Summary
Здесь мы представляем протокол извлечения яда из Trichogramma dendrolimi с использованием искусственного хозяина, созданного с помощью полиэтиленовой пленки и раствора аминокислоты.
Abstract
Паразитоидные осы представляют собой разнообразную группу перепончатокрылых насекомых, которые служат бесценными ресурсами для биоборьбы с вредителями. Чтобы обеспечить успешный паразитизм, паразитоидные осы впрыскивают яд своим хозяевам, чтобы подавить иммунитет своих хозяев, модулировать их развитие, метаболизм и даже поведение. Насчитывая более 600 000 видов, разнообразие паразитоидных ос превосходит разнообразие других ядовитых животных, таких как змеи, конусные улитки и пауки. Яд паразитоидной ос является малоизученным источником биологически активных молекул с потенциальными применениями в борьбе с вредителями и медицине. Тем не менее, сбор паразитоидного яда затруднен из-за невозможности использования прямой или электрической стимуляции и трудности вскрытия из-за их небольшого размера. Трихограмма - это род крошечных (~0,5 мм) яиц паразитоидных ос, которые широко используются для биологической борьбы с чешуекрылыми вредителями как в сельском хозяйстве, так и в лесах. Здесь мы сообщаем о методе извлечения яда из T. dendrolimi с использованием искусственных хозяев. Этих искусственных хозяев создают с помощью полиэтиленовой пленки и растворов аминокислот, а затем прививают осам трихограммы от паразитизма. Впоследствии яд собирали и концентрировали. Этот метод позволяет извлекать большое количество яда трихограммы , избегая при этом загрязнения других тканей, вызванного вскрытием, что является распространенной проблемой в протоколах вскрытия резервуаров яда. Этот инновационный подход облегчает изучение яда трихограммы , прокладывая путь для новых исследований и потенциальных применений.
Introduction
Паразитоидные осы являются паразитическими перепончатокрылыми насекомыми, которые являются важными ресурсами для биологического контроля1. Существует большое разнообразие паразитоидных ос, насчитывающее более 600 000видов2. Разнообразие паразитоидных ос намного превосходит разнообразие других ядовитых членистоногих, таких как змеи, конусные улитки, пауки, скорпионы и пчелы. Яд является важным паразитарным фактором паразитоидных ос. При успешном паразитизме яд вводится в организм хозяина, модулируя его поведение, иммунитет, развитие и метаболизм3. Кроме того, яд паразитоидных ос демонстрирует удивительное разнообразие в своих молекулярных структурах, мишенях и функциях, что отражает сложную коэволюцию с их хозяевами. Таким образом, паразитоидный яд является ценным и недооцененным ресурсом активных молекул для инсектицидных или медицинских целей4. В отличие от яда змей, конусных улиток, пауков, скорпионов и пчел, яд паразитоидных ос не может быть собран прямой стимуляцией илиэлектростимуляцией. Современный метод извлечения яда паразитоидных ос заключается в вскрытии резервуара яда. Однако паразитоидные осы часто бывают мелкими, и вскрытие паразитоидных ос требует высоких технических навыков. Поэтому, если мы сможем найти способ эффективно и удобно собирать яд паразитоидных ос, это будет большим подспорьем для исследования яда паразитоидных ос.
Trichogramma (лат. Trichogrammatidae) — род мелких (~0,5 мм длиной) паразитоидных ос6. Эти осы являются одними из наиболее широко используемых агентов биоконтроля, особенно нацеленных на яйца различных чешуекрылых вредителей как в сельском хозяйстве, так и в лесах. Например, T. dendrolimi, один из наиболее широко используемых видов Trichogramma в Китае, широко применяется для борьбы с различными сельскохозяйственными и лесными вредителями, такими как Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis и Chilo suppressalis. Предыдущие исследования показали, что осы Trichogramma могут вводить свои яйца в искусственных хозяев7. Искусственные хозяева могут быть созданы с использованием таких материалов, как воск8, агар9, парапленка10 и пластиковая пленка11. Раствор в искусственных хозяевах, который индуцирует достаточное количество яйцекладок для трихограммы , может быть простым, например, аминокислотами или неорганическими солями12. Основываясь на характеристике, что T. dendrolimi может паразитировать на искусственных хозяевах, в этом исследовании представлен новый метод извлечения яда из паразитоидных ос с использованием искусственных хозяев. Этот подход направлен на устранение недостатков, связанных с низким выходом, низкой чистотой и восприимчивостью к загрязнению в современных методах экстракции. С помощью этого метода можно извлечь большое количество яда высокой чистоты из T. dendrolimi , что отвечает потребностям научных исследований и скрининга биологически активных молекул для инсектицидных или медицинских целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Разведение насекомых
- Кормят Corcyra cephalonica на кукурузной муке при температуре 26 ± 1°С и относительной влажности воздуха 40% ± 10%.
