Summary
यहां, हम पॉलीथीन फिल्म और अमीनो एसिड समाधान के साथ बनाए गए कृत्रिम मेजबान का उपयोग करके ट्राइकोग्रामा डेंड्रोलिमी से जहर निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
परजीवी ततैया हाइमनोप्टेरान कीड़ों का एक विविध समूह है जो कीट जैव नियंत्रण के लिए अमूल्य संसाधनों के रूप में काम करते हैं। सफल परजीवीवाद सुनिश्चित करने के लिए, परजीवी ततैया अपने मेजबानों की प्रतिरक्षा को दबाने के लिए अपने मेजबानों में जहर इंजेक्ट करते हैं, मेजबानों के विकास, चयापचय और यहां तक कि व्यवहार को संशोधित करते हैं। 600,000 से अधिक अनुमानित प्रजातियों के साथ, परजीवी ततैया की विविधता अन्य विषैले जानवरों, जैसे सांप, शंकु घोंघे और मकड़ियों से आगे निकल जाती है। परजीवी ततैया का जहर कीट नियंत्रण और चिकित्सा में संभावित अनुप्रयोगों के साथ बायोएक्टिव अणुओं का एक अस्पष्टीकृत स्रोत है। हालांकि, परजीवी जहर इकट्ठा करना प्रत्यक्ष या विद्युत उत्तेजना का उपयोग करने में असमर्थता और उनके छोटे आकार के कारण विच्छेदन में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण है। ट्राइकोग्रामा छोटे (~ 0.5 मिमी) अंडे परजीवी ततैया का एक जीनस है जो व्यापक रूप से कृषि और जंगलों दोनों में लेपिडोप्टेरान कीटों के जैविक नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है। यहां, हम कृत्रिम मेजबानों का उपयोग करके टी. डेंड्रोलिमी से जहर निकालने की एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। इन कृत्रिम मेजबानों को पॉलीथीन फिल्म और अमीनो एसिड समाधान के साथ बनाया जाता है और फिर परजीवीवाद के लिए ट्राइकोग्रामा ततैया के साथ टीका लगाया जाता है। बाद में जहर एकत्र किया गया और केंद्रित किया गया। यह विधि विच्छेदन के कारण होने वाले अन्य ऊतकों से संदूषण से बचने के दौरान बड़ी मात्रा में ट्राइकोग्रामा जहर के निष्कर्षण को सक्षम बनाती है, विष जलाशय विच्छेदन प्रोटोकॉल में एक आम मुद्दा। यह अभिनव दृष्टिकोण ट्राइकोग्रामा जहर के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, जिससे नए शोध और संभावित अनुप्रयोगों का मार्ग प्रशस्त होता है।
Introduction
परजीवी ततैया परजीवी हाइमनोप्टेरान कीड़े हैं जो जैविक नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण संसाधन हैं1. परजीवी ततैया की एक विस्तृत विविधता है, जिसमें 600,000 से अधिक अनुमानित प्रजातियांहैं 2. परजीवी ततैया की विविधता अन्य विषैले आर्थ्रोपोड्स, जैसे सांप, शंकु घोंघे, मकड़ियों, बिच्छू और मधुमक्खियों से कहीं अधिक है। परजीवी ततैया में जहर एक महत्वपूर्ण परजीवी कारक है। सफल परजीवीवाद के लिए, जहर को मेजबान में इंजेक्ट किया जाता है, मेजबान के व्यवहार, प्रतिरक्षा, विकास और चयापचय को संशोधित करता है3. इसके अलावा, परजीवी ततैया का जहर इसकी आणविक संरचनाओं, लक्ष्यों और कार्यों में उल्लेखनीय विविधता प्रदर्शित करता है, जो उनके मेजबानों के साथ जटिल सह-विकास को दर्शाता है। इस प्रकार, परजीवी जहर कीटनाशक याचिकित्सा प्रयोजनों के लिए सक्रिय अणुओं का एक मूल्यवान और कम सराहना किया गया संसाधन