリーニングを促進するためのサポートとなります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もなく、競合する金銭的利害関係もありません。
Acknowledgments
我々は、海南省自然科学基金会(助成金番号323QN262)、中国国家自然科学基金会(助成金番号31701843および32172483)、江蘇省農業科学技術イノベーション基金(助成金番号.CX(22)3012およびCX(21)3008)、江蘇省「双荘博士」基金(助成金第202030472号)、南京農業大学スタートアップ基金(助成金第804018号)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
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