- Разводить штамм T. dendrolimi из инсектария Цзилинь в помещении, используя яйца Corcyra cephalonica в качестве хозяев. Кормят взрослых ос 10%-ной сахарозой водой в трубках дрозофилы при температуре 26 ± 1 °C, относительной влажности воздуха 70% ± 10%, светлых (L): темных (D) периодов 14 ч: 10 ч.
2. Подготовка карт яиц из полиэтиленовой пленки
- Возьмите полиэтиленовую пленку длиной 16 см, шириной 12 см и толщиной 20 мкм. Выдавить 30 полукруглых выступов диаметром 2-3 мм и высотой примерно 3 мм с помощью стеклянного шлифовального стержня по стандартной схеме ПЦР-пластины из 96 отверстий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс выдавливания 30 полукруглых выступов с помощью стеклянного шлифовального стержня необходимо выполнять, обращая внимание на давление, потому что слишком твердый пресс проткнет пластик и загрязнит извлеченный неядовитый шлифовальный стержень. - Продезинфицируйте прессованную полиэтиленовую пленку, подвергая обе стороны воздействию ультрафиолета (УФ) в течение 1 часа.
- Добавьте небольшое количество 10% поливинилового спирта на полукруглую поверхность.
3. Паразитизм Trichogramma dendrolimi
- После анестезииСО2 поместите самок ос T. dendrolimi в ящик для сбора, и количество ос составило ~3000.
- Приложите выпуклую сторону пленочной карточки для яиц к коробке для сбора и закрепите края резинкой.
- Добавьте 4 мкл раствора аминокислоты (6 г/л лейцина, 4 г/л фенилаланина, 4,25 г/л гистидина) к каждому полукруглому выпячиванию. Накройте его плоской полиэтиленовой пленкой длиной 16 см и шириной 12 см. С помощью резинки плотно накройте сборный ящик двумя листами пластика.
- Дайте осам T. dendrolimi свободно паразитировать в течение 4-8 ч и обеспечьте 10%-ную сахарозную воду через смоченный хлопок.
4. Сбор яда T. dendrolimi
- Извлеките паразитизированный раствор аминокислоты из внутреннего выступа карточки искусственной яйцеклетки и переложите его в колпачок пробирки объемом 1,5 мл.
- Накройте крышку пробирки нейлоновой сеткой диаметром 10 мкм диаметром 25 мм, плотно закрепите нейлоновую сетку и центрифужную пробирку. Поместите центрифужную пробирку вертикально для короткого центрифугирования с помощью мини-центрифуги (1360 x g) на 10 с и соберите отфильтрованный раствор (~100 мкл яда T. dendrolimi ).
- Измерьте концентрацию собранного яда T. dendrolimi с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (таблица материалов).
- Храните яд при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
5. Анализ SDS-PAGE
- Добавьте 30 мкл яда T. dendrolimi в 10 мкл 4-кратного буфера для загрузки образца с додецилсульфатом-полиакриламидным гелем натрия (SDS-PAGE) (таблица материалов) и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин.
- Выполните прогон геля SDS-PAGE при напряжении 130 В в течение 120 мин.
- Окрасьте и обесцвечивайте гель SDS-PAGE с помощью аппарата для окрашивания белков (таблица материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Концентрацию белка в репрезентативных образцах яда измеряли с помощью набора для анализа белков, результаты представлены в таблице 1. Результаты показали, что концентрация белка яда, собранного этим методом, варьировала от 0,35 мкг/мкл до 0,46 мкг/мкл, в то время как отрицательный контроль раствора аминокислоты имел концентрацию белка только от 0,03 мкг/мкл до 0,05 мкг/мкл. Концентрация белка яда, собранного этим методом, намного выше, чем у отрицательного контроля, что показывает, что этот метод может хорошо собирать яд паразитических ос. Кроме того, нет специфической корреляции между временем паразитирования и концентрацией, потому что разные партии паразитических ос могут иметь разную жизнеспособность.
Кроме того, яд T. dendrolimi был проанализирован с помощью SDS-PAGE, и на рисунке 1 был выявлен диапазон белков яда, охватывающий от менее 10 кДа до более чем 130 кДа. Однако, когда отрицательный контроль аминокислоты был проанализирован с помощью SDS-PAGE, было обнаружено, что в ней нет белка (дополнительный рисунок 1), что также доказывает, что белок, собранный этим методом, действительно является белком яда паразитических ос.