है। सांप, शंकु घोंघे, मकड़ियों, बिच्छू और मधुमक्खियों के जहर के विपरीत, परजीवी ततैया का जहर प्रत्यक्ष उत्तेजना या विद्युत उत्तेजना द्वारा एकत्र नहीं किया जा सकता है5. परजीवी ततैया के जहर के निष्कर्षण की वर्तमान विधि जहर जलाशय को विच्छेदन करना है। हालांकि, परजीवी ततैया अक्सर छोटे होते हैं, और परजीवी ततैया के विच्छेदन के लिए उच्च तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। इसलिए, यदि हम परजीवी ततैया के जहर को कुशलतापूर्वक और आसानी से इकट्ठा करने का एक तरीका खोज सकते हैं, तो परजीवी ततैया के जहर पर शोध करने में बहुत मदद मिलेगी।
ट्राइकोग्रामा (हाइमनोप्टेरा: ट्राइकोग्रामेटिडे) छोटे (~ 0.5 मिमी लंबे) परजीवी ततैया6 का एक जीनस है। ये ततैया सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले जैव नियंत्रण एजेंटों में से हैं, विशेष रूप से कृषि और जंगलों दोनों में विभिन्न लेपिडोप्टेरान कीटों के अंडों को लक्षित करते हैं। उदाहरण के लिए, टी. डेंड्रोलिमी, चीन में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली ट्राइकोग्रामा प्रजातियों में से एक, को विभिन्न प्रकार के कृषि और वानिकी कीटों को नियंत्रित करने के लिए बड़े पैमाने पर लागू किया गया है, जैसे कि डेंड्रोलिमस सुपरन्स, ओस्ट्रिनिया फर्नाकैलिस और चिलो सप्रेसलिस। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ट्राइकोग्रामा ततैया अपने अंडे कृत्रिम मेजबान7 में इंजेक्ट कर सकती है। कृत्रिम मेजबान मोम8, अगर9, पैराफिल्म10 और प्लास्टिक की फिल्म11 जैसी सामग्रियों का उपयोग करके बनाया जा सकता है। कृत्रिम मेजबान है कि Trichogramma के लिए पर्याप्त oviposition लाती है में समाधान सरल हो सकता है, जैसे अमीनो एसिड या अकार्बनिक लवण12. विशेषता के आधार पर कि टी. डेंड्रोलिमी कृत्रिम मेजबानों को परजीवी बना सकता है, यह अध्ययन कृत्रिम मेजबानों का उपयोग करके परजीवी ततैया से जहर निकालने के लिए एक नई विधि प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण का उद्देश्य कम उपज, कम शुद्धता और वर्तमान निष्कर्षण तकनीकों में संदूषण की संवेदनशीलता की कमियों को दूर करना है। इस पद्धति का उपयोग करके, टी. डेंड्रोलिमी से बड़ी मात्रा में उच्च शुद्धता वाला जहर निकाला जा सकता है, जो कीटनाशक या चिकित्सा उद्देश्यों के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान और बायोएक्टिव अणुओं की जांच की जरूरतों को पूरा करता है।
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Protocol
1. कीट पालन
- 26 ± 1 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर मकई के आटे पर कोर्सीरा सेफलोनिका खिलाएं और 40% ± 10% की सापेक्ष आर्द्रता।
- नस्ल टी. डेंड्रोलिमी मेजबान के रूप में कोर्सीरा सेफेलोनिका के अंडे का उपयोग करके जिलिन कीटनाशक घर के अंदर से तनाव। 26 ± 1 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ड्रोसोफिला ट्यूबों में ततैया वयस्कों को 10% सुक्रोज पानी खिलाएं, 70% ± 10% की सापेक्ष आर्द्रता, प्रकाश (एल): अंधेरे (डी) 14 घंटे की अवधि: 10 घंटे।