Рисунок 1: SDS-PAGE анализ белка яда T. dendrolimi. Дорожки 1-2: загруженное количество белка яда составляло 8 мкг и 10 мкг соответственно. М: Маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Образец | Время паразитизма (ч) | Концентрация (мкг/мкл) | |
| Яд | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Контроль | 1 | НП | 0.04 |
| 2 | НП | 0.03 | |
| 3 | НП | 0.05 | |
| 4 | НП | 0.03 | |
| 5 | НП | 0.03 | |
Таблица 1: Информация о концентрации яда и контроль. Концентрацию белка в репрезентативных ядах и контрольных образцах измеряли с помощью набора для анализа белка BCA. Контроль: непаразитированные элементы управления. НП: никакого паразитизма
Дополнительный рисунок 1: SDS-PAGE анализ контроля и яда. Контроль: непаразитируемый контроль. Яд: загруженное количество белка яда составляло 10 мкг. М: Маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье мы представляем метод извлечения яда из T. dendrolimi с использованием искусственных хозяев. Ключевые моменты в эксперименте по сбору яда заключаются в следующем. (1) Во время приготовления T. dendrolimi необходимо быстро обезболивать соответствующей концентрацией CO2. Если концентрацияСО2 слишком низкая, ее будет недостаточно для быстрого обезболивания трихограммы . И наоборот, если концентрация слишком высока, трихограммы могут погибнуть, снижая их способность паразитировать на искусственном хозяине. (2) Необходимо обеспечить стерильность раствора аминокислоты, так как загрязнение раствора аминокислоты может отрицательно сказаться на эффективности паразитизма. (3) Паразитирование искусственных яйцеклеток должно проводиться в темных условиях, чтобы способствовать паразитизму. (4) Рекомендуется либо непосредственно проводить последующие эксперименты, либо замораживать образцы, чтобы обеспечить активность яда и предотвратить его разложение.
Рекомендуется судить о паразитировании по визуализации отложенных яиц. Если отложенные яйца не наблюдаются под микроскопом, возможно, яд не был извлечен. Ограничением методики является то, что она требует большого количества паразитоидных ос. Для одного извлечения яда требуется около 3000 паразитоидных ос, что увеличивает рабочую нагрузку.
Предыдущий метод извлечения яда паразитоидной осы заключался в вскрытии резервуара яда. Однако паразитоидные осы крошечные; Например, трихограмма имеет длину менее 1 мм. Высоки не только технические требования к вскрытию резервуаров с ядом, но и загрязнение других тканей во время вскрытия. Новый метод с использованием искусственных хозяев может повысить эффективность экстракции яда и избежать загрязнения других тканей в результате вскрытия.
Этот метод можно распространить и на других паразитоидных ос. Например, для получения яда T. neustadt можно использовать полиэтиленовые пленочные ооциты, содержащие смесь ионов соли и аминокислот, а для получения яда T. pretiosum — искусственные восковые яйца, содержащие раствор KCl-MgSO4. Помимо Trichogramma, сообщалось, что Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 и Habrobracon hebetor10 могут паразитировать на искусственных хозяевах. Используя свойства этих паразитоидных ос паразитировать на искусственных хозяевах, можно разработать аналогичные методы экстракции яда.
Яд паразитоидной ос является малоизученным источником биологических молекул с потенциальными проблемами для борьбы с вредителями и медицинского применения. В последнее время признана потенциальная польза паразитоидного яда в фармакологии и сельском хозяйстве14,15. Фармакологически многие компоненты паразитоидного яда имеют широкие потенциальные перспективы применения в оптимизации иммунотерапии, лечении тромботических нарушений и нахождении шаблонов для новых антибиотиков. В сельском хозяйстве некоторые компоненты паразитоидного яда могут использоваться в качестве агентов биологического контроля для регулирования развития, размножения и иммунитета вредителей для достижения цели эффективной борьбы с вредителями15. Тем не менее, отсутствие эффективных методов экстракции яда часто ограничивает исследования яда паразитоидных ос, особенно крошечных паразитоидных ос, таких как Trichogramma. В данной работе представлен эффективный метод извлечения яда трихограммы, который обеспечивает метод для последующего изучения яда трихограммы, такого как идентификация белкового состава и функции яда. Кроме того, этот метод также может быть использован в качестве эталона для других исследований яда паразитоидных ос и обеспечивает поддержку в продвижении скрининга биологически активных молекул из паразитоидных ядов для инсектицидного или медицинского применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автору нечего раскрывать и нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Выражаем признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда естественных наук провинции Хайнань (грант No 323QN262), Национального фонда естественных наук Китая (гранты No 31701843 и 32172483), Фонда инноваций в области сельскохозяйственной науки и технологий провинции Цзянсу (грант No 323QN262). CX(22)3012 и CX(21)3008), Фонд «Доктор Шуанчуан» провинции Цзянсу (грант No 202030472) и стартап-фонд Нанкинского сельскохозяйственного университета (грант No 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