2. पॉलीथीन प्लास्टिक फिल्म अंडे कार्ड की तैयारी
- 16 सेमी की लंबाई, 12 सेमी की चौड़ाई और 20 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक पॉलीथीन प्लास्टिक की फिल्म लें। 30 छेद के मानक पीसीआर प्लेट लेआउट के अनुसार ग्लास पीसने वाली रॉड का उपयोग करके 2-3 मिमी के व्यास और लगभग 3 मिमी की ऊंचाई के साथ 96 अर्धवृत्ताकार प्रोट्रूशियंस दबाएं।
नोट: एक ग्लास पीसने वाली छड़ का उपयोग करके 30 अर्धवृत्ताकार प्रोट्रूशियंस को दबाने की प्रक्रिया को दबाव पर ध्यान देने की आवश्यकता है क्योंकि बहुत कठिन प्रेस प्लास्टिक को पंचर कर देगा और निकाले गए विषैले पीस रॉड को दूषित कर देगा। - 1 घंटे के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के लिए दोनों पक्षों को उजागर करके दबाए गए पॉलीथीन प्लास्टिक की फिल्म कीटाणुरहित करें।
- अर्धवृत्ताकार सतह पर 10% पॉलीविनाइल अल्कोहल की एक छोटी मात्रा जोड़ें।
3. ट्राइकोग्रामा डेंड्रोलिमी परजीवीवाद
- सीओ2 संज्ञाहरण के बाद, टी. डेंड्रोलिमी मादा ततैया को एक संग्रह बॉक्स में रखें, और ततैया की संख्या ~ 3000 थी।
- फिल्म एग कार्ड के उत्तल पक्ष को संग्रह बॉक्स की ओर रखें और किनारों को रबर बैंड से सुरक्षित करें।
- प्रत्येक अर्धवृत्ताकार फलाव में अमीनो एसिड समाधान (6 ग्राम / एल ल्यूसीन, 4 ग्राम / एल फेनिलएलनिन, 4.25 ग्राम / एल हिस्टिडाइन) के 4 माइक्रोन जोड़ें। इसे 16 सेमी लंबी और 12 सेमी चौड़ी एक फ्लैट पॉलीथीन प्लास्टिक की फिल्म के साथ कवर करें। प्लास्टिक की दो शीट के साथ संग्रह बॉक्स को कसकर कवर करने के लिए एक रबर बैंड का उपयोग करें।
- देंड्रोलिमी ततैया 4-8 घंटे के लिए स्वतंत्र रूप से परजीवी करें और गीले कपास के माध्यम से 10% सुक्रोज पानी प्रदान करें।
4. टी. डेंड्रोलिमी जहर इकट्ठा करना
- कृत्रिम अंडा कार्ड के आंतरिक फलाव से परजीवी अमीनो एसिड समाधान प्राप्त करें और इसे 1.5 एमएल ट्यूबों की टोपी में स्थानांतरित करें।
- एक 25 मिमी व्यास के साथ एक 10 माइक्रोन नायलॉन नेट के साथ ट्यूब टोपी कवर, नायलॉन नेट और अपकेंद्रित्र ट्यूब कसकर जकड़ना. 10 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र (1360 x ग्राम) का उपयोग कर लघु अपकेंद्रित्र के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब सीधा रखें और फ़िल्टर्ड समाधान ( टी dendrolimi जहर के ~ 100 माइक्रोन) इकट्ठा.
- एकत्र की एकाग्रता को मापें टी. डेंड्रोलिमी जहर एक बिसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) परख किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करना।
- आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जहर की दुकान.
5. एसडीएस-पेज विश्लेषण
- डेंड्रोलिमी जहर के 30 माइक्रोन को 4x सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) नमूना लोडिंग बफर (सामग्री की तालिका) के 10 माइक्रोन में जोड़ें और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी करें।
- 120 मिनट के लिए 130 वी पर एसडीएस-पेज जेल रन करें।
- दाग और प्रोटीन धुंधला तंत्र (सामग्री की तालिका) का उपयोग एसडीएस-पेज जेल decolorize.
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Representative Results
प्रतिनिधि जहर के नमूनों की प्रोटीन एकाग्रता को प्रोटीन परख किट का उपयोग करके मापा गया था, जिसमें परिणाम तालिका 1में प्रस्तुत किए गए थे। परिणामों से पता चला कि इस विधि द्वारा एकत्र किए गए विष प्रोटीन की सांद्रता 0.35 μg/μL से 0.46 μg/μL तक थी, जबकि अमीनो एसिड समाधान के नकारात्मक नियंत्रण में केवल 0.03 μg/μL से 0.05 μg/μL की प्रोटीन सांद्रता थी। इस विधि द्वारा एकत्र किए गए विष प्रोटीन की एकाग्रता नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में बहुत अधिक है, जो दर्शाता है कि यह विधि परजीवी ततैया के जहर को अच्छी तरह से एकत्र कर सकती है। इसके अलावा, परजीवीवाद समय और एकाग्रता के बीच कोई विशिष्ट संबंध नहीं है क्योंकि परजीवी ततैया के विभिन्न बैचों में अलग-अलग जीवन शक्ति हो सकती है।
इसके अतिरिक्त, टी. डेंड्रोलिमी जहर का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था, जिसमें चित्रा 1 में 10 केडीए से 130 केडीए से अधिक तक फैले विष प्रोटीन रेंज का खुलासा किया गया था। हालांकि, जब एसडीएस-पेज द्वारा अमीनो एसिड के नकारात्मक नियंत्रण का विश्लेषण किया गया था, तो यह पाया गया कि इसमें कोई प्रोटीन नहीं था (पूरक चित्रा 1), जिसने यह भी साबित किया कि इस विधि द्वारा एकत्र प्रोटीन वास्तव में परजीवी ततैया का जहर प्रोटीन था।
चित्रा 1: टी. डेंड्रोलिमी विष प्रोटीन का एसडीएस-पेज विश्लेषण। लेन 1-2: विष प्रोटीन की भरी हुई मात्रा क्रमशः 8 μg और 10 μg थी। एम: मार्कर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नमूना | परजीवीवाद समय (ज) | एकाग्रता (μg/μL) | |
| विष | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| नियंत्रण | 1 | एनपी | 0.04 |
| 2 | एनपी | 0.03 | |
| 3 | एनपी | 0.05 | |
| 4 | एनपी | 0.03 | |
| 5 | एनपी | 0.03 | |
तालिका 1: जहर और नियंत्रण की एकाग्रता की जानकारी। प्रतिनिधि जहर और नियंत्रण नमूनों की प्रोटीन एकाग्रता बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर मापा गया था. नियंत्रण: अपरजीवी नियंत्रण। एनपी: कोई परजीवीवाद नहीं
अनुपूरक चित्रा 1: नियंत्रण और जहर का एसडीएस-पेज विश्लेषण। नियंत्रण: अपरजीवी नियंत्रण। जहर: विष प्रोटीन की भरी हुई मात्रा 10 μg थी। एम: मार्कर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां, हम कृत्रिम मेजबानों का उपयोग करके टी. डेंड्रोलिमी से जहर निकालने की एक विधि प्रस्तुत करते हैं। विष संग्रह प्रयोग में मुख्य बिंदु इस प्रकार हैं। (1) तैयारी के दौरान, टी. डेंड्रोलिमी को सीओ2 की उचित एकाग्रता के साथ तेजी से संवेदनाहारी किया जाना चाहिए। यदि सीओ2 एकाग्रता बहुत कम है, तो ट्राइकोग्रामा को जल्दी से संवेदनाहारी करना अपर्याप्त होगा। इसके विपरीत, यदि एकाग्रता बहुत अधिक है, तो ट्राइकोग्रामा मर सकता है, कृत्रिम मेजबान को परजीवी करने की उनकी क्षमता को कम कर सकता है। (2) अमीनो एसिड समाधान की बाँझपन सुनिश्चित की जानी चाहिए, क्योंकि अमीनो एसिड समाधान का संदूषण परजीवीवाद दक्षता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। (3) परजीवीवाद को बढ़ावा देने के लिए कृत्रिम अंडा कार्ड का परजीवीकरण अंधेरे परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। (4) यह या तो सीधे बहाव प्रयोगों बाहर ले जाने के लिए या जहर की गतिविधि सुनिश्चित करने और गिरावट को रोकने के लिए नमूनों फ्रीज करने के लिए सिफारिश की है.
जमा अंडे की कल्पना करके परजीवीकरण का न्याय करने की सिफारिश की जाती है। यदि जमा अंडे माइक्रोस्कोप के नीचे नहीं देखे जाते हैं, तो कोई जहर नहीं निकाला जा सकता है। तकनीक की सीमा यह है कि इसके लिए बड़ी संख्या में परजीवी ततैया की आवश्यकता होती है। एक एकल विष निष्कर्षण के लिए लगभग 3,000 परजीवी ततैया की आवश्यकता होती है, जिससे कार्यभार बढ़ जाता है।
परजीवी ततैया के जहर के निष्कर्षण की पिछली विधि जहर जलाशय को विच्छेदित करना था। हालांकि, परजीवी ततैया छोटे हैं; उदाहरण के लिए, ट्राइकोग्रामा 1 मिमी से कम लंबा है। इतना ही नहीं विष जलाशयों उच्च विदारक की तकनीकी आवश्यकताओं रहे हैं, लेकिन विच्छेदन के दौरान अन्य ऊतकों के संदूषण भी आम है. कृत्रिम मेजबानों का उपयोग करके उपन्यास विधि जहर निष्कर्षण की दक्षता में सुधार कर सकती है और विच्छेदन के कारण होने वाले अन्य ऊतकों से संदूषण से बच सकती है।
इस विधि को अन्य परजीवी ततैया तक भी बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नमक आयनों और अमीनो एसिड के मिश्रण वाले पॉलीथीन प्लास्टिक फिल्म oocytes का उपयोग T. neustadt जहर प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, और KCl-MgSO4 समाधान युक्त कृत्रिम मोम अंडे का उपयोग T. pretiosum जहर प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। ट्राइकोग्रामा के अलावा, यह बताया गया है कि एनास्टेटस जपोनिकस13, माइक्रोप्लिटिस क्रोसीप्स9, और हैब्रोब्रैकॉन हेबेटर10 कृत्रिम मेजबानों को परजीवी बना सकते हैं। कृत्रिम मेजबानों को परजीवी बनाने के लिए इन परजीवी ततैया के गुणों का उपयोग करके, समान जहर निष्कर्षण विधियों को विकसित किया जा सकता है।
परजीवी ततैया का जहर संभावित कीट नियंत्रण और चिकित्सा अनुप्रयोगों के साथ जैविक अणुओं का एक अस्पष्टीकृत स्रोत है। हाल ही में, औषध विज्ञान और कृषि में परजीवी जहर के संभावित उपयोगों14,15 मान्यता प्राप्त किया गया है. औषधीय रूप से, परजीवी जहर में कई घटकों में इम्यूनोथेरेपी के अनुकूलन, थ्रोम्बोटिक विकारों का इलाज करने और नए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए टेम्पलेट खोजने में व्यापक संभावित अनुप्रयोग संभावनाएं हैं। कृषि में, परजीवी जहर में कुछ घटकों को प्रभावी ढंग से कीटों15 को नियंत्रित करने के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए कीटों के विकास, प्रजनन और प्रतिरक्षा को विनियमित करने के लिए जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, कुशल विष निष्कर्षण विधियों की कमी अक्सर परजीवी ततैया के जहर पर अनुसंधान को सीमित करती है, विशेष रूप से छोटे परजीवी ततैया जैसे ट्राइकोग्रामा। यह पेपर ट्राइकोग्रामा के जहर को निकालने के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है, जो ट्राइकोग्रामा जहर के अनुवर्ती अध्ययन के लिए एक विधि प्रदान करता है, जैसे कि प्रोटीन संरचना और जहर समारोह की पहचान। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग अन्य परजीवी ततैया विष अनुसंधान के संदर्भ के रूप में भी किया जा सकता है और कीटनाशक या चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए परजीवी जहर से बायोएक्टिव अणुओं की स्क्रीनिंग को बढ़ावा देने के लिए सहायता प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
हम हैनान प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 323QN262), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31701843 और 32172483), जिआंगसु कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार कोष (अनुदान संख्या 12000 अनुदान संख्या 1500000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 सीएक्स (22) 3012 और सीएक्स (21) 3008), जियांग्सू प्रांत के "शुआंगचुआंग डॉक्टर" फाउंडेशन (अनुदान संख्या 202030472), और नानजिंग कृषि विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड (अनुदान संख्या 804018)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
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